專利名稱：含有葡甲胺的蛋白質(zhì)制劑的穩(wěn)定劑及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有氨基糖的一種一一葡甲胺的、使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的藥物 及其應(yīng)用。更具體地說，本發(fā)明涉及含有葡甲胺的、使抗體分子穩(wěn)定的 藥物，以及使抗體分子穩(wěn)定的方法，該方法包含添加葡曱胺的步驟。本 發(fā)明還涉及含有通過葡甲胺而穩(wěn)定化的抗體分子的藥物組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
對(duì)于生物藥品的制劑化，需要的是可使作為藥物使用的蛋白質(zhì)穩(wěn)定 保存的制劑(非專利文獻(xiàn)1)。已知通常的蛋白質(zhì)降解的途徑有可溶性的多聚體的形成或者伴隨 沉淀、不溶物的生成等的蛋白質(zhì)分子的物理性聚集的降解途徑(非專利文 獻(xiàn)2);以及通過水解.脫酰胺反應(yīng)、甲硫氨酸氧化反應(yīng)等的化學(xué)修飾導(dǎo) 致的降解途徑(非專利文獻(xiàn)3)。在開發(fā)蛋白質(zhì)作為藥物時(shí)，必須提供將 上迷兩種降解途徑抑制到最小限度、在保存中不會(huì)發(fā)生其蛋白質(zhì)的生物 學(xué)活性降低的制劑。將上述降解途徑抑制到最小限度的方法是進(jìn)行溶液 pH的最佳化、緩沖液 鹽的種類和濃度、以及穩(wěn)定劑的種類和濃度的 最佳化。已知可作為藥物使用的抗體有全長抗體、片段抗體、小分子抗體、的抗體制劑通;要、求非常高、濃^的制劑，因此制備非常困難(非專利文獻(xiàn) 5)。為此，在緩沖溶液的種類和pH的最佳化之外，人們還對(duì)使抗體穩(wěn) 定進(jìn)行了各種嘗試。例如在WO02/096457(專利文獻(xiàn)l)中公開了含有酸 性成分的抗體高濃度穩(wěn)定制劑，為了使抗體穩(wěn)定，使用MgCl2、 CaCl2 作為添加劑。還已知小分子抗體等容易發(fā)生聚集，穩(wěn)定性非常低(非專利 文獻(xiàn)8、 9),還已知scFv的單體非常容易聚集，在高濃度條件下單體聚 集，形成二聚體(非專利文獻(xiàn)10)。因此，將這些抗體以溶液制劑的形式 開發(fā)藥物時(shí)，使抗體分子在溶液中穩(wěn)定(即抑制聚集)是非常重要的課題。 通常，蛋白質(zhì)通過冷凍干燥，比溶液狀態(tài)更為穩(wěn)定(聚集受到抑制)，專利文獻(xiàn)ll、 12、 13)。有報(bào)道稱在IgG抗體冷凍干燥時(shí)，蔗糖用作 賦形劑很有效(非專利文獻(xiàn)14)。目前葡甲胺是用作X射線造影劑(泛影葡胺)、MRI造影劑(札噴酸葡 甲胺)等，目前尚未見到關(guān)于其可以使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的效果的報(bào)道。非專利文獻(xiàn)l:Nat. Rev. Drug Discov， 2005, 4(4)， 298-306 非專利文獻(xiàn)2:Int. J. Pharm， 2005, 289, 1-30 非專利文獻(xiàn)3:lnt. J. Ph誕1999, 185, 129-188 非專利文獻(xiàn)4:J. Pharm. Sci. 2004, 93(6), 1390-1402 非專利文獻(xiàn)5: Pharmaceutical Research 1994, 11(5), 624—632 非專利文獻(xiàn)6:Clin. Chem. Lab. Med, 2000, 38(8):759-764 非專利文獻(xiàn)7 :Journa) of Immunological Methods, 1U (1988), 17-23 非專利文獻(xiàn)8:FEBS Letters Volume 360， Issue 3 ， 1995, 247-250 非專利文獻(xiàn)9:FEBS Letters, 1995, 441, 458-462 非專利文獻(xiàn)10:J. Mol. Biol. 2002, 320, 107-127 非專利文獻(xiàn)ll:Pharm Biotechnol, 2002, 13, 109-33 非專利文獻(xiàn)12:lnt. J. Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60 非專利文獻(xiàn)13:Pharm. Res. 1997, 14(8), 969-75 非專利文融14:J. Pharm. Sci. 2001， 90(3), 310-21 專利文獻(xiàn)i:WO02/096457發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)上述狀況，其目的在于提供使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法，該方 法包含將作為氨基糖的 一種的葡甲胺添加到蛋白質(zhì)中的步驟。更具體地說，本發(fā)明提供使抗體分子穩(wěn)定的方法，該方法包含將葡 甲胺添加抗體分子中的步驟；或者提供抑制抗體分子聚集的方法。本發(fā) 明的課題還在于提供含有葡甲胺、使抗體分子穩(wěn)定的藥物，或者抑制抗 體分子聚集的藥物。本發(fā)明的目的又在于提供含有由葡甲胺穩(wěn)定的抗體 分子的藥物組合物，該藥物組合物的制備方法，以及含有該藥物組合物 的試劑盒。本發(fā)明人為解決上述課題，對(duì)氨基糖的一種一葡甲胺的抗體穩(wěn)定效杲進(jìn)行了研究。首先，本發(fā)明人使用sc(Fv)2形式的hVB22B sc(Fv)2，研究了葡甲 胺對(duì)聚集反應(yīng)的抑制效果。結(jié)果表明，通過添加葡甲胺，單體的殘留率 大幅提高，可大幅抑制hVB22B的聚集反應(yīng)。通過本研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)穩(wěn) 定性低的小分子抗體添加葡甲胺則可以顯著提高穩(wěn)定性。本研究首次表 明，葡曱胺可用作蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑。接著，對(duì)于葡甲胺對(duì)其它的sc(Fv)2分子以及全長抗體的穩(wěn)定效果 進(jìn)行了研究。結(jié)果表明通過添加葡甲胺，不僅對(duì)sc(Fv)2，對(duì)于全長抗 體的IgG等的抗體分子全體均具有抑制聚集化的效果。與蔗糖相比，葡甲胺對(duì)于抑制聚集物(會(huì)合體)生成的效果在溶液 制劑、冷凍干燥應(yīng)激、凍干制劑中均很明顯。另外，葡甲胺對(duì)于抗體濃 度為100mg/ml這樣非常高濃度的制劑、不管是溶液狀態(tài)還是凍干狀態(tài) 均顯示高的穩(wěn)定化效果。并且表明，通過添加葡曱胺，即使在低溫下或 常溫下長期保存，也可以抑制抗體分子的聚集。即，由本發(fā)明初次發(fā)現(xiàn)了葡曱胺可用作抗體分子的穩(wěn)定劑，本發(fā)明 人由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明更具體的提供以下的[1H21]。 [1]藥物，該藥物含有葡甲胺，可使蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定。 [2]藥物，該藥物含有葡甲胺，可抑制蛋白質(zhì)的聚集。 [3] [1]或[2]的藥物，其中，蛋白質(zhì)是抗體分子。 [4] [3]或[4]的藥物，其中，抗體分子是全長抗體、片段化抗體、小 分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。[5] [1]-[4]中任一項(xiàng)的藥物，該藥物的劑型是凍干制劑。 [6][1]-[5]中任一項(xiàng)的藥物，其中，葡曱胺是其鹽或其衍生物。 [7]使蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加葡甲胺 的步驟。[8]抑制蛋白質(zhì)聚集的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加葡曱胺的步驟。[9] [7]或[8]的方法，該方法是在長期低溫保存條件下，使蛋白質(zhì)長 期穩(wěn)定或抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。[10] [7]或[8]的方法，該方法是在長期常溫保存條件下，使蛋白質(zhì)長 期穩(wěn)定或抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。[n][7]-[io]中任一項(xiàng)的方法，其中，蛋白質(zhì)是抗體分子。[12] [ll]的方法，其中，抗體分子是全長抗體、片段化抗體、小分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。[13] [7]-[12]中任一項(xiàng)的方法，該方法包含在添加葡甲胺的步驟之后 將蛋白質(zhì)冷凍干燥的步驟。[14] [7]-[13]中任一項(xiàng)的方法，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。[15]藥物組合物，該藥物組合物添加了葡甲胺。[16] [15]的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的劑型是凍干 制劑。[17] [15]或[16]的藥物組合物，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。 [18]含有抗體分子的藥物組合物的制備方法，該方法包含向含有抗體的組合物中添加葡甲胺的步驟。[19]含有抗體分子的藥物組合物的制備方法，該方法包含以下(l)和(2)的步驟(1) 將葡甲胺添加到含有抗體的組合物中的步驟；(2) 使(l)的混合物冷凍干燥的步驟。[20] [18]或[19]的藥物組合物的制備方法，其中，抗體分子是全長抗 體、片段化抗體、小分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。 [21][18]-[20]中任一項(xiàng)的制備方法，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。附圖簡述

圖1是表示葡甲胺對(duì)hVB22B的穩(wěn)定化效果的圖。 圖2是表示葡甲胺對(duì)sc(Fv)2分子和全長抗體的穩(wěn)定化效果的圖。 圖中的數(shù)值表示溶液加速條件下聚集物的含有率(％)。圖3是表示IgG的溶液制劑化和凍干制劑化中葡曱胺的穩(wěn)定性效果的圖。圖4是表示單鏈雙抗體(Single chain diabody)型sc(Fv)2在長期低溫 保存(-2(TC、 6個(gè)月)下葡曱胺的穩(wěn)定性效果的圖。圖5是表示人源化雙特異性抗體長期常溫保存(25。C、 2個(gè)月)下葡 甲胺的穩(wěn)定性效果的圖。圖6是表示單鏈抗體sc(Fv)2的制備過程的圖。實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明人在研究sc(Fv)2的穩(wěn)定化制劑的過程中，發(fā)現(xiàn)了作為氨基 糖的一種的新型穩(wěn)定劑葡甲胺。并且發(fā)現(xiàn)該葡甲胺不僅可穩(wěn)定小分子抗 體sc(Fv)2,也可以穩(wěn)定全長抗體。并且發(fā)現(xiàn)葡甲胺與在蛋白質(zhì)藥物制 劑中通常作為穩(wěn)定劑使用的蔗糖等糖或氨基糖相比，對(duì)于抗體分子等蛋 白質(zhì)或肽顯示優(yōu)異的穩(wěn)定效果。本發(fā)明根據(jù)上迷認(rèn)識(shí)完成。本發(fā)明涉及使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加葡甲 胺。本發(fā)明的穩(wěn)定化可以是長期穩(wěn)定化。本發(fā)明中，"長期穩(wěn)定化"如下 定義。為小分子抗體的溶液制劑時(shí)，是指在55。C下保存兩周后聚集物的 量為35%或以下，或者在40。C下保存兩周后聚集物的量為10%或以下、 優(yōu)選7%或以下，或者在25。C下保存兩個(gè)月后聚集物的量為1%或以下， 或者在-20。C保存六個(gè)月后聚集物的量為2%或以下、優(yōu)選1%或以下。 為除小分子抗體之外的全部抗體或者通常的蛋白質(zhì)溶液制劑時(shí)，是指 60。C下保存三周后聚集物的量為20%或以下、優(yōu)選10%或以下，或者在 -20°〇下保存六個(gè)月后聚集物的量為2%或以下、優(yōu)選1%或以下。為IgG、 包括小分子抗體的所有抗體或者通常的蛋白質(zhì)凍千制劑時(shí)，是指在40°C 下保存一個(gè)月后聚集物的量為5%或以下、優(yōu)選1%或以下、進(jìn)一步優(yōu)選 0.5%或以下。本發(fā)明中，"葡曱胺"是別名為N-甲基葡胺、化學(xué)式為l-脫氧-l-甲 基氨基-D-葡萄糖醇以及以下化學(xué)式所示的化合物。ho' h h. ohl-脫氧-l-甲基氨基-D-葡萄糖醇本發(fā)明中，"葡曱胺"包含葡甲胺衍生物或葡曱胺的鹽等。葡甲胺衍 生物或葡曱胺的鹽可例舉酰胺基泛影酸葡甲胺、泛影酸鈉葡曱胺、釓噴[化1]<formula>formula see original document page 8</formula>酸葡甲胺、釓特酸葡甲胺、碘他拉葡胺、碘托葡胺、釓貝葡胺、meglumine iodoxamate、氟尼辛葡曱胺、gastrografin (疏酸葡甲胺鹽)等。但并不限 于此。另外，上述葡甲胺的羥基、氨基等可以進(jìn)行化學(xué)修飾，修飾所得 的產(chǎn)物也包含在本發(fā)明的葡甲胺中。本發(fā)明中，作為穩(wěn)定化對(duì)象的藥物組合物(蛋白質(zhì))可以是包括肽的 蛋白質(zhì)或者其它生物體高分子、合成高分子化合物、低分子化合物或它 們的衍生物或其組合的復(fù)合物的任意形式。本發(fā)明的優(yōu)選例子可例舉抗 體。本發(fā)明中，作為穩(wěn)定化對(duì)象的抗體可以使用公知的抗體，可以是全 長抗體、片段化抗體、修飾抗體或小分子抗體的任意一種。公知的全長抗體可例舉IgG (IgGl, IgG2， IgG3， IgG4)、 IgD、 IgE、 IgM、 IgY等，其種類沒有特別限定。全長抗體也包括雙特異性IgG抗 體(J Immunol Methods. 2001 Feb 1;248(1-2):7-15)。另外，使用新型抗原、按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備的抗體 也可作為對(duì)象。具體來說，例如新型抗體的制備可如下進(jìn)行。使用新型抗原蛋白質(zhì)或其片段作為致敏抗原，將其按照通常的免疫 方法進(jìn)行免疫，將所得的免疫細(xì)胞按照常規(guī)的細(xì)胞融合法與公知的親代 細(xì)胞融合，通過常規(guī)的篩選方法篩選單克隆的抗體生成細(xì)胞(雜交瘤)。 抗原的制備可按照公知的方法例如使用桿狀病毒的方法(W098/46777等) 等進(jìn)行。雜交瘤的制備例如可按照MUstein等人的方法(Kohler. G,和 Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46)等進(jìn)行?？乖拿庖咴?低時(shí)，可以使其與白蛋白等具有免疫原性的巨大分子結(jié)合，進(jìn)行免疫。 然后使用反轉(zhuǎn)錄酶從雜交瘤的mRNA中合成抗體的可變區(qū)(V區(qū))的 cDNA，按照公知的方法對(duì)所得的cDNA的序列進(jìn)行解讀。識(shí)別新型抗原的抗體只要可與新型抗原結(jié)合即可，沒有特別限定， 可以適當(dāng)采用小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、綿羊抗體、人抗體等。另 外，為了使其對(duì)人的異種抗原性降低等，還可以使用人為改變的基因重 組型抗體、例如嵌合抗體、人源化抗體等。這些改變抗體可以采用已知 的方法制備。嵌合抗體是含有人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠抗體的重鏈、 輕鏈可變區(qū)與人抗體的重鏈、輕鏈恒定區(qū)的抗體等，可通過將編碼小鼠 抗體可變區(qū)的DNA與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其整合到表達(dá) 栽體中，導(dǎo)入宿主生成獲得。人源化抗體也稱為重構(gòu)人抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)所得，已知這是常規(guī) 的基因重組方法。具體來說如下獲得設(shè)計(jì)將小鼠抗體的CDR與人抗 體的支架區(qū)(FR)連接的DNA序列，通過PCR法，從制備為末端具有重 疊部分的多個(gè)寡核苷酸中合成上述DNA序列。將所得的DNA與編碼人 抗體恒定區(qū)的DNA連接，整合到表達(dá)栽體中，將其導(dǎo)入宿主，生產(chǎn)獲 得(參照歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)EP239400、國際專利申請(qǐng)公開號(hào) WO96-02576)。經(jīng)由CDR連接的人抗體的FR可選擇互補(bǔ)決定區(qū)可形成 良好的抗原結(jié)合部位的支架區(qū)。還可根椐需要置換抗體可變區(qū)中支架區(qū) 的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合部位(Sato， K. 等人.，Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。還已知人抗體的獲得方法。例如體外用所需抗原或表達(dá)所需抗原的 細(xì)胞對(duì)人淋巴細(xì)胞致敏，將致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞、例如U266 融合，可得到具有與抗原的結(jié)合活性的所需的人抗體(參照日本特公平 1-59878)。另外，還可以將具有人抗體基因的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng) 物用所需抗原進(jìn)行免疫，獲得所需的人抗體(國際專利申請(qǐng)公開號(hào) W093/12227、 WO92/03918、 WO94/02602、 W094/25585、 WO96/34096、 W096/33735)。并且還已知使用人抗體文庫，通過淘選技術(shù)獲得人抗體 的技術(shù)。例如，以人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過噬菌體展 示法在噬菌體的表面表達(dá)，可選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。如果對(duì)所選擇 的噬菌體的基因進(jìn)行分析，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的 DNA序列。如果了解了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，則可以制備具 有該序列的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)栽體，可以獲得人抗體。這些方法是已知的，可 以參考WO92/01047、 WO92/20791 、 WO93/06213 、 W093/11236、 W093/19172、 WO95/01438、 W095/15388。它們可以是公知的抗體或新制備的抗;的任意 一種。片i化抗體或小分 子抗體包括全長抗體(例如全長IgG)的一部分缺損的抗體片段，只要具 有與抗原的結(jié)合能力即可，沒有特別限定?？贵w片段的具體例子例如有 Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv (單鏈Fv) (Huston, J. S.等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883， Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113, Resenburg和Moore編輯.，SpringerVerlag, New York, 269-315頁，(1994))， VHH (camelid VH, J Biotechnol. 2001 Jun; 74(4):277-302.)或sc(Fv)2等，優(yōu)選sc(Fv)2。為了獲得上述抗體 片段，可以是將抗體用酶、例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等進(jìn)行處理，生 成抗體片段，或者構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)栽體， 然后在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(例如參照Co, M. S.等人.，J. Immunol. (1994) 152， 2968-2976 ; Better, M.和Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178， 476-496; Pluckthun, A.和Skerra, A.， Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi， E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux，丄等人.，Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E.和 Walker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137)。本發(fā)明中，優(yōu)選的小分子抗體是含有抗體的兩個(gè)或以上VH以及兩 個(gè)或以上VL，這些各可變區(qū)可以直接或者經(jīng)由接頭等間接地結(jié)合的抗 體。結(jié)合可以是共價(jià)鍵也可以是非共價(jià)鍵，還可以是共價(jià)鍵與非共價(jià)鍵 兩者。進(jìn)一步優(yōu)選的小分子抗體是含有兩個(gè)或以上VH和VL通過非共 價(jià)鍵結(jié)合形成的VH-VL對(duì)的抗體。這種情況下，優(yōu)選小分子抗體中的 一方的VH-VL對(duì)與另 一方的VH-VL對(duì)之間的距離比全長抗體中的距離 還短的抗體。本發(fā)明中，小分子抗體可例舉scFv、雙抗體或sc(Fv)2。 scFv是可 變區(qū)與可變區(qū)通過接頭等結(jié)合的片段。雙抗體是使兩個(gè)scFv等(以下稱為構(gòu)成雙抗體的片段)結(jié)合，形成二 聚體所得，通常含有2個(gè)VL和2個(gè)VH。構(gòu)成雙抗體的片段之間的結(jié)合 可以是非共價(jià)鍵，也可以是共價(jià)鍵，優(yōu)選非共價(jià)鍵。構(gòu)成雙抗體的片段可以是將VL與VH結(jié)合的片段、將VL與VL結(jié) 合的片段、將VH與VH結(jié)合的片段等，優(yōu)選將VH與VL結(jié)合的片段。 構(gòu)成雙抗體的片段中，對(duì)于將可變區(qū)與可變區(qū)結(jié)合的接頭沒有特別限 定，優(yōu)選使用同 一 片段中可變區(qū)之間不發(fā)生非共價(jià)結(jié)合的程度的較短的 接頭。上迷接頭的長度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定，通常為2-14個(gè)氨 基酸，優(yōu)選3-9個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選4-6個(gè)氨基酸。這種情況下，在同 一片段上編碼的VL與VH之間的接頭短，因此，同一鏈上的VL與VH 之間不發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，不形成單鏈V區(qū)片段，因此形成與其它片段的 非共價(jià)結(jié)合的二聚體。并且，與雙抗體制備同樣的原理，還可以使3個(gè) 或以上構(gòu)成雙抗體的片段結(jié)合，制備三聚體、四聚體等多聚體化的抗體。sc(Fv)2是兩個(gè)重鏈可變區(qū)([VH])和兩個(gè)輕鏈可變區(qū)([VL])通過接頭 結(jié)合、制成的單鏈多肽的抗體(Hudson等人.，J Immunol. Methods (1999) 23177-189)。該兩個(gè)VH和VL可以來自不同的單克隆抗體 例如有 Journal oflmmunology, 1994, 152, 5368-5374中公開的兩種抗原、或者識(shí) 別兩種表位的雙特異性sc(Fv)2。 sc(Fv)2例如可通過接頭等將兩個(gè) scFv(單鏈Fv) (Huston, J. S.等人.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 5879-5883， Plickthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies" Vol. 113， Resenburg和Moore編輯.，Springer Verlag， New York, pp. 269-315, (1994))結(jié)合來制備。接頭可以使用可通過基因工程導(dǎo)入的任意的肽接 頭、或者合成化合物接頭、例如Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996 中所公開的接頭等，本發(fā)明中優(yōu)選肽接頭。肽接頭的長度沒有特別限定， 可根據(jù)目的由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，通常為l-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選 5-30個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選12-18個(gè)氨基酸(例如15個(gè)氨基酸)。所結(jié)合的兩個(gè)重鏈可變區(qū)和兩個(gè)輕鏈可變區(qū)的順序沒有特別限定， 可以以任何順序排列，例如可以是以下配置。[VH]接頭[VL]接頭[VH]接頭[VL][VL]接頭[VH]接頭[VH]接頭[VL][VH]接頭[VL]接頭[VL]接頭[VH][VH]接頭[VH]接頭[VL]接頭[VL][VL]接頭[VL]接頭[VH]接頭[VH][VL]接頭[VH]接頭[VL]接頭[VH]本發(fā)明中，優(yōu)選具有[VH]接頭[VL]接頭[VL]接頭[VH]配置的sc(Fv)2。重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列可以置換、缺失、附加和/ 或插入。并且重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)聚集時(shí)，只要具有抗原結(jié)合活性， 可以使部分缺損，也可以附加其它的多肽?？勺儏^(qū)可以進(jìn)行嵌合化或人源化處理。本發(fā)明中，將抗體的可變區(qū)結(jié)合的接頭可以使用通過基因工程導(dǎo)入 的任意的肽接頭、或者合成化合物接頭、例如Protein Engineering, 9(3)， 299-305， 1996,中公開的接頭。本發(fā)明中優(yōu)選的接頭是肽接頭。肽接頭的長度沒有特別限定，可由 本領(lǐng)域技術(shù)人員根椐目標(biāo)適當(dāng)選擇，通常為1-100個(gè)氨基酸，優(yōu)選3-50個(gè)氨基酸，進(jìn)一步優(yōu)選5-30個(gè)氨基酸，特別優(yōu)選12-18個(gè)氨基酸(例如 15個(gè)氨基酸)。肽接頭的氨基酸序列例如可以是下述序列。SerGly.Ser Gly Gly Ser Ser.GlyGlyGly.Gly'Gly,Ser(SEQ ID NO. :41) Ser.Gly.Gly.Gly(SEQ ID NO. :42) Gly.Gly.Gly.Gly'Ser(SEQ ID NO,:") Ser,Gly'Gly'Gly'Gly(SEQ ID NO,: 44) Gly Gly. Gly'Gly'Gly. Ser卿ID NO. :45) Ser.GlrGly.Gly.Gly.Gly(SEQ ID NO.: 46) Gly.Gly.Gly.Gy'Gly.Gly.Ser(SEQ ID NO. :47) Ser, Gly, Gly Gly Gly. Gly. Gly (SEQ ID NO.: 48) (Gly'Gly'G)y.Gly.Ser(SEQ ID NO. :43))n (Ser.Gly'Gly'Gly.Gly(SEQ ID NO. :44))n[n為1或以上的整數(shù)]合成化學(xué)物接頭(化學(xué)交聯(lián)劑)是肽的交聯(lián)中通常使用的交聯(lián)劑，例 如N-輕基琥珀酰亞胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸雙(磺 基琥珀酰亞胺基酯)(BS3)、丙酸二硫代雙(琥珀酰亞胺基酯)(DSP)、丙酸 二石充代雙(石黃基琥珀酰亞胺基酯)(D丁SSP)、乙二醇雙(琥珀酰亞胺基琥珀 酸酯)(EGS)、乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、 二琥 珀酰亞胺基酒石酸鹽(DST)、 二磺基琥珀酰亞胺基酒石酸鹽(磺基-DST)、 雙[2-(琥珀酰亞胺氧基拔基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、雙[2-(磺基琥珀酰 亞胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，這些交聯(lián)劑是市售產(chǎn)<formula>formula see original document page 13</formula>將四個(gè)抗體的可變區(qū)結(jié)合時(shí)，通常需要三個(gè)接頭，可以使用完全相 同的接頭，也可以使用不同的接頭。sc(Fv)2可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的方法制備。例如將編碼sc(Fv)2的DNA插入到的栽體中，在導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使sc(Fv)2表達(dá)，回 收表達(dá)產(chǎn)物，由此可制備sc(Fv)2。該栽體只要可穩(wěn)定地保持插入的DNA即可，沒有特別限定，例如 如杲宿主使用大腸桿菌，則克隆栽體優(yōu)選pBluescript載體(Stratagene制) 等，也可以利用市售的各種栽體。在本發(fā)明的生產(chǎn)sc(Fv)2的目的中使 用栽體時(shí)，表達(dá)載體特別有用。表達(dá)栽體只要是在試管內(nèi)、大腸桿菌內(nèi)、 培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)、生物個(gè)體內(nèi)表達(dá)sc(Fv)2的栽體即可，沒有特別限定，例 如，如果在試管內(nèi)表達(dá)則優(yōu)選使用pBEST栽體(Promega制)，如果在大 腸桿菌中表達(dá)則優(yōu)選使用pET栽體(Invitrogen制)，在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)則 優(yōu)選使用pME18S-FL3栽體(GenBank登錄號(hào)AB009864),在生物個(gè)體中 表達(dá)則優(yōu)選使用pME18S栽體(Mol Cell Biol. 8:466-472 (1988))等。本發(fā) 明的DNA向栽體中的插入可按照常規(guī)方法、例如通過使用限制酶切位 點(diǎn)的連接酶反應(yīng)進(jìn)行(Current protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel等人.(1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 11.4-11.11)。上述宿主細(xì)胞沒有特別限定，可以根椐目的使用各種宿主細(xì)胞。用 于表達(dá)sc(Fv)2的細(xì)胞例如有細(xì)菌細(xì)胞(例如、鏈球菌、葡萄球菌、大腸 桿菌、鏈霉菌、枯草桿菌)、真菌細(xì)胞(例如酵母、曲霉)、昆蟲細(xì)胞(例如 果蠅S2、草地貪夜蛾SF9)、動(dòng)物細(xì)胞(例如CHO、 COS、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、黑素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞。栽體向宿主細(xì)胞的導(dǎo) 入例如可通過磷酸朽沉淀法、電脈沖穿孔法(Current protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel等人.(1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 9.1-9.9)、脂轉(zhuǎn)染法(GIBCO-BRL制)、顯微注射法等公知的方法 進(jìn)行。將本發(fā)明的sc(Fv)2分泌到培養(yǎng)基中時(shí)，sc(Fv)2的回收可以通過回 收培養(yǎng)基來實(shí)施。當(dāng)sc(Fv)2在細(xì)胞內(nèi)生成時(shí)，首先溶解該細(xì)胞，然后 回收sc(Fv)2組合物。已知為了制備與某種多肽具有同等功能的多肽，本領(lǐng)域的已知方法 是向多肽中導(dǎo)入突變的方法。例如本領(lǐng)域枝術(shù)人員使用位點(diǎn)專一性誘變 法(Hashimoto-Gotoh， T.等.Gene 152， 271-275， (1995); Zoller, MJ，和 Smith, M. Methods Enzymol. 100, 468-500, (1983); Kramer, W.等人., Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456， (1984); Kramer, W.和Fritz HJ， Methods Enzymol. 154， 350-367， (1987); Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA.82， 488-492, (1985); Kunkel, Methods Enz拜l. 85, 2763-2766， (1988))等， 將適當(dāng)?shù)耐蛔儗?dǎo)入本發(fā)明的抗體，由此可制備與該抗體功能同等的抗 體。氨基酸的突變還可以在自然界中產(chǎn)生。這樣，本發(fā)明的抗體的氨基 酸序列中具有1個(gè)或多個(gè)氨基酸突變的氨基酸序列、與該抗體功能同等 的抗體也包含在本發(fā)明的抗體中。突變的氨基酸數(shù)目沒有特別限定，通常為30個(gè)氨基酸或以內(nèi)，優(yōu) 選15個(gè)氨基酸或以內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選5個(gè)氨基酸或以內(nèi)(例如3個(gè)氨基酸 或以內(nèi))。突變的氨基酸殘基中，優(yōu)選突變?yōu)榭杀Ａ舭被嶂ф溞再|(zhì)的其 它的氨基酸。例如作為氨基酸支鏈的性質(zhì)?？衫e疏水性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、具有脂族支鏈的氨基酸(G、 A、 V、 L、 1、 P)、具有含羥基 支鏈的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含硫原子支鏈的氨基酸(C、 M)、具有羧 酸和含酰胺的支鏈的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、具有含堿基支鏈的氨基酸(R、 K、 H)、具有含芳族支鏈的氨基酸(H、 F、 Y、 W)(括號(hào)內(nèi)均表示氨基酸 的單字母標(biāo)記)。還已知具有通過對(duì)氨基酸序列有i或多個(gè)氨基酸殘基缺失、附加和/或被其它氨基酸置換而修飾的氨基酸序列的多肽也可以保持 其生物學(xué)活性(Mark, D. F.等人.,Proc. Natl, Acad. Sci. USA 81, 5662-5666 (1984); Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research 10, 6487-6500 (1982); Wang, A.等人.，Science 224, 1431-1433; Dalbadie-McFarland， G. 等人.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6409-6413 (1982))。另外，抗體的恒 定區(qū)等的氨基酸序列也是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。本發(fā)明中使用的抗體可以是修飾抗體，修飾抗體可以是與聚乙二醇 (PEG)、放射性物質(zhì)、毒素等各種分子結(jié)合的綴合抗體。修飾抗體除抗體綴合物之外，還可以是抗體分子、抗體分子片段、 抗體樣分子與其它蛋白質(zhì) 肽的融合蛋白。融合蛋白有TNFa與Fc的 融合蛋白(Int J Clin Pract. 2005 Jan;59(l):l 14-8)、或者IL2與scFv的融合 蛋白(J Immunol Methods. 2004 Dec;295(l-2):49-56)等，對(duì)此沒有特別限 定。本發(fā)明中使用的抗體可以是抗體樣分子。抗體樣分子有affibodies (Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Mar 18; 100(6):3191-6)和錨蛋白(Nat Biotechnol. 2004 May; 22(5):575-82)，對(duì)此沒有特別限定。上述抗體可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法制備。具體來說，將作為目標(biāo)的抗體的DNA整合到表達(dá)栽體中。此時(shí)是整合到表達(dá)栽體中， 在表達(dá)控制區(qū)例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的控制下進(jìn)行表達(dá)。接著，通過該表 達(dá)栽體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使抗體表達(dá)。此時(shí)可以使用適當(dāng)?shù)乃拗髋c表達(dá)栽 體的組合。
栽體的例子有Ml3系栽體、pUC系栽體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。在以cDNA亞克隆、切取為目的時(shí)，除上述載體外例如 還有pGEM-丁、 pDIRECT、 p丁7等。
在為了生產(chǎn)抗體而使用栽體時(shí)，表達(dá)栽體特別有用。作為表達(dá)栽體， 例如以在大腸桿菌中表達(dá)為目的時(shí)，除了具有在大腸桿菌中擴(kuò)增等上述 特征之外，在宿主為JM109、 DH5ot、 HBIOI、 XL1-Blue等大腸桿菌時(shí)， 具有在大腸桿菌中有高效表達(dá)的啟動(dòng)子例如lacZ啟動(dòng)子(Ward等.(1989) Nature 341:544-546; (1992) FASEB J. 6:2422-2427)、 araB啟動(dòng)子(Better 等.(1988) Science 240:1041-1043)、或者T7啟動(dòng)子等是不可缺少的。所 述栽體除上述栽體之外，還有pGEX-5X-l (Pharmacia制)、"QIAexpress system" (QIAGEN制)、pEGFP或pET (這種情況下，宿主優(yōu)選為表達(dá)T7 RNA聚合酶的BL21)等。
栽體中可以含有用于多肽分泌的信號(hào)序列。作為多肽分泌的信號(hào)序
列，在大腸桿菌的周質(zhì)中生產(chǎn)時(shí)，可以使用pe舊信號(hào)序列(Lei, S. P.等. ■J. Bacteriol. 169:4379 (1987))。栽體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入例如可采用氯化鈣 法、電穿孔法進(jìn)行。
除大腸桿菌之外，例如本發(fā)明的制備多肽的栽體可以是來自哺乳動(dòng) 物的表達(dá)載體(例如pcDNA3 (Invitrogen制)或pEGF-BOS (Nucleic Acids Res. (1990) 18(17):5322)、 pEF、 pCDM8)、來自昆蟲細(xì)胞的表達(dá)栽體(例 如"Bac-to-BAC桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，，(GIBCOBRL制)、pBacPAK8)、來自 植物的表達(dá)栽體(例如pMHl、 pMH2)、來自動(dòng)物病毒的表達(dá)栽體(例如 pSHV、 pMV、 pAdexLcw、)、來自反轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)栽體(例如pZIPneo)、 來自酵母的表達(dá)栽體(例如"畢赤氏酵母表達(dá)試劑盒"(Invitrogen制)、 pNVll、 SP-QOl)、來自枯草桿菌的表達(dá)栽體(例如pPL608、 pKTH50)。
在目的是在CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá) 時(shí)，具有在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所必須的啟動(dòng)子例如SV40啟動(dòng)子(Mulligan等. (1979) Nature 277:108)、 MMLV-LTR啟動(dòng)子、EFla啟動(dòng)子(Mizushima 等.(1990) Nucleic Acids Res. 18:5322)、 CMV啟動(dòng)子等是不可缺少的，進(jìn)一步優(yōu)選具有用于篩選對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因(例如可通過藥物(新霉素、
G418等)進(jìn)行判別的抗藥性基因)。具有上迷特性的載體例如有pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 pOPRSV、 pOP13等。
并且，在為了使基因穩(wěn)定表達(dá)且擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的基因拷貝數(shù)時(shí)，有向 核酸合成途徑缺損的CHO細(xì)胞中導(dǎo)入具有與其互補(bǔ)的DHFR基因的栽 體(例如pCHOI等)，通過曱氨蝶呤(MTX)擴(kuò)增的方法；另外，在以基因 的瞬時(shí)表達(dá)為目的時(shí)，可以使用染色體上具有表達(dá)SV40T抗原的基因的 COS細(xì)胞，通過具有SV40復(fù)制起點(diǎn)的栽體(pcD等)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的方法。 復(fù)制起點(diǎn)還可以使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的 復(fù)制起點(diǎn)。并且，為了在宿主細(xì)胞系內(nèi)擴(kuò)增基因拷貝數(shù)，表達(dá)栽體可以 含有氨基葡糖苷轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌 呤—鳥。票呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作 為選擇性標(biāo)志。
本發(fā)明中，將葡甲胺"添加"到蛋白質(zhì)中是指使葡曱胺與蛋白質(zhì)混 合。本發(fā)明中，使葡甲胺與蛋白質(zhì)混合可以是使蛋白質(zhì)溶解于含有葡甲
胺的溶液中。
本發(fā)明中，"穩(wěn)定化"是指蛋白質(zhì)保持天然狀態(tài)或者具有活性的狀
太
通過添加本發(fā)明的含有葡甲胺的穩(wěn)定劑，如果蛋白質(zhì)的活性比天然 狀態(tài)或者對(duì)照升高，或者在保存時(shí)由于聚集導(dǎo)致的活性降低更小，則均 可視為蛋白質(zhì)穩(wěn)定化。作為蛋白質(zhì)的具體例子，抗體分子的活性是否升 高，這可在相同條件下通過測定目標(biāo)活性來確認(rèn)。作為穩(wěn)定化目標(biāo)的抗 體分子可以是合成的抗體分子，也可以從生物體中分離。
本發(fā)明中，活性可以是結(jié)合活性、中和活性、細(xì)胞傷害活性、激動(dòng) 活性、拮抗活性、酶活性等任何活性，沒有特別限定，優(yōu)選為對(duì)生物體、 組織、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA、 RNA等的量和/或質(zhì)的變化、影響的活性， 特別優(yōu)選激動(dòng)活性。
激動(dòng)活性是指抗體與受體等的抗原結(jié)合，使信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞等 的、誘導(dǎo)一些生理活性變化的活性。生理學(xué)活性例如有生長活性、存活 活性、分化活性、轉(zhuǎn)錄活性、膜傳輸活性、結(jié)合活性、蛋白質(zhì)分解活性、 磷酸化/脫磷酸化活性、氧化還原活性、轉(zhuǎn)移活性、核酸分解活性、脫水 活性、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性、編程性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性等，但并不限于此。本發(fā)明中，對(duì)抗原沒有特別限定，可以是任何抗原。抗原的例子有
受體、癌抗原、MHC抗原、分化抗原等。受體的例子例如有造血因
子受體家族、細(xì)胞因子受體家族、酪氨酸激酶受體家族、絲氨酸/蘇氨酸
激酶受體家族、TNF受體家族、G蛋白質(zhì)共軛受體家族、GPI錨蛋白受
體家族、酪氨酸磷酸酶受體家族、粘著因子家族、激素受體家族等受體
家族的受體等。這些屬于受體家族的受體及其特征存在于多種文獻(xiàn)中， 例如有. Cooke BA., King RJB,, van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Bio
chemistry Vol.l8B "Hormones and their Actions Part I'pp.l-46 (1988) Elsevier Sci
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"黏著因子手冊"(1994)(秀潤社，東京，曰本)等'
屬于上述受體家族的具體的受體例如有人或小鼠紅細(xì)胞生成素 (EPO)受體、人或小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)受體、人或小鼠血小 板生成素(TPO)受體、人或小鼠胰島素受體、人或小鼠Flt-3配體受體、 人或小鼠來自血小板的生長因子(PDGF)受體、人或小鼠干擾素(IFN)-a、 )3受體、人或小鼠瘦素受體、人或小鼠生長激素(GH)受體、人或小鼠白 細(xì)胞介素(IL)-10受體、人或小鼠胰島素樣生長因子(IGF)-I受體、人或小 鼠白血病抑制因子(UF)受體、人或小鼠睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)受體等
(hEPOR: Si薩，S.等人，(1990) Blood 76, 31-35.: m已POR: D' Andrea, AD.等人.(1989) Cell 57, 277-285.; hG-CSFR: Fukunaga, R.等人.(1990)
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癌抗原是與細(xì)胞惡性化相伴表達(dá)的抗原，也稱為腫瘤特異性抗原。 細(xì)胞癌化時(shí)在細(xì)胞表面或蛋白質(zhì)分子上表達(dá)的異常糖鏈也是癌抗原，特 別稱為癌糖鏈抗原。癌抗原的例子例如有CA 19-9、CA 15-3、 sialyl SSEA-1
(SLX)等。
MHC抗原大致分為MHC-I類抗原和MHC-II類抗原，MHC-I類抗 原中含有HLA-A、 -B、 -C、 -E、 -F、 -G、 -H， MHC II類抗原含有HLA-DR、 -DQ、 -DP。
分化抗原包含
CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7，CD8,CD10,CDUa,CDllb，CDUc,CD13,CD14
,CD15s,CCU6,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28，CD29,CD30,CD32,CD3
3,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD4b,CD42a,CD42b,CD43,CD44,CD45,CD45
RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,CD54,CD55,CD56,C
D57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD73，CD95,CD102,C
D106,CD122,CD126,CDw130 。
測定活性變化所使用的檢測指標(biāo)只要是可以測定量和/或質(zhì)的變化 的即可，均可使用。例如可以采用無細(xì)胞體系(無細(xì)胞測定)的指標(biāo)、細(xì) 胞體系(細(xì)胞測定)的指標(biāo)、組織體系的指標(biāo)、生物體系的指標(biāo)。
無細(xì)胞體系的指標(biāo)可以采用酶促反應(yīng)或蛋白質(zhì)、DNA、 RNA的量 和/或質(zhì)的變化。酶促反應(yīng)例如可以采用氨基酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)、糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)、 脫水反應(yīng)、脫氫反應(yīng)、底物切斷反應(yīng)等。也可以采用蛋白質(zhì)的磷酸化、 脫磷酸化、二聚體化、多聚體化、分解、離解等，或者DNA、 RNA的 擴(kuò)增、切斷、延伸。例如，可以以存在于信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游的蛋白質(zhì)的 磷酸化作為檢測指標(biāo)。
細(xì)胞體系的指標(biāo)可以采用細(xì)胞表型的變化、例如生成物質(zhì)的量和/ 或質(zhì)的變化、生長活性的變化、細(xì)胞數(shù)目的變化、形態(tài)的變化、特性的 變化等。生成物質(zhì)可以使用分泌蛋白、表面抗原、胞內(nèi)蛋白、mRNA等。 形態(tài)的變化可以采用突起的形成和/或突起數(shù)目的變化、扁平度的變化、伸長度/縱橫比的變化、細(xì)胞大小的變化、內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化、作為細(xì)胞集 團(tuán)的異形性/均勻性、細(xì)胞密度的變化等。這些形態(tài)變化可以通過檢測鏡 下的觀察來確認(rèn)。特性的變化可以采用錨定蛋白依賴性、細(xì)胞因子依賴 響應(yīng)性、激素依賴性、抗藥性、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞游走活性、搏動(dòng)性、 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)變化等。細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性有細(xì)胞浸潤活性、細(xì)胞游走活性。細(xì)胞
內(nèi)物質(zhì)的變化例如可采用酶活性、mRNA量、Ca^或cAMP等細(xì)胞內(nèi)信 息傳遞物質(zhì)量、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)量等。細(xì)胞膜受體可以以受體的由刺激誘 導(dǎo)的細(xì)胞生長活性的變化為指標(biāo)。
組織體系的指標(biāo)可以以所使用的組織的功能變化為檢測指標(biāo)。生物 體系的指標(biāo)可以采用組織重量變化、血液系統(tǒng)的變化、例如血細(xì)胞數(shù)目 的變化、蛋白質(zhì)的量或酶活性、電解質(zhì)的量的變化、以及循環(huán)系統(tǒng)的變 化例如血壓、脈搏數(shù)的變化等。
作為測定這些檢測指標(biāo)的方法沒有特別限定，可以采用吸光、發(fā)光、 顯色、焚光、放射活性、熒光偏振光度、表面等離子共振信號(hào)、時(shí)間分 辨熒光度、質(zhì)量、吸收光譜、光散射、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等。這些測定 方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是周知的，可以根據(jù)目的適當(dāng)選擇。
例如吸收光語可以通過通常使用的光度計(jì)或讀板儀等，發(fā)光可通過 發(fā)光計(jì)等，熒光可通過熒光計(jì)等測定。質(zhì)量可使用質(zhì)量分析儀測定。放 射活性可根據(jù)放射線的種類使用y計(jì)數(shù)器等測定儀器、熒光偏振光度可 使用BEACON (寶酒造)、表面等離子共振信號(hào)通過BIACORE、時(shí)間分 辯熒光、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等可通過ARVO等測定。并且流式細(xì)胞儀等 也可以用于測定。這些測定方法可以在一種測定方法中測定兩種或以上 的檢測指標(biāo)，為了簡便，可以將兩種或以上的測定同時(shí)和/或連續(xù)測定， 由此可以測定更多的檢測指標(biāo)。例如可以將熒光和熒光共振能量轉(zhuǎn)移同 時(shí)通過焚光計(jì)測定。
本發(fā)明中，激動(dòng)活性的測定可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn) 行。例如如實(shí)施例所述，可以以細(xì)胞生長為指標(biāo)，通過測定激動(dòng)活性的 方法進(jìn)行判定。更具體地說，向顯示激動(dòng)依賴性生長的細(xì)胞中添加要測 定激動(dòng)活性的抗體并培養(yǎng)，然后根據(jù)WST-8等的存活細(xì)胞數(shù)，添加在 特定的波長中呈現(xiàn)顯色反應(yīng)的試刑，測定吸光度，以所得吸光度為指標(biāo) 測定激動(dòng)活性。法制備，例如抗原為發(fā)出細(xì)胞生長信號(hào)的受體時(shí)，可以使用表達(dá)該受體 的細(xì)胞?；蛘呖乖瓰椴话l(fā)出細(xì)胞生長信號(hào)的受體時(shí)，可以制備含有發(fā)出 細(xì)胞生長信號(hào)的受體的胞內(nèi)域和不發(fā)出細(xì)胞生長信號(hào)的受體的胞外域 的嵌合受體，使該嵌合受體在細(xì)胞中表達(dá)。發(fā)出細(xì)胞生長信號(hào)的受體的
例子例如有G-CSF受體、mpl、 neu、 GM-CSF受體、EPO受體、c-kit、 FLT-3等。表達(dá)受體的細(xì)胞例如有BaF3、 NFS60、 FDCP-1、 FDCP-2、 CTLL-2、 DA-1、 KT-3。
本發(fā)明中，蛋白質(zhì)"穩(wěn)定化"是蛋白質(zhì)的聚集反應(yīng)受到抑制的狀態(tài)， 是指抑制在保存中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)聚集物的增加、和/或抑制保存中產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)不溶性聚集物(沉淀物)的增加和/或保持蛋白質(zhì)的功能，優(yōu)選是指 抑制保存中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)聚集物的增加。
本發(fā)明涉及抑制蛋白質(zhì)聚集的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加氨 基糖的一種，即葡甲胺的步驟。更具體地說，涉及抑制抗體分子聚集的 方法，該方法包含向抗體分子中添加葡曱胺的步驟。
本發(fā)明中，聚集是指蛋白質(zhì)(抗體分子)不可逆或可逆地聚集，抗體 形成的兩個(gè)分子或以上的多聚體。聚集是否受到抑制，這可以通過本領(lǐng) 域所公知的方法例如沉淀平衡法(超離心法)、滲透壓法、光散射法、低 角度激光光散射法、小角度X射線散射法、小角度中子散射法或凝膠過 濾法等，測定抗體分子聚集物的含有率來進(jìn)行。通過添加葡甲胺，如果 保存時(shí)抗體聚集物含有率降低，則可以解釋為聚集受到抑制。
抗體的聚集物含有率的測定方法如實(shí)施例所述，有使用SEC (大小 排阻層析)進(jìn)行的方法，但并不限定于這些方法。
本發(fā)明中，"使抗體分子穩(wěn)定"是不管抗體濃度或狀態(tài)，使溶液抗體 制劑、冷凍干燥抗體制劑或噴霧干燥制劑中所含的抗體分子穩(wěn)定?？梢?是使低溫下或常溫下長期保存的抗體分子穩(wěn)定。本發(fā)明中，低溫保存的
一個(gè)例子可以是在-8o。c至icrc下保存，冷凍保存也包括在保存形式中。
低溫的優(yōu)選例子是-20。C或5°C,但并不限于該溫度。本發(fā)明中，常溫保 存的一個(gè)例子是15。C-30。C下的保存。常溫的優(yōu)選例子有25°C，但并不
限于該溫度。
溶液制劑化可以通過本領(lǐng)域所周知的方法實(shí)施。例如如非專利文獻(xiàn) (J. Pharm. Sc， 2004， 93(6)， 1390-1402)記栽，通?？梢圆捎美肨FF月筵的
膜濃縮法。冷凍干燥可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的方法(Pharm. Biotechnol， 2002， 13， 109-33; Int. J. Pharm. 2000， 203(1-2)， 1-60; Pharm. Res. 1997, 14(8), 969-75)實(shí)施。例如，將溶液適量分注到冷凍干燥中使 用的瓶等容器中，在冷凍庫或冷凍干燥庫中進(jìn)行，或者浸泡到丙酮/千冰、 液氮等冷介質(zhì)中進(jìn)行。噴霧千燥制劑化可按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知的方法實(shí)施(J.Pharm. Sci. 1998 Nov; 87(1 l):l條-l 1)。關(guān)于溶液制劑化和冷凍干燥，可以按照實(shí)施例所記栽的方法進(jìn)行， 但并不限于此。本發(fā)明涉及含有氨基糖的一種一葡甲胺、使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的藥物，或 者是抑制蛋白質(zhì)聚集的藥物。更具體地說，涉及含有葡甲胺、使抗體分 子穩(wěn)定的藥物、或抑制抗體分子聚集的藥物，本發(fā)明還涉及含有葡曱胺、使抗體分子穩(wěn)定的藥物，或者使冷凍干 燥抗體制劑中所含的抗體分子穩(wěn)定的藥物。本發(fā)明中，藥物中可以添加保存劑或穩(wěn)定劑等制劑上可接受的栽 體。制劑上可接受是指其本身是具有穩(wěn)定上迷蛋白質(zhì)作用的材料，也可 以是不具有穩(wěn)定作用的材料，是可以與上述藥物一起給予的制劑上可接 受的材料?？梢允遣痪哂蟹€(wěn)定作用的材料，也可以通過與葡曱胺聯(lián)合使 用、協(xié)同性或相加性地具有穩(wěn)定效果的材料。制劑上可接受的材料例如有滅菌水或生理鹽水、穩(wěn)定劑、賦形劑、 緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA等)、粘合劑等。本發(fā)明中，可以例舉非離子表面活性劑作為表面活性劑，其典型例 子例如有單癸酸脫水山梨醇酯、單月桂酸脫水山梨醇酯、單棕櫚酸脫 水山梨醇酯等脫水山梨醇脂肪酸酯；單癸酸甘油酯、單肉豆蔻酸甘油酯、 單硬脂酸甘油酯等甘油脂肪酸酯；十甘油單硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸 酯、十甘油單油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸 酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯、 聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯、聚氧 乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯 山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸 酯；聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等聚氣乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬 脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧化丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟基醚等聚氧乙彿聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷 基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油等聚氧乙烯氫化蓖麻 油；聚氧乙烯山梨醇蜜蠟等聚氧乙烯蜜蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚 氧乙紼羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等具有 HLB 6-18的表面活性劑等。表面活性劑也可以是陰離子表面活性劑，其典型的例子例如有鯨 蠟基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具有碳原子數(shù)10-18的烷基 的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等環(huán)氧乙烷的平均加成摩爾數(shù)為 2-4、烷基的碳原子數(shù)為10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基磺基琥 珀酸酯鈉等烷基的碳原子數(shù)為8-18的烷基磺基琥珀酸酯鹽；天然系表面 活性劑例如卯磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等的鞘磷脂；碳原子數(shù)為12-18 的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等?？梢詫⑸鲜霰砻婊钚詣┑囊环N或兩種或以上組合添加到本發(fā)明的 制劑中。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑是聚山梨醇20、 40、 60或80等聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨醇20和80。 也優(yōu)選以泊洛沙姆(Pluronic F-68 (注冊商標(biāo)))為代表的聚氧乙烯聚氧化 丙二醇。表面活性劑的添加量根椐所使用的表面活性劑的種類而不同，為聚 山梨醇20或聚山梨醇80時(shí)，通常為0.001-100 mg/ml,優(yōu)選0,003-50 mg/ml，進(jìn)一步優(yōu)選0,005-2 mg/ml。本發(fā)明中，緩沖劑可以例舉磷酸、檸檬酸緩沖液、乙酸、蘋果酸、 酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸卸、葡糖酸、辛酸、脫氧膽酸、水楊酸、 三乙醇胺、富馬酸等有機(jī)酸等，或者碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸 緩沖液、咪唑緩沖液等。還可以通過溶解于在溶液制劑領(lǐng)域中公知的水性緩沖液中制備溶 液制劑。緩沖液的濃度通常為1-500 mM，優(yōu)選5-100mM,進(jìn)一步優(yōu)選 10-20 mM。本發(fā)明的藥物還可以含有其它的低分子量的多肽、血清白蛋白、明 膠或免疫球蛋白等蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖和單糖等糖類、或碳水化合物、糖醇。本發(fā)明中，氨基酸可以例舉堿性氨基酸，例如有精氨酸、賴氨酸、組氨酸、鳥氨酸等，或這些氨基酸的無機(jī)鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式，即磷酸氨基酸)。使用游離氨基酸時(shí)，優(yōu)選的pH值通過添加適當(dāng)?shù)纳?上可接受的緩沖物質(zhì)例如無機(jī)酸、特別是鹽酸、磷酸、疏酸、乙酸、甲 酸或它們的鹽來進(jìn)行調(diào)節(jié)。此時(shí)，從可以獲得穩(wěn)定的凍干產(chǎn)物的角度看， 磷酸鹽的應(yīng)用特別有利。制備物中實(shí)質(zhì)上不含有有機(jī)酸例如蘋果酸、酒 石酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等時(shí)，或者不存在對(duì)應(yīng)的陰離子(蘋果酸 離子、酒石酸離子、檸檬酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)時(shí)特別有 利。優(yōu)選的氨基酸有精氨酸、賴氨酸、組氨酸或鳥氨酸。還可以使用酸 性氨基酸例如谷氨酸和天冬氨酸及其鹽的形式(優(yōu)選鈉鹽)、或者中性氨 基酸例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫 氨酸、半胱氨酸或丙氨酸，或者芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色 氨酸或衍生物N-乙?；彼?。本發(fā)明中，多糖和單糖等糖類或碳水化合物例如有葡聚糖、葡萄糖、 果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖等。本發(fā)明中，糖醇例如有甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。制成注射水溶液時(shí)，例如有生理鹽水、含有葡萄糖或其它輔助試劑 的等滲液、例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化鈉，還可以 結(jié)合使用適當(dāng)?shù)娜芙庵鷦├绱?乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、 非離子性表面活性劑(聚山梨醇80、 HCO-50)等。還可以根據(jù)需要進(jìn)一步含有稀釋劑、溶解助劑、pH調(diào)節(jié)劑、無痛 劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。本發(fā)明中，含硫還原劑例如有N-乙酰基半胱氨酸、N-乙?；桶?胱氨酸、硫辛醇、疏二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫代山梨醇、巰基 乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽以及碳原子數(shù)1-7的硫代鏈烷酸等 具有巰基的還原劑等。本發(fā)明中，抗氧化劑例如有異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥 基茴香醚、a-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕 櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊 基酯、沒食子酸丙酯或者乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷酸鈉、偏磷酸 鈉等螯合劑。還可根椐需要封入微膠嚢(羥甲基纖維素、明膠、聚[曱基丙烯酸曱 酉旨]等的微膠嚢)中，或者制成膠體藥物傳遞系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠嚢等)(參照"Remington，s Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed.， 1980等)。并且將藥物制成緩釋性藥劑的 方法是公知的，也可適用于本發(fā)明(Langer等人,，丄Biomed. Mater. Res. 1981， 15: 167-277; Langer， Chem. Tech. 1982, 12: 98-105;美國專利第 3,773,919號(hào);歐洲專利申請(qǐng)公開(EP) 58,481; Sidman等人.，Biopolymers 1983， 22: 547-556;和EP第133,988號(hào))。本發(fā)明涉及含有通過氨基糖的 一種，即葡曱胺進(jìn)行穩(wěn)定的抗體分子 的藥物組合物。本發(fā)明涉及含有通過作為氨基糖的 一種的葡甲胺使其聚 集化得到抑制的抗體分子的藥物組合物。本發(fā)明又涉及含有該藥物組合 物以及藥學(xué)上可接受的栽體的試劑盒。本發(fā)明的藥物組合物和試劑盒中除了上述穩(wěn)定化抗體分子之外，還 可以含有制劑上可接受的材料。制劑上可接受的材料可例舉上述內(nèi)容。本發(fā)明的藥物組合物的形態(tài)(劑型)可以例舉注射劑型、凍干劑型、 溶液劑型或噴霧千燥劑型等，但并不限于此。本發(fā)明的制劑可以以通常密封、滅菌的塑料或玻璃制的瓶、安瓿瓶、 注射器等規(guī)定容量的形狀容器、以及瓶等大容量形狀的容器供給。從使 用方便的角度考慮優(yōu)選預(yù)充式注射器。對(duì)患者給予可以是口服、非口服給予的任意形式，優(yōu)選非口服給予， 例如可以是注射給予。作為注射給予的例子，例如可通過靜脈內(nèi)注射、 肌內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射等進(jìn)行全身或局部給予?？筛鶕?jù)患者 的年齡、癥狀選擇適當(dāng)?shù)慕o予方法。關(guān)于給予量，例如對(duì)蛋白質(zhì)、肽、 抗體，可以是每1 kg體重每次在0.0001 mg-1000 mg的范圍選擇?；蛘?例如每位患者在0.001-100000 mg/個(gè)體的范圍選擇給予量。但是，本發(fā) 明并不受這些給予量和給予方法等的限定。對(duì)于低分子的化合物，成人 的有效成分量是每天在0.1-2000 mg的范圍，但本發(fā)明并不受這些給予 量和給予方法等的限制。本發(fā)明的凍干制劑或噴霧干燥制劑可以在使用前制成溶液制劑。因 此，本發(fā)明也提供含有本發(fā)明凍干制劑或者噴霧干燥制劑、以及藥學(xué)上 可接受的載體的試劑盒。藥學(xué)上可接受的栽體只要是可以使本發(fā)明的凍 千制劑或者噴霧干燥制劑形成溶液制劑即可，對(duì)栽體的種類、是否有組 合等均沒有限制，通過使用本發(fā)明的穩(wěn)定劑作為藥學(xué)上可接受的栽體及 其部分，可以抑制溶液制劑中抗體分子的聚集。本發(fā)明涉及含有抗體的藥物組合物的制備方法，該方法包含向抗體 中添加葡甲胺、使抗體分子穩(wěn)定的步驟。還涉及含有抗體分子的藥物組 合物的制備方法，該制備方法包含向抗體中添加葡甲胺、抑制抗體分子 聚集的步驟。另外，本發(fā)明還涉及含有抗體分子的藥物組合物的制備方法，該方法包含(l)向抗體中添加葡甲胺的步驟，以及(2)將(1)的混合物 制成溶液制劑的步驟。本發(fā)明又涉及含有抗體分子的藥物組合物的制備 方法，該方法包含以下步驟(l)向抗體中添加葡曱胺的步驟；以及(2) 將(1 )的混合物冷凍干燥的步驟。書中。 實(shí)施例以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。[實(shí)施例l]葡甲胺對(duì)hVB22B的穩(wěn)定效果的研究使用純化為高純度的sc(Fv)2, hVB22B sc(Fv)2 u2-wz4 (SEQ ID NO.l,參照以下參考例)，對(duì)葡甲胺抑制聚集反應(yīng)的效果進(jìn)行研究。穩(wěn) 定性試^^中的溶劑條件、hVB22B濃度如下所示。<穩(wěn)定性試驗(yàn)條件>對(duì)照20mM檸檬酸鈉(pH6.5)葡甲胺20mM檸檬酸鈉、pH6.5、 10%葡甲胺hVB22B u2-wz4: 1.0mg/ml上述條件下，在55。C-3天后和6天后，使用SEC(大小排阻層析)， 測定單體殘留率(單體殘留率是熱加速試驗(yàn)樣品的單體峰面積相對(duì)于初 期狀態(tài)單體峰面積的。/。)。 SEC的分析條件如下所示。<SEC的分析條件〉柱TSKgel Super2000sw (TOSOH)洗脫液50mM石舞酸鈉、300 mMKCl， pH 7.0流速0.2ml/分鐘才全測波長220 nmSEC的分析結(jié)果如圖1所示。圖1是在上迷溶液條件下的初始、55。C-3天后、6天后單體殘留率隨時(shí)間變化的圖。由以上結(jié)果表明，與對(duì)照比較，通過添加葡甲胺，單體殘留率大幅 提高，可大幅抑制hVB22B的聚集反應(yīng)。通過本研究發(fā)現(xiàn)通過向穩(wěn)定 性非常低的小分子抗體添加葡曱胺，可以顯著提高其穩(wěn)定性。本研究還 首次表明，葡曱胺可用作蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑。[實(shí)施例2]葡甲胺對(duì)其它的sc(Fv)2分子、以及全長抗體的穩(wěn)定效果的研究在[實(shí)施例l]所示的hVB22B以外的sc(Fv)2:以下所示的mVB22B (SEQIDN0.2,以下參照參考例)、12E10(SEQIDNO.3、 WO02/33072)、 2D7 (SEQ ID NO. 4,以下參照參考例)中，對(duì)葡曱胺的穩(wěn)定化效果進(jìn)行 了研究。還對(duì)不是sc(Fv)2而是全長抗體IgGl的人源化抗IL-6受體抗體 (H鏈-SEQIDNO. 5、 L鏈-SEQ ID N0.6、 W092/19759)的穩(wěn)定化效果進(jìn) 行了研究。穩(wěn)定性試驗(yàn)中的溶劑條件、各抗體濃度如下。<穩(wěn)定性試驗(yàn)條件〉對(duì)照20mM檸檬酸緩沖液，pH6.5葡甲胺20mM檸檬酸緩沖液、10%葡甲胺，pH6.5mVB22B: 28 pg/ml， 40。C-1周后、2周后進(jìn)行測定2D7: 59 jag/ml, 4(TC-1周后、2周后進(jìn)行測定12E10: 10|ig/ml， 55°C-1周后、2周后進(jìn)行測定IgG: 6.84mg/ml, 60。C-周后、3周后進(jìn)行測定在上述條件下實(shí)施熱加速試驗(yàn)。<SEC的分析條件〉對(duì)于mVB22B、 2D7、 12E10,在下述條件下進(jìn)行分析。柱TSKgel Super2000SW (TOSOH)洗脫液50mM磷酸鈉、300 mMKCl， pH 7.0流速0.2ml/分鐘才企測波長220 nm對(duì)于IgG，在下迷條件下進(jìn)行分析。柱TSKgel G3000SWxl (TOSOH)洗脫液DPBS(-) 流速0.5 ml/分鐘才企測波長220 nm圖2表示在上述各溶液加速條件下的聚集物(aggregate)隨時(shí)間變化。 穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果顯示，不僅限于sc(Fv)2、 IgG，在任何分子形式中添 加葡甲胺，都會(huì)抑制聚集物的生成。由以上結(jié)果表明，通過添加葡甲胺， 不僅對(duì)sc(Fv)2,在全長抗體的IgG等抗體分子全體中都具有抑制聚集的 效果。目前并未報(bào)道葡甲胺作為抗體分子穩(wěn)定劑的作用，本研究首次了 解了葡甲胺可用作抗體分子的穩(wěn)定劑。[實(shí)施例3]作為IgG的溶液穩(wěn)定劑、凍干制劑的賦型劑的葡曱胺的研究 研究了葡甲胺作為IgG的溶液制劑的穩(wěn)定劑、或者作為凍干制劑的賦型劑的穩(wěn)定化效果。使用通常的蔗糖作為IgG的穩(wěn)定劑(賦型劑)的比較。有報(bào)道稱蔗糖作為制劑的凍干制劑非常有效。用于試驗(yàn)的試樣和穩(wěn)定試驗(yàn)性條件如下所示。 <供給試驗(yàn)的試樣>試樣l: IgG80mg/瓶、蔗糖100mg/瓶，聚山梨醇80 1mg/瓶，磷酸 鈉鹽30nmol/弁瓦，pH6.0試樣2: IgG 80mg/瓶、蔗糖70 mg/瓶，聚山梨醇80 lmg/瓶，磷酸 鈉鹽30 inmol/瓶，pH6.0試樣3: IgG 80mg/瓶、蔗糖50 mg/瓶，聚山梨醇80 lmg/瓶，磷酸 鈉鹽30pmol/瓶，pH6.0試樣4: IgG 80mg/瓶、葡甲胺55mg/瓶，聚山梨醇80 1mg/瓶，磷 酸鈉鹽30 nmol/弁瓦，pH6.0試樣5: IgG 80mg/瓶、葡甲胺40mg/瓶，聚山梨醇80 1mg/瓶，磷 酸鈉鹽30 pmol/瓶，pH6.0試樣6: IgG 80mg/瓶、葡甲胺30mg/瓶，聚山梨醇80 lmg/瓶，磷 酸鈉鹽30 pmol/并瓦，pH6.0對(duì)于上述試樣的凍干制劑，將要IgG濃度為40 mg/ml的冷凍干燥前 的溶液以各2 ml填充到瓶中，使用架式冷凍干燥機(jī)進(jìn)行包含下迷條件的 冷凍干燥。*冷凍干燥條件步驟名 溫度預(yù)備冷凍 -50°C一次干燥 -20'C 二次干燥 25—30°C上述試樣的溶液制劑是通過在每一瓶凍干制劑中添加0.6 ml注射水 來制備。此時(shí)，IgG的濃度約為120mg/ml。<穩(wěn)定性試驗(yàn)條件〉冷凍干燥前后對(duì)冷凍干燥前的溶液和冷凍干燥制劑進(jìn)行測定凍干制劑對(duì)40'C-l個(gè)月的保存試樣進(jìn)行測定溶液制劑對(duì)25°C-2周的保存試樣進(jìn)行測定<SEC的分析條件〉按照以下分析條件進(jìn)行測定。柱TSKgel G3000SWxl (TOSOH)洗脫液pH 7.0的磷酸緩沖液(含有300 mmol/1氯化鈉和0.05%疊氮 化鈉的pH 7.0的50 mmol/L磷酸緩沖液) 流速1 ml/分鐘 檢測波長280 nm圖3中表示與冷凍干燥前后(冷凍干燥前的溶液和凍干制劑)的聚集 物含量有關(guān)的蔗糖和葡曱胺的比較，以及與制備凍干制劑、4(TC-1個(gè)月 加速試驗(yàn)后聚集物含量相關(guān)的蔗糖和葡甲胺的比較，以及與溶液制劑中 25°C-2周加速試驗(yàn)后聚集物含量相關(guān)的蔗糖和葡甲胺的比較。在任何比較中，與蔗糖相比，葡甲胺均使聚集物含有率降低。由此 發(fā)現(xiàn)，葡甲胺對(duì)于聚集物的生成的穩(wěn)定化作用比蔗糖更大。該穩(wěn)定化作 用中可見葡甲胺的濃度依賴性，葡甲胺濃度越高則越可見高的穩(wěn)定化作 用。即，相對(duì)于冷凍干燥步驟中抗體的干燥應(yīng)激，通過添加葡曱胺，葡 甲胺濃度相關(guān)性地抑制冷凍干燥導(dǎo)致的聚集物的增加。同樣也可抑制凍 千制劑40°C-1個(gè)月保存導(dǎo)致的聚集化。還發(fā)現(xiàn)，對(duì)于濃度約為120mg/ml 的溶液制劑，同樣也可抑制25°C-2周保存導(dǎo)致的聚集化。對(duì)于上迷超過 100 mg/ml的高濃度溶液制劑，不管是溶液狀態(tài)還是冷凍干燥狀態(tài)，葡 曱胺與葡萄糖相比均具有高的穩(wěn)定化效果?！紝?shí)施例4]在hVB22B u2-wz4在-20。C下冷凍保存時(shí)葡甲胺的穩(wěn)定化效果按照本發(fā)明參考例1-3、 WO2005/056603或WO2005/056604所示的方法表達(dá)hVB22Bu2-wz4,純化單鏈雙抗體型sc(Fv)2。使用純化的單鏈 雙抗體型sc(Fv)2,制備以下溶液條件的配方(F1和F2)。 Fl: 10 mg/ml單鏈雙抗體型sc(Fv)220 mM組氨酸(pH 6,8) +150 mM NaCl+0.5 mg/ml聚山梨醇80 F2: 10 mg/ml單鏈雙抗體型sc(Fv)2+150 mM葡甲胺 20 mM組氨酸(pH 6.8) +150 mM NaCl+0.5 mg/ml聚山梨醇80 將這些試樣在-20。C下冷凍保存6個(gè)月。使用SEC(凝膠過濾色語)， 在以下的條件下對(duì)保存前的試樣(初始)的聚集物含有率和在-20。C下保 存6個(gè)月后的試樣(-20'C 6個(gè)月)的聚集物的含有率進(jìn)行分析。 液相色譜柱TSKgel G3000SWXL (東乂 一)移動(dòng)相50 mM磷酸緩沖液(pH 7.0)+300 mM氯化鉀流速0.5ml/分鐘檢測220 nm試樣注入量10^1柱溫二 室溫樣品溫度5 C圖4表示經(jīng)SEC分析的保存前的試樣和-20'C "6個(gè)月保存后的試樣 的聚集物含有率。關(guān)于聚集物的增加量，-20°<:.6個(gè)月后，在不含有葡 甲胺的Fl中聚集物增加了 4.8%，而含有葡甲胺作為穩(wěn)定劑的F2中聚集 物的增加抑制為0.4%。本實(shí)施例顯示，葡曱胺在冷凍狀態(tài)下也具有穩(wěn)定 蛋白質(zhì)的作用?！紝?shí)施例5]葡曱胺在人源化雙特異性抗體hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ中的穩(wěn)定效果使用純化的人源化雙特異性抗體hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ，制備 以下溶液條件的配方(AF1、 AF2、 AF3)。含有hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ 的人源化雙特異性抗體是IgG4型抗體，是含有SEQ IDNO.49所示的第 一 H鏈的可變區(qū)(hA69-KQ)、 SEQ ID NO.50所示的第二 H鏈的可變區(qū) (hB26-PF)、以及與各H鏈共通的SEQ ID N0.51所示的L鏈的可變區(qū) (hAL-AQ)的抗體。AF1: 20mM 組氨酸-HC1, 50mM NaCl, pH5.8， 120mg/mlhA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQAF2: 20mM組氨酸-HCl， 50mM NaCl， pH5.8， 200mM葡曱胺，pH5.8 120mg/ml hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQAF3: 20mM組氨酸-HCl， 50mM NaCl， 200mM精氨酸-HCl, pH5.8 120mg/ml hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ。將這些試樣在25。C下常溫保存2個(gè)月。使用SEC(凝膠過濾色鐠)， 在以下的條件下對(duì)保存前的試樣(初始)的聚集物含有率和25°C-2個(gè)月保 存后的試樣(25'C-2M)的聚集物含有率進(jìn)行分析。測定時(shí)，使用SEC的 移動(dòng)相將AF1、 AF2、 AF3稀釋為1 mg/ml，使用稀釋的試樣進(jìn)行分析。液相色譜柱TSKgel G3000SWXL(東乂一)移動(dòng)相50 mM磷酸緩沖液(pH 7.0)+300 mM氯化鉀流速0.5 ml/分鐘檢測220 nm試樣注入量10 pi (用移動(dòng)相將120 mg/mL的溶液稀釋為1 mg/mL, 注入所得溶液)柱溫二 室溫沖羊品溫度5 。C圖5中顯示，徑SEC分析的保存前的試樣和25。C '2個(gè)月后的試樣 的聚集物含有率。關(guān)于25。C 6個(gè)月的聚集物的增加量，在不含有穩(wěn)定 劑的AF1中聚集物增加了 0.51%;而在含有葡甲胺作為穩(wěn)定劑的AF2中， 可以將聚集物的增加抑制為0.26%;含有精氨酸作為穩(wěn)定劑的AF3中， 聚集物的增加為0.27%,與精氨酸比較，葡甲胺具有同等或以上的穩(wěn)定 化效果。另外，與實(shí)施例3同樣，在含有120 mg/ml的高濃度人源化雙 特異性抗體hA69-KQ/hB26-PF/hAL-AQ溶液中，葡甲胺也顯示具有穩(wěn)定 化效果。另外，葡甲胺不^f叉對(duì)IgG、 sc(Fv)2,在雙特異性IgG中也顯示 具有穩(wěn)定化效果，因此可廣泛用作蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑使用。以下，對(duì)于本發(fā)明的sc(Fv)2抗體(hVB22B、 mVB22B、 2D7)的制作 方法給出了參考例，但本發(fā)明并不限于這些參考例。[參考例1]抗人Mpl抗體的制備1.1表達(dá)Mpl的BaF3細(xì)胞林的構(gòu)建為了獲得TPO依賴的生長性的細(xì)胞林，構(gòu)建了表達(dá)全長Mpl基因 的BaF3細(xì)胞林。通過PCR擴(kuò)增全長人Mpl cDNA (Palacios， R.等人.，Cell, 41, 727-734 (1985)) (GenBank#NM005373)，克隆到除去了 pCHOI(Hirata, Y. 等人.，F(xiàn)EBS Letter, 356， 244-248 (1994))的DHFR基因表達(dá)區(qū)域、插入 HEF-VH-g丫l (Sato， K.等人.，Mol Immunol., 31, 371-381 (1994))的新霉素 抗性基因表達(dá)區(qū)域的表達(dá)栽體pC0S2上，構(gòu)建pCOS2-hMplfu11。使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech制)，從由食蟹猴 骨髓細(xì)胞中提取的總RNA中克隆食蟹猴Mp!cDNA(SEQIDN0.7)。將 所得食蟹猴cDNA插入到pCOS2中，構(gòu)建pCOS2-猴Mplfull。通過PCR擴(kuò)增全長小鼠Mpl cDNA (GenBank#NM—010823),插入到 pCOS2中，構(gòu)建pCOS2-小鼠Mplfull。將制備的各載體(20嗎)與懸浮在PBS中的BaF3細(xì)胞(lxl(^細(xì)胞/ml) 混合，加入到基因脈沖池(Gene Pulser cuvettes)中，使用Gene Pulser II (Bio-Rad)，以0.33 kV、 950 pFD的容量施加脈沖。將通過電穿孔處理導(dǎo) 入了基因的BaF3細(xì)胞加入到含有1 ng/ml小鼠干擾素3(以下稱為mIL-3, Peprotech制)、500 pg/ml遺傳霉素(Invitrogen制)、10% FBS (Invitrogen 制)的RPMI1640培養(yǎng)基(Invitrogen制)，進(jìn)行篩選，構(gòu)建人表達(dá)Mpl的 BaF3細(xì)胞抹(以下稱為BaF3-人Mpl)、猴表達(dá)Mpl的BaF3細(xì)胞抹(以下 稱為BaF3-猴Mpl)和小鼠表達(dá)Mpl的BaF3細(xì)胞林(以下稱為BaF3-小鼠 Mpl)。篩選后使用含有1 ng/ml rhTPO (R&D制)、10% FBS的RPMI1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)并保持。1.2表達(dá)Mpl的CHO細(xì)胞林的構(gòu)建為了獲得使用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)結(jié)合活性的細(xì)胞林，進(jìn)行表達(dá)全長 Mpl基因的CHO細(xì)胞林的構(gòu)建。首先，在pCXN2 (Niwa, H.等人.，Gene, 108， 193-199 (1991))的 Hindlll位點(diǎn)插入pCHOI的DHFR基因表達(dá)區(qū)域，制備表達(dá)栽體pXND3。 以pCOS2-hMplfu11、 pCOS2-猴Mplfull和pCOS2-小鼠Mplfull為模板， 使用含有His-tag序列的引物，通過PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增得到的各Mpl基 因克隆到pCXND3上，構(gòu)建pCXND3-hMpl-His、 pCXND3-猴Mpl-His、 pCXND3-小鼠Mpl-His。將制備的各栽體(25 pg)與懸浮于PBS中的CHO-DG44細(xì)胞(lxl07 細(xì)胞/ml)混合，加入到基因脈沖池中，使用GenePulserII(Bio-Rad),以 1.5 kV、 25 pFD的容量施加脈沖。將通過電穿孔處理導(dǎo)入了基因的CHO 細(xì)胞加入到含有500 ng/ml遺傳霉素、lxHT (Invitrogen制)的 CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(Invitrogen制)，進(jìn)行篩選，構(gòu)建人表達(dá)Mpl的CHO 細(xì)胞林(以下稱為CHO-人Mpl)、猴表達(dá)Mpl的CHO細(xì)胞林(以下稱為 CHO-猴Mpl)和小鼠表達(dá)Mpl的CHO細(xì)胞抹(以下稱為CHO-小鼠Mpl)。1.3可溶型人Mpl蛋白質(zhì)的制備為了制備可溶型人Mpl蛋白質(zhì)，如下構(gòu)建在昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞中分 泌生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)。制備在人Mpl的胞外區(qū)(Gln26-Trp491)的下游附加FLAG標(biāo)簽的基 因，將該基因插入到pBACSurf-l轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(Novagen制)的Ps"畫SmaI位 點(diǎn)，制備pBACSurfl-hMpl-FLAG。接著，使用Bac-N-Blue轉(zhuǎn)染試劑盒 (Invitrogen制)，將4 pg pBACSurfl-hMpl-FLAG導(dǎo)入Sf9細(xì)胞中。培養(yǎng) 三天后回收培養(yǎng)上清，通過噬菌斑測定分離重組病毒。制備病毒懸液后 感染Sf9細(xì)胞，回收培養(yǎng)上清。使用所得培養(yǎng)上清，如下純化可溶型人Mpl蛋白質(zhì)。將培養(yǎng)上清吸 附于Q Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences制)，然后使用50 mM 磷酸鈉緩沖液、0.0P/q(v/v)吐溫20、 500 mM氯化鈉(pH7.2)進(jìn)行洗脫。 將洗脫液吸附于FLAGM2-瓊脂糖(SIGMA-ALDRICH制)，然后使用100 mM甘氨酸-鹽酸、0.0r/。(v/v)吐溫20 (pH 3.5)洗脫。洗脫后立即用1 M Tris-鹽酸(pH 8.0)中和，使用PD-10柱(Amersham Biosciences制)進(jìn)行 PBS(-)、 0.01% (v/v)吐溫20的置換。將純化的可溶型Mpl蛋白質(zhì)稱為 shMpl-FLAG。1.4人Mpl-IgGFc融合蛋白的制備人Mpl-IgG Fc融合蛋白基因按照Bennett等人的方法(Bennett， B. D. 爭人，丄Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991))制備。將編碼人Mpl胞夕卜 區(qū)(Gln 26-T卬491)的堿基序列與編碼人IgG-丫l的Fc區(qū)(Asp216下游區(qū)域) 的堿基序列連接，在連接部位附加Bst EII序列(氨基酸Val-Thr)作為融 合接頭。信號(hào)序列使用人IgG H鏈可變區(qū)的信號(hào)肽19個(gè)氨基酸。將所得的人Mpl-IgG Fc融合蛋白基因克隆到pCXND3上，構(gòu)建 pCXND3-hMpl-Fc。將制備的栽體(25 pg)與懸浮于PBS的CHO-DG44細(xì)胞(1"07細(xì)胞 /ml)混合。加入到基因脈沖池中，使用Gene Pulser II (Bio-Rad)，以1.5 kV、 25 ^FD的容量施加脈沖。將通過電穿孔處理導(dǎo)入了基因的CHO細(xì)胞加 入到含有500 ^g/ml遺傳霉素、lxHT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中，進(jìn)行 篩選，構(gòu)建表達(dá)shMPL-Fc的CHO細(xì)胞林(CHO-hMpI-Fc)。使用所得培養(yǎng)上清，如下對(duì)人Mpl-IgG Fc融合蛋白進(jìn)行純化。 將培養(yǎng)上清吸附于Q瓊脂糖Fast Flow (Amersham Biosciences)后， 使用50 mM磷酸鈉緩沖液、0.0P/o(v/v)吐溫20、 1 M氯化鈉(pH 7.6)進(jìn) 行洗脫，將洗脫液吸附于HiTrap蛋白G HP柱(Amersham Biosciences), 然后用0.1 M甘氨酸-HC1、 150mMNaCl、 0.01% (v/v)吐溫20 (pH 2.7) 洗脫。洗脫后立即用1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和。用PD-10 columns (Amersham Biosciences),進(jìn)行PBS(-)、 0.01%(v/v)吐溫20的置換。將 純化的可溶型Mpl蛋白質(zhì)稱為hMpl-Fc。1.5 shMpl-FLAG或BaF3-人Mpl的免疫以及雜交瘤的篩選 使用MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr小鼠(以下稱為MRL/lpr小鼠，購自日 本Charles River),從8周齡開始免疫。初次免疫是在100 ing/只的 shMPL-FLAG中加入氟氏完全佐劑(H37Ra, Beckton Dickinson制)，將乳 化液皮下給予。追加免疫是在50 ^g/只的shMPL-FLAG中加入氟氏不完 全佐劑(Beckton Dickinson制)，將乳化液皮下給予。共進(jìn)行六次免疫， 然后對(duì)三只小鼠通過尾靜脈內(nèi)給予50 iug/只shMPL-FLAG進(jìn)行最終免 疫。將小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3-X63Ag8Ul(P3Ul、購自ATCC)與小鼠脾臟細(xì) 胞混合， 一邊加入聚乙二醇1500 (Roche Diagnostics制)一邊混合，進(jìn)行 細(xì)胞融合。第二天使用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，使用培養(yǎng)上清，實(shí)施使 用shMPL-FLAG或hMpl-Fc固相化的免疫板的ELISA、以及以使用BaF3-人Mpl的細(xì)胞生長活性為指標(biāo)的篩選。將BaF3-人Mpl以每只Balb/c小 鼠1.0"07個(gè)細(xì)胞、以1周至5個(gè)月的間隔腹腔內(nèi)給予，共免疫ll次。 同樣通過細(xì)胞融合制備雜交瘤，實(shí)施以使用BaF3人Mpl的細(xì)胞生長活性為指標(biāo)的篩選。陽性克隆是通過極限稀釋法進(jìn)行單克隆化，然后放大 培養(yǎng)，回收培養(yǎng)上清。1.6抗人Mpl抗體的分析抗體濃度是使用山羊抗小鼠IgG (gamma) (ZYMED制)和堿性磷酸 酶-山羊抗小鼠IgG (gamma) (ZYMED制)進(jìn)行小鼠IgG的夾層ELISA， 以等同同型的市售抗體作為標(biāo)準(zhǔn)品；使用GraphPad Prism (GmphPad Software, USA)制備校正曲線，進(jìn)行抗體濃度的換算。抗體的同型通過使用同型特異性第二抗體的抗原相關(guān)性ELISA確 定。將hMpl-Fc用包被液(O.l mM NaHC03, (pH9.6)， 0.02% (w/v) NaN3) 稀釋，濃度為lng/ml，在4r下反應(yīng)過夜，進(jìn)行包被，然后用稀釋緩沖 液(50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 1 mM MgCl2， 150 mM NaCl， 0.05% (v/v)吐 溫20, 0.02% (w/v) NaN3, 1°/。 (w/v) BSA))進(jìn)行封閉處理，加入雜交瘤的培 養(yǎng)上清，在室溫下放置1小時(shí)。用淋洗緩沖液(0.0S。/()(v/v)吐溫20,PBS) 清洗，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的同型特異性第二抗體，在室溫下放置1小 時(shí)。顯色是使用將SIGMA104 (Sigma-Aldrich)用底物緩沖液(50 mM NaHC03 (pH9.8), 10 mM MgCl2)稀釋為1 mg/ml所得，通過Benchmark Plus (Bio-Rad)測定405 nm的吸光度。與shMpl-FLAG和hMPL-Fc的結(jié)合活性通過ELISA進(jìn)行評(píng)價(jià)。包被 純化的shMpl-FLAG和hMPL-Fc,濃度為1 |ug/ml，然后用稀釋緩沖液進(jìn) 行封閉處理。加入雜交瘤的培養(yǎng)上清，在室溫下放置l小時(shí)，然后加入 堿性磷酸酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Zymed)，與上述方法同樣地進(jìn)行顯 色。在室溫下顯色1小時(shí)后測定405 nm的吸光度，用GraphPad Prism 計(jì)算EC50值?；厥誄HO-人Mpl或CHO-猴Mpl,懸浮于FACS緩沖液(1 % FBS/ PBS) 中，使?jié)舛葹镮xlO6細(xì)胞/ml。分注到Multiscreen (Millipore)中，以100 pi/ 孔分注，通過離心操作除去培養(yǎng)上清。加入稀釋的培養(yǎng)上清，濃度為5 (ig/ml,在冰上反應(yīng)30分鐘。將細(xì)胞用FACS緩沖液清洗一次，添加FITC 標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(Beckman Coulter制)，在冰上反應(yīng)30分鐘。反應(yīng) 后以500 rpm離心1分鐘，除去上清，懸浮于400 pi FACS緩沖液中， 使用EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter制)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。通過前向 散射光和側(cè)向散射光的直方圖在活細(xì)胞集團(tuán)中設(shè)定閥?？贵w的激動(dòng)活性使用顯示TPO依賴性生長的BaF3-人Mpl或BaF3-猴Mpl進(jìn)行評(píng)價(jià)。將各細(xì)胞懸浮于含有10%胎牛血清(Invitrogen制)的RPMI1640 (Invitrogen制)中，使其濃度為4xl05細(xì)胞/ml,以60 pl/孔分 注到96孔板中，向各孔中加入40 pl rh丁PO和各種濃度的雜交瘤培養(yǎng)上 清，在37。C下、5%(:02的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。以10 一/孔加入細(xì)胞計(jì) 數(shù)試劑SF (Nacalai Tesque制)，培養(yǎng)2小時(shí)，然后用Benchmark Plus測 定450 nm的吸光度(對(duì)照655 nm),用GraphPad Prism計(jì)算ECs。值。 由這些分析共得到了 163個(gè)與人Mpl結(jié)合的小鼠單克隆抗體。 以下記栽的抗人Mpl抗體中，TA136由BaF3-人Mpl免疫小鼠構(gòu)建， 除此之外的抗體由shMpl-Flag免疫小鼠構(gòu)建。1.7抗人Mpl抗體的純化使用雜交瘤的培養(yǎng)上清，如下進(jìn)行抗人Mpl抗體的純化。 將培養(yǎng)上清吸附于HiTrap蛋白G HP柱(Amersham Biosciences),然后用0.1 M甘氨酸-鹽酸(pH2.7)洗脫。洗脫后立即用1 M Tds-HCl (pH 9.0)中和，用PBS進(jìn)行過夜透析，進(jìn)行緩沖液置換。1.8抗人Mpl抗體VB22B的表位確定利用抗人Mpl抗體VB22B可在蛋白質(zhì)印跡中使用的性質(zhì)，構(gòu)建人 Mpl的部分序列與GST的融合蛋白，進(jìn)行VB22B表位分析。分別通過 PCR擴(kuò)增MG1 (Gln26 -Trp491)、 MG2 (Gln26-Leu274)的區(qū)域，克隆到 pGEX-4T-3 (Amersham制)上，使其以GST融合蛋白的形式表達(dá)。將質(zhì) 粒DNA導(dǎo)入DH5a中，得到轉(zhuǎn)化體，向?qū)?shù)生長期的轉(zhuǎn)化體中加入IPTG, 濃度為1 mM,由此誘導(dǎo)GST融合蛋白的表達(dá)，培養(yǎng)2小時(shí)后回收菌體。 通過超聲波破碎，用XL-80 超速離心機(jī)(Beckman,轉(zhuǎn)子70.1Ti)、以 35,000 rpm離心30分鐘，然后回收培養(yǎng)上清，使用GST純化組件 (Amersham制)進(jìn)行純化。通過10%-SDS-PAGE進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)印PVDF 膜，進(jìn)行使用VB22B小鼠抗體的蛋白質(zhì)印跡。VB22B識(shí)別MG-l、MG-2， 因此表明VB22B的表位在Gln26-Leu274的區(qū)域。接著，制備MG3 (Gln26-Ala189)、 MG4 (Gln26-Pro106)、 MG5 (Gln26-Glu259)、 MG6 (Gln26-Gly245)的區(qū)域與GST的融合蛋白，同樣 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，結(jié)果，VB22B識(shí)別MG5、 MG6,但不識(shí)別MG3、 MG4, 由此可以預(yù)想VB22B的表位存在于Alal89-Gly245的周圍。再制備 MG7(Gln26-Ala231)、MG8(Gln26-Pro217)與GST的融合蛋白，進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果，VB22B識(shí)別MG7，但不識(shí)別MG8，由此顯示VB22B的表位存在 于Gln217-Ala213的附近。再確認(rèn)MG10 (Gln213-Ala231)與GST的融合 蛋白的結(jié)合，由此限定了 VB22B的表位是Gln213-Ala231的19個(gè)氨基酸。1.9 /L八JVipi機(jī),VtJ〃t3日7機(jī)盡機(jī)，又^日7又^還厭,王化、利用抗人Mpl抗體VB22B與可溶型重組Mpl結(jié)合的性質(zhì)，對(duì)實(shí)施 例1.4中所示的人Mpi-IgG Fc融合蛋白與VB22B IgG的抗原抗體反應(yīng)的 速度進(jìn)行理論分析。在Biacore 2000 (Biacore)上設(shè)置傳感芯片CM5 (Biacore)，通過胺偶聯(lián)法將人Mpl-IgG Fc融合蛋白固定。接著使用 HBS-EP緩沖液(Biacore)制備1.25-20 ^g/ml的VB22B IgG,添加2分鐘 的VB22B IgG，獲得結(jié)合區(qū)域，然后再添加2分鐘的HBS-EP緩沖液， 得到解離區(qū)域。在傳感芯片上的與人Mp卜IgG Fc融合蛋白結(jié)合的VB22B IgG通過添加15秒鐘10 mM氫氧化鈉除去，使傳感芯片再生。使用 SBS-EP緩沖液作為運(yùn)行緩沖液，流速為20pl/分鐘。使用BIAevaluation Version 3,1軟件(Biacore)，由在各濃度下得到的傳感圖譜(sensorgrams) 計(jì)算反應(yīng)速度常數(shù)。結(jié)果，VB22B IgG的解離常數(shù)(KB)為1.67士0.713xl(T9 M。[參考例2]抗人Mpl單鏈抗體的制備在取得的抗人Mpl抗體中，對(duì)于結(jié)合活性和激動(dòng)活性高的23種抗 體通過基因工程方法構(gòu)建單鏈抗體的表達(dá)體系。以下給出抗人Mpl抗體 VB22B的單鏈抗體制備例。2.1抗人Mpl抗體可變區(qū)的克隆使用由生產(chǎn)抗人Mpl抗體的雜交瘤提取的總RNA，通過RT-PCR 法進(jìn)行擴(kuò)增?？俁NA是使用Rneasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN)，從 1 x io7個(gè)細(xì)胞的雜交瘤中提取。使用1 pg的總RNA,使用SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒 (Clontech),使用與小鼠IgG2b恒定區(qū)序列互補(bǔ)的合成寡核苷酸 MHC-IgG2b (SEQ ID N0.8)或與小鼠k鏈恒定區(qū)堿基序列互補(bǔ)的合成寡 核苷酸kappa (SEQ ID NO,9)擴(kuò)增5'末端一側(cè)的基因片段。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在42。C下進(jìn)行1小時(shí)30分鐘。PCR反應(yīng)溶液(50 iil)的組成如下所示。 5 pl的10xAdvantage 2 PCR緩沖液 5pl的10x通用引物AMix 0.2 mM dNTPs (dATP， dGTP， dCTP, dTTP) 1 pl的Advantage 2聚合酶Mix(以上成分均為CLONTECH制)、 2.5 pi反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 10 pmol合成寡核苷酸MHC-IgG2b或kappa 反應(yīng)溫度條件如下。 94。C的初始溫度30秒、 將94。C/5秒、72°C/3分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次, 將94。C/5秒、7(TC/10秒、72°C/3分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次， 將94°C/5秒、68'C/10秒、72°C/3分鐘的循環(huán)進(jìn)行25次, 最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱7分鐘。PCR產(chǎn)物使用QIAquick Gel提取試劑盒(QIAGEN)，由瓊脂糖凝膠 中純化，然后克隆到pGEM-T Easy栽體上(Promega)。再使用ABI 3700 DNA測序儀(Perkin Elmer制造)確定堿基序列?？寺〉腣B22B H鏈可變區(qū)(以下稱為VB22B-VH)的堿基序列SEQ ID NO.0,氨基酸序列表示為SEQ ID NO.ll， L鏈可變區(qū)(以下稱為 VB22B-VL)的堿基序列表示為SEQ ID N0.12,氨基酸序列表示為SEQ ID NO,13。2.2抗人Mpl抗體雙抗體表達(dá)栽體的制備編碼VB22B單鏈Fv(以下稱為VB22B雙抗體)的基因(該基因使用含 有5個(gè)氨基酸的接頭序列)如下構(gòu)建分別使用PCR法，對(duì)編碼 VB22B-VH的基因的3，末端和編碼VB22B-VL的基因的5，末端上附加編 碼含(Gly4Ser),的接頭的堿基序列的基因進(jìn)行擴(kuò)增，再連接。VB22B-VH的正向引物70.115HF (SEQ ID N0.14)設(shè)計(jì)成具有EcoIR 位點(diǎn)，VB22B-VH的反向引物33.115HR (SEQ ID N0.15)設(shè)計(jì)成與編碼 VB22B-VH的C末端的DNA雜交、且具有與編碼含(Gly4Ser),的接頭的堿基序列和與編碼VB22B-VL的N末端的DNA雜交的堿基序列。 VB22B-VL的正向引物33.115LF (SEQ ID N0.16)設(shè)計(jì)成具有編碼 VB22B-VL的N末端的堿基序列、以及編碼含有(Gly4Ser)！的接頭的堿基 序列、編碼VB22B-VH的C末端的堿基序列。VB22B-VL的反向引物 33.U5LR (SEQ ID N0.17)設(shè)計(jì)成與編碼VB22B-VL的C末端的DNA雜 交、且具有編碼FLAG標(biāo)簽(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys /SEQ ID N0.18)的堿基序列、并具有NotH立點(diǎn)。第一 PCR中，如下合成含有VB22B-VH和接頭序列、以及VB22B-VL 和接頭序列的兩個(gè)PCR反應(yīng)物。PCR反應(yīng)溶液(50 iul)的組成如下所示。5 Jul的lOxPCR緩沖液0.4 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)2.5單位的DNA聚合酶Takara Ex Taq (以上成分均為寶酒造制)。10 ng含有VB22B-VH或VB22B-VL基因的pGEM-T Easy載體10 pmol合成寡核苷酸70.115HF和33.115HR、或33'115LF和 33.115LR反應(yīng)溫度條件如下。94。C的初始溫度30秒、將94。C/15秒、70°C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、70。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94°C/15秒、68°C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行28次，最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱5分鐘 使用QIAquickGel提取試劑盒(QIAGEN制)，從瓊脂糖凝膠中純化 約400bp的PCR產(chǎn)物，使用各PCR產(chǎn)物的一部分如下進(jìn)行第二 PCR PCR反應(yīng)溶液(50^U)的組成如下所示。 5 pi的lOxPCR緩沖液 0.4 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.5單位的DNA聚合酶Takara Ex Taq (以上成分均為寶酒造制)。 1 ^的第一PCR產(chǎn)物(2種)10pmol合成寡核苷酸70.115HF、 33.U5LR反應(yīng)溫度條件如下。94。C的初始溫度30秒、將94。C/15秒、72。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、7(TC/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94°C/15秒、68°C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行28次，最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱5分鐘。使用QIAquick Gel提取試刑盒(QIAGEN)，從瓊脂糖凝膠中純化， 用限制酶EcoII (寶酒造制)和限制酶Notl (寶酒造制)消化，然后使用 QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化，克隆到pCXND3上，制備 pCXND3-VB22B db。2.3抗人Mpl抗體sc(Fv)2表達(dá)栽體的制備為了制備表達(dá)含有來自VB22B的兩個(gè)H鏈可變區(qū)和兩個(gè)L鏈可變 區(qū)的突變抗體[sc(Fv)2]的質(zhì)粒，使用上述的pCXND3-VB22Bdb，如下通 過PCR法進(jìn)行修飾。首先，對(duì)于在編碼VB22B-VH的基因的3'末端和編碼VB22B-VL 的基因的5'末端附加編碼含15個(gè)氨基酸的接頭(Gly4Ser)3的堿基序列得 到的基是因分別用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，通過連接構(gòu)建的。該構(gòu)建過程中， 新設(shè)計(jì)了三種引物。VB22B-VH的正向引物VB22B-fpvu (引物A, SEQ ID NO,19)設(shè)計(jì)成在5'末端具有EcoIR位點(diǎn)、VB22B db的Gln22和Leu23 變換為PvuII位點(diǎn)。VB22B-VH的反向引物sc-rL15 (引物B， SEQ ID NO.20)設(shè)計(jì)成與編碼VB22B-VH的C末端的DNA雜交，且具有編碼含 (Gly4Ser)3的接頭的堿基序列、以及與編碼VB22B-VL的N末端的DNA 雜交的堿基序列。VB22B-VL的正向引物sc-fL 15 (引物C, SEQ ID NO.21) 設(shè)計(jì)成具有編碼VB22B-VL的N末端的堿基序列、以及編碼含有 (Gly4Ser)3的接頭的堿基序列、編碼VB22B-VH的C末端的堿基序列。第一PCR中，如下合成含有VB22B-VH和接頭序列、VB22B-VL 和接頭序列的兩個(gè)PCR反應(yīng)物。PCR反應(yīng)溶液(50 pl)的組成如下所示。5 ^的10xPCR緩沖液0,4 mM dNTPs (dATP, dGTP, dC丁P， dTTP)2.5單位的DNA聚合酶Takara Ex Taq(以上成分均為寶酒造制)。 10ngpCXND3-VB22B db10pmol合成寡核苷酸VB22B-fpvu、 sc-rL15或sc-fL15、 33.115LR(引物D)反應(yīng)溫度條件如下。94。C的初始溫度30秒、將94。C/15秒、72。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、7(TC/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、68。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行28次，最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱5分鐘。使用QIAquickGel提取試劑盒(QIAGEN制)，從瓊脂糖凝膠中純化 約400 bp的PCR產(chǎn)物，使用各PCR產(chǎn)物的一部分如下進(jìn)行第二PCR。 PCR反應(yīng)溶液(50pl)的組成如下所示。 5 pl的10xPCR緩沖液 0.4 mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.5單位的DNA聚合酶Takara Ex T叫 (以上成分均為寶酒造制)。 1 pi的第一 PCR產(chǎn)物(2種) 10pmol合成寡核苷酸70.115HF、 33 115LR 反應(yīng)溫度條件如下。 94。C的初始溫度30秒、 將94。C/15秒、72。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次， 將94。C/15秒、7(TC/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次， 將94。C/15秒、68X:/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行28次， 最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱5分鐘。使用QIAquick Gel提取試劑盒(QIAGEN制)從瓊脂糖凝膠中純化約 800 bp的PCR產(chǎn)物，然后用限制酶EcoEI (寶酒造制)和限制酶NotI (寶 酒造制)消化，使用QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)純化，克隆到 pBacPAK9 (Clontech)上，制備pBacPAK9-scVB22B。接著，制備插入到pBacPAK9-scVB22B的PvuII位點(diǎn)的片段。即， 該片段是將編碼N末端缺損的VB22B-VH和VB22B-VL用含(Gly4Ser》 的接頭連接得到的氨基酸的基因進(jìn)一步用編碼VB22B-VH的N末端的 基因和編碼含(Gly4Ser)3的接頭的堿基序列連接得到的片段，是兩末端為 PvuII識(shí)別序列的片段。新設(shè)計(jì)兩種引物，使用PCR法制備該片段。目 標(biāo)片段的正向引物Fv2-f (引物E, SEQ ID N0.22)設(shè)計(jì)成在5'末端具有 PvuII位點(diǎn)，并具有VB22B-VH的5'末端一側(cè)的序列。目標(biāo)片段的反向 引物Fv2-r (引物F, SEQ ID NO,23)設(shè)計(jì)成與編碼VB22B-VL的C末端 的DNA雜交，且具有編碼含有(Gly4Ser)3的接頭的堿基序列、以及與編 碼VB22B-VH的N末端的DNA雜交的堿基序列，并且具有PvuII位點(diǎn)。 以pBacPAK9-scVB22B為模板，如下進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)溶液(5(^1)的組成如下所示。5 pi的10xPCR緩沖液0.4 mM dNTPs (dATP, dGTP， dC丁P, dTTP)2.5單位的DNA聚合酶Takara Ex T叫 (以上成分均為寶酒造制)。10網(wǎng)的pBacPAK9-scVB22B10pmol合成寡核苷酸Fv2-f、 Fv2-r反應(yīng)溫度條件如下。94。C的初始溫度30秒、將94。C/15秒、72°C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、7(TC/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行5次，將94。C/15秒、68。C/2分鐘的循環(huán)進(jìn)行28次，最后在72。C下將反應(yīng)產(chǎn)物加熱5分鐘。使用QIAquick Gel提取試劑盒(QIAGEN),從瓊脂糖凝膠中純化約 800 bp的PCR產(chǎn)物，然后克隆到pGEM-T Easy栽體(Promega)上。確定 堿基序列后，用限制酶PvuII (寶酒造制)消化，回收目標(biāo)片段。將 pBacPAK9-scVB22B用限制酶PvuII (寶酒造制)消化后，將回收的片段連 接，制備pBacPAK9-VB22B sc(Fv)2。將制備的栽體用限制酶EcoRI (寶 酒造制)和限制酶Notl (寶酒造制)消化后,用QIAquick Gel提取試劑盒 (QIAGEN)從瓊脂糖凝膠中純化約1600 bp的片段，克隆到表達(dá)栽體pCXND3中，制備pCXND3-VB22Bsc(Fv)2。2.4使用動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行的抗人Mpl單鏈抗體的表達(dá) 使用CHO-DG44細(xì)胞進(jìn)行的單鏈抗體穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞林的制備如下 進(jìn)行。通過使用GenePulserII(Bio-Rad)的電穿孔法導(dǎo)入基因。將表達(dá)栽 體(25 pg)與0.75 ml懸浮于PBS中的CHO-DG44細(xì)胞(lx 107細(xì)胞/ml)混 合，將所得在冰上冷卻IO分鐘，轉(zhuǎn)移到脈沖池中，然后用1.5 kV、25 nFD 的容量給予脈沖。在室溫下經(jīng)過10分鐘的恢復(fù)期，然后將電穿孔處理 的細(xì)胞加入到含有500 pg/ml遺傳霉素的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基 (Invitrogen)中進(jìn)行篩選，構(gòu)建表達(dá)CHO細(xì)胞林。VB22Bsc(Fv)2是按照 該方法制備穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞林及其培養(yǎng)上清。使用COS7細(xì)胞進(jìn)行的單鏈抗體的瞬時(shí)表達(dá)如下進(jìn)行。將表達(dá)栽體 (10 pg)與0,75 ml懸浮于PBS中的COS7細(xì)胞(lx 107細(xì)胞/ml)混合，將所 得在水上冷卻10分鐘，轉(zhuǎn)移到脈沖池中，然后用1.5kV、 25pFD的容 量給予脈沖。在室溫下經(jīng)過10分鐘的恢復(fù)期，然后將電穿孔處理的細(xì) 胞加入到含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen)中，培養(yǎng)過夜，用 PBS清洗，然后加入CHO-S-SFMII培養(yǎng)基，約培養(yǎng)3天。VB22B雙抗 體按照該方法制備培養(yǎng)上清。2.5培養(yǎng)上清中抗人Mpl單鏈抗體的定量在COS細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的抗人Mpl單鏈抗體的培養(yǎng)上清中的濃度 利用表面等離子共振測定。即，在Biacore 2000 (Biacore制)上設(shè)置傳感 芯片CM5 (Bia畫制)，與抗FLAG M2單克隆抗體(SIGMA-ALDRICH 制)結(jié)合。以流速5 ml/秒流入適當(dāng)濃度的樣品，再流入50mM二乙胺， 使結(jié)合的抗體解離。測定流入樣品時(shí)的質(zhì)量變化，使用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì) 量變化制備的校正曲線，計(jì)算濃度。雙價(jià)小抗體的標(biāo)準(zhǔn)品是使用dbl2E10 (參照WO 02/33073、 WO 02/33072)， sc(Fv)2的標(biāo)準(zhǔn)品使用具有相同基 因結(jié)構(gòu)的12E10sc(Fv)2。2.6抗人Mpl雙抗體和單鏈抗體的制備將表達(dá)VB22B雙抗體的COS7細(xì)胞或CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清吸附于 用50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、 150 mMNaCl、 0.05%吐溫20平衡的抗FlagM2親和凝膠柱(Sigma-Aldrich)，用100 mM甘氨酸-HCl (pH 3.5)洗脫。 洗脫組分立即用1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和，然后用HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (Amersham Biosciences)柱進(jìn)行凝膠過濾色語。凝膠過濾 色譜的緩沖液使用PBS、 0.01%吐溫20。將表達(dá)VB22B sc(Fv)2的C0S7細(xì)胞的培養(yǎng)上清以與雙抗體純化相 同的條件進(jìn)行純化。大量制備時(shí)，將CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清過用20 mM 磷酸緩沖液(pH 6.8)平衡的Macro-Prep陶資羥基磷灰石I型(Bio-Rad)柱， 用250 mM磷酸緩沖液(pH6.8)階段性洗脫。洗脫的組分用超濾膜進(jìn)行濃 縮，然后用HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (Amersham Biosciences)柱進(jìn)行 凝膠過濾色語，分離分子量相當(dāng)于約40 kD-70 kD的組分。將該組分吸 附于用50 mM Tris-HCl (pH 7.4)、 150 mM NaCl、 0.05%吐溫20平衡的 抗FlagM2親和凝膠柱，用100mM甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脫。洗脫組分 立即用1 M Tris-HCl (pH 8.0)中和，用HiLoad 26/60 Superdex 200 pg柱 進(jìn)行凝膠過濾色語。凝膠過濾色語的緩沖液使用20 mM乙酸緩沖液(pH 6.0)、 150mMNaCl、 0.01%吐溫80。各純化步驟中，雙抗體和sc(Fv)2 的確認(rèn)是采用SDS-PAGE和使用了抗Flag抗體(Sigma-Alddch)的蛋白質(zhì) 印跡進(jìn)行。分別將所分離的峰組分根椐Laemli的方法進(jìn)行電泳，用考馬 斯亮藍(lán)染色，結(jié)果，雙抗體是在分子量約29 kDa處檢測出單一條帶， sc(Fv)2是在分子量約55 kDa處檢測出單一條帶。2.7通過流式細(xì)胞儀對(duì)抗人Mpl單鏈抗體結(jié)合活性的評(píng)價(jià) 回收CHO-人Mpl、 CHO-猴Mpl、 CHO-小鼠Mpl，懸浮于FACS緩 沖液(1% FBS/PBS)中,濃度為lx 106 cells/mL。分注到Multiscreen-HV 過濾板(Millipore)中，濃度為100 pl/孔，通過離心操作除去上清。加入 適當(dāng)濃度的雙抗體或sc(Fv)2,在水上反應(yīng)30分鐘。將細(xì)胞用200|li1的 FACS緩沖液清洗一次，添加10 ng/ml的抗FLAG M2單克隆抗體 (Sigma-Aldrich),在水上反應(yīng)30分鐘。接著用200 pl FACS緩沖液清洗 細(xì)胞一次，添加稀釋100倍的FITC標(biāo)記抗小鼠IgG抗體(Beckman Coulter),在水上反應(yīng)30分鐘。最后離心,除去上清，懸浮于400 plFACS 緩沖液中，用EPICS ELITE ESP(BeckmanCouIter)供給流式細(xì)胞儀。通 過前向散射光和側(cè)向散射光的直方圖在活細(xì)胞集團(tuán)中設(shè)定閥(y—卜)。 使用純化的VB22B sc(Fv)2，對(duì)與表達(dá)各種Mpl的CHO細(xì)胞的結(jié)合活性進(jìn)行評(píng)價(jià)?？梢源_認(rèn)對(duì)宿主細(xì)胞CHO和CHO-小鼠Mpl不顯示結(jié) 合活性，但與CHO-人Mpl和CHO-猴Mpl特異性結(jié)合。該結(jié)合活性的 傾向與VB22B IgG相同，因此可以推測抗體結(jié)合部位并未才艮據(jù)低分子化而變化。2.8抗人Mpl單鏈抗體的人源化為了實(shí)施VB22B sc(Fv)2的人源化，由公開的Kabat Database (ftp:〃ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)獲得抗體的序列數(shù)椐，分成H鏈 可變區(qū)、L鏈可變區(qū)進(jìn)行同源性檢索。結(jié)果可知，H鏈可變區(qū)與 DN13(Smithson S. L.等人.,Mol Immunol. 36, 113-124 (1999))具有高的同 源性。還得知L鏈可變區(qū)與ToP027 (Hougs L.等人.，J. Immunol. 162， 224-237 (199")具有高同源性。制備將互補(bǔ)抗原決定區(qū)(以下稱為CDR) 移植到這些抗體的支架區(qū)(以下稱為FR))得到的人源化抗體。使人源化 抗體sc(Fv)2在CHO-DG44細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)行使用BaF3-人Mpl的激動(dòng) 活性評(píng)價(jià)。以激動(dòng)活性為指標(biāo)，向FR內(nèi)加入氨基酸置換，制備與小鼠 型VB22B sc(Fv)2具有同等的激動(dòng)活性的人源化VB22B sc(Fv)2抗體。具體來說，設(shè)計(jì)成將50個(gè)堿基左右的合成寡DNA雜交約20個(gè)堿 基左右，將這些合成寡DNA通過PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，制備編碼各可變區(qū) 的基因。使用這些基因，與實(shí)施例2、 3的方法同樣地制備sc(Fv)2，克 隆到表達(dá)載體pCXND3中，制備插入人源化VB22B sc(Fv)2的各表達(dá)栽 體pCXND3-hVB22B p-z sc(Fv)2 、 pCXND3-hVB22B g-e sc(Fv)2 、 pCXND3-hVB22B e sc(Fv)2 、 pCXND3-hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 、 pCXND3-hVB22B q-wz5 sc(Fv)2。該質(zhì)粒中所含有的hVB22B p-z sc(Fv)2 的堿基序列如SEQ IDN0.24所示，氨基酸序列如SEQ IDN0.25所示； hVB22B g-e sc(Fv)2的堿基序列如SEQ ID N0.26所示，氨基酸序列如 SEQ ID N0.27所示；hVB22B e sc(Fv)2的堿基序列如SEQ ID N0.28所 示，氨基酸序列如SEQIDNO.29所示；hVB22B u2 —wz4 sc(Fv)2的堿基 序列如SEQ IDNO.30所示，氨基酸序列如SEQIDNO.l所示；hVB22B q -wz5 sc(Fv)2的堿基序列如SEQ ID N0.31所示，氨基酸序列如SEQ ID NO,32所示。小鼠型VB22Bsc(Fv)2的堿基序列表示為SEQIDN0.33, 氨基酸序列表示為SEQ ID NO,2。與實(shí)施例2.4的方法同樣在CHO-DG44 細(xì)胞中表達(dá)，回收培養(yǎng)上清。人源化VB22B sc(Fv)2未附加Flag標(biāo)簽，因此由培養(yǎng)上清進(jìn)行純化時(shí)，是利用實(shí)施例1.8記栽的VB22B所識(shí)別的 表位MG10 (Gln213-Ala231)與GST的融合蛋白進(jìn)行。MG10與GST的 融合蛋白的純化是使用谷胱甘肽瓊脂糖4B (Amersham Biosciences),按 照生產(chǎn)商的說明書進(jìn)行純化。并且將純化的MG10與GST融合蛋白按 照生產(chǎn)商的說明書固定在H汀rap NHS-activated HP柱(Amersham Biosciences)上，制備親和柱。將人源化表達(dá)VB22B sc(Fv)2的CHO細(xì) 胞的培養(yǎng)上清流入用50 mM Tris-HCl (pH7.4)、 150 mM NaCl、 0.01% Tween 80平衡的MG10-GST融合蛋白質(zhì)固定化柱，使人源化VB22B sc(Fv)2吸附，用100 mM甘氨酸-HCl (pH3.5)、 0.01%吐溫80洗脫。洗 脫組分立即用1 M Tris-HCl (pH7.4)中和，使用HiLoad 16/60 Superdex 200 pg (Amersham Biosciences)柱進(jìn)行凝膠過濾色語。凝膠過濾色語的緩 沖液使用20 mM檸檬酸緩沖液(pH7.5)、 300 mM NaCl和0.01%吐溫80。[參考例3] 2D7 sc(Fv)2型雙抗體表達(dá)栽體的制備如WO2004/033499所述，通過將HLA 1型的抗體2D7單克隆抗體 改變?yōu)閷⒅劓満洼p鏈可變區(qū)用5 mer的接頭連接而成的小分子抗體(2D7 雙抗體)，顯示對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性急劇升高。因此，將 2D7雙抗體改變?yōu)楸徽J(rèn)為結(jié)構(gòu)上比較穩(wěn)定的sc(Fv)2型，與以往的雙抗 體(HL5)比較研究細(xì)胞死亡誘導(dǎo)活性。首先，按照以下順序制備編碼2D7 sc(Fv)2的DNA表達(dá)栽體，其中， 2D7抗體的重鏈可變區(qū)序列(VH)和輕鏈可變區(qū)序列(VL)排列成 VH-VL-VH-VL ， 分 另'J 用 15 mer 的 接 頭 (GlyGlyGlyGly SerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer)連接而成。以按照WO2004/033449記栽的方法制備的、將VH-VL用5 mer接 頭(GlyGlyGlyGlySer)連接而成的2D7雙抗體(HL5)表達(dá)栽體為模板，通 過引物2D7DBH1 (SEQ ID N0.34)和引物2D7PA2 (SEQ ID N0.35)進(jìn)行 PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段A。同樣，通過引物2D7DPA3 (SEQ ID N0.36)和 引物2D7PA5(SEQIDN0.37)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段B。通過這里得 到的片段A和片段B在同一個(gè)管內(nèi)混合，進(jìn)行PCR重組反應(yīng)使片段A 和片段B連接。由此得到在N末端含有VH的信號(hào)序列、VH-VL用15 mer 接頭連接的DNA片段"2D7雙抗體HL15-1"。接著，以2D7雙抗體(HL5)表達(dá)栽體為模板，通過引物2D7PA2 (SEQIDN0.35)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段C。同樣，通過引物D7PA3(SEQID N0.36)和引物2D7DBL2 (SEQ ID N0.39)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段D。 這里得到的片段C和片段D在同 一個(gè)管內(nèi)混合，通過PCR重組反應(yīng)使 兩個(gè)片段連接。通過該操作，VH-VL通過15 mer的接頭連接，得到了 在C末端含有Flag-tag區(qū)的DNA片段"2D7雙抗體HL15-2"。將上述反應(yīng)得到的兩個(gè)DNA片段、即"2D7雙抗體HL15-1" DNA 片段和"2D7雙抗體HL15-2" DNA片段分別用EcoRI-BamHI和 BamHI-NotI切斷，將兩個(gè)DNA片段插入到預(yù)先用Ecol-Notl切斷開裂 的表達(dá)栽體pCXND3中。分析插入的DNA堿基序列，如目標(biāo)所示，確 認(rèn)編碼信號(hào)-VH(15)VL(15)VH(15)VL-Flag的cDNA插入到pCXND3的 EcoII-NotI之間，構(gòu)建了 2D7sc(Fv)2表達(dá)栽體(pCXND3-2D7sc(Fv)2)。 2D7sc(Fv)2堿基序列表示為SEQ ID NO.40、氨基酸序列表示為SEQ ID N0.4。[參考例4]生成表達(dá)2D7 sc(Fv)2的細(xì)胞株的建立將20 用Pvul切斷、形成直鏈的pCXND3-2D7sc(Fv)2抗體按照 以下的電穿孔法導(dǎo)入到CHO細(xì)胞(DG44細(xì)胞抹)中。用CHO-S-SFM-II培養(yǎng)基(Invitrogen)培養(yǎng)的DG44細(xì)胞用水冷PBS 清洗兩次，然后懸浮于PBS中，使其濃度為lxl0々ml。向其中混合20 上述質(zhì)粒，進(jìn)行電脈沖(1.5 kV，25 pFD)。以適當(dāng)?shù)谋壤♂尲?xì)胞，將細(xì) 胞鋪于96孔板上，在添加了終濃度為500 pg/ml G418 (Invitrogen)的 CHO-S-SFM-II培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。將生長的單一集落挑取約30個(gè)克隆的2D7 sc(Fv)2的表達(dá)量。表達(dá)最高的克隆在含有5 nM MTX的無核酸 的CHOS-SFM-II培養(yǎng)基(Invitrogen)中進(jìn)行培養(yǎng)，擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，將所 得的細(xì)胞林作為高生產(chǎn)細(xì)胞抹。[參考例5] 2D7 sc(Fv)2的大量純化在T-125燒瓶中，將次融合的2D7 sc(Fv)2高產(chǎn)量CHO細(xì)胞林轉(zhuǎn)移 到滾瓶(250 ml/瓶CHO-S-SFM II培養(yǎng)基)，使其濃度為lxloVml。在37'C 下培養(yǎng)，6天后回收培養(yǎng)液。通過離心除去死細(xì)胞，然后過0.45 jxm的 濾器，將其用于純化。2D7 sc(Fv)2的純化如下進(jìn)行。首先，向用緩沖液A (20 mM磷酸鈉pH 6.8)平衡的羥基磷灰石柱 (micro prep Hydroxyapatite I， Bio-Rad)中加入回收的培養(yǎng)上清。用緩沖液 A清洗柱，然后用緩沖液C (250 mM磷酸鈉pH 6.8)洗脫2D7 sc(Fv)2。 含有2D7 sc(Fv)2的組分用等量緩沖液A稀釋，然后將其加入到抗-Flag M2瓊脂糖親和柱中(Bio-Rad)。將該柱用緩沖液C (50 mM tris-HCl pH7.4, 150 mM NaCl, 0.0％吐溫20)清洗，然后用緩沖液D (100 mM甘氨酸 H3.5， 0.01%吐溫20)洗脫2D7 sc(Fv)2。將回收的樣品立即用Tris-HCl pH 8,0中和，使終濃度為25 mM。然后將該組分用centriprep YM-10 (AMICON)濃縮，通過Superdex200HR (26/60)柱(Amersham Pharmacia) 進(jìn)行凝膠過濾色語純化。用含有0.01 %吐溫20的PBS進(jìn)行凝膠過濾色語純化。由高產(chǎn)量2D7 sc(Fv)2的CHO細(xì)胞抹生產(chǎn)的小分子抗體幾乎都是在分子量約52 Kd的 位置具有洗脫峰，與同樣在52 Kd洗脫的2D7雙抗體的峰完全一致。只回收由凝膠過濾色語純化分離的52 Kd的峰，將其作為2D7 sc(Fv)2蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。將回收的樣品的一部分進(jìn)行SDS電泳和銀染，確 認(rèn)目標(biāo)蛋白以100%的純度純化?；厥盏募兓瘶?biāo)準(zhǔn)品用centriprep YM-10 (AMICON)濃縮。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性通過使用含有本發(fā)明的葡甲胺的穩(wěn)定劑，可以抑制抗體分子的聚集 反應(yīng)，可以使抗體分子以單體狀態(tài)存在。將抗體作為藥物開發(fā)時(shí)，為了 使各抗體分子穩(wěn)定存在，必須將制劑保存中的聚集反應(yīng)限制到最小限 度。本發(fā)明的穩(wěn)定劑即使是要穩(wěn)定的抗體為非常高濃度，也可以使抗體 分子穩(wěn)定、抑制聚集反應(yīng)，因此在制備抗體制劑時(shí)非常有用。另外，本 發(fā)明的含有葡甲胺的試劑在使抗體分子形成溶液制劑或者凍干制劑時(shí) 也具有使抗體分子穩(wěn)定的效果?；蛘邔?duì)于制成凍干制劑時(shí)的冷凍干燥應(yīng) 激也具有使抗體分子穩(wěn)定的效果。并且本發(fā)明的穩(wěn)定劑對(duì)于全長抗體、 片段抗體或小分子抗體等任何抗體均顯示穩(wěn)定效果，制備抗體制劑時(shí)可 廣泛應(yīng)用。本發(fā)明的含有通過葡甲胺穩(wěn)定的抗體分子的藥物組合物使抗體分 子的修飾、聚集得到抑制，因此與以往的抗體制劑相比保存狀態(tài)良好，有望使保存時(shí)聚集導(dǎo)致的活性降低更小。
權(quán)利要求
1. 藥物，該藥物含有葡甲胺，可使蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定。
2. 藥物，該藥物含有葡甲胺，可抑制蛋白質(zhì)的聚集。
3. 權(quán)利要求1或2的藥物，其中，蛋白質(zhì)是抗體分子。
4. 權(quán)利要求3或4的藥物，其中，抗體分子是全長抗體、片段化 抗體、小分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。
5. 權(quán)利要求"4中任一項(xiàng)的藥物，該藥物的劑型是凍干制劑。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥物，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。
7. 使蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加葡甲胺 的步驟。
8. 抑制蛋白質(zhì)聚集的方法，該方法包含向蛋白質(zhì)中添加葡甲胺的步驟。
9. 權(quán)利要求7或8的方法，該方法是在長期低溫保存條件下，使 蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定或抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。
10. 權(quán)利要求7或8的方法，該方法是在長期常溫保存條件下，使 蛋白質(zhì)長期穩(wěn)定或抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。
11. 權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的方法，其中，蛋白質(zhì)是抗體分子。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中，抗體分子是全長抗體、片段化抗 體、小分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。
13. 權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的方法，該方法包含在添加葡甲胺的步 驟之后將蛋白質(zhì)冷凍干燥的步驟。
14. 權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)的方法，其中，葡曱胺是其鹽或其衍生物。
15. 藥物組合物，該藥物組合物添加了葡甲胺。
16. 權(quán)利要求15的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物的劑型是凍干制劑。
17. 權(quán)利要求15或16的藥物組合物，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。
18. 含有抗體分子的藥物組合物的制備方法，該方法包含向含有抗 體的組合物中添加葡曱胺的步驟。
19. 含有抗體分子的藥物組合物的制備方法，該方法包含以下(l) 和(2)的步驟(1) 將葡曱胺添加到含有抗體的組合物中的步驟；(2) 使(l)的混合物冷凍干燥的步驟。
20. 權(quán)利要求18或19的藥物組合物的制備方法，其中，抗體分子 是全長抗體、片段化抗體、小分子抗體、修飾抗體或抗體類分子的任意一種。
21. 權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)的制備方法，其中，葡甲胺是其鹽或其衍生物。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的方法、或者抑制蛋白質(zhì)聚集的方法，這些方法包含將葡甲胺添加到蛋白質(zhì)中的步驟。本發(fā)明還提供含有葡甲胺、使蛋白質(zhì)穩(wěn)定的藥物，或者抑制蛋白質(zhì)聚集的藥物。并且本發(fā)明的課題還在于提供含有由于葡甲胺而穩(wěn)定的抗體分子的藥物組合物、該藥物組合物的制備方法、以及含有該藥物組合物的試劑盒。本發(fā)明人為解決上述課題，對(duì)于氨基糖的一種一葡甲胺的抗體穩(wěn)定性效果進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡甲胺可用作抗體分子的穩(wěn)定劑，也可用作凍干制劑的賦型劑。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101237890SQ200680029170
公開日2008年8月6日 申請(qǐng)日期2006年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者井川智之, 龜岡大介 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社