專(zhuān)利名稱(chēng)：應(yīng)用levovirin 治療病毒感染的制作方法
本申請(qǐng)要求1999年12月30日申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)第09/471,513號(hào)的權(quán)益，后一申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第60/164,366號(hào)和第60/164,365號(hào)的權(quán)益，所述專(zhuān)利申請(qǐng)內(nèi)容均通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。
在細(xì)胞因子相關(guān)性治療方法中，給予細(xì)胞因子調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡向Th1型應(yīng)答或Th2型應(yīng)答方向轉(zhuǎn)移。例如，Knight等人提出，促進(jìn)Th1細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-12(白細(xì)胞介素-12)可用于治療愛(ài)滋病，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)，對(duì)鼠艾滋病毒或Rauscher白血病病毒(RLV)感染的小鼠給予IL-12，有效恢復(fù)細(xì)胞介導(dǎo)性免疫[Knight，S.C.和Patterson.S.，Annu.Rev.Immunol.1994.15593-615]。再例如，Gracie，J.A.等人證明，給予小鼠IL-18對(duì)產(chǎn)生Th1型應(yīng)答具有關(guān)鍵性的多效活性。[Gracie等人，J Clin Invest 1999 Nov 15；104(10)1393-1401]。雖然給予細(xì)胞因子一般導(dǎo)致目標(biāo)細(xì)胞因子相對(duì)特異性增加，但是長(zhǎng)期給予細(xì)胞因子可能出現(xiàn)各種問(wèn)題。例如，重組細(xì)胞因子的生產(chǎn)相對(duì)昂貴，而從天然材料中分離非重組細(xì)胞因子一般較難，因?yàn)樵谔烊徊牧现屑?xì)胞因子的濃度非常低。更大的問(wèn)題在于細(xì)胞因子的制品通常需要純度非常高以避免重復(fù)給藥引起過(guò)敏反應(yīng)。而且，根據(jù)細(xì)胞因子性質(zhì)，其在患者體的耐受性可能較差。
在非細(xì)胞因子相關(guān)性方法中，應(yīng)用細(xì)胞因子以外的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)調(diào)節(jié)Th1型應(yīng)答和Th2型應(yīng)答之間的平衡。例如，SprietsmaJ.E.[Sprietsma J.E；Med Hypotheses 1999 Jul；53(1)6-16]提出，鋅離子(Zn++)和一氧化氮(NO)與谷胱甘肽(GSH)及其氧化型GSSG一起，可能有助于調(diào)節(jié)對(duì)抗原的免疫反應(yīng)。該作者還詳細(xì)報(bào)道了Zn++、NO和/或GSH的不足使Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向Th2，而Zn++、NO和/或GSH的補(bǔ)給可以使Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向Th1。給予Zn++或GSH/GSSG特別有利，因?yàn)檫@些物質(zhì)即使在高濃度時(shí)也是無(wú)毒的，而且生產(chǎn)成本低廉。此外，Zn++和GSH/GSSG制品可以口服方式給予，因此大大降低了過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，特別是當(dāng)所述制品不是超純時(shí)。但是，給予Zn++和/或GSH/GSSG似乎僅有利于從Th2為主的狀態(tài)恢復(fù)Th1/Th2平衡，而給予Zn++和/或GSH/GSSG是否可以從正常的Th1/Th2平衡增強(qiáng)Th1型應(yīng)答還不清楚。
再例如，通過(guò)引用結(jié)合到本文的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)09/156.646中論述了一種方法，發(fā)明者利用核苷類(lèi)似物病毒唑(1-(5-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)調(diào)節(jié)Th1/Th2型應(yīng)答的平衡。使用病毒唑特別有利于病毒感染的治療，因?yàn)椴《具虿粌H調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th1型應(yīng)答，還可以作為病毒復(fù)制的抑制劑。例如，病毒唑已被成功應(yīng)用于丙型肝炎的治療。這一效果部分是因?yàn)榭共《咀饔?，部分是因?yàn)檎{(diào)節(jié)細(xì)胞因子平衡。
盡管病毒唑在病毒數(shù)量和免疫狀態(tài)方面表現(xiàn)出令人滿(mǎn)意的效果，但是長(zhǎng)期給予較高劑量的病毒唑常常伴有若干副作用，包括白細(xì)胞減少和溶血性貧血。為了減少副作用的發(fā)生或其嚴(yán)重性，已有介紹同時(shí)給予病毒唑和IFNα-2B[Reichert，O.等，1998；Lancet 35183-87]。但是，同時(shí)給予病毒唑和IFNα-2B大大增加治療費(fèi)用。而且，長(zhǎng)期給予IFNα-2B增加了由其引起新的副作用的風(fēng)險(xiǎn)。
盡管在病毒性疾病的治療中應(yīng)用病毒唑較成功，但病毒唑的使用因?yàn)楦鞣N副作用的產(chǎn)生仍然存在問(wèn)題。所以，需要提供改進(jìn)的方法和組合物來(lái)調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡以治療病毒感染，而且其副作用較輕或者無(wú)毒性副作用。
本發(fā)明主題的一個(gè)方面是，給予LevovirinTM增強(qiáng)患者Th1型應(yīng)答(相對(duì)于Th2型應(yīng)答)，特別設(shè)想了Th1型應(yīng)答絕對(duì)增加。本發(fā)明主題的再一方面是，體內(nèi)給予LevovirinTM，優(yōu)選靜脈注射給予或者口服給予，其中LevovirinTM的優(yōu)選劑量為0.1mg/kg-1.0mg/kg。
根據(jù)以下詳細(xì)介紹的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案和附圖
可以更清楚了解本發(fā)明的各種目的、特性、方面和優(yōu)點(diǎn)，附圖中的相同數(shù)字代表相同組分。
圖2圖示合成LevovirinTM的合成方案。
圖3A-C圖示LevovirinTM和病毒唑?qū)h1型應(yīng)答各組分的各種生物效應(yīng)。
圖4圖示與LevovirinTM和病毒唑治療有關(guān)的伴刀豆球蛋白A注射小鼠的血清ALT水平。
發(fā)明詳述本文使用的術(shù)語(yǔ)“病毒感染”是指任何階段的病毒感染，包括潛伏期、休止期或靜止期、急性期以及抗病毒免疫產(chǎn)生及維持期。因此，術(shù)語(yǔ)“治療”包括產(chǎn)生或恢復(fù)患者免疫系統(tǒng)免疫力的各個(gè)方面，以及減弱或抑制病毒復(fù)制的各個(gè)方面。
此外，本文使用的淋巴因子是輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子亞群，一般認(rèn)為可分為兩個(gè)亞類(lèi)，Th1和Th2。Th1細(xì)胞(更新的說(shuō)法是1型細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子(TNFα)和干擾素γ(IFNγ)，主要負(fù)責(zé)諸如遲發(fā)型超敏反應(yīng)和抗病毒免疫的細(xì)胞介導(dǎo)免疫。相反，Th2細(xì)胞(更新的說(shuō)法是2型細(xì)胞)產(chǎn)生白細(xì)胞介素IL4、IL5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要與促進(jìn)體液免疫應(yīng)答有關(guān)，例如可見(jiàn)于過(guò)敏原反應(yīng)的應(yīng)答，例如IgE和IgG4抗體同種型轉(zhuǎn)換(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7145-173)。
本文進(jìn)一步使用的術(shù)語(yǔ)Th1和Th2“應(yīng)答”包括Th1和Th2淋巴因子分別誘導(dǎo)產(chǎn)生的全部效應(yīng)。所述應(yīng)答尤其還包括相應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生增加、相應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖增強(qiáng)，以及其他與細(xì)胞因子產(chǎn)生增加有關(guān)的作用，包括運(yùn)動(dòng)作用。Th1型應(yīng)答的一般特征為IL-2、TNF-α和IFN-γ增加，而Th2型應(yīng)答的典型特征為IL4、IL-5、IL-6和IL-10增加。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，CD4淋巴細(xì)胞數(shù)約500細(xì)胞/微升的HIV感染患者，接受30天的治療，每天注射一次總劑量為0.5mg/kg體重的LevovirinTM水溶液。
本發(fā)明主題的可選擇方面是，所述HIV感染不需要限于約500細(xì)胞/微升的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)，而是也可以包括較低的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)，包括CD4淋巴細(xì)胞數(shù)500-300個(gè)、300-150個(gè)和150個(gè)以下。相似地，較高的CD4淋巴細(xì)胞數(shù)(即＞500個(gè))也列入考慮中。還應(yīng)進(jìn)一步了解到，除了病毒效價(jià)和CD4淋巴細(xì)胞數(shù)外的各種臨床標(biāo)記也可能是合適的，包括檢測(cè)所述HIV病毒存在的直接和間接試驗(yàn)。例如，直接試驗(yàn)包括PBMC和血漿HIV的定量培養(yǎng)、定性和定量PCR方法等。間接試驗(yàn)包括定性和定量ELISA方法等。
關(guān)于所述病毒感染的病毒類(lèi)型，設(shè)想所述病毒感染的治療不是只針對(duì)某一特定類(lèi)型或某一亞型的HIV病毒，還應(yīng)了解到除了HIV外的各種病毒也列入考慮中。一般考慮的選擇病毒感染包括可用LevovirinTM的D-異構(gòu)體病毒唑治療的病毒感染。特別考慮的選擇病毒感染包括HCV感染和HBV感染。
本發(fā)明主題的其它選擇方面是，LevovirinTM的給藥方式不必限于連續(xù)30天每日注射一次，而可以包括選擇給藥頻率和途徑。例如，在需要給予較大劑量LevovirinTM時(shí)，可以考慮每天注射二至四或者更多次。相似地，在需要長(zhǎng)時(shí)期保持LevovirinTM高血漿濃度時(shí)，可以考慮持續(xù)給藥。例如，更長(zhǎng)期給藥可以包括使用連續(xù)輸注、滲透泵或持續(xù)釋放植入物。還應(yīng)進(jìn)一步了解到，所述給藥途徑不只限于注射，而合適的給藥途徑包括口服、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、肺部給藥等途徑。因此，可選擇的LevovirinTM制劑形式可以包括片劑、糖漿、凝膠、氣霧劑等。還可以考慮體外給予LevovirinTM。例如，可以把預(yù)定量的全血或全血的分離部分與LevovirinTM體外預(yù)溫育，以促進(jìn)或產(chǎn)生針對(duì)免疫原性刺激的免疫應(yīng)答。
關(guān)于LevovirinTM的劑量，還設(shè)想了各種合適選擇劑量，包括0.5mg/kg-0.1mg/kg或更低劑量，也包括0.5mg/kg-1.0mg/kg或更高劑量。一般來(lái)說(shuō)，合適的劑量取決于多項(xiàng)參數(shù)，包括病毒感染類(lèi)型、病毒感染階段、需要的LevovirinTM血漿濃度、治療時(shí)間等。例如，一些病毒感染較低血漿濃度LevovirinTM就可以獲得治療成功，而其他病毒感染可能需要較高的劑量。
本發(fā)明主題更進(jìn)一步的選擇方面是，LevovirinTM可以與另外的藥用活性物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用而有助于治療所述病毒感染?？紤]另外的藥用活性物質(zhì)包括抗病毒劑和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)。例如，抗病毒劑包括蛋白酶抑制劑、或核苷酸和核苷類(lèi)似物，而免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)可以包括細(xì)胞因子。
盡管不希望受任何特定理論的限制，但是認(rèn)為給予LevovirinTM與患者體內(nèi)Th1型應(yīng)答相對(duì)于Th2型應(yīng)答的增加有關(guān)，特別認(rèn)為T(mén)h1型應(yīng)答相對(duì)于Th2型應(yīng)答的增加是因?yàn)門(mén)h1型應(yīng)答絕對(duì)增加。所述細(xì)胞因子水平因此可能個(gè)別增加或者全面增加。例如，預(yù)計(jì)對(duì)活化人PBMC給予LevovirinTM可能導(dǎo)致IL-2平均峰值水平相對(duì)于活化對(duì)照水平增加至少70％(重量)。另一方面，預(yù)計(jì)對(duì)活化人PBMC給予LevovirinTM可能導(dǎo)致IFN-γ平均峰值水平相對(duì)于活化對(duì)照水平增加至少20％(重量)，或者TNF-α平均峰值水平相對(duì)于活化對(duì)照水平增加至少50％(重量)(另見(jiàn)圖3A-C)。再例如，預(yù)計(jì)Th1型應(yīng)答增強(qiáng)可能包括IL-2、IFN-γ和TNF-α的平均峰值分別增加(相對(duì)于活化對(duì)照水平)42％(重量)、125％(重量)和72％(重量)。
特別應(yīng)該了解的是，盡管病毒唑與LevovirinTM在可治療病毒感染類(lèi)型上多少存在重疊，但是LevovirinTM的毒性顯著降低。例如，經(jīng)口給予小鼠180mg/kg劑量的病毒唑，持續(xù)四周，產(chǎn)生顯著的溶血性貧血和白細(xì)胞減少癥，而LevovirinTM沒(méi)有產(chǎn)生任何可觀(guān)察到的臨床病狀。而且，特別認(rèn)為，LevovirinTM治療病毒性疾病主要基于調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡轉(zhuǎn)向Th1為主的應(yīng)答，而主要治療基礎(chǔ)不在于直接的抗病毒作用。本文使用的術(shù)語(yǔ)“直接抗病毒”作用或活性是指藥物對(duì)病毒裝配或復(fù)制的直接作用或活性。相反，認(rèn)為由免疫系統(tǒng)一個(gè)或多個(gè)組分至少部分介導(dǎo)引起的病毒活性或復(fù)制的減弱不是“直接抗病毒”作用或活性。同樣，還應(yīng)了解到，根據(jù)本發(fā)明主題進(jìn)行治療時(shí)的Th2型應(yīng)答相對(duì)減少可能對(duì)與Th2型應(yīng)答增加有關(guān)的疾病特別有利(例如HCV感染)。
實(shí)施例1LevovirinTM的合成1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖(1)于室溫在氬氣環(huán)境中通過(guò)注射器在15分鐘內(nèi)將新鮮配制的無(wú)水甲醇HCl(40ml，在0℃下在甲醇中鼓泡通入無(wú)水HCL氣體至總重增加4g制得)加入至L-核糖(50.0g，333.33mmol)的無(wú)水甲醇(500ml)攪拌溶液中。加入甲醇HCl后，于室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物3-4小時(shí)。然后加入無(wú)水吡啶(100ml)，并在高真空下以低于40℃的溫度蒸發(fā)至干。再加入無(wú)水吡啶(100ml)，重復(fù)這一過(guò)程。該殘余物以無(wú)水吡啶(250ml)溶解后，在氬氣環(huán)境中冰浴降溫至0℃。通過(guò)滴液漏斗在15分鐘內(nèi)將乙酸酐(100ml)加入至這一冷卻的攪拌溶液中。在加入乙酸酐后，于室溫除濕環(huán)境下攪拌該反應(yīng)混合物24小時(shí)。然后將該反應(yīng)混合物蒸發(fā)至無(wú)水。所得殘余物分配在乙酸乙酯(400ml)和水(400ml)之間，然后在乙酸乙酯中萃取。將水層用乙酸乙酯(100ml)重新萃取。用水(400ml)、飽和NaHCO3溶液(2×300ml)、水(300ml)和鹽水(200ml)清洗混合的乙酸乙酯萃取液。該有機(jī)萃取物經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥后，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)至無(wú)水。該殘余物在高真空下用無(wú)水甲苯(2×150ml)共蒸發(fā)。所得無(wú)水油狀殘余物(92g，95％)直接在以下反應(yīng)中的使用，而不需要進(jìn)一步表征。
將上述反應(yīng)中得到的糖漿(92g)溶于冰醋酸(300ml)中，并在室溫下用乙酸酐(75ml)處理。將所述溶液在氬氣環(huán)境中冰浴降溫至0-5℃。在15分鐘內(nèi)緩慢加入濃硫酸(21ml)。于室溫?cái)嚢柙摲磻?yīng)混合物14小時(shí)，然后傾倒至碎冰(500g)上，攪拌直至冰融化。加入水(500ml)并用三氯甲烷(CHCl3)(2×300ml)萃取。用水(3×400ml)、飽和NaHCO3溶液(2×300ml)、水(200ml)和鹽水(200ml)清洗所得的三氯甲烷萃取液。清洗后的有機(jī)萃取液經(jīng)無(wú)水MgSO4干燥后，過(guò)濾、蒸發(fā)無(wú)水得到油狀殘余物(99g)。該殘余物用無(wú)水甲苯(200ml)共蒸發(fā)，然后溶于乙醚(200ml)中，將之在10℃下冷卻一天后得到無(wú)色晶體。用正己烷∶乙醚(2∶1，50ml)過(guò)濾、清洗該結(jié)晶固體，然后干燥得到60.5g產(chǎn)物。
甲基-1-(2，3，5-三-O-乙?；?β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(3)和甲基-1-(2，3，5-三-O-乙?；?β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-5-甲酸酯(4)將甲基-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(25.4g，200mmol)、1，2，3，5-四-O-乙?；?β-L-呋喃核糖(63.66g，200mmol)和二(對(duì)硝基苯基)磷酸酯(1g)的混合物放入一個(gè)RB燒瓶(500ml)中。將該燒瓶放入預(yù)加熱至165-175℃的油浴中，在水抽真空下攪拌25分鐘。通過(guò)置于抽吸器與RB燒瓶之間的冰冷收集器收集置換出來(lái)的醋酸。然后將燒瓶從油浴中拿出，冷卻。當(dāng)燒瓶溫度達(dá)到約60-70℃時(shí)，加入乙酸乙酯(300ml)和飽和NaHCO3(150ml)溶液，在乙酸乙酯中萃取。將水層用乙酸乙酯(200ml)重新萃取。先后用飽和NaHCO3溶液(300ml)、水(300ml)和鹽水(200ml)清洗混合的乙酸乙酯萃取液。該有機(jī)萃取物經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥后，過(guò)濾，將濾液蒸發(fā)至無(wú)水。將殘余物溶于乙醇(100ml)，并用甲醇(60ml)稀釋?zhuān)缓髮⒅?0℃下冷卻12小時(shí)后得到無(wú)色晶體。用最低溫度的乙醇(20ml)過(guò)濾、清洗該固體，然后在高真空下用固體NaOH干燥得到60g(78％)的濾液。將所述濾液蒸發(fā)至無(wú)水并以ChCl3→乙酸乙酯(9∶1)作為洗脫液從硅膠柱上提純。從所述濾液中分離出兩種產(chǎn)物流速較快的產(chǎn)物8.5g(11％)和流速較慢的產(chǎn)物5g(6.5％)。流速較慢的產(chǎn)物相當(dāng)于結(jié)晶產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)流速較快的產(chǎn)物即化合物(4)，是以泡沫形式獲得的?；衔?3)的產(chǎn)量是65g(84％)。
1-β-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(5)將甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(62g，161mmol)置于一個(gè)鋼瓶中并在0℃下用新鮮制備的甲醇氨(350ml，通過(guò)在0℃下向無(wú)水甲醇通入無(wú)水HCl氣體直至飽和制得)處理。關(guān)閉鋼瓶并在室溫下?lián)u動(dòng)18小時(shí)。然后將鋼瓶冷卻至0℃，打開(kāi)后將內(nèi)容物蒸發(fā)至無(wú)水。所述殘余物用無(wú)水乙醇(100ml)處理并蒸發(fā)至無(wú)水。所得的殘余物用丙酮研磨得到固體產(chǎn)物，該固體產(chǎn)物用丙酮過(guò)濾和清洗。在室溫下將所得固體產(chǎn)物干燥過(guò)夜，然后溶于乙醇(600ml)和水(10ml)的熱混合液中。通過(guò)在加熱板上加熱和攪拌后所述乙醇溶液的體積減至150ml。將所述熱的乙醇溶液冷卻后得到無(wú)色晶體，將其用丙酮過(guò)濾、清洗并真空干燥。將過(guò)濾液進(jìn)一步濃縮得到另外的物質(zhì)。總產(chǎn)量為35g(89％)。
實(shí)施例2測(cè)定LevovirinTM和病毒唑作用的細(xì)胞因子類(lèi)型通過(guò)密度梯度離心后，用Lymphokwik(One Lambda，Canoga Park，CA)富集T細(xì)胞從健康捐血者血液中分離外周血單核細(xì)胞。通過(guò)塑膠粘附去除污染的單核細(xì)胞。純化的T細(xì)胞包括＞99％的CD2+、＜1％的HLA-DR+和＜5％的CD25+，將之保存于RPMI-AP5(含5％自體血漿、1％谷氨酰胺、1％青霉素/鏈霉素和0.05％2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基)中。為了檢測(cè)細(xì)胞因子蛋白的水平，通過(guò)加入80ng的葡萄球菌腸毒素B(SEB，Sigma，St.Louis，MI)活化T細(xì)胞(0.2ml含0.2*106個(gè)細(xì)胞)，將之在含有0-10μM LevovirinTM或病毒唑的96孔板上于37℃培養(yǎng)48小時(shí)。活化后，分析上清液中細(xì)胞源性細(xì)胞因子的產(chǎn)量。使用專(zhuān)用于IL-2、IFN-γ和TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)試劑盒(Biosource，Camarillo，CA)檢測(cè)細(xì)胞因子。所有的ELISA結(jié)果都以pg/ml表示。數(shù)據(jù)以活化對(duì)照的百分?jǐn)?shù)表示，這一百分?jǐn)?shù)是以L(fǎng)evovirinTM或病毒唑存在時(shí)活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子水平與未經(jīng)處理的活化T細(xì)胞的細(xì)胞因子水平之比乘以100％。因此，細(xì)胞因子0效應(yīng)應(yīng)為100％活化對(duì)照值。圖3A-C圖示經(jīng)LevovirinTM或病毒唑處理的T細(xì)胞和各種Th1細(xì)胞因子之間的劑量反應(yīng)相似。表1顯示病毒唑和LevovirinTM對(duì)SEB激活的T細(xì)胞表達(dá)Th1細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的作用。目前的數(shù)據(jù)清楚地表明，LevovirinTM具有顯著的治療以1型細(xì)胞因子占主導(dǎo)地位疾病的潛力。治療方案 IL-2 IFN-γ TNF-αSEB 100 100 100SEB+病毒唑 143±18 131±6 124±4SEB+LevovirinTM131±12 122±3 144±7表1表中細(xì)胞因子的所有數(shù)據(jù)都是以活化對(duì)照的平均百分?jǐn)?shù)(+/-標(biāo)準(zhǔn)差)表示的。SEB誘導(dǎo)的1型細(xì)胞因子分泌的絕對(duì)水平(pg/ml+/-標(biāo)準(zhǔn)差)如下IL-2是640+/-36，IFN-γ是462+/-37，而TNF-α是223+/-27。所有細(xì)胞因子的靜息水平都＜30pg/ml。
實(shí)施例3直接抗病毒活性和細(xì)胞毒性試驗(yàn)按Huffman，J.H.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，875-83和Barnard，D.L.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，8223-223所述方法，體外測(cè)試LevovirinTM和病毒唑?qū)α鞲胁《続和B、副流感病毒1和2和呼吸道合胞病毒的直接抗病毒活性。國(guó)家癌癥研究所(the National Cancer Institute)使用設(shè)計(jì)用于檢測(cè)在病毒復(fù)制周期所有階段起作用的藥物的方法[Weislow，O.W.等人，J.Natl..Cancer Inst.1989，81577-586]對(duì)抗人類(lèi)免疫缺陷病毒的活性進(jìn)行了評(píng)估。采用Marion等人，Hepatology 1987，7724-731所述方法，監(jiān)測(cè)抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。病毒唑的抗HIV活性和細(xì)胞毒性可見(jiàn)以前的資料[McCormick，J.B.，Lancet，1998.II1367-1369]。
表2顯示LevovirinTM和病毒唑在各種病毒感染細(xì)胞中的直接抗病毒活性和細(xì)胞毒性的比較?；衔? 活性HB HIV INFL.A INFL.B PARA1PARA3 RSVLevovirinTM直接抗病毒活性 ＞100 ＞600 ＞200 ＞200 ＞1000 ＞1000 ＞1000細(xì)胞毒性＞100 ＞600 ＞200 ＞200 ＞1000 ＞1000 ＞1000病毒唑 直接抗病毒活性 ＞100 40 6.1 1.9 40 45細(xì)胞毒性 53＞40 56 ＞100 ＞1000 480 100表2病毒的測(cè)試范圍包括乙型肝炎病毒(HBV)、人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒(INFL)A和B、副流感病毒(PARA)1和3，以及呼吸道合胞病毒(RSV)?？共《净钚?EC50)或細(xì)胞毒性(CC50)以μM表示。
實(shí)施例4LevovirinTM在伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝炎中的抗炎活性給BALB/c小鼠(每組6只)腹膜內(nèi)注射單劑量20μg(1mg/kg)的LevovirinTM或病毒唑或者200μl PBS，1小時(shí)后通過(guò)尾靜脈注射0.3mg的伴刀豆球蛋白A(Con A，Calbiochem，San Diego，CA)。24小時(shí)后用甲氧氟烷麻醉小鼠，然后通過(guò)心臟穿抽取全血。血液凝固獲得血清并將之用于檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。所述血清中的ALT水平通過(guò)一個(gè)酶活試驗(yàn)(Sigma)檢測(cè)，該酶活試驗(yàn)基于對(duì)ALT催化其底物丙氨酸和α-酮戊二酸形成產(chǎn)物(丙酮酸和谷氨酸)的比色測(cè)量。圖4圖示病毒唑或LevovirinTM或PBS作用的血清ALT量。病毒唑和LevovirinTM都可以明顯使Con A誘導(dǎo)的ALT水平由大約1900U/ml降低至969U/ml±192(病毒唑)以及954U/ml±179(LevovirinTM)。
這樣，公開(kāi)了化合物的特定實(shí)施方案和應(yīng)用以及用LevovirinTM治療病毒感染的方法。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該顯而易見(jiàn)的是，除了已經(jīng)講述的之外，還可有許多不偏離本發(fā)明構(gòu)思的改進(jìn)。因此，本發(fā)明主題只受后附的權(quán)利要求書(shū)的限制。而且，解釋說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)時(shí)，所有術(shù)語(yǔ)的解釋都應(yīng)是與上下文一致的最寬泛解釋。尤其是術(shù)語(yǔ)“包含”和“包括”應(yīng)該解釋為是指非獨(dú)有的要素、組分或步驟，即表示所述要素、組分或步驟可以存在或使用或與其他沒(méi)有明確指出的要素、組分或步驟組合。
權(quán)利要求
1.一種治療患者病毒感染的方法，該方法包括給予結(jié)構(gòu)1的化合物；其中結(jié)構(gòu)1是
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒感染選自HIV感染、HCV感染和HBV感染。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟使所述患者體內(nèi)的Th1型應(yīng)答相對(duì)于Th2型應(yīng)答增強(qiáng)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述Th1型應(yīng)答增強(qiáng)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述Th1型應(yīng)答增強(qiáng)包括IL-2的平均峰值相對(duì)于活化對(duì)照水平升高至少70％(重量)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述Th1型應(yīng)答增強(qiáng)包括IFN-γ的平均峰值相對(duì)于活化對(duì)照水平升高至少20％(重量)。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述Th1型應(yīng)答增強(qiáng)包括TNF-α的平均峰值相對(duì)于活化對(duì)照水平升高至少50％(重量)。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述Th1型應(yīng)答增強(qiáng)包括IL-2、IFN-γ和TNF-α的平均峰值相對(duì)于活化對(duì)照水平分別升高42％(重量)、125％(重量)和72％(重量)。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟包括體內(nèi)給藥。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟包括口服給藥。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟包括注射給藥。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述給藥步驟包括給予劑量為0.1-1.0mg/kg體重的所述化合物。
13.一種免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，它為結(jié)構(gòu)1的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑
全文摘要
應(yīng)用治療患者病毒感染的方法給予1－(β－L－呋喃核糖基)－1，2，4－三唑－3－甲酰胺，所述病毒感染包括HIV感染、HCV感染或HBV感染。
文檔編號(hào)A61K31/7056GK1409721SQ00817021
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2000年12月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者R·譚 申請(qǐng)人:里巴藥品公司