專利名稱：：登革血清型2減毒株的制作方法登革血清型2減毒林本發(fā)明涉及新型活的減毒VDV2(VERO來源的登革血清型2病毒)毒林，其通過在PDK上傳代和Vero細(xì)胞消毒(sanitization)而衍生自野生型登革2型毒林16681。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含此類VDV2毒林的疫苗組合物。登革病由黃病毒屬(Gubler，1988)的4種緊密相關(guān)但抗原不同的病毒血清學(xué)類型(Gubler，1988;Kautner等人，1997;Rigau-P"ez等人，1998;Vaughn等人，1997)引起。登革病毒血清型感染可以產(chǎn)生一系列臨床疾病，從非特異的病毒綜合征到嚴(yán)重的致命的出血性疾病。蚊蟲叮咬后登革熱(DF)的潛伏期平均為4天(范圍為3-14天)。DF的特征在于雙相熱、頭痛、身體各個(gè)部分的疼痛、衰竭、疹、淋巴結(jié)病和白細(xì)胞減少(Kautner等人，1997;Rigau-P"ez等人，1998)。病毒血癥期與熱性疾病相同(Vaughn等人，1997)。從DF恢復(fù)通常在7-10天中完成，但長時(shí)間的虛弱是常見的。白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)減少是時(shí)常發(fā)生的。登革出血熱(DHF)是特征在于穩(wěn)態(tài)異常和血管滲透性增加的嚴(yán)重?zé)嵝约膊?，所述血管滲透性增加可以導(dǎo)致血容量減少和低血壓(登革休克綜合征，DSS)，這通常并發(fā)嚴(yán)重內(nèi)出血。如果不治療，DHF的病死率可以高達(dá)10%，但在大多數(shù)具有治療經(jīng)驗(yàn)的中心低于1%(WHOTechnicalGuide,1986)登革熱感染的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷基于病毒的分離和/或登革熱病毒特異性抗體的檢測。登革病是僅次于瘧疾的第二種最重要的熱帶傳染病，全世界有超過一半的人口(25億)生活在處于流行傳播危險(xiǎn)中的區(qū)域。估計(jì)每年發(fā)生50，000，000-100，000，000例登革熱、500，000位住院的DHF患者和25，000例死亡。登革熱是亞洲、太平洋、非洲、拉丁美洲和加勒比海的地方流行病。超過IOO個(gè)熱帶國家具有地方流行的登革熱病毒感染，并且DHF已在超過60個(gè)這些國家中得到證實(shí)(Gubler，2002;Monath，1990。許多充分描述的因素似乎涉及登革熱感染人口增長，特別是與貧困相關(guān)的無計(jì)劃和不受控制的都市化，空中旅行增加，缺乏有效的蚊蟲控制，以及衛(wèi)生和公共衛(wèi)生基礎(chǔ)惡化(Gubler，2002)。在旅行者和移居國外者中對(duì)于登革熱的認(rèn)識(shí)漸增(Shirtcliffe等人，1998)。登革熱已證明是在具有登革熱地方流行的熱帶區(qū)域部署期間美國軍隊(duì)中熱性疾病的主要原因(DeFraites等人，1994)。所述病毒在涉及人和埃及伊蚊(J^/esaeg//7〃)的周期中維持，所述埃及伊蚊是更喜歡以人為食的、家里的、白天叮咬的蚊子。人感染由在受感染埃及伊蚊的血液飼喂過程中的病毒注射起始。唾液病毒主要儲(chǔ)存于脈管外組織中。在接種后被感染的主要細(xì)胞亞群是樹突狀細(xì)胞，它隨后遷移至引流淋巴結(jié)(Wu等人，2000)。在皮膚和引流淋巴結(jié)中進(jìn)行初期復(fù)制后，病毒在急性發(fā)熱期期間出現(xiàn)在血液中，一般持續(xù)3-5天。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞一起在登革熱病毒的主要靶中。針對(duì)同型再感染的保護(hù)是完全的并且可能是終身的，但登革熱類型之間的交叉保護(hù)持續(xù)小于12周(Sabin,1952)。因此，受試者可以經(jīng)歷不同血清型的第二次感染。第二次登革熱感染是形成嚴(yán)重登革病的理論上的危險(xiǎn)因素。然而，DHF是多因素的，包括所涉及的病毒林，以及患者的年齡、免疫狀態(tài)和遺傳素質(zhì)。兩種因素在DHF的發(fā)生中起主要作用伴隨高病毒血癥(該疾病的嚴(yán)重度與病毒血癥水平相關(guān)(Vaughn等人，2000))的快速病毒復(fù)制，和伴隨炎癥介質(zhì)高水平釋i文的重要炎癥應(yīng)答(Rothman和Ennis，1999)。沒有針對(duì)登革病的特異療法。DF的處理由臥床休息、用退熱藥和鎮(zhèn)痛藥控制發(fā)熱和疼痛、以及足夠的流體攝入來支持。DHF的治療需要流體喪失的校正、凝血因子的替換和肝素輸注。預(yù)防措施目前依賴于媒介控制和個(gè)人防護(hù)措施，這難以執(zhí)行并且昂貴。目前沒有注冊針對(duì)登革熱的疫苗。因?yàn)榈歉锏?個(gè)血清型在全世界流通，并且因?yàn)樗鼈儽粓?bào)告涉及DHF病例，所以疫苗接種應(yīng)理想地給予針對(duì)所有4種登革熱病毒血清型的保護(hù)。再現(xiàn)天然免疫性的活的減毒疫苗(LAVs)已用于開發(fā)針對(duì)許多疾病的疫苗，包括屬于與登革相同的屬的幾種病毒(商購可得的黃病毒活減毒疫苗的例子包括黃熱病和日本腦炎疫苗)?；顪p毒病毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)是它們的復(fù)制能力以及誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。此外，由針對(duì)病毒不同組分(結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白)的完整病毒粒子疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答再現(xiàn)了由天然感染誘導(dǎo)的那些。登革熱疫苗計(jì)劃在泰國于CentreforVaccineDevelopment,InstituteofSciencesandTechnologyforDevelopment,MahidolUniversity開始。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上成功開發(fā)了候選活減毒疫苗，其對(duì)于在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中的登革血清型l(毒林16007,第13代)、血清型2(毒林16681，第53代=LAV2)和血清型4(毒林1036，第48代)病毒，以及對(duì)于在原代綠猴腎(PGMK)細(xì)胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)細(xì)胞(第3代)中的血清型3(毒林16562)。這些疫苗已在泰國志愿者中作為單價(jià)(單種血清型)、二價(jià)(兩種血清型)、三價(jià)(三種血清型)和四價(jià)(所有四種血清型)疫苗進(jìn)行了測試。這些疫苗被發(fā)現(xiàn)在兒童和成人中是安全并具有免疫原性(Gubler,1997)。這些LAVl-4毒林已在Mahido1University的EP1159968中進(jìn)行描述，并保藏于CNCM(分別為CNCMI-2480;C腦I-2481;C腦1-2482和C顧1-2483)。Den-2毒林16681于1964年在曼谷從DHF(登革出血熱)患者的血清中獲得(Halstead等人，1970)。原始的病毒血癥血清已在BSC-1細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)上傳代4次和在連續(xù)LLC-MK2細(xì)胞(恒河猴腎細(xì)胞)上傳代5次。在1977年，病毒在易感性的猴(普通獼猴(施caca齒""a))中體內(nèi)傳代1次，隨后再次在LLC-MK2細(xì)胞中傳代。于1M0年進(jìn)行了在蚊子(安邦巨蚊(7bxor力7"c力/^3邁6o/z7e/7Ws))中的另外2次傳代。病毒減毒通過于32。C在PDK細(xì)胞(原代犬腎細(xì)胞)上傳代來進(jìn)行。毒株的減毒根據(jù)幾種體外和體內(nèi)標(biāo)記進(jìn)行檢查。第50代滿足所有這些減毒標(biāo)準(zhǔn)，并且在第53代時(shí)被選擇作為用于疫苗生產(chǎn)的主種子(masterseed)(1982)。DEN-2PDK53疫苗候選物在人中進(jìn)行評(píng)估，并且發(fā)現(xiàn)是強(qiáng)免疫原性的，而沒有不利的臨床體征和癥狀(Bhamarapravati等人，1989)。登革2型活減毒病毒林(LAV2)的完整序列于2001年由R.Kinney等人(CDC，F(xiàn)ortCollins)確定。親本DEN-2毒林16681(SEQIDNo.3)和LAV2(SEQIDNo.38)毒林之間的序列差異描述在表1中。因此，野生型病毒林16681和LAV2毒林的遺傳比較顯示了一組9個(gè)點(diǎn)突變，所述點(diǎn)突變可以與LAV2減毒相關(guān)聯(lián)。表l:DEN-216681和DEN-216681/PDK53(LAV2)的序列差異<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>修改相應(yīng)密碼子的核苷酸變化以斜體指出。最初于1983年建立的LAV2毒林進(jìn)一步,皮迅速鑒定為潛在的疫苗候選物(Bhamarapravati和Yoksan，1997)。然而，在那時(shí)，沒有意識(shí)到通過哺乳動(dòng)物培養(yǎng)物向具有海綿狀腦炎的人的傳播是一種危險(xiǎn)，并且病毒常規(guī)地維持在原代犬腎細(xì)胞(PDK)中。此外，這種LAV2毒林相應(yīng)于異質(zhì)群體。由于在所述組合物中存在的毒林之一的潛在體外或體內(nèi)選擇，這種異質(zhì)性代表了另外的危險(xiǎn)?？紤]到這些漸增的擔(dān)心，申請人決定建立消毒(sanitization)過程以便消除任何此類危險(xiǎn)。通過用純化的LAV2基因組RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，隨后為在Vero細(xì)胞中三個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，以及病毒噬斑純化的兩個(gè)順次步驟，申請人生產(chǎn)了新型Vero來源的血清型2病毒(VDV2)。通過轉(zhuǎn)移至VER0細(xì)胞和生物學(xué)克隆而如此獲得的這種新型VDV2毒林，在序歹ij、同質(zhì)謹(jǐn)斑大小(homogenousplaquesize)和溫度敏感性方面不同于LAV2毒林，但重要的是保留了LAV2的某些表型和基因型特征，例如減毒點(diǎn)(attenuationspot)、小嗟斑表型、在高溫時(shí)的生長限制，并且保留了LAV2毒林的免疫原性特征。這些特征使得這種新型毒林成為用于在人中進(jìn)行預(yù)防性免疫接種的有價(jià)值的疫苗候選物。定乂"登革熱病毒"是屬于黃病毒科黃病毒屬的正義單鏈MA病毒。在登革血清型2(DEN-2)毒林16681的情況下，整個(gè)序列長度為10723個(gè)核苷酸(SEQIDNo.3)。RNA基因組在5'末端處包含I型帽，但沒有3'末端poly(A)尾?；蚪Y(jié)構(gòu)是5'-非編碼區(qū)(NCR)、結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼(C)、前膜/膜(prM/M)、包膜(E))和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)以及3'NCR。病毒RNA基因組與C蛋白結(jié)合從而形成核殼體(二十面體對(duì)稱)。如同其他黃病毒一樣，DEN病毒基因組編碼翻譯成單個(gè)多蛋白的不間斷開放讀碼框(0RF)。登革2型的強(qiáng)毒(致病)林的連續(xù)傳代導(dǎo)致分離出經(jīng)修飾的病毒，其是"活的且減毒的"，即有傳染性但不能引起疾病。這些經(jīng)修飾的病毒通常在猴中進(jìn)行測試以評(píng)估其減毒。然而，人是唯一顯示出臨床疾病體征的靈長類。這樣的病毒稱為"活的且減毒的"，即其在大多數(shù)受試人中引起輕度(即就調(diào)節(jié)目的而言是可接受的，因?yàn)槌尸F(xiàn)出正的利益/風(fēng)險(xiǎn)比)至低的次級(jí)效應(yīng)或者不引起次級(jí)效應(yīng)(即全身事件和/或生物學(xué)異常和/或局部反應(yīng))，但仍進(jìn)行感染并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。術(shù)語"LAV"指活的減毒登革熱病毒株。在本發(fā)明的情況下，"LAVs"是通過在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中傳代而最初來源于登革血清型2(DEN-2)毒林16681的活的減毒株。例如，"LAV2/PDK53"是毒林16681在PDK細(xì)胞中傳代53次后建立的減毒林(DEN-216681/PDK53)。"LAVVPDKSO"是毒林16681在PDK細(xì)胞中傳代50次后建立的減毒株(國-216681/PDK50)。LAV2/PDK53核苷酸序列顯示于SEQIDNo.38中。"VDV2"意指通過本申請中公開的消毒過程可獲得的LAV。因此，VDV2是生物學(xué)克隆(均質(zhì)的)VERO-適應(yīng)的登革血清型2病毒，其能夠在靈長類特別是人中誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答，包括中和抗體。本發(fā)明的VDV2毒林可以容易地直接從本文公開的VDV2序列開始重建。特異性體液免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以通過ELISA測定法容易地進(jìn)行測定。在已接種疫苗者血清中的中和抗體的存在通過如4.1.1.2.2節(jié)中所述的噬斑減少中和測試來進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)如此測定的中和抗體滴度為至少大于或等于1:10時(shí)，血清被視為對(duì)于中和抗體的存在是陽性的。術(shù)語"突變，，意指遺傳材料例如DNA、RNA、cDNA中任何可檢測的變化，或者此類變化的任何過程、機(jī)制或結(jié)果。突變包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換。在本申請的情況下，在登革2型病毒基因組序列或多蛋白中鑒定的突變依照Dunnen和Antonarakis(2000)的命名法進(jìn)行命名。如由Dunnen和Antonarakis限定的，在核酸水平上，置換由">"指明，例如"31A>G，，表示參考序列第31位處的核苷酸A變成G。在蛋白質(zhì)水平上的變異描述了突變結(jié)果且如下報(bào)告。終止密碼子由X指明(例如，R97X表示Arg96變成終止密碼子)。氨基酸置換例如由"S9G，，指明，這意指第9位處的Ser被Gly替換。r朋。^源^登革J&清^2病善(^""J先前開發(fā)的登革2型疫苗候選物L(fēng)AV2的組成通過消毒過程得到改善。本文公開的VER0來源的疫苗登革血清型2(VDV2)使用通過在PDK細(xì)胞上連續(xù)傳代而減毒的DEN-216681病毒。VDV2包含完整活減毒DEN-2病毒的基因組序列，并且具有與在人中測試的原始LAVZ毒林相同的與減毒相關(guān)聯(lián)的減毒點(diǎn)。LAV2疫苗的消毒通過去除蛋白質(zhì)并只將純化的病毒基因組材料導(dǎo)入Vero細(xì)胞中來進(jìn)行。更具體而言，毒林的消毒通過純化病毒RNA并將病毒RNA轉(zhuǎn)染到Vero細(xì)胞中來進(jìn)行。該過程包括下列步驟a)從噬斑-純化的LVA2毒抹，例如DEN-216681/PDK50病毒中提取和純化病毒RNA;b)有利地使純化的RNA與陽離子脂質(zhì)結(jié)合；c)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，特別是Vero細(xì)胞LS10;d)回收新合成的病毒；和e)通過噬斑純化來純化VDV毒林，和任選地使其在宿主細(xì)胞特別是Vero細(xì)胞中擴(kuò)增。Vero細(xì)胞技術(shù)是眾所周知的技術(shù)，其已用于不同的商業(yè)產(chǎn)品(可注射的和口服的脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬病疫苗)。在本發(fā)明中，限定的Vero細(xì)胞有利地用于保證不存在可能與外來因子存在相關(guān)的任何危險(xiǎn)。"限定的VER0細(xì)胞"意指這樣的細(xì)胞或細(xì)胞系，即關(guān)于其的培養(yǎng)條件是已知的，并且所述細(xì)胞不含任何外來因子。這些包括例如SanofiPasteur的VER0細(xì)胞LSIO。如此分離的VDV毒林通常以冷凍組合物形式或凍干產(chǎn)品形式貯存。為了那個(gè)目的，VDV可以與稀釋劑相混合，所述稀釋劑通常是包含冷凍防護(hù)化合物例如糖醇和穩(wěn)定劑的緩沖水溶液。如通過PH計(jì)于RT測定的，在冷凍或凍干前的pH有利地^:定為6-9，例如約7,例如pH7.5+/-0.2。使用前，將凍干產(chǎn)品與藥學(xué)稀釋劑或賦形劑例如無菌NaCl4%。溶液相混合，以重構(gòu)液體免疫原性組合物或疫苗。在轉(zhuǎn)染和克隆過程中選擇出在NS3-250位置處的LAV2疫苗毒株的Glu變體，并且同樣也被鑒定為對(duì)于LAV2疫苗的減毒來說關(guān)鍵的位置5'NC-57和NS1-53在VDV2序列中均被保留。與SEQIDNo.38相比較，在轉(zhuǎn)染后回收的病毒的減毒特異性基因座處進(jìn)行的測序沒有顯示任何突變。經(jīng)生物學(xué)克隆的VDV2病毒顯示出同質(zhì)噬斑表型和相對(duì)于其LAV2親本的顯著遺傳穩(wěn)定性，因?yàn)樗绕淇梢杂蓽p毒基因型的保守性中推導(dǎo)出來。對(duì)VDV2(第11代)毒林進(jìn)行測序，并且與血清型2登革活減毒病毒(LAV2)毒林序列(SEQIDNo.38)進(jìn)行比較。鑒定了一組10個(gè)核苷酸差異，其引起了位于M和Env結(jié)構(gòu)肽以及非結(jié)構(gòu)肽NS3和NS5中的6個(gè)氨基酸置換。這些差異無一相應(yīng)于任何所述LAV2減毒位置。表2:LAV2/PDK53和VDV2第11代毒林之間的序列比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>灰色陰影結(jié)構(gòu)蛋白中的差異；斜體非結(jié)構(gòu)蛋白中的差異。本發(fā)明因此提供了活的減毒登革2型病毒^^，其由野生型病毒DEN-216681獲得，DEN-216681通過在PDK細(xì)胞上連續(xù)傳代并隨后通過在VER0細(xì)胞上消毒來進(jìn)行減毒。特別地，本發(fā)明的減毒林至少包含相對(duì)于野生型DEN-216681和LAV2/PDK53毒林的核苷酸序列或多蛋白序列的鑒定出的序列突變(非沉默和任選地沉默的)。因此，本發(fā)明涉及分離的活的減毒登革2型病毒林，其包含LAV2/PDK53毒林的序列(SEQIDNo.38),或由LAV2/PDK53毒林的序列(SEQIDNo.38)組成，其中至少第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位的核苷酸，以及任選地第1638、2520、9222和10361位的核苷酸被突變，條件是下列核苷酸不被突變57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571。優(yōu)選地，所述突變是置換。優(yōu)選地，第736位的核苷酸是C,第1619位的核苷酸是A，第4723位的核苷酸是A,第S062位的核苷酸是A，第9191位的核苷酸是A，笫10063位的核苷酸是A，和第10507位的核苷酸是G。第5270位的核苷酸可以是A或T,優(yōu)選A。更加優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的分離的毒林包含序列SEQIDNo.38，其中所述序列至少包含突變736G>C、1619G>A、4723T>A、5062G>C、9191G>A、10063T〉A(chǔ)和10507A>G,和任選地突變1638A>G、2520G>A和/或9222A>G。因此，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革2型病毒林可以包含野生型登革2型毒抹16681的序列(SEQIDNo.3)，或由野生型登革2型毒抹16681的序列(SEQIDNo.3)組成，其中所述序列至少包含突變57C>T、524A>T、736G>C、1619G>A、2055C〉T、2579G>A、4018C>T、4723T>A、5062G>C、5547T>C、6599G>C、8571C>T、9191G>A、10063T〉A(chǔ)和10507A〉G。優(yōu)選地，相對(duì)于野生型毒林16681的核苷酸序列(SEQIDNo.3)，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒林進(jìn)一步包含突變1638A>G、2520G〉A(chǔ)和/或9222A>G。根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革2型病毒株可以包括變異林，所述變異林包含如上文限定的在第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位突變的序列SEQIDNo.38，并且進(jìn)一步包含給定密碼子位置中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換，所述核苷酸置換不導(dǎo)致那個(gè)位置處編碼的氨基酸的改變。有利地，根據(jù)本發(fā)明的活的減毒登革2型病毒林包含這樣的序列，其通過數(shù)目有限的突變，例如不超過5個(gè)、更加優(yōu)選地不超過2個(gè)突變，而不同于SEQIDNo.1。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的登革2型病毒林的基因組序列由核苷酸序列SEQIDNo.1組成。本發(fā)明還涉及活的減毒登革2型毒林，其可以通過在細(xì)胞特別是Vero細(xì)胞上進(jìn)一步傳代而衍生自序列SEQIDNo.1的VDV2毒林。本發(fā)明還涉及分離的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.l或其等價(jià)RNA序列，或由DNA序列SEQIDNo，1或其等價(jià)RNA序列組成。"核酸分子"指核糖核苷(腺苷、烏苷、尿苷或胞苷；"RNA分子")或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物例如硫代磷酸酯和硫酯，其為單鏈形式或雙鏈螺旋。如本文使用的，與SEQIDNo.1"等價(jià)"的RNA序列意指其中脫氧胸苷已被尿苷替換的序列SEQIDNo.1。因?yàn)镾EQIDNo.1構(gòu)成VDV2cDNA序列，因此等價(jià)的RNA序列相應(yīng)于VDV2的正鏈RNA。本發(fā)明進(jìn)一步涉及序列SEQIDNo.2的多蛋白及其片段。SEQIDNo.2是由SEQIDNo.1編碼的多蛋白的序列。參考蛋白質(zhì)的"片段"意指其序列包含參考蛋白質(zhì)的相鄰氨基酸鏈的多肽。片段的長度可以是至少8個(gè)、至少12個(gè)、至少20個(gè)氨基酸。序列SEQIDNo.2的多蛋白的所述片段至少包含M蛋白第9位(SEQIDNo.2的第214位)的精氨酸，和/或E蛋白第2M位(SEQIDNo.2的第508位)的谷氨酸，和/或NS3蛋白笫69位(SEQIDNo.2的第1543位)的蘇氨酸，和/或NS3蛋白第181位(SEQIDNo.2的第1656位)的組氨酸，和/或NS5蛋白第541位(SEQIDNo.2的第H"位)的賴氨酸，和/或NS5蛋白第832位(SEQIDNo.2的第30"位)的蘇氨酸。才艮據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，由SEQIDNo.1編碼的多蛋白的片段是M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白，或者包含M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白。免疫原性和疫苗組合物本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的VDV2毒林的免疫原性組合物，其適合于用作疫苗。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物引發(fā)針對(duì)登革熱病毒的特異性體液免疫應(yīng)答，包括中和抗體。優(yōu)選地，免疫原性組合物是疫苗。夕、根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，免疫原性組合物是單價(jià)組合物，即，它引發(fā)針對(duì)登革2型病毒的免疫應(yīng)答和/或給予只針對(duì)登革2型病毒的保護(hù)。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及多價(jià)登革免疫原性組合物。此類得。免疫原:性或疫苗i合物;以進(jìn)二步包含至少另一種血清型的活減毒登革熱病毒。特別地，免疫原性或疫苗組合物可以包含與選自血清型1、血清型3和血清型4的至少一種活減毒登革熱病毒相組合的根據(jù)本發(fā)明的VDV2。優(yōu)選地，免疫原性或疫苗組合物可以是四價(jià)登革疫苗組合物，即包含與活的減毒登革1型病毒林、活的減毒登革3型病毒林和活的減毒登革4型病毒林相組合的根據(jù)本發(fā)明的VDV2的疫苗組合物?；畹臏p毒登革1型、登革3型、登革4型病毒抹先前已得到描述?？梢詤⒖加蒑ahidolUniversity開發(fā)的活減毒疫苗，通過在原代犬腎(PDK)細(xì)胞中傳代登革血清型1(毒林16007，第U代；LAV1)和血清型4(毒林1036,第48代，LAV"病毒，以及在原代綠猴腎(PGMK)細(xì)胞(第30代)和胎恒河猴肺(FRhL)細(xì)胞(第3代)中傳代血清型3(毒林16562)(LAV3)。LAV1(SEQIDNo.40)、LAV3(SEQIDNo.41)和LAV4(SEQIDNo.42)的核苷酸序列顯示于所附序列表中。有利地，活的減毒登革1型毒林可以相應(yīng)于VDV1毒林，其通過根據(jù)本發(fā)明的消毒過程而從由Mahidol開發(fā)的LAV1毒林獲得。特別地，活的減毒登革1型毒株(VDV1)可以包含序列SEQIDNo.39，和有利地由序列SEQIDNo.39組成。免疫原性組合物(包括疫苗)可以制備為為注射劑，其可以相應(yīng)于液體溶液、懸浮液或乳狀液?；钚悦庖咴猿煞挚梢院团c之相容的藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法進(jìn)行制備。常規(guī)地，將根據(jù)本發(fā)明的抗原與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或賦形劑例如水或磷酸鹽緩沖鹽水溶液、濕潤劑、填充劑、乳化劑、穩(wěn)定劑相混合。賦形劑或稀釋劑將根據(jù)所選藥物形式、施用方法和途徑以及藥學(xué)實(shí)踐來進(jìn)行選擇。合適的賦形劑或稀釋劑以及關(guān)于藥物制劑的要求在Remington，sPharmaceuticalSciences中得到描述，所述參考文獻(xiàn)是這個(gè)領(lǐng)域中的參考書的例子。優(yōu)選地，免疫原性組合物或疫苗相應(yīng)于可注射組合物，其包含緩沖水溶液以維持例如6-9的pH(于RT用pH計(jì)測定的)。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包含佐劑，即改善或增強(qiáng)由VDV2毒林引發(fā)的免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在人疫苗領(lǐng)域中常用的任何藥學(xué)上可接受的佐劑或佐劑混合物可以用于這個(gè)目的。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以通過在人疫苗領(lǐng)域中常用的任何常規(guī)途徑進(jìn)行施用，例如腸胃外(例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi))途徑。在本發(fā)明的情況下，免疫原性組合物或疫苗優(yōu)選是在三角肌區(qū)中皮下施用的可注射組合物。^f^瘦凝并W才法本發(fā)明進(jìn)一步提供了針對(duì)登革感染對(duì)有此需要的宿主進(jìn)行免疫接種的方法，其包括給宿主施用免疫有效量的根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物。"有此需要的宿主，，指處于登革感染危險(xiǎn)中的人，即去存在登革熱病毒感染的地區(qū)旅行的個(gè)體，以及那些地區(qū)的居民。施用途徑是疫苗領(lǐng)域中使用的任何常規(guī)途徑。施用途徑的選擇取決于所選擇的制劑。優(yōu)選地，免疫原性組合物或疫苗相應(yīng)于有利地在三角肌區(qū)中經(jīng)由皮下途徑施用的可注射組合物。免疫原性組合物或疫苗中的LAV或VDV特別是VDV2的量可以方便地表示為病毒噬斑形成單位(PFU)單位或細(xì)胞培養(yǎng)半感染劑量(CCID5。)劑型，并且通過使用常規(guī)藥學(xué)技術(shù)來進(jìn)行制備。例如，對(duì)于單價(jià)組合物，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以以包含10-106CCID5。，或103-105CCID5。LAV或VDV，例如4±0.5log1()CCID5。的劑量的VDV2毒林的劑型進(jìn)行制備。當(dāng)組合物是多價(jià)的時(shí)，為了減少病毒干擾的可能性并因此達(dá)到平衡的免疫應(yīng)答(即針對(duì)組合物中包含的所有血清型的免疫應(yīng)答)，在所施用的疫苗中存在的每種不同登革血清型的量可以是不相等的。"免疫有效量，，是能夠誘導(dǎo)特異性體液免疫應(yīng)答(包括在已接種疫苗者血清中的中和抗體)的量，如通過如4，1.1.2.2節(jié)中所述的謹(jǐn)斑減少中和測試所評(píng)估的；當(dāng)如此測定的中和抗體滴度為至少大于或等于1:10時(shí)，血清被視為對(duì)于中和抗體的存在是陽性的。施用體積可以依施用途徑而變。皮下注射可以為約0.1ml-1.0ml,優(yōu)選0.5ml的體積。關(guān)于組合物施用的最佳時(shí)間是在最初暴露于登革熱病毒之前約1-3個(gè)月。本發(fā)明的疫苗可以作為預(yù)防劑在處于登革感染危險(xiǎn)中的成人或兒童中施用。因此，所靶向的群體包括未接觸過登革熱病毒的人以及接觸過登革熱病毒的人。本發(fā)明的疫苗可以以單次劑量進(jìn)行施用，或者任選地，施用可以涉及使用致敏劑量，隨后為加強(qiáng)劑量，所述加強(qiáng)劑量例如在2-6個(gè)月后施用，這由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定為適當(dāng)?shù)?。本發(fā)明將根據(jù)下列附圖和實(shí)施例進(jìn)一步進(jìn)行描述。附l是VDV2種子的歷史概括。圖2是流程圖,其概述了所開發(fā)的產(chǎn)生填充產(chǎn)品(單價(jià))，"即用型"劑量的制備過程。圖3是VDV2基因組圖i普的圖示。上方的箭頭是多蛋白的編碼序列。下方的箭頭表示成熟肽的編碼序列。直條表示野生型登革2型毒株16681和LAV2毒林之間的核苷酸變化。星號(hào)標(biāo)明LAV2和VDV2之間的核苷酸變化。圖4顯示于37匸孵育7天后，對(duì)登革2型病毒LAV2、VDV2和毒林16681的噬斑大小分析。圖5是圖形分析，其顯示了關(guān)于登革2型病毒LAV2、VDV2和毒林16681的噬斑大小分布。fil是用于在未接觸過黃病毒的健康成人中評(píng)估VDV2單價(jià)疫苗的安全性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的概括。實(shí)施例實(shí)施例1:消毒1.1病毒RNA的純化RNA純化和轉(zhuǎn)染過程如下進(jìn)行。將DEN-2/PDK50懸浮液重懸浮于0.5ml水中并進(jìn)行稀釋，以l更包含至少3x104和直至3x107TCID50或PFU的病毒/毫升。向0.5ml病毒中加入在0.01mlWilliam's培養(yǎng)基中稀釋的1個(gè)單位benzonase，以便消化來自細(xì)胞來源的DM或RNA分子，并使溶液于4。C在攪拌器上孵育2小時(shí)。在孵育步驟結(jié)束時(shí)，加入0.65ml包含氯化胍、去污劑(SDS)和P巰基乙醇的變性緩沖液(RTL-P巰基乙醇緩沖液，在試劑盒RNeasyMinikit,QiagenRef.74104中提供)，并且蛋白質(zhì)用苯酚/氯仿(1/1，體積/體積)提取l次，再用氯仿(體積/體積)提取l次，隨后于室溫在14，000rpm下離心5分鐘。每次提取后，收集水相，注意不要收集界面處的材料(白色沉淀)，并且轉(zhuǎn)移到干凈的lmlE卯endorf管中。隨后根據(jù)制造商(RNeasyminikit，QIAgen)的建議將RNA溶液施加到QIAgen柱上，以便去除痕量溶劑，并用0.06ml不含核酸酶的H20水洗脫。病毒RNA的存在通過定量RT-PCR，使用用已知量的病毒建立的參考曲線進(jìn)行證實(shí)，單位為TCID5。/ml。1.2用純化的RNA轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞轉(zhuǎn)染使用lipofectamine(LF2000Reagent,LifeTechnologies)來進(jìn)行，所述lipofectamine是通過電荷相互作用與RNA結(jié)合并且允許通過與細(xì)胞膜融合而將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽離子脂質(zhì)混合物。LF2000試劑的最佳量在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中通過下述過程來測定使在16-24小時(shí)前鋪板(在6孔平板中，0.3-0.5x106細(xì)胞/孔)的Vero細(xì)胞與劑量漸增的(5-20lipofectamine—起孵育。細(xì)胞隨后于32。C和5%C02下孵育4-5小時(shí)，之后用不含F(xiàn)CS的新鮮培養(yǎng)基替換該培養(yǎng)基，并于32。C繼續(xù)孵育過夜。在倒置顯微鏡下定期檢查毒性(圓形、有折射力或漂浮的細(xì)胞，細(xì)胞單層的同質(zhì)性)，共48小時(shí)。在這些條件下無毒的lipofectamine的最高劑量是10nil,并且被選擇用于RM轉(zhuǎn)染。使用1/4的RNA制備物(根據(jù)qRT-PCR為約2x104logeqTCID5。)平行地進(jìn)行4次轉(zhuǎn)染。將25微升的病毒RNA溶液在500jil包含15piLF2000Reagent(通過電荷相互作用與RNA結(jié)合并且允許通過與細(xì)胞膜融合而將復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的陽離子脂質(zhì)混合物)的OptiMEM培養(yǎng)基(GIBCO)中進(jìn)行稀釋。在4次反應(yīng)的2次中加入200ng酵母tRNA作為載體。在加入至6孔平板的匯合Vero細(xì)胞并在361C孵育之前，允許4種轉(zhuǎn)染混合物于室溫沉淀10分鐘。4小時(shí)后，去除轉(zhuǎn)染混合物并將細(xì)胞在PBS中漂洗1次。加入3毫升轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基(Williams,GIBC0),并于32。C繼續(xù)孵育5天。該培養(yǎng)基隨后用3ml登革感染培養(yǎng)基(補(bǔ)充有10mMMgS04的Williams)替換。在轉(zhuǎn)染后第8天，在tRNA存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的2個(gè)孔中的l個(gè)之中檢測到呈現(xiàn)出典型的致細(xì)胞病變效應(yīng)(圓形、有折射力的細(xì)胞)的細(xì)胞病灶。在這些細(xì)胞的上清液中病毒的釋放通過qRT-PCR來證實(shí)。轉(zhuǎn)染后11天，只在這個(gè)孔中檢測到顯著的致細(xì)胞病變效應(yīng)，而其他3個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)染的孔的上清液保持陰性。將在轉(zhuǎn)染后回收的病毒溶液重命名為TV100(代替16681PDK50/Vero-2)，并且在包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液中進(jìn)行I/2稀釋后顯示出5.8logTCID5。/ml的感染滴度(pH=7.5)。1.3轉(zhuǎn)染后回收的病毒的表征對(duì)減毒重要的特異性基因座的點(diǎn)測序由R.Kinney(CDC,FortCollins)來進(jìn)行。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于表3中。表3:在減毒特異性位置處的轉(zhuǎn)染病毒測序<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>VDV2保留了在5'NC-57和NS1-53處的重要的減毒基因座，以及在PDK53疫苗中的NS3-250-Glu變體的野生型16681基因座。觀察到在PDK53疫苗中的NS3-250-Glu/Val混合物在PDK45和PDI[53代之間是穩(wěn)定的，這暗示選擇已在Vero細(xì)胞中發(fā)生。從已接種疫苗者血清中分離的DEN-2疫苗的先前分析已證明，這種選擇也可以在人中發(fā)生。病毒噬斑直徑在Vero細(xì)胞中進(jìn)行測量。簡而言之，Vero細(xì)胞以1，000，000細(xì)胞/ci^的密度在包含4%FBS的培養(yǎng)基中進(jìn)行鋪板。過夜醉育后，去除培養(yǎng)基，并用系列2倍或5倍稀釋的病毒感染細(xì)胞。于37。C和5。/。C02下1.5小時(shí)后，去除接種物，并將細(xì)胞在包含1.26%甲基纖維素和IOo/qFBS的極限Eagle培養(yǎng)基(MimimalEagleMedium,MEM)中于37。C和5。/。002下進(jìn)行孵育。孵育11天后，平板于-20。C在冷丙酮中固定20分鐘，并通過使用稀釋至2.5jug/ml的黃病毒特異性mAb的免疫染色來顯示。病毒噬斑使用圖像分析軟件(Saisam/Microvision)來領(lǐng)l]量。將VDV2與LAV216681/PDK50種子進(jìn)行比較(表4)，并且顯示出直徑1-3mm的相似的均質(zhì)小噬斑。表4:LAV216681/PDK50和VDV2的嗟斑大小<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>LP/MP:在6個(gè)孔中大/中等噬斑的數(shù)目SP:在6個(gè)孔中小噬斑的數(shù)目1.4噬斑純化對(duì)轉(zhuǎn)染后回收的病毒進(jìn)行3次另外的擴(kuò)增傳代(P2-P4)。對(duì)經(jīng)P3和P4傳代病毒(分別命名為LST003和LST007)進(jìn)行通過噬斑純化的生物學(xué)克隆。筒而言之，Vero細(xì)胞在6孔平板中進(jìn)行鋪板，并用系列稀釋的病毒進(jìn)行感染，以便獲得每板1-20個(gè)噬斑。于37tl和5%0)2下1.5小時(shí)后，去除接種物并使細(xì)胞在3ml固體培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，所述固體培養(yǎng)基由在42C預(yù)加熱的MEM-10%FCS組成，并與在"t!進(jìn)行平衡的2%熔化瓊脂糖即時(shí)混合。允許培養(yǎng)基于室溫凝固30分鐘；在流動(dòng)通風(fēng)櫥(flowhood)中，并將板以倒置位置于321C-5%0)2孵育10天。隨后加入補(bǔ)充有0.01%中性紅的第二層相同培養(yǎng)基，并使板于32。C再孵育l夜。在無菌條件下使用配備有0.1ml尖頭(tip)的微量移液管(micro-pipet)挑取6個(gè)良好分離的小噬斑，并轉(zhuǎn)移到包含0.2ffllMEM-4%FCS的無菌管內(nèi)3個(gè)來自P3代(鑒定為克隆31、32和33)，和3個(gè)來自P4代(鑒定為克隆71、72和73)。該懸浮液通過渦旋振蕩進(jìn)行均質(zhì)化，在相同培養(yǎng)基中進(jìn)行系列稀釋，并立即用于感染Vero細(xì)胞的6孔平板。重復(fù)該方案，并進(jìn)行第二次挑取，在克隆32、33、71和72上挑取2個(gè)SP,和在克隆31上挑取1個(gè)SP。在Vero細(xì)胞上擴(kuò)增之前，在T25ci^燒瓶中將每個(gè)被挑取的噬斑在1ml培養(yǎng)基中進(jìn)行稀釋。在感染后第6天收集培養(yǎng)基，用相同體積的包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH7.5)進(jìn)行稀釋，并冷凍于-7(TC。所有這些步驟于32。C進(jìn)行。經(jīng)噬斑純化的病毒分別命名為311、321、322、331、332、341、342、351、352、711、712、721和722。感染滴度在第一次擴(kuò)增結(jié)束時(shí)在Vero細(xì)胞上進(jìn)行測定(參見下文)克隆311:3.95LogCCID5。/ml克隆321:5.20LogCCID5。/ml克隆322:5.45LogCCID5。/ml克隆331:5.55LogCCID5。/ml克隆332:4.95LogCCID5。/ml克隆341:2.80LogCCID5。/ml克隆342:4.85LogCCID5。/ml克隆351:5.35LogCCID5。/ml克隆352:5.50LogCCID5。/ml克隆711:5.45LogCCID5。/ml克隆712:5.65LogCCID5。/ml克隆721:5.30LogCCID50/ml克隆722:5.60LogCCID5。/ml對(duì)于下列3個(gè)克隆進(jìn)行在Vero細(xì)胞上的第二次擴(kuò)增331、352和722。在感染后第8天收集培養(yǎng)物上清液，用包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH7.5)作1/2稀釋，并命名為TV331、TV352和TV722。1.5經(jīng)克隆的病毒的表征在第一次擴(kuò)增后，所有擴(kuò)增的病毒顯示出相同的噬斑大小表型以及等于或高于5logCCID5。/ml的滴度(除了明顯較低的克隆311和341之外)。對(duì)來自笫一次擴(kuò)增的6個(gè)克隆(克隆321、331、351、352、711、721)和來自第二次擴(kuò)增的3個(gè)克隆進(jìn)行在減毒特異性位置處的測序，并且沒有顯示出突變。在克隆之間不存在任何顯著差異的情況下，選擇TV722并在VERO細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，以便產(chǎn)生VDV2疫苗候選毒株。表5:在DEN-2病毒的減毒特異性點(diǎn)處的測序<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>核苷酸位置在各自基因下指明，并且參考DEN-216681毒林的公開序列。總之，總共11次傳代對(duì)于獲得在VERO細(xì)胞上進(jìn)行適應(yīng)的DEN-2166681/PDK50的生物學(xué)克隆是必需的。然后，通過測定VDV2第11代的完整序列和表型測試來進(jìn)行進(jìn)一步的表征。實(shí)施例2:測序病毒全序列根據(jù)下述策略產(chǎn)生。純化病毒基因組RNA。通過16次重疊RT-PCR反應(yīng)而擴(kuò)增出完整基因組。每次PCR被這樣設(shè)計(jì)，即使得在每條DNA鏈上添加測序標(biāo)簽。這使得測序反應(yīng)更簡單，所有測序反應(yīng)均由單對(duì)通用測序引物來驅(qū)動(dòng)。每種PCR產(chǎn)物在2條DNA鏈上進(jìn)行個(gè)別測序。所有結(jié)果被重新裝配以重建完整的VDV卩基因組。2.1材料2.1.1病毒此處涉及的病毒是DEN-216681;LAV-2/PDK53;VDV2，其序列在所附的序列表中給出。這些病毒的完整基因組序列長度為10723個(gè)核苷酸。2.1.2引物所有引物已在Seqweb生物信息學(xué)軟件包(Accelrys),引物設(shè)計(jì)模塊中進(jìn)行了設(shè)計(jì)(表6)。表6:RT-PCR和測序引物列表<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.2方法2.2.1病毒RNA的純化根據(jù)以前的經(jīng)驗(yàn)，需要最低限度1000DICC5。以在接下來的步驟中獲得陽性RT-PCR反應(yīng)。這意味著需要最低限度104DICC5。/mL的病毒滴度。病毒基因組RNA使用QIAamp病毒RNA小試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的建議進(jìn)行純化。簡而言之，將來自粗制病毒樣品的140體積在裂解溶液存在下進(jìn)行孵育，并加載到試劑盒柱上。洗滌步驟后，純化的病毒RM通過60ju1包含1ju1(40個(gè)單位)RM酶抑制劑(RNAseOut,Sigma)的、不含核酸酶的無菌水進(jìn)行洗脫。2.2.2反轉(zhuǎn)錄病毒RM通過來自ABGene的反轉(zhuǎn)錄酶(反向iT)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再次應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)操作條件，在20jli1的最終反應(yīng)體積中使用10jul純化的RNA。反應(yīng)通過負(fù)鏈引物的雜交來起始。每次PCR進(jìn)行1次RT反應(yīng)。cDNA合成通過于47'C孵育45分鐘來獲得。2.2.3PCR所有PCR采用ExpandHighFidelityPCR系統(tǒng)(Rochediagnostics)，使用來自表6的所有16對(duì)引物(+)和(-)來進(jìn)行。PCR條件如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>所有PCR產(chǎn)物通過在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳來檢查。2.2.4測序測序反應(yīng)的主要部分已夕卜包給GenomeExpress。基因組末端、錯(cuò)讀(ambiguities)、某些內(nèi)部PCR接頭以及用于4支術(shù)原因而未由GenomeExpress測序的區(qū)域在機(jī)構(gòu)內(nèi)部(in-house)進(jìn)行。.在GenomeExpress的測序PCR產(chǎn)物于+4。C進(jìn)行運(yùn)輸，并且測序結(jié)果作為信息序列文件被接受。關(guān)于每個(gè)單個(gè)序列，可獲得文本文件、質(zhì)量文件(qualityfile)和色鐠圖。序列比對(duì)后，在色語圖上檢查所有差異，并且如果鑒定為序列算法誤差則進(jìn)行校正。機(jī)構(gòu)內(nèi)部測序測序反應(yīng)使用SequithermExcellIILC試劑盒(Epicentre)在熱循環(huán)儀PTC-200(MJResearch)上進(jìn)行。每種PCR產(chǎn)物在單個(gè)反應(yīng)中獨(dú)立地對(duì)2條鏈進(jìn)行測序。將反應(yīng)體系加載到測序電泳凝膠上。測序運(yùn)行和分析在自動(dòng)化測序儀GeneReadIR4200(Li-Cor)上進(jìn)行。2.3結(jié)果所有PCR片段使用共同的PCR添加尾從2個(gè)末端開始進(jìn)行測序，所述PCR添加尾即在所有引物的5'末端處添加的特異性基序5'引物M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQIDNo.36)3'引物:M13REV-AACAGCTATGACCATG(SEQIDNo.37)M13-SEQ和M13-REV序列相應(yīng)于通用M13引物基序(NewEnglandBiolabs標(biāo)準(zhǔn))。對(duì)于最終重疊群裝配，在VectorNTi中，在ContigExpress才莫塊26測序反應(yīng)DM高達(dá)200/250ng反應(yīng)緩沖液7.2pi引物(1-2pM)各1.5Ml酶1^1H20高達(dá)20pi添加3Ji1變性/加樣緩沖液。樣品于95。C變性3分鐘，并緊在樣品加載前用水冷卻。測序電*氺電泳參數(shù)_凝膠參數(shù)_1500V凝膠高度41cm35mA凝膠厚度0.2mm40W溫度45'C時(shí)間9H00掃描速度330個(gè)循環(huán)92。C50"C70"C70X:PCR程序壓流率行電電功i中中4少少.*>-少CJ\<J乂>*JSi性交伸伸n雜延延(Informax)中進(jìn)行快速分析。將LAV2參考序列與所有單個(gè)測序結(jié)果進(jìn)行比較。在此類條件下，所有結(jié)果可以在完整基因組上的右側(cè)位置處進(jìn)行比對(duì)，甚至當(dāng)某些區(qū)域仍缺少重疊群裝配時(shí)，從而產(chǎn)生總基因組比對(duì)的快速顯現(xiàn)。2.3.1完整的VDV2序列的裝配最終序列比對(duì)在VectorNTi,AlignX模塊(Informax)中進(jìn)行。通過軟件將常規(guī)多重序列比對(duì)算法ClustalW(Thompson等人，1994)用于建立總體比對(duì)。所有序列結(jié)果連同LAV2參考序列一起比對(duì)，從而允許更好地重建基因組。關(guān)于參考而言在序列中的任何差異需要在另一次獨(dú)立測序反應(yīng)上進(jìn)行證實(shí)。VDV2的完整序列顯示于SEQIDNo.1中。通常在單個(gè)序列中發(fā)現(xiàn)某些錯(cuò)讀，特別是在序列末端附近。這是在任何PCR片段的2個(gè)末端處一定程度的反應(yīng)質(zhì)量差的內(nèi)在原因。此類質(zhì)量差的序列被排除在比對(duì)之外，直至可從其他PCR產(chǎn)物獲得2個(gè)其他獨(dú)立的測序反應(yīng)。當(dāng)在至少2個(gè)獨(dú)立的與共有序列相匹配的其他PCR序列中未得到證實(shí)時(shí)，相對(duì)于參考的差異在最終比對(duì)中不加以考慮。相反地，在2個(gè)獨(dú)立序列上證實(shí)的任何差異在最終序列中保留。表7概括了每個(gè)單獨(dú)測序反應(yīng)的特征，指出了起點(diǎn)、終點(diǎn)和長度。還指出了鄰近PCR之間的重疊，以及指出了在最后一列中與參考序列的差異。表7:登革VDV2單獨(dú)序列的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>基因組的2個(gè)末端不能由PCR擴(kuò)增進(jìn)行測序，因?yàn)閏DNA合成和PCRDNA反應(yīng)需要與基因組末端互補(bǔ)的寡核苷酸。在擴(kuò)增步驟過程中，這些寡核普酸被摻入PCR片段中。序列結(jié)果是合成的寡核苷酸的序列，而不是病毒自身的序列。來自病毒基因組2個(gè)末端的PCR確實(shí)正確地運(yùn)轉(zhuǎn)，這暗示病毒序列與所述寡核普酸序列并無顯著不同(如果有顯著不同，那么PCR擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)已失敗或至少應(yīng)當(dāng)具有差的質(zhì)量)。我們不能將它們與所有其他PCR擴(kuò)增區(qū)分開。因此，在重建的基因組中，2個(gè)基因組末端被視為等同于寡核苷酸序列(并且還等同于參考)。在5'末端，所述序列是核苷酸1-32的序列。在3'末端，所述序列是核苷酸10695-10723的序列。2.3.2序列比較已檢測到相對(duì)于親本LAV2基因組序列的IO個(gè)核苷酸差異。VDV2疫苗毒林通過病毒消毒和從犬到猴細(xì)胞的傳代而衍生自LAV2。LAV2和VDV2之間的差異可以具有幾個(gè)來源。首先，克隆步驟可以選出與LAV2中先前檢測的主要序列并非100%—致的病毒亞群。其次，LAV2在PDK細(xì)胞上產(chǎn)生，而VDV2在Vero細(xì)胞上制備。此類從犬到猴細(xì)胞的傳代已知可能誘導(dǎo)病毒變化，其反映了對(duì)新細(xì)胞系的適應(yīng)。第三，對(duì)于所有RNA病毒，較低的病毒RNA聚合酶保真度觸發(fā)了比DM聚合酶更高的基因組突變率。就序列而言，與LAV2病毒減毒相關(guān)的所有9個(gè)核苷酸位置在VDV2第ll代中被保留。此外，VDV2笫9代和第11代之間的序列比較顯示，在第9和11代之間發(fā)生2個(gè)突變，所述突變與表型、病毒血癥和免疫原性的差異相關(guān)聯(lián)。表8:LAV2/PDK53毒林與VDV2第9和11代毒林之間的序列比較<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>斜體VDV2第9代和第11代之間的序列差異當(dāng)在所有可獲得的Genbank血清型2登革基因組序列之間進(jìn)行序列比對(duì)時(shí)，看起來只有2個(gè)位置由其他登革2毒株(1638和2520)共享，兩者在氨基酸水平上都是沉默的。所有其他位置對(duì)于VDV2第11代毒林是特異的，這觸發(fā)了氨基酸置換(表8)。關(guān)于氨基酸變化，非結(jié)構(gòu)肽中的4個(gè)變化從生物化學(xué)觀點(diǎn)來看是相對(duì)保守的，而M和包膜中的2個(gè)變化產(chǎn)生電荷和疏水性中的修飾。實(shí)施例3:表征這些研究的目的是評(píng)估減毒標(biāo)記中的變化是否通過傳代而出現(xiàn)。圖2中顯示的流程圖概述了所開發(fā)的產(chǎn)生填充產(chǎn)品(單價(jià))，"即用型"劑量的制備過程。簡而言之，VDV2第8代在Vero細(xì)胞上2次連續(xù)傳代后，獲得各自的工作種子(workingseed)。最終病毒培養(yǎng)也通過感染Vero細(xì)胞懸浮液來實(shí)施。隨后收獲產(chǎn)生的病毒。脫氧核糖核酸(DNA)根據(jù)酶處理進(jìn)行消化。雜質(zhì)通過超濾來去除。感染滴度通過濃縮步驟而得到增強(qiáng)。加入包含冷凍保護(hù)劑的緩沖水溶液(pH-7.5)，并且隨后將這種經(jīng)0.22-jum過濾的混合物在相同溶液內(nèi)稀釋至靶定的劑量。然后將活性物質(zhì)填充到玻璃管形瓶內(nèi)，冷凍干燥，并在使用前進(jìn)行貯存。3.1表型標(biāo)記表9呈現(xiàn)了來自對(duì)DEN-216681wt毒林、DEN-216681/PDK53疫苗毒林、VDV2第9代和VDV2第11代(最后的適應(yīng)傳代物)進(jìn)行的3種表型測定法的數(shù)據(jù)溫度敏感性(Ts)，在猴細(xì)胞(Vero)和蚊子細(xì)胞(C6/36)上的生長曲線，和在新生小鼠中的神經(jīng)毒力(數(shù)據(jù)在CDC獲得)。減少的小鼠神經(jīng)毒力(減少的死亡率和更長的平均存活時(shí)間(AST))、于39'C的受限制的生長和在C6/36上的受限制的復(fù)制目前被科學(xué)界認(rèn)為是登革熱病毒的減毒標(biāo)準(zhǔn)。Vero-適應(yīng)的傳代物顯示出清楚的Ts特性，并且比DEN2/PDK53更受限制。最后的適應(yīng)傳代物在這種測定法中被限制約3log。溫度敏感性還通過病毒生長曲線來證實(shí)。在Vero細(xì)胞上，對(duì)于所有受試病毒觀察到相似的復(fù)制水平。在蚊子細(xì)胞上，Vero-適應(yīng)的病毒的病毒生長與wtDEN2相比較明顯被限制(約3log),和與DEN2/PDK53相比較稍微被限制(約0.5log)。令人驚訝的是，Vero-適應(yīng)的病毒的小鼠神經(jīng)毒力接近于wtDEN2的神經(jīng)毒力，并且顯著高于DEN2/PDKS3疫苗的神經(jīng)毒力。這些數(shù)據(jù)指出相關(guān)于病毒林減毒來說這種說法的低預(yù)測值(參見臨床數(shù)據(jù))。圖5比較了VDV2第9和11代、DEN2/PDK53以及wtDEN2的噬斑大小分布。WtDEN2顯示出異質(zhì)特性95%的噬斑具有大小均質(zhì)特性，主要群體(81%)具有<0.6mm的噬斑和次要群體(12%)具有1-2mm的噬斑。這種特性接近于，但不同于DEN2-PDK53的特性。值得注意的是，中間適應(yīng)傳代物VDV2P9顯示出更異質(zhì)的特性，主要群體(70%)具有1-2咖的噬斑，和次要群體(25%)具有<0.6mm的噬斑。這些數(shù)據(jù)證明，VDV2毒株在第9代時(shí)仍未完全適應(yīng)，并且需要2次另外傳代以獲得在Vero細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制的均質(zhì)群體。表9:DEN-卩病毒表型的概括<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>N:動(dòng)物數(shù)目實(shí)施例4:在猴中的免疫原性、病毒血癥和毒理學(xué)可以在猴中獲得的最可靠和眾多的數(shù)據(jù)涉及免疫原性和病毒血癥。特別地，病毒血癥已被鑒定為與人中的毒力和疾病嚴(yán)重度有關(guān)的因素之一，并隨后構(gòu)成了所考慮的重要參數(shù)。很顯然，免疫原性是測試疫苗時(shí)的關(guān)鍵參數(shù)。發(fā)明人已確定了關(guān)于病毒血癥和免疫原性的最小/最大值。表10:對(duì)于在猴中由登革疫苗候選物誘導(dǎo)的應(yīng)答的最低要求，如在Vero或LLC-MK2細(xì)胞(這些細(xì)胞在此類測定法中視為等價(jià)的)中通過噬斑測定法測量的_<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>pfu:謹(jǐn)斑形成單位PRNT50:噬斑減少中和滴度50(相應(yīng)于噬斑數(shù)目減少50%的滴度)4.1在動(dòng)物中的臨床前藥理學(xué)、藥物動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)物代謝4.1.1材料和方法4人丄7凝,發(fā)猴實(shí)驗(yàn)根據(jù)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的歐洲指南來進(jìn)行。對(duì)來自毛里求斯(CRPLeVallon)的恒河猴(食蟹猴(施caca/^c/c"/ar"))進(jìn)行免疫接種。在免疫接種前，猴在SanofiPasteur的動(dòng)物研究所隔離檢疫6周。猴通過皮下(SC)途徑在臂中用體積0.5ml的疫苗進(jìn)行免疫(參見各個(gè)分別的部分)。在用氯胺酮(Imalgene,Merial)輕度麻醉后，通過刺破腹股溝靜脈或隱靜脈來收集血液。在第0和28天，抽取5ml血液用于評(píng)估抗體應(yīng)答，而在第2和10天之間只抽取1ml血液用于評(píng)估病毒血癥。在冰上收集血液并保持在冰上直至血清分離。為了做到這點(diǎn)，血液于4C離心20分鐘，并且收集血清并貯存于-80。C直至在RichKinney，s實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行測試。在干冰中裝運(yùn)到美國?！度?,2病#益癥和哞和戎##吝f哞希^試，戶^7V所有分析在CDC，F(xiàn)ortCollins,USA的R.Kinney實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。裝運(yùn)血清樣品并貯存于-80。C直至測試時(shí)。在第一次解凍時(shí)，就病毒血癥測試樣品，并對(duì)血清作1:5稀釋。在就中和抗體進(jìn)行測試之前，使1:5血清稀釋物于56"C滅活30分鐘。4.1.1.2.1病毒血癥將0.125ml血清加入至在96孔平板的第1個(gè)孔中的0.1"ml稀釋劑(RPMI培養(yǎng)基)之中，并進(jìn)行10倍系列稀釋，對(duì)于每次稀釋將0.025ml轉(zhuǎn)移到0.225ml稀釋劑中。將0.2ml10°3-105'3稀釋系列在Vero細(xì)胞的6孔平板中進(jìn)行鋪板(病毒于37'C吸附1.5小時(shí)，用4ml不含中性紅的瓊脂糖覆蓋，6-7天后用2ml包含中性紅的瓊脂糖覆蓋，并計(jì)數(shù)噬斑)。病毒檢測極限是-10PFU/ml。關(guān)于對(duì)照，將原液DEN-16681PDK-53(LAV2)疫苗進(jìn)行鋪板。4.1.1.2.2PRNT(噬斑減少中和測試)中和抗體如Huang等人(2000)中所述進(jìn)行定量。簡而言之，將0.2ml熱滅活的經(jīng)1:5稀釋的血清加入96孔平板的第一個(gè)孔中，并進(jìn)行2倍系列稀釋，對(duì)于每次稀釋將0.1ml轉(zhuǎn)移到0.1ml稀釋劑(RPMI培養(yǎng)基)中。這導(dǎo)致產(chǎn)生1:10-1:320的血清稀釋系列。將0，1mlDEN病毒("-:^0PFU;親本DEN2l"81病毒)加入至每個(gè)血清稀釋孔中，得到總共0.2ml血清-病毒混合物。96孔平板于4X:孵育過夜。將0.1ml血清-病毒混合物(包含30-80PFU的輸入病毒)在6孑LVero平板中進(jìn)行鋪板(如上文在"病毒血癥"部分所指明的)，并且在用中性紅染色后計(jì)數(shù)噬斑。在2倍、l倍和0.5倍測試濃度下輸入病毒的多次反向滴定(backtitration)提供了輸入PFU的直接實(shí)驗(yàn)測定，這是用于測定50%(PRNT5Q)和70%(PRNT7。)終點(diǎn)抗體滴度的基礎(chǔ)。陰性血清結(jié)果應(yīng)當(dāng)具有〈1:10的中和抗體滴度。顯示出320的中和滴度的血清在1:80-1:2560的稀釋度進(jìn)行再次測試，以確定終點(diǎn)滴度。4,1.2在猴中對(duì)在第9代時(shí)的單價(jià)VDV2候選物的評(píng)估VDV2候選物的純化/選擇已如實(shí)施例1中所述進(jìn)行。在SanofiPasteur中，在細(xì)胞培養(yǎng)中9次傳代后，所選擇的克隆(基于表型標(biāo)記和序列)對(duì)來自CRPLeVallon,毛里求斯的雄性恒河猴(食蟹猴，平均重量3.1kg)進(jìn)行了測試。在第0天免疫接種后，從第2天到第10天追蹤病毒血癥，并且在第0天和第28天測量免疫原性。當(dāng)以液體形式時(shí)，所有病毒和疫苗保存于-70。C。LAV2:滴度10393DICC5。/ml;凍干的，重懸浮于0.5mlPBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H2。0.133g/l;MgCl2.6,，0.lg/1)中，并且全部施用。傳代物VDV2DEN2-TV722(2次噬斑純化+1次擴(kuò)增)滴度10"DICC5。/ml;液體，在PBS(包含Ca"和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6H2。，0.1g/l)中稀釋至1053pfu/ml;施用0.5ml。通過SC途徑在臂中用23Gl針進(jìn)行注射，對(duì)于VDV2采用105DICC5。的劑量。結(jié)果呈現(xiàn)于表11中。第28天時(shí)的滴定對(duì)于PRNT。和PRNL。均一式三份地進(jìn)行。VDV2和LAV2之間的比較顯示了病毒血癥方面的明顯差異，對(duì)于VDV2在3/4的猴子中與LAV2相比較具有短持續(xù)時(shí)間的高病毒血癥，以及對(duì)于2種類型均具有顯著的免疫原性(對(duì)于VDV2更加低)。在Vero細(xì)胞上只傳代數(shù)次后，在這個(gè)前主(pre-master)水平上，這種病毒血癥可以視為對(duì)于VDV2太高。然而，野生型DEN-2(以及還有其他類型)誘導(dǎo)更長持續(xù)時(shí)間(6-7天)和強(qiáng)度(高達(dá)5logs噬斑形成單位[pfu])的病毒血癥(Monath等人，2000;Bray等人，l"6)。表11:VDV2第9代的免疫原性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>4.1.3在第11代時(shí)的單價(jià)VDV2候選物的評(píng)估因?yàn)樗鲆呙绲拿庖咴砸言诘?代時(shí)進(jìn)行了測試，所以設(shè)計(jì)了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來在2次另外傳代后測試所述單價(jià)傳代物(第IO代)。如前面一樣使用來自C.R.P.LeVallon，lieMaurice的雄性食蟹猴(24只猴，平均重量3.4kg)。第11代VDV2:批次滴度8.07loglODICC50/ml安慰劑含Ca"和Mg"的PBSVDV3:VERO來源的疫苗登革血清型3毒抹，通過LAV3在Vero細(xì)胞上進(jìn)行消毒而獲得。VDV4:VERO來源的疫苗登革血清型4毒林，通過UV4在Vero細(xì)胞上進(jìn)行消毒而獲得。疫苗在PBS(包含Ca'+和Mg2+;CaCl2.2H200.133g/l;MgCl2.6H20，0.lg/1)中稀釋至105'3DICC5。/ml;通過SC途徑在臂中用23G1針施用0.5ml，相應(yīng)于105DICC5。的劑量。病毒血癥和免疫原性已照例在CDC中由RKinney進(jìn)行測量。結(jié)果顯示于表12中。VDV2第11代單價(jià)疫苗誘導(dǎo)了顯著的免疫應(yīng)答，而病毒血癥很低或不存在。根據(jù)其中第9代VDV2誘導(dǎo)高的早期病毒血癥的先前實(shí)驗(yàn)，將考慮這種不存在的/很低的VDV2-誘導(dǎo)的病毒血癥。第9和11代之間的某些進(jìn)化抑制了這種高的病毒血癥，而免疫原性被維持。因此，VDV2構(gòu)成了可接受的候選物。應(yīng)當(dāng)指出，在相同實(shí)驗(yàn)中，4只猴子用涉及相同VDV2第11代疫苗的四價(jià)制劑進(jìn)行疫苗接種；對(duì)于VDV1和VDV2沒有檢測到病毒血癥，而VDV3和VDV4+秀導(dǎo)了病毒血癥。另外2個(gè)實(shí)驗(yàn)涉及單獨(dú)地或與其他血清型相組合地施用VDV2。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)(四價(jià)研究；5-log的每種血清型)中，對(duì)于VDV2和VDV1沒有檢測到病毒血癥，而對(duì)于VDV3和VDV4檢測到高水平的病毒血癥。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將VDV2第ll代單獨(dú)施用，或在包括VDV1的四價(jià)組合內(nèi)施用。當(dāng)單獨(dú)施用時(shí)，VDV2第11代僅在4只猴子的1只中誘導(dǎo)了低的病毒血癥(峰值40)，而另外3是陰性的。當(dāng)存在于四價(jià)制劑中時(shí)，VDV2沒有誘導(dǎo)病毒血癥，或誘導(dǎo)了與VDV3和VDV4相比明顯更低的病毒血癥，即使VDV2以4log進(jìn)行施用，而VDV3和VDV4以21og進(jìn)行施用。這證明了在病毒血癥方面VDV2具有較高的安全性。因此，單價(jià)VDV2滿足在猴中最初限定的成功標(biāo)準(zhǔn)。表12:第11代VDV2的免疫原性和病毒血癥<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>4，2VDV2的毒理學(xué)4.2.1在猴中的神經(jīng)毒力測試這種測試的目的是證實(shí)由SanofiPasteur生產(chǎn)的減毒的2型登革熱病毒種子在猴中沒有向神經(jīng)特性(Ph.Eur.2.6.18)。10只來自毛里求斯的恒河猴通過大腦內(nèi)途徑(在每個(gè)半球的丘腦中1071°CCID5。/mL)用VDV2笫9代進(jìn)行接種。在測試結(jié)束時(shí)，將猴處死并用福爾馬林溶液灌注。組織樣品取自每只猴的腦(延髓、腦橋和小腦、中腦、丘腦(包括左和右部)、大腦皮層的左和右側(cè))。切下厚度為8jum的切片并通過曙紅和掊花青進(jìn)行染色。在用血清型2原代病毒種子注射的猴腦中沒有觀察到病原性的組織病理學(xué)征兆。4.2.2在皮下施用1次VDV2并隨后經(jīng)過28天的觀察期之后，在恒河猴中的GLP毒性研究這項(xiàng)GLP研究的目的是評(píng)估VDV2第9代與其他登革疫苗候選物之間的相互作用。該研究的笫一個(gè)步驟是在施用另一種疫苗候選物之前，評(píng)估VDV2的安全性和免疫原性。在第0天時(shí)給恒河猴(4只雄性和4只雌性)皮下施用1個(gè)人劑量的VDV2(大約104CCIDs。/劑)。2只雄性和2只雌性的對(duì)照組接受媒介物(4%。NaCl)。在整個(gè)研究過程中監(jiān)控死亡率、臨床病狀、體重和食物消耗。體溫在測試前測量1次，并從每次施用的那天起及其后2天期間每天測量一次。在測試前以及第8和27天時(shí)各獲取1次血樣用于臨床實(shí)驗(yàn)室測定。不存在對(duì)臨床體征、體重、食物消耗、皮膚反應(yīng)、體溫、血液學(xué)、臨床化學(xué)或器官重量的影響。在研究期間沒有報(bào)告死亡。總之，如通過生活(in-life)臨床觀察和臨床病理學(xué)所評(píng)估的，給恒河猴(食蟹猴)皮下施用測試劑量的VDV2不會(huì)不利地影響猴的健康。實(shí)施例5:單價(jià)VDV2在未接觸過黃病毒的年齡為18-40歲的健康成人中的安全性這個(gè)1期試驗(yàn)的目的是證明在未接觸過黃病毒的成人中與SUmaril(用作對(duì)照組)相比較，單價(jià)VDV2第11代在104CCID5。的病毒濃度下的安全性、病毒血癥和免疫原性特性。給予單次注射，在6和12個(gè)月時(shí)隨訪。對(duì)于安全預(yù)防措施，在研究中進(jìn)行順次包括。參與和疫苗接種因此是交錯(cuò)的第l個(gè)群組(n-4/組，總數(shù)n-12)進(jìn)行了疫苗接種。在決定繼續(xù)對(duì)剩余受試者(n-8/組，總數(shù)n-16)進(jìn)行疫苗接種之前，一直到第28天收集的安全性數(shù)據(jù)由獨(dú)立數(shù)據(jù)監(jiān)察委員會(huì)(IndependentDataMonitoringCommittee)(IDMC)和皇家阿德雷德醫(yī)院研究藥物小組委員會(huì)(RoyalAdelaideHospitalInvestigationalDrugsSubcommittee)(IDSC)進(jìn)行評(píng)審。試驗(yàn)設(shè)計(jì)的圖示在圖6中提供。施用疫苗后，患者定期接受各種臨床檢查和測試。這個(gè)隨訪的概括在下表13中給出。參與的群體由在入選當(dāng)天時(shí)年齡為18_40歲(即18歲生日那一天至41歲生日前那一天)的成人組成，所迷成人是未接觸過黃病毒的[存在針對(duì)黃病毒疾病(例如黃熱病、日本腦炎、登革熱)的疫苗接種；或黃病毒感染史(經(jīng)臨床、血清學(xué)或微生物學(xué)證實(shí))，或以前居住在具有高度的登革感染地方流行性的地區(qū)或去具有高度的登革感染地方流行性的地區(qū)旅行(無論持續(xù)時(shí)間多長)，或居住在NorthQueensland2周或更長時(shí)間或去NorthQueensland旅行2周或更長時(shí)間的人被排除]。表13:關(guān)于隨訪的流程圖<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>口就診之間的時(shí)間間隔將由研究疫苗接種日期進(jìn)行計(jì)算，所述研究疫苗接種日期可能不同于就診日期(例如在符合臨時(shí)排除標(biāo)準(zhǔn)的情況下)。V06和V07必須以至少1天的間隔進(jìn)4亍。測試的產(chǎn)品是評(píng)估的疫苗是管形瓶中的凍干產(chǎn)品，所述凍千產(chǎn)品用分開提供的稀釋劑即時(shí)重構(gòu)活性成分4±0.51og!。CCID5。的單價(jià)Vero登革熱病毒血清型2(VDV2第11代)/0.5mL劑量;稀釋劑無菌NaCl4%。溶液，用于疫苗重構(gòu)。重構(gòu)的疫苗，即0.5mL單價(jià)VDV2的NaCl4%。溶液，應(yīng)當(dāng)立即使用或維持于+2。C""+8。C直至使用。在三角肌區(qū)中皮下施用0.5mL疫苗劑量。對(duì)照疫苗Stamaril⑥是由AventisPasteur生產(chǎn)的黃熱病疫苗。Stamaril⑥表現(xiàn)為凍干的、不含禽白血病的、穩(wěn)定化的產(chǎn)品，其緊在使用前用稀釋劑進(jìn)行重構(gòu)。(活性成分活的減毒黃熱病病毒(17D毒林)>1,000小鼠半致死劑量(LD5。)/稀釋劑無菌NaCl4%0溶液)。在三角肌區(qū)中皮下施用對(duì)照疫苗。沒有受試者具有與疫苗接種有關(guān)的臨床顯著綜合征。1個(gè)受試者具有暫時(shí)的發(fā)熱(〈38X:)。l個(gè)受試者具有局部反應(yīng)(硬結(jié))。沒有觀察到與疫苗接種有關(guān)的嚴(yán)重不利事件。在針對(duì)登革2的疫苗接種后28天，所有受試者具有抗體應(yīng)答(滴度為1888-6393)。參考文獻(xiàn)Bhamarapravati，N和YoksanS,(1997).DengueandDengueHemorrhagicFever.Liveattenuatedtetravalentdenguevaccines,CABIPublishing,367-379.BurkeDS和MonathTP.Flaviviruses(2001)InKnipeDMandHowleyPM，eds.FieldsVirology第4版，第1巻，1043-1125DeFraitesRF,SmoakBL，TrofaAF，HokeCH，Kanesa-thasanN，KingA，MacArthyP0，等人DenguefeveramongU.S.militarypersonnel-Haiti,September-November,1994.MMWR1994;43:845—848.Dunnen和Antonarakis(2000)Mutationnomenclatureextensionsandsuggestionstodescribecomplexmutations:adiscussion.HumMutation.15:7-12;Erratumin:HumMutat2002;20(5):403GublerDJ.Dengue.(1988)In:Epidemiologyofarthropod—borneviraldisease.MonathTPM，editor,BocaRaton(FL):CRCPress:223-60GublerDJ，KunoDengue和DengueHemorrhagicFever.CABInternationalPublishing1997GublerD.Epidemicdengue/denguehemorrhagicfeverasapublichealth,socialandeconomicprobleminthe21stcentury.(2002)TRENDSinMicrobiology.10:100-103HalsteadSB和SimasthienP(1970).ObservationsrelatedtopathogenesisofDenguehaemorrhagicfever.II.Antigenicandbiologicalpropertiesofdenguevirusesandtheirassociationwithdiseaseresponseinthehost.YaleJ.Biol.Med;42:261-275.Huang等人(2000).J.Virol74;3020-3028.JirakanjanakitN，KhinMM，YoksanS，BhamarapravatiN.(1999)Dynamicsofsusceptibilityandtransmissibilityofthelive,attenuated,candidatevaccinesdengue-1PDK13,dengue-3PGMK30F3,anddengue-4PDK48afteroralinfectioninAedesaegypti.AmJTropMedHyg.，61(4):672-676KautnerI，RobinsonMJ,KubnleU.(1997)DengueVirusinfection:Epidemiology,pathogenesis,clinicalpresentation,diagnosis,andprevention.JofPediatrics;131:516-524Monath，TP.(1994)Dengue:therisktodevelopedanddevelopingcountries.ProcNatlAcadSci;91:2395-2400.MonathTP,LevenbookI，SoikeK,ZhangZX，RatterreeM，DraperK等人(2000)Chimericyellowfevervirus17D-Japaneseencephalitisvirusvaccine:dose-responseeffectivenessandextendedsafetytestinginrhesusmonkeys.JournalofVirology;74(4):1742-1751BrayM，MenR,LaiCJ.(1996)Monkeysimmunizedwithintertypicchimericdenguevirusesareprotectedagainstwild—typeviruschallenge.JVirol;70(6):4162-4166Rigau-P6rezJG，ClarkGG，GublerDJ，ReiterP，SandersEJ，VorndamAV.(1998)Dengueanddenguehaemorrhagicfever.Lancet;352:971-977.RothmanAL，EnnisFA.(1999)Immunopathogenesisofdenguehemorrhagicfever.Virology;257:1—6SabinAB.(1952)ResearchondengueduringWorldWarII.AmJTropMedHyg;1:30-50ShirtcliffeP，CameronE，NicholsonKG,WiselkaMJ.(1998)Don'tforgetdengue!Clinicalfeaturesofdenguefeverinreturningtravellers.JRoyCollPhysLond.;32:235-237.ThompsonJD，HigginsDG和GibsonTJ.(1994)CLIJSTALW:improvingthesensitivityofprogressivemultiplesequencealignmentthroughsequenceweighting,position-specificgappenaltiesandweightmatrixchoice.Nucl.Acids.Res.，22(22)，4673-4680VaughnDW，GreenS，KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SimtayakornS，RothmanAL，ErniisFA,NisalakA.(1997)Dengueintheearlyfebrilephase:viremiaandantibodyresponse.JInfectDis;176:322-30.VaughnDW，GreenS,KalayanaroojS，InnisBL，NimmannityaS，SuntayakornS，EndyTP,RaengsakulrachB，RothmanAL，EnnisFA，NisalakA.(2000)Dengueviremiatiter,antibodyresponsepattern,andvirusserotypecorrelatewithdiseaseseverity.JInfDisj181:2-9.WHOTechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosis:treatmentandcontrol,pl-2.WorldHealthOrganization,Geneva,SwitzerlandWuS，Grouard-VogelG,SunW，MascolaJ，BrachtelE，PutvatanaR.(2000)HumanskinLangerhanscellsaretargetsofdenguevirusinfection.NatureMed;7:816-820KhinMM,JirakanjanakitN，YoksanS，BhamarapravatiN.(1994)Infection,dissemination,transmission,andbiologicalattributesofdengue-2PDK53candidatevaccinevirusafteroralinfectioninAedesaegypti.AmJTropMedHyg.，51(6):864—869權(quán)利要求1.活的減毒登革2型病毒株，其包含序列SEQIDNo.38，其中至少第736、1619、4723、5062、9191、10063和10507位的核苷酸被突變，條件是下列核苷酸不被突變57、524、2055、2579、4018、5547、6599和8571。2.根據(jù)權(quán)利要求1的登革2型病毒林，其中選自第1638、2520、9222和10361位的位置處的至少一個(gè)核苷酸進(jìn)一步被突變。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的登革2型病毒林，其中SEQIDNo.38包含突變736G>C、1619G>A、1638A>G、2520G>A、4723T>A、5062G>C、9191G>A、9222A>G、10063T〉A(chǔ)和10507A>G。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項(xiàng)的登革2型病毒林，其進(jìn)一步包含在給定密碼子位置中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的置換，所述置換不導(dǎo)致那個(gè)位置處所編碼的氨基酸的改變。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的登革2型病毒林，其包含SEQIDNo.1。6.免疫原性組合物，其在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的活的減毒登革2型病毒林。7.疫苗組合物，其在藥學(xué)上可接受的載體中包含根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的活的減毒登革2型病毒林。8.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其是單價(jià)疫苗組合物。9.根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗組合物，其是多價(jià)登革疫苗組合物。10.根據(jù)權(quán)利要求9的疫苗組合物，其包含含有序列SEQIDNo.39的活的減毒登革2型病毒林。11.根據(jù)權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的疫苗組合物，其包含10-105CCIDs。的根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的活的減毒登革2型病毒林。12.分離的核酸，其包含DNA序列SEQIDNo.l或其等價(jià)RNA序列。13.由SEQIDNo.l或其片段編碼的分離的多蛋白，其至少包含M蛋白第9位的精氨酸，和/或E蛋白第228位的谷氨酸，和/或NS3蛋白第69位的蘇氨酸，和/或NS3蛋白第181位的組氨酸，和/或NS5蛋白第541位的賴氨酸，和/或NS5蛋白第832位的蘇氨酸。14.根據(jù)權(quán)利要求13的多蛋白的片段，其包含M蛋白，和/或E蛋白，和/或NS3蛋白，和/或NS5蛋白。全文摘要本發(fā)明涉及活的減毒VDV2(VERO來源的疫苗登革血清型2)毒株，其通過在PDK和Vero細(xì)胞上傳代而衍生自野生型登革2型毒株16681。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含VDV2毒株的疫苗組合物。文檔編號(hào)A61K39/12GK101238209SQ200680028515公開日2008年8月6日申請日期2006年6月7日優(yōu)先權(quán)日2005年6月17日發(fā)明者B·蓋伊,C·黃,J·朗,R·奇尼,V·巴班申請人:賽諾菲巴斯德有限公司;病害控防中心