專(zhuān)利名稱(chēng)：乳酸桿菌用于治療病毒感染的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株用于制備用于治療和/或預(yù) 防病毒感染的藥物組合物的用途。
背景技術(shù)：
益生菌被定義為當(dāng)給予足夠量時(shí)對(duì)接受者有益的活微生物。乳酸桿菌
(Lactone////)和雙歧桿菌(&:/^Z^cter/a)是益生菌制品中最常用的細(xì)菌。這些 細(xì)菌通常是安全的，基于這些生物體的益生制品也是這樣。對(duì)于所有年齡組和 免疫損傷的個(gè)體，都沒(méi)有致病性。不同的益生菌的MA顯示出其具有對(duì)不同的 生理學(xué)或病理學(xué)狀態(tài)的臨床益處。在由抗生素治療或輪狀病毒感染弓胞的腹灣 方面顯示了最明確的作用。還有研究顯示MA益生菌之后，在炎'M疾病，特 異性皮炎和血膽固醇過(guò)多方面有積極的臨床作用。益生菌促成這些臨床改善的 機(jī)理還不清楚。人的體外，以及動(dòng)物的體內(nèi)和體夕h 開(kāi)究，顯示不同種的乳酸桿 菌通過(guò)很多不同的途徑影響先天和后天的免疫系統(tǒng)。臨床研究主要顯示先天細(xì) 胞免疫系統(tǒng)的刺激作用和針對(duì)天然感染和全身或口服免疫的體液免疫反應(yīng)的加 強(qiáng)。關(guān)于先天免疫系統(tǒng)的作用，增強(qiáng)的多形核細(xì)胞(PMN)的吞噬細(xì)胞活性和 增強(qiáng)的NK細(xì)鵬中瘤殺傷活性已經(jīng)被報(bào)道。根據(jù)我們掌握的知識(shí)，現(xiàn)在尚沒(méi)有 臨床研究顯示在^A益生菌之后，在特定細(xì)胞免疫系統(tǒng)中的作用。
本發(fā)明全面研究了每日MA乳酸桿菌或革蘭氏陰性菌P /朋^7^后，對(duì)先 天和后天免疫系統(tǒng)的影響。有趣的是，己經(jīng)觀察到接受丄./7/朋ton/m (胚芽乳酸 桿菌)的受試者的特定細(xì)胞免疫系統(tǒng)的歡活作用以及接受丄.戸raa7鄉(xiāng)(副干酪 乳酸桿菌)的受試者的這種指示。此外，觀察了接受不同的乳酸桿菌物種的受 試者中，對(duì)先天免疫系統(tǒng)的免疫增強(qiáng)作用，例如NKT細(xì)胞群的擴(kuò)張和吞噬細(xì)胞 活性的增強(qiáng)。無(wú)論怎樣，革蘭氏陰性菌尸/2^fe"微的^A對(duì)根據(jù)這里描述的試 驗(yàn)觀懂的不同的免疫參數(shù)均沒(méi)有產(chǎn)生影響。
抗生素耐藥性的發(fā)展和對(duì)感染的不同治療的失敗，使得對(duì)益生制品
(probiotics)作為可選擇的工具的興趣有所增加?？赡苡袑?duì)一種針對(duì)普通感冒問(wèn) 題的益生功能性食品產(chǎn)品的需求。每年感冒感染的發(fā)病率都非常高，這是清楚 的。含有高7jC平維生素C的食品傳統(tǒng)上被用于i^減少普通感冒的發(fā)病率。在 市場(chǎng)上，有許多不同產(chǎn)品聲稱(chēng)其對(duì)免疫系統(tǒng)有一定作用。
本申請(qǐng)的目的是研究益生功能食品產(chǎn)品，在按常規(guī)纟^之后是否可以通過(guò) 相似的途徑影響普通感冒的癥狀，并且因此可以作為大眾解決這些問(wèn)題的替代 性解決方案。
發(fā)明概要
本發(fā)明的一個(gè)目的是選自乳酸桿菌的至少一種益生菌菌株用于制備用于治 療和/或預(yù)防病毒感染的藥物組合物的用途。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種治療和/或預(yù)防病毒感染的方法，其中選自乳酸 桿菌的至少一種益生菌菌株被纟好個(gè)體。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了試驗(yàn)中報(bào)告任何小的不良腸胃反應(yīng)的志愿者數(shù)目。 圖2顯示了每ml血中不同的淋巴細(xì)胞的基線(xiàn)數(shù)(0天)(平均值± (SEM))。 圖3顯示了淋巴細(xì)胞的基線(xiàn)(0天)百分?jǐn)?shù)或者GMFI (平均值士 (SEM))， 其對(duì)不同的細(xì)胞活化和記IZ標(biāo)記為陽(yáng)性。
圖4，隨機(jī)指定受試者為九個(gè)不同的研究組。試驗(yàn)從兩周的間歇期開(kāi)始。其 后，接著是活性研究階段。在該階段中，受試者每天接受一個(gè)齊糧的研究產(chǎn)品 至14天(丄./ /朋ton/w報(bào)a/ /9、 丄.y^we她附、丄.戸racos"ez、 丄.gassm、丄. ^jam朋，、i3 /w"cfemis組)或35天((丄.p/朋ton/m 299v和安慰劑組)。每劑量 包含101()細(xì)菌群落總數(shù)(CFU)(乳酸桿菌組)或者109 CFU的桿菌(P. lundensis 組)。
圖5，用流式細(xì)胞儀測(cè)定的表達(dá)活化表型CD8CD25、 CD8HLA-DR、 CD4CD25和CD4HLA-DR的淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析。顯示了基于個(gè)體比值 的各組值(士SEM)， 14力0天以及35 ^/0天(僅對(duì)于L. plantarum和安慰劑組)。
圖6，用流式細(xì)胞儀測(cè)定的皿記憶表型CD8CD45RO和CD4CD45RO的 淋巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析。顯示了基于個(gè)體比值的各組值(士SEM)， 14刃0天
以及35力0天(僅對(duì)于L.plantamm和安慰劑組)。
圖7，用流式細(xì)胞儀測(cè)定的NKT細(xì)胞標(biāo)記物(CD56CD16CD3)陽(yáng)性的淋
巴細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)被分析?；趥€(gè)體比值分組計(jì)算(14力0天)。
圖8,通過(guò)用FITC-iH己的E. coli或S. aureus i咅養(yǎng)全血細(xì)胞，嗜中性茅娜
胞的吞噬活性被測(cè)定。圖中顯示了分別確定的在14天禾口 0天獲得的平均熒光值
的比值并分組計(jì)算。
圖9顯示了得自實(shí)驗(yàn)2的皿活^^型CD4CD25的淋巴細(xì)胞的比值。 圖10顯示了得自實(shí)驗(yàn)2的^ii活化表型CD4+CD2,的淋巴細(xì)胞的比值。 圖11顯示了得自實(shí)驗(yàn)2的表達(dá)活化表型008+111^-011+的淋巴細(xì)胞的比值。 圖12顯示了得自實(shí)驗(yàn)2的^ii活4t^型CD8+CD25+的淋巴細(xì)胞的比值。 圖13顯示了得自實(shí)驗(yàn)2的 活<様型CD4CD45RO的淋巴細(xì)胞的比值。
發(fā)明詳述
本發(fā)明所使用的乳酸桿菌可以選自由胚芽乳酸桿菌(丄"cto&a7/M ; /朋torwm)、 鼠李糖乳酸桿菌(Z^cto6co7/i r/K m似o愿)、發(fā)酵孚L酸桿菌 (丄actoZ ad〃u^/fe 7we"^w)、畐'j干酷乳酸桿菌CLactoZ)acz7/u^/ aracayez')禾口力口氏乳 酸桿菌(lactotoc///^go^m')組成的組，但是不限于此。
本發(fā)明{頓的胚芽乳酸桿菌可以選自由胚芽乳酸桿菌299， DSM6595，胚 芽乳酸桿菌299v， DSM 9843，胚芽乳酸桿菌HEAL 9， DSM 15312，胚芽 乳酸桿菌HEAL 19， DSM 15313，和胚芽乳酸桿菌HEAL 99， DSM 15316組 成的組，但是不限于此。
本發(fā)明使用的副干酪乳酸桿菌可以選自由副干酪乳酸桿菌8700:2， DSM 13434，和副干酪乳酸桿菌02A， DSM13432組成的組，但是不限于此。本發(fā) 明使用的加氏乳酸桿菌可以選自加氏乳酸桿菌VPG44， DSM 16737，但是不限 于此。
除了本文明確公開(kāi)的菌株以外，其他益生菌株可以根據(jù)本發(fā)明自然的被使 用，并且在發(fā)明的范圍之內(nèi)，只要它能提供預(yù)期作用，即，對(duì)病毒感染具有預(yù) 防作用或減輕病毒感染的作用。
在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物中至少使用兩種益生菌株。所述的 至少兩種菌株意圖換l,或同時(shí)給予。因此，菌株可以以在一種組合物中以混
糊的形式被給予或者它們可以按順序以不同的組合物被分別會(huì)舒。
依據(jù)本發(fā)明，治療病毒感染是可能的。能治療的病毒感染是那些被選自由
單純性皰疹i病毒、單純性皰疹n病毒、帶，疹病毒、普通感冒病毒、鼻病 毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸病毒和冠^bt病毒組成的組的病 毒引起的，但不限于此。這里沒(méi)有特別提及的任何其他病毒感染，只要益生菌 育^有作用就在發(fā)明的范圍之內(nèi)。已知的，有很多不同的病毒和他們的 引起 普通感冒。所有的這 毒都在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
本文中，"治療和/或預(yù)防"一詞包括個(gè)體的預(yù)防治療，即為了預(yù)防疾病/感 染，在疾病或病毒感染發(fā)生之前開(kāi)始用益生菌治療，和已經(jīng)發(fā)生在個(gè)體中的疾 病/感染的治療。在后一個(gè)瞎況中，癥狀的緩解例如是被期望的，或病人的總體 狀況被加強(qiáng)或者患者更快的從疾病/感染被治愈。因此，個(gè)體可以是有或無(wú)感染 發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的人或者在患者體內(nèi)已經(jīng)有感染的人。
在發(fā)明的一個(gè)實(shí)航式中，藥物組合物中的^^所述的菌株的量為約ixio6
至約lxlO"CFU，，自約lxl()8至約lx1012，且更優(yōu)選自約lxl()9至約lx1011，
但是不限于此。
本發(fā)明的藥物組合物可以是例如液體制劑或者固體制劑。 當(dāng)藥物組合物是固體制劑時(shí)，它可以被制造為片劑，含片，糖果，咀嚼片，
口香糖，膠囊，小藥囊，粉劑，顆粒劑，包衣微粒，腸包衣片，腸包衣膠囊，
絲或薄膜。
當(dāng)藥物組合物是液體制劑時(shí)，它可以被制造為口服溶液，混懸液，乳液或
糖漿。所述組合物可以進(jìn)一步包括載體材料，獨(dú)立的選自由燕麥粥(oat meal grud)、乳職酵食品、抗性淀粉、月善釤千維、碳7K化^t)、蛋白質(zhì)和糖^j七蛋 白組成的組，但是不限于此。
本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述的藥物組合物是藥用食品、功能食品、食品添 加劑、營(yíng)養(yǎng)品或食物制品(foodpreparation)。
根據(jù)發(fā)明4頓或生產(chǎn)的本發(fā)明的藥物組，，還可以包括其他物質(zhì)，例如 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的情性載體，或者藥學(xué)上可接受的輔劑、載體、防腐劑等。
"藥物組合物"一詞不是必須是標(biāo)準(zhǔn)意義上的藥物組合物，可以被制造為食 品組合物、食品添加劑、功能食品、藥用食品或營(yíng)養(yǎng)品的形式，只要能達(dá)到所 要的效果，即治療或預(yù)防病毒感染的效果。所述的食品組合物可以選自由飲料、
酸乳酪、果汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類(lèi)、健康棒(health bars)、糊(spreads) 和營(yíng)養(yǎng)品組成的組。食品組合物可以進(jìn)一步包含載體材料，其中所述的載體材 料選自由燕麥粥、乳職酵食品、抗性淀粉(resistant starch)、膳^^千維、#7夂 化合物、蛋白質(zhì)和糖基化蛋白組成的組。
因此，本發(fā)明組合物的用途可以是 在病毒感染發(fā)展之前的預(yù)防有用的 意義上非常有益。因?yàn)椤搅乃幬锝M糊不一定是標(biāo)準(zhǔn)意義上的藥物組合物， 還可以是食品添加劑或功會(huì)^食品，所以對(duì)普通的健康的個(gè)體而言，月艮用本發(fā)明 組^tl用于預(yù)防是非常方便的。
實(shí)施例 實(shí)施例1
受試者和i微標(biāo)準(zhǔn)
選醉齡范圍為18-55歲(中值26歲)的五十七名^)(見(jiàn)健康志愿者，作盲 安慰劑對(duì)照研究。受試者被隨機(jī)指定為八個(gè)小組，接受下歹啲革蘭氏陽(yáng)性菌中 的一種L,plantarum299v(n=7)， L.plantarumHeal 19(n=7)， L. fermentum 35D (n=7), L paracasei 8700:2 (n=7)， L. gasseri WG44 (n=7), L. rhamnosus 271 (n=7)， 或革蘭氏陰性菌，R hmdensis (n=7)或安慰劑(n=10)。菌的劑量為對(duì)于乳酸桿 菌10W菌/天和P.lundensisl09菌/天。對(duì)照組用脫脂奶粉(1 g)。根據(jù)組，研究持 續(xù)6或9周，包括兩周間歇期(washoutperiod)， 2或5周活躍研究期和2周追 蹤期(圖4)。旨受i，被供給包括益生產(chǎn)品的一組產(chǎn)品，在整4^開(kāi)究期間應(yīng) 該沒(méi)有耗盡。從受試者ffiil在兩個(gè)或三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，0天，14天和35天靜脈穿刺 抽取外周血樣品。在逸驗(yàn)過(guò)程中每日記錄每個(gè)受試者所述的不良反應(yīng)，健康狀 況和確認(rèn)MA的研究產(chǎn)品。
流式細(xì)胞術(shù)
全血中淋巴細(xì)胞表型的分析fflil流式細(xì)胞術(shù)實(shí)現(xiàn)。下列的抗人單克隆抗體 用作不同細(xì)胞群的表面標(biāo)志CD3FITC (SK7)、 CD4APC (SK3)、 CD8PerCP (SK1)、 CD19PeiCP (SJ25C1) 、 CD56PE (MY31)、 CD16PE (B73.1) 和CD5 FITC (L17F12)。下列的抗人單克隆抗體用于檢測(cè)不同的激舒的己憶 標(biāo)記CD25FITC (2A3)、 HLA-DRPE (L243)、 CD45ROPE (UCHL-1)、 CD38 PE (HB7)、 CD27 PE (L128)禾口 CDllb PE (D12)。所有的抗體購(gòu)買(mǎi)
自Becton-Dickinson (Erembodegum， Belgium)。全血(100^1)用抗體OOjjI/ 抗體)在4。C黑暗中i咅養(yǎng)30min。然后加入2 ml FACS溶角辦液(lysing solution) (Becton-Dickinson)并在20。C暗室中培養(yǎng)15min。用3 ml FACSFlow沖洗細(xì)胞并 在300 x g離心5min。沖洗過(guò)的細(xì)胞重懸浮在200^1 FACSFlow中并用CellQuest 軟件在FacsCalibur (Becton- DickJnson)分析。
吞噬作用測(cè)定
粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的吞噬活性用PHAGOTEST (Orpegen Pharma， Heidelberg, Germany)定量，根據(jù)制造廠家的說(shuō)明，有某些修改。簡(jiǎn)要的，將 20xl06FITC標(biāo)記的大腸桿菌或FITCiH己的S aw陀^加入預(yù)冷的全血(100^1) 中。血細(xì)胞和菌在37。C培養(yǎng)10FacsCalibur，用CellQuest軟件。
計(jì)算
不同的免疫參數(shù)的個(gè)體變iM過(guò)計(jì)算在14天和0天或者35天和0天獲得 的皿之間的比值而確定。這些比iM于所有的組的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。 統(tǒng)計(jì)
所有的統(tǒng)計(jì)分析^fOT Statview實(shí)現(xiàn)。Mam-Whitney U檢驗(yàn)法來(lái)比較不 同的組。 結(jié)果
臨床觀察
57個(gè)志愿者之中54人完成了該研究。兩人因?yàn)楦腥竞涂股刂委煴慌懦?外(一人在安慰劑組而另一人在接受P. lundensis的組)。 一人因?yàn)閼言性?6天 被排除在外(安慰劑組)。MA研究產(chǎn)品之后只報(bào)告有輕微的腸胃不良的副作用 (圖l)。
MA乳酸桿菌激活T細(xì)胞
關(guān)于在CD4+和CD8+T細(xì)胞上的激活標(biāo)記，有大的基線(xiàn)(0天)個(gè)體變化。 圖2中顯示了^ii不同細(xì)胞表面標(biāo)記的細(xì)胞的基線(xiàn)百分比。在該時(shí)間點(diǎn)上沒(méi)有 觀察到不同組之間的顯著差別。因?yàn)橛^察到有巨大的個(gè)體間差異，選擇比較每 個(gè)個(gè)體在14天和35天與0天相比的比值。所有的計(jì)算和比較都基于這些比值 (14 ^/0天和35 ^/0天)做出。攝入含有丄./ /朋torwm (胚芽乳酸桿菌)299v 的被研究的產(chǎn)品14天之后，在CD8+ T細(xì)胞上激活標(biāo)記CD25的表達(dá)有大約兩 倍的增長(zhǎng)(p=0.01)(圖5)。在攝入丄，/7/朋tomw299v之后，有強(qiáng)的CD8+T細(xì)
胞上HLA-DR的增量調(diào)節(jié)的指示，雖然不顯著(p=0.12)。另外，在攝入L，plantarum,299v之后還可以觀察到CD4"T細(xì)胞歡活的趨勢(shì)。MA其它包括在本 研究之內(nèi)的學(xué)L酸桿ra種以及革蘭氏陰性菌P /朋^7^，沒(méi)有歡活CD8，細(xì)胞 也沒(méi)有激活CD4寸細(xì)胞。但是，有這樣的^勢(shì)即攝入丄.戸raca^/ (副干酪乳酸 桿菌)確實(shí)增多CD4+T細(xì)胞上HLA-DR的泰ii (P=0.18)。 MA乳酸桿菌誘發(fā)CD4+ T細(xì)胞的記憶表型
^S受不同研究產(chǎn)品的各組之間CD4+禾口 CD8"T細(xì)胞上CD45RO泰逸的熒 光強(qiáng)度(GMFI)的幾何平均值進(jìn)行比較。如上所述，根據(jù)各比值(14^/0天和 35天/0天)的組計(jì)算結(jié)果用于比較。MA包含丄./7/朋torwmZ^v的研究產(chǎn)品35 n后，CD4+ T細(xì)l&Jl CD45RO GMFI增長(zhǎng)顯著(p=0.03 )。在攝入L. p/朋torwm 之后，CD8+T細(xì)胞上表達(dá)的CD45RO還有增長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖6)。此外，攝入L，plantarum,299v似乎對(duì)CD8，細(xì)irtCD45RO的增量調(diào)節(jié)有積極的影響(1)=0.10)(圖 6)。
MA研究產(chǎn)品之后對(duì)不同的細(xì)胞群的影響
攝入L，plantarum,299v之后，鑒定為NKT細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的百分比有所增長(zhǎng) (P=0.06)(圖7)。關(guān)于其他細(xì)胞群，與0天相比較，沒(méi)有檢觀倒相對(duì)增長(zhǎng)、減少，例如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、B-l細(xì)胞(CD19+CD5+)、 NK細(xì)胞、 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。
吞噬作用活性
在FSC-SSC圖中鑒定粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。測(cè)定這些細(xì)胞吞噬FITC標(biāo)記的 革蘭氏陽(yáng)性菌或革蘭氏陰性菌的能力。如圖S中所示，從給予攝入L，plantarum,299v(p=0.064), tommW9v (p=0.064)、 L.plantarum Heal 19 (p=0.064), L. fermentum (p=0.064) 或 L paracasei (p=0.5)(p=0.05)的志愿者獲得的粒細(xì)胞比用安慰劑處理的志愿者的粒細(xì)胞 對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌的吞噬作用更有效。然而，各組對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S. ，的吞噬作用沒(méi)有區(qū)別。沒(méi)有檢測(cè)到單核細(xì)胞吞噬活性的區(qū)別(數(shù)據(jù)沒(méi)有 顯示)。
討論
免疫系統(tǒng)的主要任務(wù)是對(duì)微生物產(chǎn)生決速且強(qiáng)烈的應(yīng)答從而預(yù)防和治愈感 染。殺死微生物所4頓的強(qiáng)大的機(jī)制也會(huì)弓胞對(duì)我們自身組織的損傷。因此， 不對(duì)劍門(mén)自身組織產(chǎn)生應(yīng)答，也不對(duì)環(huán)境中出現(xiàn)的無(wú)害物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答是必需的。
因此，免疫系 劍門(mén)自己身體的組成部分，和食品以及MA的蛋白質(zhì)都發(fā)展 并維持耐受性。如果失敗，將出現(xiàn)許多疾病。發(fā)展特異性免疫耐受性的手段是 免疫系統(tǒng)必要的任務(wù)。
所有免疫反應(yīng)中的一個(gè)重要角色是T輔助細(xì)胞扮演的。當(dāng)T輔助細(xì)胞被它
的特異性抗原激活時(shí)，將變得有活性，分裂，成熟且生成指導(dǎo)免疫系統(tǒng)中其他
類(lèi)型細(xì)胞的作用的一系列細(xì)胞因子，例如細(xì)胞毒性T細(xì)胞和B細(xì)胞。T輔助細(xì) 胞的激活是為了生成大多數(shù)類(lèi)型免疫反應(yīng)所必須的，包括抗體的生成。相反的， 如果T輔助細(xì)胞的激「活被阻止，那么大多數(shù)類(lèi)型的免疫反應(yīng)將被阻斷。
確保T輔助細(xì)胞激活和耐受性維持的機(jī)制有幾種。 一種機(jī)制是胸腺中有識(shí) 別自身組織和對(duì)自身組織一起反應(yīng)的會(huì)旨力的T細(xì)胞的清除。然而，這種清除不 完全，所以此外，我們還需要發(fā)展對(duì)外源性抗原的特異性免疫耐受性。否則， 我們將對(duì)所有類(lèi)型的吸A^卩MA的物質(zhì)有強(qiáng)烈應(yīng)答，導(dǎo)致大量炎癥和免疫資源 浪費(fèi)。
一種對(duì)維持耐受性很重要的細(xì)胞鄉(xiāng)是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。該細(xì)胞類(lèi)型可以通 過(guò)某些標(biāo)記識(shí)別，例如CD4和CD25的表面表達(dá)，具有細(xì)胞內(nèi)CTLA4，和核 蛋白Foxp3的轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有能力當(dāng)遇見(jiàn)無(wú)害物質(zhì)的時(shí)候防止其他T細(xì) 胞被激舌，由此，阻止所有類(lèi)型的不需要的免疫反應(yīng)。
本文中，與某標(biāo)記連用的符號(hào)"+"，例如CD4+和CD25+意思是指該標(biāo)記 在T細(xì)mi:表達(dá)。例如。04+0)25+ T細(xì)胞是在其表面表達(dá)CD4標(biāo)記和CD25 標(biāo)記的T細(xì)胞。但是沒(méi)有述及表達(dá)的標(biāo)記的量，只是說(shuō)它存在。本文中與標(biāo)記 連用的符號(hào)"++"，例如CD4卄或CD25w意思是指有大量標(biāo)記被表達(dá)。調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞是那些表面有大量CD25的細(xì)胞，即004+0025++細(xì)胞。另一方面， CD4+CD25+T細(xì)胞是唯一被激活的T細(xì)胞。有時(shí)，不使用特殊符號(hào)"+'鄰"++"， 例如僅僅為CD4CD25細(xì)胞，這表示這些細(xì)胞是被激活的，例如CD4+CD25+細(xì) 胞。因此，CD4CD25與CD4+CD25+是一樣的。當(dāng)討論調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的時(shí)候， 常寫(xiě)作CD4+CD25W細(xì)胞。
該盲安慰齊樹(shù)照研究是獨(dú)特的，原因在于它是比較了在MA不同的革蘭氏 陽(yáng)性乳酸桿菌或革蘭氏陰性菌P.lundensis之后一些免疫參數(shù)的影響的第一項(xiàng)研 究。有趣的是，攝入P.lundensis沒(méi)有影響任何測(cè)量的參數(shù)。相反，攝入乳酸桿 菌影響特異性和先天免疫系統(tǒng)不同的組分。該研究中有個(gè)新的發(fā)現(xiàn)，攝入L.
p/朋ton/m Xt激活和誘導(dǎo)T細(xì)胞群中的記憶細(xì)胞有顯著的積極作用。IL-2受體a 鏈(CD25)有顯著的增量調(diào)節(jié)，且有細(xì)胞毒性T細(xì)ISJ: HLA-DR增量調(diào)節(jié)的 強(qiáng)烈趨勢(shì)。這些激活標(biāo)記增量調(diào)節(jié)的趨勢(shì)還可以在攝入/^/朋ton/m之后，在輔 助T細(xì)胞上觀察到。i^活^射己的表達(dá)表明T細(xì)胞開(kāi)始對(duì)抗原特異或非特異'鵬U 激作出響應(yīng)而增殖，且這些細(xì)胞與靜止性T細(xì)胞相比更容易發(fā)揮它們的效應(yīng)功 會(huì)g。丄./7/朋tomw誘導(dǎo)的T細(xì)胞的歡活的機(jī)制可能是il31被toll-like受^^活的 抗原3iM細(xì)胞與微生物化合物相結(jié)合。抗原遞呈細(xì)胞的激活使得它們更加有效 地^敏原傳遞至T細(xì)胞。另外，輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞都表現(xiàn)出有toll-like受體 的不同的敏，這很可能使得這些細(xì)胞易于被微生物成分和產(chǎn)品非特異性歡活。
與輔助T細(xì)胞分隔相類(lèi)似，CD45RO的表達(dá)似乎是標(biāo)記了一個(gè)記憶群，在 細(xì)胞毒性T細(xì)胞中也是。發(fā)現(xiàn)在輔助T細(xì)胞上的這種記〖乙細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)有顯 著的增長(zhǎng)，且在攝入丄./ /朋ton/m35^t后，細(xì)胞毒性T細(xì)胞上有增量調(diào)節(jié)的趨 勢(shì)。另外，攝入丄.戸raca ez'(副干酪乳酸桿菌)也顯示了細(xì)胞毒性T細(xì)胞上 CD45RO的增量調(diào)節(jié)的趨勢(shì)。與幼稚T細(xì)胞(naiveTcells)相比較，CD45RO+ T細(xì)胞可以分泌廣譜的細(xì)胞因子。財(cái)卜，當(dāng)CD3-TCR復(fù)合物在次最適度的條件 下受刺激的時(shí)候，CD45RO T細(xì)胞可以增殖并生成IL-2，而幼稚的T細(xì)胞需要 強(qiáng)的CD3-TCR刺激以實(shí)現(xiàn)這些功能。記憶T細(xì)胞的生成對(duì)于感染和接種疫苗 之后誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答而言是重要的。
先天的細(xì)胞免疫系統(tǒng)也受益生菌的MA的影響。己經(jīng)被證實(shí)了，在mA丄. 戸raco^'(副干酪乳酸桿菌)之后，自然殺傷T (NKT)細(xì)胞群擴(kuò)大。NKT細(xì) 胞構(gòu)成一個(gè)共皿NK細(xì)胞iH己CD56和T細(xì)胞標(biāo)記CD3-T細(xì)胞受體復(fù)^"物的 淋巴細(xì)胞亞群。對(duì)人和小鼠的研究均證實(shí)了 NKT細(xì)胞在自身免疫性疾病的調(diào)節(jié) 中扮演了重要的角色，例如多發(fā)性硬化、I型糖尿病、以及系統(tǒng)性紅斑狼搭。 NKT細(xì)胞還產(chǎn)^t拋中瘤和病毒感染的細(xì)胞的效應(yīng)功能。因此，NKT細(xì)胞的功 能多效(pleotropic)。評(píng)價(jià)了益生菌免疫效應(yīng)的其他臨床研究顯示了攝入丄. ^amwoms /^VW7和S^foZ acte 7'Mm /acte HN019加強(qiáng)了 K562細(xì)胞的NK (包 括NKT)細(xì)胞腫瘤殺傷活性。該研究中，ffiil其它人證實(shí)了以下觀察結(jié)果，多 形核細(xì)胞的吞噬活性在攝入不同的乳酸桿菌之后有所增長(zhǎng)。在本研究中觀測(cè)到 的對(duì)不同的免疫參數(shù)的影響結(jié)果是人們可能推測(cè)出細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NKT細(xì)胞
擴(kuò)增的同時(shí)歡活指向?qū)共《靖腥竞?劍中瘤的加強(qiáng)的免疫防御。體夕R開(kāi)究發(fā)現(xiàn)，
乳酸桿菌誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-12和IL-18,支持了^AS些細(xì)菌刺激細(xì)胞介導(dǎo) 活性的理論。
依照本發(fā)明，得到攝入丄.； /朋ton/m (胚芽乳酸桿菌)和丄.評(píng)raco^'(副 干酪乳酸桿菌)對(duì)特異性和先天細(xì)胞免錢(qián)統(tǒng)有大的影響的結(jié)論。然而，這里 證實(shí)的免疫功能的增長(zhǎng)目前難于與被證明對(duì)人體有健康益處相關(guān)聯(lián)。為了解決 這一特殊的問(wèn)題，需要對(duì)患有例如病毒感染劍中瘤的個(gè)體完成進(jìn)一步的臨床試 驗(yàn)。在這樣的研究中，對(duì)分別會(huì)^丄./7/朋toram (胚芽乳酸桿菌)和丄.; araca^ (畐扦酪乳酸桿菌)或組合纟好進(jìn)行比較將是特另憾興趣的。
實(shí)施例2
該實(shí)施例的目的是為了研鄉(xiāng)過(guò)更長(zhǎng)的時(shí)間纟好相同種的乳酸桿菌，與按 ",一個(gè)個(gè)的給予幾種乳酸桿菌(不同種)相比較，對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。
志愿者被纟好凍干菌的粉劑14或35天。作為革蘭氏陽(yáng)性菌的益生菌胚芽 乳酸桿菌299v被單3蟲(chóng)4柳或與L rhamnosus， L. fermentum， L. paracasei禾口 L. gasseri ^^f^ffi。纟^ Psedomonaslundensis，作為革蘭氏陰性菌。
下列組被研究
1) 胚芽乳酸桿菌35天
2) L, plantarum7天，L. rhamnosus 7天，L fermentum 7天，L. paracasei 7天，Lgassen7天。總共35天。(換頓序)
3 ) L. plantarum、 L. rhamnosus、 L. fermentum、 L. paracasei、 L. gasseri混 合物，總共14天
4) L rhamnosus 14天
5) L. fermentum 14天
6) L paracasei 14天
7) L gasseri 14天
8) Pseudomonas lundensis 14天 對(duì)照組1)安慰劑35天 對(duì)照組2)安慰劑14天
在0天，14天和35天取血樣。按照上面的i力驗(yàn)l說(shuō)明的，iBl流式細(xì)胞術(shù) 確定每個(gè)小組的表達(dá)大量CD25的輔助T細(xì)胞(CD4+)的量。
結(jié)果
在14天，有CD4+CD25++ T細(xì)胞在按順^A五種不同的乳酸桿M株 的個(gè)體中擴(kuò)增的邊際顯著性(borderline significance)。 討論
已經(jīng)表明皿高密度的CD25分子(0)4+€025++)的T輔助細(xì)胞(CD4+)， 對(duì)提供對(duì)抗自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)和炎性腸疾病的保護(hù)是重要的。發(fā)現(xiàn)這 些細(xì)胞在按順序攝入不同的乳酸桿菌之后被擴(kuò)增，表明攝入這些^1會(huì)樹(shù)有發(fā) RhM疾病的風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體有益。
實(shí)驗(yàn)3
本研究的目的是研究攝入以?xún)龈尚瘟δ苁称樊a(chǎn)品形式的乳酸菌至少3個(gè) 月是否會(huì)影響普通感冒(commoncold)的癥狀的嚴(yán)重度和發(fā)病率以及持續(xù)時(shí)間。
重要的是，這是在人體體內(nèi)進(jìn)4亍的，因?yàn)椴还苁求w外研究還是動(dòng)物石開(kāi)究都 不能反映給予人體時(shí)的有效程度。在培養(yǎng)之后直接給予時(shí)，這些菌在腸中定居 的能力在早期研究中已經(jīng)被記載。
因此，目標(biāo)是研究攝入胚芽乳酸桿菌299v (DSM9843)和副干酪乳酸桿菌 8700: 2 (DSM13434) (lxl09cfb/d)的混合物是否會(huì)減少患普通感冒的風(fēng)險(xiǎn)。
該研究持續(xù)時(shí)間為90天，且500個(gè)人將參加該項(xiàng)研究。250個(gè)vM娥受活 性產(chǎn)品，250人將被纟好安慰劑。
研究將是隨機(jī)的，雙盲的且安慰齊樹(shù)照的，有兩個(gè)平行組。
淘汰標(biāo)準(zhǔn)如下已知對(duì)制劑中包含的任何成分不耐受或有變態(tài)反應(yīng)的；變 態(tài)反應(yīng)醫(yī)學(xué)治療的；嚴(yán)重的胃腸道病癥正在治療的；懷孕或哺乳的；近12個(gè)月 內(nèi)已接種流行性感冒疫苗的；以及吸煙者。
提供的益生衝低壓凍干的胚芽乳酸桿菌299v和副干酪乳酸桿菌8700: 2。
蔗糖、麥芽糊精和水解明膠作為抗凍劑被加入。劑量為每日攝入lg凍干的乳酸 桿菌(近似lxl()9db/天)。與早餐配合攝取。
該產(chǎn)品將由Probi AB， Lund， Sweden生產(chǎn)、包裝并貼標(biāo)。產(chǎn)品的質(zhì)量也 由ProbiAB檢查。每個(gè)小藥囊(sachet)將用研究的名字，最佳日期(the best by date),怎樣儲(chǔ)藏的，制造者的名字，調(diào)查負(fù)責(zé)人的名字和*他的電話(huà)號(hào)碼標(biāo)記。 除了Jl^信息之外，將標(biāo)示受試者的號(hào)碼加到二級(jí)包裝上。對(duì)溶解和服用的詳 細(xì)說(shuō)明將放入二級(jí)包裝。產(chǎn)品將以小藥囊的形式提供。
從一14^104天，受試者可以不攝入包含益生菌的產(chǎn)品。受試者在研究 時(shí)期將被提供一個(gè)不允i^MA的益生菌產(chǎn)品列表。
糞便樣品在l天(在MA研究產(chǎn)品之前)，15天(在MA^后)，和104天 (在MA^后)上交。樣品應(yīng)該在上頓于分析之前不艦18小時(shí)內(nèi)收集入兩 根管子中，且在這個(gè)期間內(nèi)儲(chǔ)藏在冰箱中。樣品將用于分析乳酸桿菌。
血樣于第1天和第15天提取。樣品將用于分析CD4+和CD8+。
考慮到實(shí)驗(yàn)1和2，可以期望，月艮用益生菌混合物的個(gè)體與安慰劑組相比較， 將看到對(duì)抗普通感冒的更強(qiáng)的保護(hù)。
權(quán)利要求
1. 至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株用于制備用于治療和/或預(yù)防病毒感染的藥物組合物的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述的至少一種乳酸桿菌的菌株選自由胚 芽乳酸桿菌(丄flctoZ aa7/w^ / /朋ton/附)、鼠李糖乳酸桿菌(Z/ ctoZ)ac///^ /^amm"cmtf)、發(fā)酵孚L酸桿菌(丄actoZ^a7/ tf T^wewftz/w)、畐"干酪乳酸桿菌 (丄acto/wo7/^/ aracoye/)禾口力口氏乳酸桿菌(丄actoZ acz7/usgasmen')纟且成的組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述的胚芽乳酸桿菌選自由胚芽乳酸桿菌 299， DSM6595，胚芽乳酸桿菌299v， DSM9843， 胚芽乳酸桿菌HEAL9， DSM 15312，胚芽乳酸桿菌HEAL 19， DSM 15313，和胚芽乳酸桿菌HEAL 99， DSM 15316組成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述的副干酪乳酸桿菌菌株選自由副干酪 孚L酸桿菌8700:2， DSM 13434，禾n副干酪乳酸桿菌02A， DSM13432纟賊的 組。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其中所述的加氏乳酸桿菌選自加氏乳酸桿菌 VPG44， DSM16737。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的用途，其中至少4頓兩種益生菌菌株。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述的至少兩種菌株柳頓序或同時(shí)給藥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的用途，其中所述的病毒感染是由選自由單 純性皰疹I(lǐng)病毒、單純性皰疹I(lǐng)I病毒、帶狀皰疹病毒、普通感冒病毒、鼻病毒、 腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸病毒和冠纟犬病毒組成的組的病毒引 起的。
9. 根據(jù)1X利要求1-8中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物組合物是液體制劑或 者固體制劑。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述固體制劑選自由片劑，含片，糖果， 咀嚼片，口香糖，膠囊，小藥囊，粉劑，顆粒劑，包衣微粒和包衣片、腸包衣 片和J交囊，以及皿和薄膜組成的組。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述液體制劑選自由口服溶液，溫懸液， 乳液和糖漿組成的組。 12. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述的組合物包括載體材料。13. 根據(jù)權(quán)利要求l-9中任一項(xiàng)的用途，其中所述的藥物組合物是藥用食品、 功會(huì)搶品、食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)品或食物制品。14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13的用途，其中所述載##料^^1的選自由燕麥粥、 乳酸發(fā)酵食品、抗性淀粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖S^七蛋白組成 的組。15. 根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其中所述食物制品選自由飲料、酸乳酪、果 汁、冰淇淋、面包、餅干、谷類(lèi)、健康棒和糊組成的組。16. 根據(jù)l^利要求1-15中{壬一項(xiàng)的用途，其中所述的^菌株在所述組合 物中以約lxl()6至約lx1014 CFU，優(yōu)選自約lxl()8至約lx1012，且更優(yōu)選自約 1xl(f至約lxi011的量存在。17. —種治療和/或預(yù)防病毒感染的方法，其中將至少一種選自乳酸桿菌的 益生菌菌株舒?zhèn)€體。18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述的益生^m株選自由胚芽乳酸桿菌、 鼠李糖乳酸桿菌、發(fā)^IL酸桿菌、副干酪乳酸桿菌和加氏乳酸桿菌組成的組， 并被舒?zhèn)€體。19. 根據(jù)豐又利要求17或18的方法，其中至少^^兩種益生菌菌株。20. 根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述的菌株l,或同時(shí)被給藥。21. 根據(jù)權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述的病毒感染是由選自由 單純性皰疹I(lǐng)病毒、單純性皰疹I(lǐng)I病毒、帶狀皰疹病毒、普通感冒病毒、鼻病 毒、腺病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸病毒和冠狀病毒組成的組的病 毒引起的。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種選自乳酸桿菌的益生菌菌株在制備用于治療和/或預(yù)防病毒感染的藥物組合物中的用途。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101384269SQ200680036802
公開(kāi)日2009年3月11日 申請(qǐng)日期2006年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月6日
發(fā)明者A·伯格倫, A·沃爾德, C·拉斯克, J·阿倫法爾 申請(qǐng)人:普羅比公司