專利名稱：腹膜保護(hù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有吡哆胺等吡哆素類作為有效成分的腹膜保護(hù)劑。
技術(shù)背景長期腹膜透析(PD)患者中，會逐漸引發(fā)腹膜功能低下，其特征在于 通過腹膜的葡萄糖依賴性滲透壓梯度的消失亢進(jìn)以及超濾能力喪失[非 專利文獻(xiàn)1和2]。上迷衰竭癥的腹膜功能的特征性變化的最大的表現(xiàn)形 式是血液和透析液之間的小分子溶質(zhì)(尿素、肌酸酐、葡萄糖)交換的功 能性面積(即所謂的"有效腹膜表面積(EPSA)")增大[非專利文獻(xiàn)3]。這樣 的變化是由于血管生成亢進(jìn)以及腹膜血管擴(kuò)張引起的[非專利文獻(xiàn)4]。作為腹膜功能衰竭基礎(chǔ)的分子性機(jī)理尚未了解清楚。長時間的伴隨 有炎癥性變化的腹膜炎再發(fā)對腹膜有損傷[非專利文獻(xiàn)1和5]，但這并 不是超濾衰竭癥的發(fā)病條件[非專利文獻(xiàn)4和6]。通過最近的研究，對 長期PD患者腹膜功能低下推斷并明確了其機(jī)理[非專利文獻(xiàn)7-14]。慢 性尿毒癥本身引起腹膜變化，使EPSA增加[非專利文獻(xiàn)8]。腹膜的生物 化學(xué)變化至少部分是由于尿毒癥性循環(huán)以及PD液兩者導(dǎo)致的反應(yīng)性非 常高的羰基化合物(RCO)的超負(fù)荷("腹膜的羰基應(yīng)激")[非專利文獻(xiàn) 9-M]。血漿RCO在尿毒癥性循環(huán)中蓄積，逐漸向腹腔內(nèi)擴(kuò)散，在后期 引發(fā)糖化終產(chǎn)物(AGE)的修飾[非專利文獻(xiàn)15-21]。 PD中，由于葡萄糖 PD液的加熱滅菌而產(chǎn)生的RCO進(jìn)入到腹膜內(nèi)。它們由于透析處理本身 導(dǎo)致的血清RCO物質(zhì)移動的增加而不斷補(bǔ)充。該腹膜的羰基應(yīng)激結(jié)構(gòu) 性地促進(jìn)了對腹膜蛋白質(zhì)的不可逆性AGE修飾。該RCO進(jìn)一步刺激細(xì) 胞因子和增殖因子(VEGF等)的生成，可見到對腹膜細(xì)胞中一氧化氮合 成酶(NOS)的表達(dá)的調(diào)節(jié)[非專利文獻(xiàn)22-25]。 VEGF與一氧化氮(NO)共 同刺激血管生成，使透過性增加，使腹膜毛細(xì)血管擴(kuò)張[非專利文獻(xiàn) 23-25]。這些綜合性的變化導(dǎo)致EPSA增大，由此使得滲透壓相對于正 常情況更快地消失，最終無法進(jìn)行超濾。FGF-2和TGF-(3的正調(diào)節(jié)也會 刺激腹膜間質(zhì)的纖維化[非專利文獻(xiàn)24和26]。非專利文獻(xiàn)l:Davies SJ 等人Wdney Int 54: 2207-2217, l998非專利文獻(xiàn):2:Krediet RT,等人Perit Dial Bull 6:61-65, 1986非專利文獻(xiàn)3:Rippr B,等人Peritoneal physiology: Transport of solutions. 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胺顯示腹膜保護(hù)作用，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供含有吡哆素類或其鹽作為有效成分的腹膜保護(hù)劑。 優(yōu)選吡嗜素類為吡。多胺。優(yōu)選本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑用于治療和/或預(yù)防腹膜透析患者中腹膜 功能衰竭或超濾衰竭。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供保護(hù)腹膜的方法，該方法包含將有效 量的吡。多素類或其鹽施用于包括人在內(nèi)的哺乳動物的步驟。本發(fā)明的又一方面提供吡哆素類及其鹽在腹膜保護(hù)劑制備中的的 應(yīng)用。實(shí)施發(fā)明的最佳方式以下對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)說明。本發(fā)明中，使用腎部分摘除的尿毒癥大鼠模型，對其使用以葡萄糖 為基礎(chǔ)的常規(guī)透析液進(jìn)行PD,評價吡。多胺(最近開發(fā)的后期糖化終產(chǎn)物 (AGE)和羰基應(yīng)激的強(qiáng)力抑制藥物)對于腹膜的結(jié)構(gòu)性、功能性和生物化 學(xué)性變化的保護(hù)效果。尿毒癥時的腹膜的特征是血液和透析液之間的小分子溶質(zhì)的功能 性交換面積增大、血管生長、AGF生成增加，誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子 (VEGF和FGF-2)的表達(dá)上調(diào)。與PD相關(guān)的腹膜功能性、結(jié)構(gòu)性和生物 化學(xué)性的變化也同樣，與未進(jìn)行PD的慢性尿毒癥患者相比較為重癥。 對進(jìn)行PD的尿毒癥大鼠施用吡。多胺使小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度和血管密 度顯著降低，該結(jié)果顯示吡哆胺對于超濾衰竭的有益的作用。該改善伴隨著誘導(dǎo)AGE蓄積和血管生成的細(xì)胞因子表達(dá)的降低。如上所述，由尿毒癥的環(huán)境以及由PD處理而產(chǎn)生的腹膜羰基應(yīng)激 是生物活性分子誘導(dǎo)導(dǎo)致的血管增生以及小分子溶質(zhì)的功能性交換面 積的增大的一個原因，最終導(dǎo)致超濾衰竭。本發(fā)明中，通過使用吡哆胺進(jìn)行處理，來自血漿的小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn) 運(yùn)速度以及來自透析液的葡萄糖吸收速度顯著降低。另人驚異的是，通 過使用吡。多胺進(jìn)行處理，尿毒癥對膜透過性的影響幾乎完全消失。該腹 膜功能的改善伴隨著由尿毒癥和PD誘導(dǎo)的血管生成的亢進(jìn)、以及誘導(dǎo) 血管生成的細(xì)胞因子表達(dá)的抑制。實(shí)際上，通過使用吡哆胺的介入治療， 組織的戊糖素含量顯著降低。因此，吡。多胺通過改善腹膜的功能性、結(jié) 構(gòu)性和分子生物化學(xué)的變化，可以保護(hù)進(jìn)行PD的尿毒癥患者的腹膜。 即，本發(fā)明涉及含有吡哆素類或其鹽作為有效成分的腹膜保護(hù)劑。 本發(fā)明中作為有效成分使用的吡哆素類有吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺 或它們的鹽等。上述中，特別優(yōu)選使用吡哆胺或其鹽。上述吡哆醇、吡 。多醛和吡，胺是下式所示的化合物。式中，R表示CH20H(為吡哆醇時)、CHO(為吡哆醛時)或CH2NH2(為吡。多胺時)。吡。多素類的鹽有吡哆素類的鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無 機(jī)酸鹽或馬來酸鹽、富馬酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等有機(jī)酸鹽。鹽特別 優(yōu)選磷酸吡噴醇、磷酸吡。多醛或磷酸吡。多胺等。吡哆素類或其鹽可以以水合物或溶劑合物的形式存在。吡哆素類或 其鹽可通過公知的方法合成，或者購買市售商品。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑含有吡哆素類作為有效成分，根椐需要，可以 作為含有用于制劑化的添加物的藥物組合物的形式提供。藥物組合物可通過將作為有效成分的吡哆素類與藥學(xué)上可接受的栽體組合來配合制備。藥學(xué)上可接受的栽體有生理鹽水、林格氏液、磷酸緩沖生理鹽水、 其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的栽體等，但并不限于這些。藥物組合物例如 可包含選自穩(wěn)定劑、抗氧化劑、著色劑、賦形劑、粘合劑、增稠劑、分 散劑、再吸附促進(jìn)劑、緩沖液、表面活性劑、防腐劑、乳化劑、等滲劑 和稀釋劑等的一種或以上的添加劑。上述藥學(xué)上可接受的載體和添加刑優(yōu)選選擇使作為有效成分的吡。多素類的副作用為最小，且對吡哆素類藥 效的抑制為最低。吡。多素類與藥學(xué)上可接受的栽體和/或添加劑組合含有 的藥物組合物的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。例如將本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑以混懸物的形式口服施用時，藥物組合 物中可以配合微晶纖維素、作為混懸劑的海藻酸或海藻酸鈉、作為增稠 劑的曱基纖維素、以及香精等。在制備速釋性片劑時，藥物組合物中可 以配合微晶纖維素、淀粉、硬脂酸鎂以及乳糖或其它賦形劑、粘合劑、 增量劑、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑等。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑以注射溶液或混懸液的形式施用時，可以使用 滅菌的、含有合成單或雙甘油的油、以及含有油酸的脂肪酸等的適當(dāng)?shù)?分散劑或濕潤劑和混懸劑，制備成注射溶液或混懸液。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑以栓劑的形式施用于直腸時，通過將常溫下為 固體但在直腸腔中溶解、釋放藥物的可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇等 的適當(dāng)?shù)馁x形劑與吡。多素類混合制備栓劑。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑的給藥途徑?jīng)]有特別限定，可以是口服給予、 或非口服施用(例如皮下施用、肌內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、靜脈內(nèi)施用等)的 任何形式。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑為固體制劑時，該固體制劑中含有的吡哆素類的含量通常為0.01-30重量％,優(yōu)選0.1-20重量％。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑 為液體制劑時，該液體制刑中含有的吡哆素類的含量通常為0.1-20 mg/ml， 優(yōu)選1-10 mg/ml。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑的施用量和施用次數(shù)可根據(jù)包括施用的目的、 施用形式、劑型、攝取者的年齡、體重或性別等條件等的各種因素適當(dāng) 設(shè)定。通常的施用量是作為有效成分的吡哆素類的施用量為每天約 0.1-100 mg/kg,優(yōu)選約0.5-50 mg/kg的范圍。優(yōu)選每天分1-4次左右施 用上迷施用量的制劑。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑的施用期間沒有限定，可以 是短期(例如一天-數(shù)周)施用，也可以是長時間施用(數(shù)周至一個月或以上)。本發(fā)明的腹膜保護(hù)劑可用于治療和/或預(yù)防腹膜透析患者的腹膜功 能衰竭或超濾衰竭。本說明書中，治療包括使腹膜功能衰竭或超濾衰竭 治愈、改善、或抑制其進(jìn)展、緩和惡化等。本說明書中，預(yù)防包含將腹 膜功能衰竭或超濾衰竭的發(fā)生防患于未然，或者防止其狀態(tài)的惡化。本發(fā)明中，通過將用于治療或預(yù)防腹膜功能衰竭或超濾衰竭的有效 量的吡嗜素類施用于患者(例如腹膜透析患者)，可以保護(hù)腹膜，由此可 以治療和/或預(yù)防腹膜功能衰竭或超濾衰竭。通過以下的實(shí)施例進(jìn)一 步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受實(shí)施例 的限定。實(shí)施例(A)方法 (1)實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物的方案如

圖1所示。將6周齡、體重為200±3 g的 Sprague-Dawley雄性大鼠(CLER Japan, Inc.、東京)隨機(jī)分成才莫擬手術(shù)的 對照大鼠(第l組n=6)、未進(jìn)行腹膜透析的尿毒癥大鼠(第2組n=12) 和進(jìn)行腹膜透析的尿毒癥大鼠(11=24)。再將進(jìn)行腹膜透析的尿毒癥大鼠 進(jìn)一步分成用4.25 。/。Dianeal(注冊商標(biāo))(3.86。/。葡萄糖、2.5 mEq/CAPD 液。Baxter Health care Corp.、 'J / 4州，,> 々)透析的組(第3組: n=12)、和用1 L的4.25% Dianeal (注冊商標(biāo))中含有5 mg吡。多胺 (Pirdorine、 Biostratum Inc.、北卡羅來納州)的液體進(jìn)行腹膜透析的組(第 4組nH2)。如已報道的[Lameire N，等人、Kidney Int 54:2194-2206, 1998;和 KleinknechtC，等人、Kidney Int 47:S51-S54, 1995]，尿毒癥模型通過摘除 5/6腎制備。使大鼠自由攝取含有1.06%鉤、0.9%磷酸鹽、21%蛋白質(zhì)的 實(shí)驗(yàn)大鼠標(biāo)準(zhǔn)鉺料(CE2: CLER Japan，Inc、東京)和自來水直至被殺死的 前夜。第13周，在異氟烷麻醉下將連接有13.5 cm導(dǎo)管的Rat-o-ports (Access Technologies, Norefolk Medical、 Illinois skokie)植入所有的大鼠 中。Rat-o-ports植入頸部皮下， 一周后用30 ml透析液開始每天兩次的 腹膜透析，持續(xù)6周[Zweers MM，等人、Nephrol Dial Transplant 16:651-654, 2001]。腹膜透析開始前，在第2組、第3組、第4組中分別有4只、5只、2只大鼠死亡。最終得到了模擬手術(shù)對照組(第1組 n=6)、未進(jìn)行腹膜透析的尿毒癥組(第2組n-8)、進(jìn)行腹膜透析的尿毒 癥組(第3組n=7)、使用5 mg吡。多胺進(jìn)行腹膜透析的尿毒癥組(第4組 n,。(2) 組織采集進(jìn)4亍6周PD,然后由接口處注入4.25% Dianeal (注冊商標(biāo))，實(shí)施 腹膜平衡試驗(yàn)(60分鐘)。然后通過麻醉使大鼠安樂死。從在第21周采 集的肝素血中分離血漿。摘出腸系膜，通過光學(xué)顯微鏡檢查或免疫組織 化學(xué)檢查進(jìn)行評價。(3) 血漿和腹膜透析液的分析血漿和腹膜透析液中葡萄糖、肌酸酐、尿素、總膽固醇以及三甘油 的濃度通過自動分析儀(Hitachi型號730-60、日立電子林式會社)測定。(4) 通過HPLC進(jìn)行的戊糖素的測定 按照已報道的方法[MiyataT,等人、J. Am. Soc. Nephrol 7: 1198-1206，1996],使用HPLC對大鼠腹膜中戊糖素含量進(jìn)行評價。用1.5 ml氯仿/ 曱醇(2:1)、然后用l.Oml甲醇將腹膜組織(100mg)進(jìn)行勻漿，除去脂質(zhì)， 真空下干燥，在ll(TC下用500 ml6NHCl進(jìn)行16小時的水解。將酸解 產(chǎn)物在真空中干燥，用400 iiil 10 mM HC1重新構(gòu)建，用孔徑0.5pm的 濾器過濾，用PBS稀釋。將稀釋的樣品注入到HPLC裝置中，通過C18 反相柱(5 ^un、 4.6x250 mm: Waters、東京)進(jìn)行分離。將洗脫液用熒光 檢測器(RF-10A:島津制作所、東京)和激發(fā)/發(fā)光波長335/385 nm進(jìn)行 監(jiān)控。使用合成戊糖素(《> 卜i/'" )[Miyata T，等人、J. Am. Soc. Nephrol 7: U98-1206, 1996]制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(5) 免疫組織化學(xué)分析使用用甲醛固定、用石蠟包埋的切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。由石 蠟塊制備4 pm的切片，脫石蠟，浸泡在呈梯度濃度的乙醇中進(jìn)行脫水。 使用抗PGF-卩1抗體(l:40、 Santa CruzBiotechnology、加利福尼亞州Santa Cruz)、抗血管性血友病因子抗體(1:400、 Daco、 f》7 —々々"kX卜，':/ -)、抗VEGF抗體(1:100、 Santa Cruz Biotechnology)、抗FGF-2抗體(1:400、 Santa Cruz Biotechnology),抗AGE抗體(l :200、株式會社卜5 > ^ in 二 々、熊本)作為第一抗體。將切片用二甲苯脫石蠟，用乙醇脫水。將切片 在室溫下、在含有0.3%^02的甲醇中浸泡10分鐘，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。通過加熱進(jìn)行抗原性活化。用磷酸緩沖生理鹽水(pH 7.4)清 洗，然后將切片(抗TGF-卩1、血管性血友病因子、FGF2、 VEGF抗體) 在O.Ol M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中、在微波爐(500 W)中、在IOO'C下加 熱10分鐘。加入第一抗體，在室溫下溫育1小時，然后沖洗切片，與 第二抗體(二于k一東京)一起溫育45分鐘，浸泡在0.2% 3，3-二氨基聯(lián)苯 胺四鹽酸鹽(DAB)中，然后用蘇木精進(jìn)行對比染色。用未免疫兔或山羊 IgG進(jìn)行免疫標(biāo)記的特異性研究。
(6) 血管數(shù)量的評價
血管數(shù)量是在對血管性血友病因子進(jìn)行染色的切片中，通過使用 WinROOF軟件(三谷商事、東京)的圖像分析進(jìn)行評價。在每個皮質(zhì)區(qū)內(nèi) 隨機(jī)選擇20個視野，使用40倍的物鏡估算毛細(xì)血管數(shù)的平均值。結(jié)果 以是正常對照動物的多少倍來表示。
(7) VEGF和FGF-2表達(dá)的檢測
通過半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RG-TCR)對VEGF或FGF2 (腸系 膜)的mRNA表達(dá)進(jìn)行定量。使用IS0GEN(二"7fOi;—:/、東京)從腸系 膜中提取總RNA。使用隨機(jī)引物(LIFE TECHNOLOGIES),用200單位 的MMLV反轉(zhuǎn)錄酶(BioLabs. Inc.)反轉(zhuǎn)錄2貼RNA。 PCR擴(kuò)增按照已報 道的方法[Inagi R,等人、FEBS Letters 463: 260-264, 1999]進(jìn)行。寡核苷酸 引物的序列如下。VEGF的引物
5，—ACT GGA CCC TGG CTT TAC 丁GC-3' (SEQ ID NO. 1) 5'-TTG GTG AGG TTT GAT CCG CAT G-3， (SEQ ID NO. 2) 擴(kuò)增片段的全長為310bp FGF2的引物
5，-CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT-3， (SEQ ID NO. 3) 5,-TCA AGC TCT TAG CAG ACA TTG-3' (SEQ ID NO. 4) 擴(kuò)增片段的全長為276bp 大鼠P-肌動蛋白的引物
5，-GTGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACT-3' (SEQ ID NO. 5) 5'-ATG GCA TGA GGG AGC GCG TAA CCC TCA TAG-3' (SEQ ID NO. 6) 擴(kuò)增片段為402bp
使用(3-肌動蛋白作為可以使不同試樣中的RNA量進(jìn)行比較的內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)。試樣是使用DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus、〕才、于力'乂卜州/ —々才一々)，為VEGF或FGF2時以94°C1分鐘、58°C1分鐘，為卩-肌動 蛋白時以60°C1分鐘、72°C1分鐘的適當(dāng)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中， 將RNA的量進(jìn)行各種改變，將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增進(jìn)行18、 21、 25、 28、 31、 34、 36個循環(huán)。由該實(shí)驗(yàn)中可知，在VEGF或FGF2的mRNA擴(kuò)增 中以35個循環(huán)、在(3-肌動蛋白的mRNA的擴(kuò)增中以16或21個循環(huán)擴(kuò) 增，則PCR產(chǎn)物信號差異與所使用的RNA保持定量關(guān)系。用2%瓊脂 糖電泳進(jìn)行分離，用溴化乙錠進(jìn)行染色，將所得PCR產(chǎn)物通過使用定量 程序(NIH image軟件)的信號強(qiáng)度測定進(jìn)行定量。mRNA是測定三個檢 樣，對每種實(shí)驗(yàn)將結(jié)果進(jìn)行平均。對各實(shí)驗(yàn)條件均進(jìn)行共3-4次的獨(dú)立 實(shí)驗(yàn)，將結(jié)果平均，以平均土SD表示。 (8)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
結(jié)果均以平均土SD表示。各組間差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性是通過 Wilcoxon的非參數(shù)檢驗(yàn)(平均值為2個時)或者克魯斯凱-沃利斯(々，又 力a々才m;0檢驗(yàn)(平均值為3個或以上時)進(jìn)行評價。本實(shí)施例的統(tǒng)計(jì) 學(xué)分析中，顯著差異的檢測是利用SPSS軟件(SPSS Inc、伊利諾伊州芝 加哥)。低于0.05的P值視為顯著。(B)結(jié)果 (1)功能分析腎部分摘除的尿毒癥大鼠生物化學(xué)數(shù)據(jù)和體重如表1所示。尿毒癥 大鼠(第2-4組)中，與非尿毒癥大鼠(第1組)比較，血漿肌酸酐、尿素、 總膽固醇量顯著增加，體重減輕。對尿毒癥組的有否進(jìn)行PD和/或是吡 。多胺處理之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行分析，這些值中均未見顯著差異。葡萄糖和 三甘油的血漿濃度在所有的組之間均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表l:生物化學(xué)數(shù)據(jù)和體重(21周)組 血漿肌酸酐血漿尿素血漿葡萄糖甘油三酯 總膽固醇 體重 _(mg/dl) (咖/dl) (咖/dl) (鵬/dl) (郵/dl) (g)1 (n=6) 0.3土0.0 16.0±2.4185. 5±64.9 141. 7±13. 5 71.0±13.5 530±372 (n-8) 1. 3±0. 6* 68. 0±35. 7 137. 5±31. 9 146, 6士46. 9 117. 3±25. 6* 416±56*3 (n=7) 1，6±0.3* 62.8±13.0* 121.1±36.5 157.1士58.4 143.1±33.9* 435±10*4 (n-lO)l. 3±0.6* 70. 1±23.4* 155. 2±20. 5 122. 5土50. 2 12S.4±31.8* 419±29= *:相對于第一組pO.Ol在腎部分摘除后13周，對已評價的腹膜(PM)的功能參數(shù)進(jìn)行評價， 尿毒癥大鼠(第2組)的來自血漿的小分子溶質(zhì)(即肌酸酐、尿素)的轉(zhuǎn)運(yùn)速 度(圖2A和B)以及來自透析液的葡萄糖的吸收速度(圖2C)比對照大鼠 (第1組)顯著高。肌酸酐(圖3A的黑圓圏)或葡萄糖(圖3B)的透過性增加 與腎衰竭的程度之間可見顯著相關(guān)。這些數(shù)椐與Kombet等人最近的慢 性尿毒癥本身使腹膜變化并且使EPSA增大的觀察結(jié)果一致[Korbet SM， 等人、Am J Kidney Dis 22:588-591， 1993]。在PD中，腹膜的透過性逐漸變化。使用通常的以葡萄糖為基礎(chǔ)的 透析液進(jìn)行6周的PD,則來自血漿的小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度(圖2A和B 的第3組)以及來自透析液的葡萄糖的吸收速度(圖2C)顯箸增加。尿毒癥和PD處理導(dǎo)致的腹膜功能的變化至少部分性地成為來自尿 毒癥性循環(huán)和PD液兩者的腹膜羰基應(yīng)激的原因。因此，對于尿毒癥使 用吡。多胺(作為AGE和羰基應(yīng)激的強(qiáng)力抑制藥物在臨床中應(yīng)用)在腹腔 內(nèi)進(jìn)行PD。通過吡。多胺(5 mg/ml)進(jìn)行6周的處理，來自血漿的小分子溶質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度(圖2A和B的第4組)以及來自透析液的葡萄糖的吸收 速度(圖2C)顯著降低。如圖3A和B (白色三角)所示，吡哆胺使小分子 溶質(zhì)(肌酸酐和葡萄糖)的透過性增加和腎衰竭程度之間的回歸直線的斜 率急劇減小。吡噴胺的處理使尿毒癥對膜透過性的影響幾乎完全消失。
(2) 組織學(xué)分析
已知EPSA的增大與血管生成亢進(jìn)密切相關(guān)。因此，測定血管性血 友病因子染色后腹膜組織中的血管數(shù)量(圖4A)。尿毒癥本身使血管數(shù)量 增力al.87倍，PD處理使該值又增大了 5.83倍。該血管生成的亢進(jìn)由于 吡。多胺的處理而顯著改善至2.68倍。肌酸酐(圖4B)或葡萄糖(圖4C)的 透過性增加與血管數(shù)量之間可見顯著相關(guān)性。該結(jié)果意味著腹膜功能低 下時EPSA的增大與尿毒癥和PD處理相關(guān)。
(3) 分子生物學(xué)分析
對與腹膜的功能和結(jié)構(gòu)變化相關(guān)的分子情況進(jìn)行研究。通過腸系膜 組織的HPLC測定對AGE和羰基應(yīng)激的周知的代用標(biāo)志戊糖素的含量 進(jìn)行測定。戊糖素含量根椐尿毒癥而增加(圖5A的第2組)，組織中戊糖 素含量與腎衰竭的程度之間存在相關(guān)關(guān)系(圖5B的黑色圓圏)。PD處理 中，促進(jìn)了戊糖素的形成(圖5A的第3組)，PD使戊糖素含量與腎衰竭 之間的回歸直線的斜率增大(圖5B的白色方框)。與此相對，吡。多胺的介 入使組織中戊糖素含量顯著降低(圖5A的第4組)，回歸直線的斜率減小 (圖5B的白色三角)。組織中的戊糖素含量與肌酸酐透過性(圖6A)和血 管數(shù)量(圖6B)的增加之間可見顯著相關(guān)。
接著，為了明確誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子的作用，通過半定量PCR 對腹膜組織中的VEGF和FGF-2的基因表達(dá)進(jìn)行分析。尿毒癥大鼠中的 VEGF (圖7B)和FGF-2 (圖7C)的表達(dá)比對照大鼠高，由于PD處理而顯 著增加。而吡。多胺使VEGF和FGF-2兩者的表達(dá)降低至與未進(jìn)行PD的 尿毒癥大鼠同樣的水平。
腹膜的分子生物學(xué)變化可進(jìn) 一 步通過對腸系膜組織切片中的 VEGF、 FGF-2、 vWF、 AGE、 TGF-卩1的免疫組織化學(xué)進(jìn)行了解(圖8)。 即，在對照大鼠的腸系膜血管內(nèi)皮中，無法感觀檢測出VEGF、 FGF-2、 vWF、 AGE、 TGF-pi的染色，這些生物學(xué)標(biāo)志在尿毒癥大鼠腹膜中微量 存在，而在進(jìn)行了 PD處理的尿毒癥大鼠中顯著存在。另一方面，進(jìn)行 了吡。多胺處理的大鼠的腸系膜毛細(xì)血管中，只檢測出了微量的染色。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明中作為有效成分使用的吡哆胺等吡哆素類是副作用小的安
全物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，可以提供可以有效抑制長期腹膜透析(PD)患者等 中的腹膜功能低下的安全的腹膜保護(hù)劑。
附圖簡述
圖1是表示動物實(shí)驗(yàn)的方案說明。將6周齡的大鼠分成尿毒癥模擬 手術(shù)組。腎部分摘除5周后進(jìn)行配置腹腔內(nèi)導(dǎo)管和皮下接口的外科埋入。 PD持續(xù)進(jìn)行至出生后第21周。
圖2表示通過PET進(jìn)行的腹膜功能分析。在對照大鼠(第l組)、不 進(jìn)行PD的尿毒癥大鼠(第2組)、無吡。多胺但進(jìn)行PD的尿毒癥大鼠(第3 組)、有5 mg/1吡。多胺并進(jìn)行PD的尿毒癥大鼠(第4組)中，對用20 ml 3.85%葡萄糖透析液進(jìn)行60分鐘交換中的Cr(A)和尿素(B)的透析液/血 漿比(D/P)、以及來自透析液的葡萄糖吸收(D/DO)(C)進(jìn)行研究。a:相對 于第l組pO.Ol。 b:相對于第2組p<0.01。 c:相對于第3組p<0.01 。 d:相對于第4組p<0.01。 e:相對于第3組p<0.05。 f:相對于第4組 p<0.05。
圖3表示肌酸酐(A)或葡萄糖(B)的透過性的增加與腎衰竭程度的相 關(guān)性。黑色圓圏第1組和第2組(A、y-0.20x+0.26、n-14、r-0.87、pO.01。 B、 y=0.0538x+0.49、 n=14、 r=0.63、 p<0.05)，白色方框第3組(A、 y=0.22x+0.39、 n=7、 r=0.76、 p>0.01。 B、 y=0.1350x+0.45、 n=7、 r=0.93、 p<0.05)，白色三角第4組(A、 y=0.22x+0.63、 n=10、 r=0.24、 p>0.1。 B、 y=0.0015x+0.29、 n=10、 r=0.025、 p>0.1)，由于慢性尿毒癥使小分子 溶質(zhì)的透過性增大。該增大由于使用通常的以葡萄糖為基礎(chǔ)的透析液進(jìn) 行PD而進(jìn)一步增大。與此相對，吡p多胺處理糾正了尿毒癥導(dǎo)致的膜透 過性的降低。
圖4是表示對血管性血友病因子的免疫組織化學(xué)分析進(jìn)行的腹膜結(jié) 構(gòu)分析。A:大鼠腸系膜的血管數(shù)量。a:相對于第l組pO.Ol。 b:相 對于第2組p〈0.01。 c:相對于第3組p<0.01。 d:相對于第4組p<0.01 。 肌酸酐(B、 y=0.052x+0.434、 n=31 、 r=0.65 、 p〈0.001)或葡萄糖(C、 y=-0.029x+0.43、 n=31、 r=-0.64、 pO.001)的透過性增大與血管數(shù)量之間存在顯著相關(guān)。慢性尿毒癥導(dǎo)致血管數(shù)增加，該增加由于使用通常的以葡萄糖為基礎(chǔ)的透析液進(jìn)行PD而進(jìn)一步增大，但通過吡哆胺的處理減少。圖5表示通過HPLC測定得到的腹膜的AGE含量。A:大鼠腸系膜 中的戊糖素含量。a:相對于第1組pO.Ol。 b:相對于第4組p<0.05。 c:相對于第3組p0.05。 B:腸系膜的戊糖素含量與腎功能衰竭導(dǎo)致的 肌酸酐透過性的程度之間存在顯著的相關(guān)。黑色圓圏第1組和第2組 (y=0 024x-0 005 、 n=14 、 r=0.91 、 pO.OOl) 白色方框第3組 (y=0.80x+0.091 、 n-7 、 r=0.82 、 pO.Ol)。白色三角第4組 (y=0.006x+0.0135、 n=10、 r=0.35、 p〉0.1)。慢性尿毒癥導(dǎo)致腸系膜的戊 糖素含量增加，由于使用通常的以葡萄糖為基礎(chǔ)的透析液進(jìn)行PD而進(jìn) 一步增加，但通過給予吡噴胺而降低。圖6表示腸系膜戊糖素含量與肌酸酐透過性或血管數(shù)量之間的相 關(guān)。腸系膜間戊多數(shù)素含量與肌酸酐透過性(A、 y=0.066x-0.018、 n=31、 r=0.65、 pO.OOl)或血管數(shù)量(B、 y=0.004x-0.001 、 n=31、 r=0.46、 p<0.01) 相關(guān)。圖7表示誘導(dǎo)血管生成的細(xì)胞因子表達(dá)的檢測。通過半定量性反轉(zhuǎn) 錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對腸系膜的VEGF或FGF2的mRNA表達(dá)進(jìn)行 分析(A)。每次實(shí)驗(yàn)均計(jì)算VEGF或FGF2的mRNA對于|3-肌動蛋白的 比的平均值。對于VEGF(B)或FGF2(C)表示兩次實(shí)驗(yàn)的平均值。a:相 對于第1組p<0.05。 b:相對于第2組p<0.05。 c:相對于第3組p<0.05。 d:相對于第4組p<0.05。 e:相對于第1組p<0.01。 f:相對于第2組 p<0.01。 g:相對于第3組p<0.01。 h:相對于第4組p<0.01 。圖8表示腸系膜的VEGF、 FGF2、 vWF、 AGE、 TGF卩1的免疫組織 化學(xué)檢測。對照大鼠的腹膜中，無法視覺上檢測出VEGF(A)、 FGF2 (B)、 vWF(C)、 AGE(D)、 TGF-卩1 (D)的染色，尿毒癥大鼠中微量存在這些生 物學(xué)標(biāo)志，而進(jìn)行了 PD處理的尿毒癥大鼠中則顯著。與此相對，在給 予了吡。多胺的大鼠腸系膜的毛細(xì)血管中，僅檢測出微量染色。倍率x400。
權(quán)利要求
1. 腹膜保護(hù)劑，其含有吡哆素類或其鹽作為有效成分。
2. 權(quán)利要求l的腹膜保護(hù)劑，其中，吡哆素類是吡哆胺。
3. 權(quán)利要求1或2的腹膜保護(hù)劑，該腹膜保護(hù)劑應(yīng)用于治療和/或 預(yù)防腹膜透析患者中的腹膜功能衰竭或超濾衰竭。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供可有效抑制長期腹膜透析(PD)患者等中的腹膜功能低下的新型腹膜保護(hù)劑。本發(fā)明可提供含有吡哆素類或其鹽作為有效成分的腹膜保護(hù)劑。
文檔編號A61K31/44GK101227904SQ200680027050
公開日2008年7月23日 申請日期2006年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者宮田敏男, 角田隆俊 申請人:學(xué)校法人東海大學(xué)