專利名稱：：組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及流感疫苗制劑和用于免疫對抗各種疾病的接種方案。具體地說，本發(fā)明涉及含7K包油乳液佐劑和3D-MPL的疫苗制劑、其在藥物中的用途，尤其是其在增強對各種抗原的免疫應答方面的用途，并涉及制備方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代謝油和乳化劑。
背景技術：
：始終需要具有改善的免疫原性的新組合物或疫苗。作為一種策略，佐劑已用于尋求和改善針對任意給定抗原產生的免疫應答。作為實例，已開發(fā)了具有佐劑的流感疫苗和抗人乳頭瘤病毒(HPV)的疫苗。流感病毒是世界上最普遍存在的病毒之一，既可感染人類，也可感染家畜。流感產生重大的經濟負擔、發(fā)病率乃至死亡率。流感病毒是RNA包膜病毒，顆粒的直徑大小約為125nm。流感病毒的基本組成為內部為與核蛋白結合的核糖核酸(RNA)核衣殼或核心，外部包繞著脂質雙層結構和外層糖蛋白的病毒被膜。病毒被膜內層主要由基質蛋白組成，而外層主要是宿主來源的脂類物質。流感病毒包含兩種表面抗原糖蛋白神經氨酸酶(NA)和血細胞凝集素(HA),它們以10-12nm長的刺突顯露在顆粒表面上。就是這些表面蛋白、尤其是血細胞凝集素，決定了流感亞型的抗原特異性。這些表面抗原漸進地、有時快速地經歷某些導致流感病毒抗原性變異的改變。這些抗原性改變叫做'漂移，和'轉換，，是不可預見的，由免疫學觀點看可能具有顯著的影響，因為它們最終導致出現(xiàn)新流感株，能使病毒逃逸免疫系統(tǒng)，幾乎每年都引起眾所周知的流行病。每個季節(jié)加入到流感疫苗中的流感病毒抹由WHO協(xié)同國家衛(wèi)生管理局以及疫苗生產商共同確定。HA是確定不同流感株的血清學特異性的最重要抗原。此75-80kD的蛋白包含眾多的抗原決定簇，其中幾個位于在不同毒抹中經歷序列改變的區(qū)域中(毒抹特異性決定簇)，其余的位于許多HA分子共有的區(qū)域中(共同決定簇)。流感病毒幾乎每年冬天都？1起大流行，曱(A)型或乙(B)型病毒的感染率在6周的時間段內高達40%。流感感染產生各種病癥，由亞臨床感染至輕微的上呼吸道感染到嚴重的病毒性肺炎。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的發(fā)病率增加，證據是住院率或死亡率增加。疾病的嚴重性主要由宿主的年齡、其免疫狀況和感染部位決定。65歲和以上的老年人尤其易受攻擊，占發(fā)達國家所有流感相關死亡的80-90%?；加谢A性慢性疾病的個體也非常有可能體驗到這種并發(fā)癥。幼兒也可能患嚴重疾病。因此，這些群體尤其需要受保護。除了這些'風險，群體以外，衛(wèi)生當局還推薦對與老年人接觸的健康成人接種。接種對控制每年的流感大流行起關鍵作用。目前可用的流感疫苗是失活流感疫苗或減毒活流感疫苗。失活流感疫苗由3種可能形式的抗原制備物組成失活全病毒、其中純化的病毒顆粒被溶解脂質包膜的去污劑或其它試劑破壞的亞病毒體(所謂的"裂解疫苗")或純化的HA或NA(亞單位疫苗)。這些失活疫苗肌內(i.m.)或鼻內(i.n.)給予。所有種類的流感疫苗通常都是三價疫苗。一般來說，它們含有的抗原得自兩種曱型流感病毒對朱和一種乙型流感病毒林。據單輻射免疫擴散(SRD)(丄M.Wood等Animprovedsingleradialimmunodifftisiontechniquefortheassayofinfluenzahaemaggiutininantigen:adaptationforpotencydeterminationofinactivatedwholevirusandsubunitvaccines.J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等，InternationalcollaborativestudyofsingleradialdiffusionandImmunoelectrophoresistechniquesfortheassayofhaemaggiutininantigenofinfluenzavirus.J.Biol.Stand.9(1981)317-330)的檢測，在大多數(shù)情況下，標準0.5ml注射劑量含有每種毒株的15嗎血細胞凝集素抗原組分。目前可用的流感疫苗被認為在所有年齡組都是安全的(DeDonato等，1999,Vaccine,17,3094-3101)。但是，很少有證據表明當前的流感疫苗在2歲以下的小孩中有作用。而且，預防典型已確認流感疾病的疫苗效力的報告比率對老年人為23-72%，這顯著低于對較年輕成年人所報告的60-90%的有效率(Govaert,1994,J.Am.Med.Assoc,21,166-1665;Gross,1995,AnnIntern.Med.123,523-527)。業(yè)已表明，流感疫苗的有效性與針對病毒林的血凝反應抑制(HI)抗體的血清滴度相關，幾個研究已發(fā)現(xiàn)較年長的成年人在流感免疫后表現(xiàn)出的HI滴度j氐于4交年豐S成年人(Murasko，2002,Experimentalgerontology,37,427-439)。因此，仍需要具有改良的免疫原性的新疫苗。疫苗抗原和有效佐劑的制劑是一種有可能增強對亞病毒體抗原的免疫應答的方法。水包油乳液形式的用佐劑MF59佐劑化的亞單位流感疫苗已商品化，已表現(xiàn)出其誘導高于無佐劑亞單位疫苗所獲抗體滴度的抗體滴度的能力(DeDonato等，1999,Vaccine,17,3094-3101)。但是，在后來的出版物中，相同疫苗沒有表現(xiàn)出其比無佐劑裂解疫苗改善的模式(Puig-Barbera等，2004,Vaccine23,283-289)。乳頭瘤病毒是小DNA腫瘤病毒，是高度物種特異性的。迄今為止已描述了100多種獨立的人乳頭瘤病毒(HPV)基因型。一般來說，HPV對皮膚(例如HPV-l和HPV-2)或粘膜表面(例如HPV-6和HPV-ll)是特異性的，通常引起持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的良性腫瘤(疣)。這種良性腫瘤可困擾所涉及的個體，但趨向于無生命威脅，有一些例外。一些HPV還與癌癥相關。HPV和人類癌癥之間最強的正相關是HPV-16和HPV-18與宮頸癌之間存在的正相關。宮頸癌是發(fā)展中國家最常見的惡性腫瘤，在全世界每年發(fā)生約500,000例新病例?，F(xiàn)在，使用疫苗積極對抗原發(fā)性HPV-16感染乃至已確診的含HPV-16的癌癥在技術上是可行的。關于抗HPV-16的預防性和治療性接種的前景的綜述，參見CasonJ.,Clin.Imm畫ther.1994;1(4)293-306和HageneseeM.E.,InfectionsinMedicine199714(7)555-556,559-564。盡管確實存在微小差異，但所描述的所有HPV基因組都具有至少8個早期基因El至E8和2個晚期基因LI和L2。另外，上游調節(jié)區(qū)具有調節(jié)序列，該調節(jié)序列似乎控制HPV基因組的大部分轉錄事件?；贖PVLI的疫苗公開于WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184和WO94/05792。此疫苗可包含為單體、殼?；虿《緲宇w粒的L1抗原。制備VLP的方法在本領域眾所周知，包括VLP分解-再組裝法，以提供增強的均一性，例如WO9913056和US6245568所述。這種顆粒可另外包含L2蛋白。基于L2的疫苗描述于例如WO93/00436。其它HPV疫苗方法基于早期蛋白，例如E7或諸如L2-E7的融合蛋白。仍需要改良的流感疫苗，例如流感疫苗或HPV疫苗。發(fā)明陳述在本發(fā)明的第一個方面，才是供一種免疫原性組合物，其包含(a)抗原，(b)水包油乳液佐劑；和(c)3DMPL,其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。用途(a)抗原，和(b)水包油乳液佐劑；和Cc)3DMPL其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述免疫原性組合物用于預防感染和/或疾病。本發(fā)明還涉及一種接種方法，該方法包括傳遞抗原、如本文定義的水包油乳液佐劑和3DMPL。本發(fā)明還涉及一種制備免疫原性組合物的方法，該方法包括組合如本文定義的水包油乳液和:阮原以及3D-MPL。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)勢在以下的其優(yōu)選實施方案的詳述中進一步描述。圖1:依據PCS檢測的SB62水包油乳液的油滴粒度分布。圖1A顯示了用MalvernZetasizer3000HS檢測的SB62批號1023的粒度測量結果A-稀釋度1/10000(Rec22至Rec2勺(用Contin和適合的光學模型1.5/0.01分析)；B=稀釋度1/20000(Rec28至Rec30)(用Contin和適合的光學模型1.5/0.01分析)。圖1B顯示了依據強度的記錄22(上部)和記錄23(下部)的示意圖。圖2:制備MPL原液的示意圖。圖3:制備AS03+MPL佐劑的示意圖。圖4:ExploFlu-OOl臨床實驗。針對裂解流感抗原的CD4T細胞應答(Q1=第一四分位數(shù)，Q3=笫三四分位數(shù))。圖5:ExploFlu-OOl臨床實驗。針對裂解流感抗原的CD8T細胞應答(Q1=第一四分位數(shù)，Q3=第三四分位數(shù))。圖6:ExploFlu-OOl臨床實驗。在用Fluarix+AS03接種后針對裂解流感病毒抗原的交叉反應性CD4T-細胞應答。圖7:ExploFlu-001臨床實驗。接種后的B細胞記憶應答。圖8:ExploFlu-002臨床實驗。再接種后抗裂解流感抗原的CD4T細胞應答。圖9:ExploFlu-002臨床實驗。再接種后的抗HI滴度。圖10:雪貂研究I。溫度監(jiān)測(初免和攻擊)。圖10A是初免，圖10B是攻擊。圖11:雪貂研究I。病毒脫落。圖12:雪貂研究II。溫度監(jiān)測(初免和攻擊)。圖12A是初免，圖12B是攻擊。圖13:雪貂研究II。病毒脫落。圖14:雪貂研究II。對H3N2A7巴拿馬(疫苗抹)(圖14A)和H3N2A/懷俄明(攻擊抹)(圖14B)的HI滴度。圖15:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下C57BI/6初免小鼠中CD4T細胞的頻率。圖16:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下C57BI/6初免小鼠中CD8T細胞的頻率。圖17:小鼠研究。使用全失活病毒作為再刺激抗原(免疫后7天)的情況下用異源毒抹初免的C57BI/6小鼠中CD4T細胞(上部)和CD8T細胞(下部)的頻率。圖18:人臨床實驗。老年人接種Fluarix、Fluarix+AS03、Fluarix+AS03+MPL后的B細胞記憶應答(接種前和接種后之間的差異)。圖19:雪貂研究m。攻擊前和攻擊后的溫度監(jiān)測。圖20:雪貂研究m。攻擊前和攻擊后的病毒脫落。圖21:雪貂研究III。針對H3N2A/懷俄明(疫苗抹)的HI滴度。圖22:雪貂研究III。針對H3N2A/巴拿馬(攻擊抹)的HI滴度。圖23:人臨床實驗。在接種后21天、90天和180天時的HI滴度(GMT)(持續(xù)性)。圖24:人臨床實驗。在接種后21天、90天和180天時的CD4應答一alldouble(產生至少兩種細胞因子的細胞)檢驗一混合抗原(持續(xù)性)。圖25:人臨床實驗。與Fluarix相比在使用AS03+MPL的再接種臨床實驗中的ffl滴度。圖26:人臨床實驗。在接種后0和21天時CD4應答的CMI—alldouble檢驗-混合抗原。圖27:采用兩個濃度的AS03+MPL的人臨床實驗。在0和21天的HI滴度。圖28:采用兩個濃度的AS03+MPL的人臨床實驗。反應原性。發(fā)明詳述就亞單位或裂解流感抗原或用VLP形式的各種癌癥相關性HPV抗原，并組合水包油乳液和3D-MPL，來表明本發(fā)明的原理。在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明人已經發(fā)現(xiàn)，相比于用無佐劑亞單位或裂解病毒或其裂解病毒抗原性制備物獲得的應答，含亞單位或裂解流感病毒或其抗原性制備物連同水包油乳液佐劑和3D-MPL的流感制劑能夠在人中改善抗所述抗原或抗原性組合物的CD4T-細胞免疫應答和/或B細胞記憶應答。所述組合物因此提供改進的流感疫苗。要求保護的制劑可用于誘導抗流感的CD4-T細胞應答，該應答能夠檢測由MHCII類分子提呈的流感表位。本申請人現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，該制劑有效靶向細胞介導的免疫系統(tǒng)，以便增加對同源和漂移的流感抹的反應性(在接種和感染時)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物連同如本文定義的水包油乳液佐劑和3D-MPL的流感制劑能夠誘導至少一種趨勢相比于無佐劑組合物，第一次接種人受試者后的B細胞記憶應答4吏高。本發(fā)明的佐劑化流感組合物具有幾個優(yōu)勢1)改善的免疫原性它們允許將老年人(50歲以上，通常65歲以上)中的弱免疫應答恢復至在年輕人中所見的水平(抗體和/或T細胞應答)；2)改善的交叉保護模式增加抗變異(漂移)流感抹的交叉保護作用；3)它們還允許使用減少的抗原劑量獲得相似的應答，因此確保了緊急情況下(例如大流行)增加的效力。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，如本文定義的水包油乳液佐劑+3DMPL對于抗體產生和B細胞記憶而言表現(xiàn)出的免疫原性結果等于(或者有時高于)用沒有水包油乳化組分的佐劑產生的免疫原性結果。這些發(fā)現(xiàn)可應用于其它形式的相同抗原和其它抗原。抗原可用于本發(fā)明的抗原包括鏈球菌抗原例如來自A組鏈球菌或B組鏈球菌，但最優(yōu)選來自月市炎鏈3求菌(5^e/^ococcw51/wei/mom'ae)。最優(yōu)選4吏用蛋白禾口/或4唐類#元原。肺炎鏈球菌糖類抗原和/或至少一種肺炎鏈球菌蛋白抗原最優(yōu)選選自肺炎球菌溶血素、PspA或其跨膜缺失變體、PspC或其跨膜缺失變體、PsaA或其跨膜缺失變體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、CbpA或其跨膜缺失變體、PhtA、PhtD、PhtB、Ph伍、SpsA、LytB、LytC、LytA、Spl25、SplOl、Spl28、Spl30和Sp133,或其免疫功能等同物。還優(yōu)選至少1(2、3、4、5、6、7、8、9或IO)種肺炎鏈球菌糖類抗原和/或優(yōu)選選自以上列出的蛋白抗原的肺炎鏈球菌蛋白抗原。某些組合物描述于WO00/56359和WO02/22167和WO02/22168(通過引用結合到本文中)。種血清型包括6B、14、19F和23F。更優(yōu)選地，所述組合物中包含至少7種血清型，例如來源于血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的血清型。再更優(yōu)選地，所述組合物中包含至少11種血清型，例如在一個實施方案中，所述組合物包含來源于血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的莢膜糖類(優(yōu)選綴合至載體蛋白)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，包括至少13種多類糖抗原(優(yōu)選綴合至載體蛋白)，但本發(fā)明還包括另外的糖類抗原，例如23價體(如血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、IOA、IIA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)。對于老年人接種(例如用于預防肺炎)而言，有利地在上述11價抗原組合物中包含血清型8和12F(最優(yōu)選還包括血清型l5和22),以形成15價組合物，而對于嬰兒或幼兒而言(這時主要考慮中耳炎)，有利地包含血清型6A和19A，以便形成13價組合物。盡管上述糖類有利地為其全長天然多糖形式，但應該理解，如果在偶聯(lián)至蛋白載體時有需要，那么也可以使用大小降低但仍然具備免疫原性的多糖(參見例如EP497524和497525)。為了預防/緩解老年(+55歲)人群的肺炎和嬰兒(最大至18個月)以及幼兒(通常是18個月到5歲)的中耳炎，本發(fā)明的優(yōu)選實施方案將本文描述的多價肺炎鏈球菌糖類與優(yōu)選選自以上列出蛋白的肺炎鏈球菌蛋白組合在一起。肺炎鏈球菌蛋白的組合還可有利地如下文所述使用。^"義'球^"蛋冷本發(fā)明的月申炎鏈主求菌(5^e/tococo^1p"ewwo"/ae)^t原i"尤選選自來自多組氨酸三聯(lián)體家族(Pht)的蛋白、來自Lyt家族的蛋白、膽堿結合蛋白、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸)、具有II型信號序列基序LXXC的蛋白(其中X是任意氨基酸)和具有I型信號序列基序的蛋白。這些種類(或基序)中的優(yōu)選實例是以下蛋白(或其截短物或免疫功能等效物)Pht(多組氨酸三聯(lián)體)家族包含蛋白phtA、PhtB、PhtD和PhtE。該家族具有以下特征脂質化序列、由脯氨酸富集區(qū)和幾個組氨酸三聯(lián)體分隔開的兩個結構域(可能涉及金屬或核苷的結合或酶活性)、(3-5)巻曲螺旋區(qū)、保守的N末端和異源的C末端。它存在于已檢驗的所有肺炎球菌菌株中。同源蛋白還可見于其它鏈球菌和奈瑟氏球菌屬(A^^^/a)。該家族優(yōu)選的成員包括PhtA、PhtB和PhtD。更優(yōu)選地，其包括PhtA或PhtD。但是，要理解的是，術語PhtA、B、D和E指具有在以下引用文獻中公開的序列的蛋白，以及其具有序列同源性的天然(和人工制備的)變體，所述變體與參比蛋白至少90%相同。優(yōu)選地，至少95%相同，最優(yōu)選97%相同。對于Pht蛋白而言，PhtA公開于WO98/18930，還可稱作Sp36。如上所述，其是一種多組氨酸三聯(lián)體家族的蛋白，且具有II型信號基序LXXC。PhtD公開于WO00/37105，也可稱作Sp036D。如上所述，它也是多組氨酸三聯(lián)體家族的一種蛋白，也具有II型LXXC信號基序。PhtB公開于WO00/37105,也稱作Sp036B。PhtB家族的另一成員是降解C3的多肽，公開于WO00/17370。該蛋白也來自多組氨酸三聯(lián)體家族，也具有II型LXXC信號基序。優(yōu)選的免疫功能等效物是公開于WO98/18930的蛋白Sp42。PhtB截短物(約79kD)公開于WO99/15675,它也被認為是PhtX家族成員。Phffi公開于WO00/30299，稱作BVH-3。SpsA是膽堿結合蛋白(Cbp),公開于WO98/39450。Lyt家族是膜結合蛋白，與細胞裂解有關。N末端結構域包含膽堿結合結構域，但Lyt家族不具有以下所示的見于膽堿結合蛋白家族(Cbp)的所有特征，因此，對本發(fā)明而言，Lyt家族被認為不同于Cbp家族。與Cbp家族相反，C末端結構域包含Lyt蛋白家族的催化結構域。該家族包括LytA、B和C。對于Lyt家族而言，LytA公開于Ronda等，EurJBiochem,164:621-624(1987)。LytB公開于WO98/18930,也稱作Sp46。LytC也公開于WO98/18930,也稱作Sp91。該家族的優(yōu)選成員是LytC。另一個優(yōu)選實施方案是Lyt家族(具體地說是LytA)截短物，其中"Lyt"如上定義，"截短物"指缺失膽堿結合區(qū)的50%或更多的蛋白。優(yōu)選地，這類蛋白缺失整個膽堿結合區(qū)。Spl25是具有細胞壁錨定基序LPXTG(其中X是任意氨基酸)的肺炎球菌表面抗原的實例。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在該類具有此基序的肺炎球菌表面蛋白中的任意蛋白在本發(fā)明范圍內都是有用的，因此被看作是本發(fā)明的又一種蛋白。Spl25自身公開于WO98/18930，也稱為ZmpB—鋅金屬蛋白酶。Spl01公開于WO98/06734(其中，其具有參考號#y85993)。其特征還在于I型信號序列。Spl33公開于WO98/06734(其中，其具有參考號#y85992)。其特征還在于I型信號序列。Spl28和Spl30公開于WO00/765400。本發(fā)明所使用的蛋白優(yōu)選選自PhtD、PhtA和PhtE，或者是這些蛋白中的2種或全部3種的組合(即PhtA+D、A+E、D+E或A+D+E)?？杉{入的其它肺炎球菌蛋白抗原為來自以下的一種或多種肺炎球菌溶血素(也稱為Ply;優(yōu)選通過化學處理或突變而脫毒)[WO96/05859,WO90/06951，WO99/03884]、PsaA及其跨膜缺失變體(Beny和Paton,InfectImmun1996年12月；64(12):5255-62)、PspA及其跨膜缺失變體(US5804193、WO92/14488、WO99/53940)、PspC及其跨膜缺失變體(WO97/09994、WO99/53940)、膽堿結合蛋白(Cbp)家族成員[例如CbpA及其跨膜缺失變體(WO97/41151;WO99/51266)]、甘油醛-3-磷酸脫氬酶(Infect,Immun.199664:3544)、HSP70(WO96/40928)、PcpA(Sanchez-Beato等，Af/craZw/Lett1998,164:207-14)、M樣蛋白(SB專利申請?zhí)朎P0837130)和粘附素18627(SB專利申請?zhí)朎P0834568)。本發(fā)明還包含這種蛋白的免疫功能等效物或截短物(如上定義)。關于膽堿結合蛋白家族，該家族的成員最初被鑒定為可通過膽堿親和層析純化的肺炎球菌蛋白。所有膽堿結合蛋白都非共價結合于細胞壁磷壁酸和膜結合型脂磷壁酸的磷酸膽堿部分。在結構上，它們有數(shù)個在整個家族中共有的區(qū)域，但這些蛋白的確切特性(氨基酸序列，長度等)可變。一般來說，膽堿結合蛋白包含N末端區(qū)(N)、保守重復區(qū)(R1和/或R2)、脯氨酸富集區(qū)(P)和保守的膽堿結合區(qū)(C)，這些區(qū)域由多個重復序列組成，占該蛋白的約一半。正如本申請中所用的，術語"膽堿結合蛋白家族(Cbp)"選自在WO97/41151中鑒定的膽堿結合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA公開于WO97/41151。CbpD和CbpG公開于WO00/29434。PspC公開于WO97/09994。PbcA公開于WO98/21337。優(yōu)選地，膽堿結合蛋白選自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。如果Cbp是所用的另一種蛋白，那么它可以是Cbp截短物，其中"Cbp"如上定義，"截短物"指缺失膽堿結合區(qū)(C)的50%或更多的蛋白。優(yōu)選這類蛋白缺失整個膽堿結合區(qū)。更優(yōu)選地，這類蛋白截短物缺失(i)膽堿結合區(qū)和(ii)該蛋白的N末端一半的一部分，但仍保留至少一個重復區(qū)(R1或R2)。再更優(yōu)選地，所述截短物具有2個重復區(qū)(R1和R2)。這類優(yōu)選實施方案的實例是描述于WO99/51266或WO99/51188的NRlxR2、RlxR2、NRlxR2P和RlxR2P，但缺失類似膽堿結合區(qū)的其它膽堿結合蛋白也包括在本發(fā)明的范圍內。Cbp截短物-Lyt截短物嵌合蛋白(或融合體)也可用于本發(fā)明的組合物。優(yōu)選地，其包括Cbp的NRlxR2(或RlxR2或NRlxR2P或RlxR2P)和Lyt的C末端區(qū)(Cterm,即缺失膽堿結合域)(例如LytCCterm或Sp91Cterm)。更優(yōu)選地，Cbp選自CbpA、PbcA、SpsA或PspC。再更優(yōu)選地，其是CbpA。優(yōu)選地，Lyt是LytC(也可稱作Sp91)。也可應用缺失了膽堿結合域(C)并表達為與Lyt的融合蛋白的PspA或PsaA截短物。優(yōu)選，Lyt是LytC。在一種肺炎球菌組合物中，可能組合本發(fā)明的不同肺炎球菌蛋白。優(yōu)選本發(fā)明的蛋白組合選自2種或多種(3或4種)不同種類，如具有II型信號序列基序LXXC的蛋白(其中X是任何氨基酸，例如多組氨酸三聯(lián)體家族(Pht))、膽堿結合蛋白家族(Cbp)、具有I型信號序列基序的蛋白(例如Spl01)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X是任意氨基酸，例如Spl28、Spl30)、毒素(例如Ply)等等。在這些種類(或基序)中的優(yōu)選實例是以上所提到的蛋白或其免疫功能等效物。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp和毒素+Pht+Cbp是優(yōu)選的種類組合。優(yōu)選的有益組合包括但不限于PhtD+NRlxR2、PhtD+NRxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtD+Ply、PhtD+Sp128、PhtD+PsaA、PhtD+PspA、PhtA+NTUxR2、PhtA+NRlxR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白、PhtA+Ply、PhtA+Spl28、PhtA+PsaA、PhtA+PspA、NRlxR2+LytC、NRlxR2P+PspA、麗xR2+PspA、NRlxR2+Spl28、RlxR2+LytC、RlxR2+PspA、RlxR2+PsaA、RlxR2+Sp128、RlxR2+PhtD、RlxR2+PhtA。優(yōu)選地，NRlxR2(或RlxR2)來自CbpA或PspC。更優(yōu)選它來自CbpA。特別優(yōu)選的肺炎球菌蛋白組合包括Ply(或其截短物或免疫功能等效物)+PhtD(或其截短物或免疫功能等效物)以及任選的NRlxR2(或RlxR2或NRlxR2P或RlxR2P)。優(yōu)選地，NRlxR2(或RlxR2或NRlxR2P或RlxR2P)來自CbpA或PspC。更優(yōu)選它來自CbpA。所述抗原可為含多糖抗原的肺炎球菌糖類綴合物，所述多糖抗原來自至少4種血清型，優(yōu)選至少7種血清型，更優(yōu)選至少ll種血清型，包括至少一種但優(yōu)選2、3或4種優(yōu)選選自上述蛋白組的肺炎鏈球菌蛋白。優(yōu)選所述蛋白中的一種蛋白是PhtD(或其免疫功能等效物)和/或Ply(或其免疫功能等效物)。與多糖接種方法有關的問題是多糖本身為弱免疫原這一事實。為克服此問題，可將多糖與蛋白載體綴合，所述載體可提供旁觀T細胞輔助作用。因此，優(yōu)選本發(fā)明所用的糖類連接至這種蛋白載體。目前常用于產生糖類免疫原的這類載體的實例包括白喉類毒素和破傷風類毒素(分別為DT、DTCRM197和TT)、匙孔蜮血藍蛋白(KLH)、來自腦膜炎奈瑟氏球菌(W.mem'"g故fifa)的OMPC以及結核菌素的純化蛋白衍生物(PPD)?；诜窝浊蚓穷惖拿庖咴越M合物(或疫苗)的優(yōu)選載體是來自流感嗜血菌(/^emo;^,7^z力力we"aze)的D蛋白(EP594610-B)或其片段。適合使用的片段包括含T輔助表位的片段。具體地說，D蛋白片段優(yōu)選包含所述蛋白的N末端1/3。D蛋白載體可作為載體用在其中綴合了多種肺炎球菌糖類抗原的組合物中。組合中的一種或多種肺炎球菌糖類可有利地綴合到D蛋白上。用于肺炎球菌糖類的另一種優(yōu)選載體是肺炎球菌蛋白本身(如上在"本發(fā)明的肺炎球菌蛋白"章節(jié)中定義)。所述糖類可通過任何已知方法(例如Likhite的美國專利4,372,945和Armor等的美國專利4,474,757的方法)與載體蛋白連接。優(yōu)選地，可進行CDAP綴合(WO95/08348)。優(yōu)選地，所述綴合物的蛋白:糖類(重量:重量)比例是0.3:1到1:1,更伊C選0.6:1至ij0.8:1，最伊乙選纟々0.7:]。本發(fā)明的特別優(yōu)選的組合物包含一種或多種綴合的肺炎球菌糖類，以及本發(fā)明的一種或多種肺炎球菌蛋白。另外，肺炎球菌糖類和蛋白可作為吸附在磷酸鋁上的原液組分以液體形式穩(wěn)定儲存。適宜地，其它抗原來源于HIV-1，(如gag或其片段，諸如p24、tat、nef、gpl20或gpl60或任何這些片段)；人類皰滲病毒，如gD或其衍生物或立即早期蛋白，如來自HSV1或HSV2的ICP27;巨細胞病毒((尤其是人類)(如gB或其衍生物))；輪狀病毒(包括減毒活病毒)；EB病毒(如gp350或其衍生物)；水痘-帶狀皰滲病毒(如gpl、II和正63);或來自肝炎病毒，如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物)、曱型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒，或來自其它病毒病原體，如副粘病毒呼吸道合胞體病毒(如F、N、M和G蛋白或其衍生物)、副流感病毒、麻滲病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黃病毒(如黃熱病毒、登革病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或流感病毒(全活病毒或失活病毒、在卵中或MDCK細胞中培養(yǎng)的裂解流感病毒或全流感病毒體(如R.Gluck,Vaccine,1992,10,915-920所述)或其純化蛋白或重組蛋白,如HA、NP、NA或M蛋白或其組合)；或來源于細菌病原體，如奈瑟氏5求菌(A^z'^en'a5/p)，包4舌'淋病奈瑟氏3求菌(iV.go"o/r/e(3)和月S膜炎奈瑟氏球菌(W.mem力g故^y)(例如莢膜糖類及其綴合物、運鐵蛋白結合蛋白、乳鐵蛋白結合蛋白、MC、粘附素)；化膿鏈球菌(Xp，ge"e力(如M蛋白或其片段，C5A蛋白酶、脂磷壁酸)、無乳鏈球菌(S.aga/ac^fe)、變異鏈球菌(S.wwto似)；杜氏嗜血菌(//.cwcre_y0;莫拉氏菌(A/oraxe〃a^p)，包括粘膜炎莫拉氏菌(7^^^^/2"http://力，也稱為粘膜炎布蘭漢氏球菌(^〃"油"附￡//"catorr/afc)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵襲素)；博德特氏菌(6orafee//a^p),包括百曰咳博德特氏菌(ApeWMM,力(例如pertactin、百日咳毒素或其衍生物、絲狀血凝素、腺芬酸環(huán)化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(及；x/ra尸em^^0和支氣管炎十粵德、特氏菌(S.^o"c/n'sep"ca);分4支對干菌(A^C6^flrfehwmWP.)，包括結核分枝桿菌(Mfw^rcw/o^)(例如ESAT6、抗原85A、-B或-C)、牛分枝桿菌(MZ)ovw)、麻風分枝桿菌(A/./印rae)、鳥分枝桿菌(M.av/w附)、副結斥亥分4支才亍菌(A/.;ara&Z)ercw/(w/51)、耳ii后分才支4干菌(A/.sweg附a〃力；軍團菌(Leg/owe〃asp/)，包4舌4旻肺軍團菌(丄./wewwop/H'/a);i矣希氏菌(￡^c/2e"'c/n'asp/),包^舌腸產毒寸生大腸^干菌O^ratox/cEco/Z)(例如定居因子、熱不穩(wěn)定毒素或其衍生物、熱穩(wěn)定毒素或其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀毒素樣毒素或其衍生物)；弧菌(J/;如/0印，;)，包括霍亂弧菌(Kc/jo/era)(例如霍亂毒素或其衍生物)；志賀氏菌(5^扭/&^;)，包括索氏志賀氏菌(S.so""e/)、痢疾志貧氏菌(S.4^eWen'ae)、弗氏志貧氏菌(S.yZexwen7);耶爾森氏菌(Jera/w'cf^p),包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(J.e"feraco似/ca)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(K;"to)、^f艮結核耶爾森氏菌(K/wewc/o似Z^7rw/osly);彎曲一f菌(G7w/7少/oZ""ers//)，包才舌空腸彎曲桿菌(C.yey,a)(例如毒素、粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C.co//);沙門氏菌(&/w0"e//0包括傷寒沙門氏菌(S.(yp/n')、副傷寒沙門氏菌(S.paraO^A/)、豬霍亂沙門氏菌(S.c/o/era"w^)、腸炎沙門氏菌(S.e加enYW力；利其斤特氏菌(丄/Werz力包括單核細月包增生利斯特氏菌(丄.mowocytoge"e力；蟲累桿菌(/^//<:0/^<:^"*包括幽門螺桿菌(/Z."/on)(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌(尸^Mfifo附o"oyw/7),包4舌銅綠々支單月包菌(尸.twwg7)ay。)；葡萄J求菌(Sto"/^/ococa^^;),包括金黃色葡萄球菌(S.m^a^)、表皮葡萄球菌(Xe/u'fife7m'(3fo);腸球菌(5"terococcMS>//7)，包括糞腸球菌(五.,cafc)、尿腸球菌(i./aec/應)；梭菌(C7o欲W應包括破傷風梭菌(C.fetom')(例如破傷風毒素和其衍生物)、肉毒梭菌(C.幻^/,m/m)(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物)、艱難梭菌(C.^^"/e)(例如才炎菌毒素A或B和其衍生物)；芽孢桿菌(^/c///^5/;),包括炭疽芽孢桿菌(及""^racz力(例如肉毒桿菌毒素和其衍生物)；棒桿菌(Coo^eZw"ehw/w5/;),包括白4矣一奉桿菌(Cc^似/2en'ae)(例如白喉毒素和其衍生物)；疏螺旋體(So/re"a包括布氏疏螺旋體(凡Zwrg^^/eh)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺S走體(凡gahm/)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺S走體(5.a/ze/Z/)(例3口OspA、OspC、DbpA、DbpB)、5.awderaom'Z(例3口OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏蜱疏螺旋體(及/2www7);埃里希氏體(5/^/z'c/2/a包括馬埃里希氏體(五.ewz)和人粒細胞埃里希氏體病(Ehrlichiosis)因子；立克次氏體(化c/:"to'aj^p),包括立氏立克次氏體(W.nc/:eto");衣原體(C72/am;^/a>spp.),包4舌石少目艮衣原體(Cfrac/owato)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、肺炎衣原體(C,p恥wmo",ae)(例如MOMP、肝素結合蛋白)、鸚鵡熱衣原體(C.戸/tod);鉤端螺旋體(丄eptos戸'ras/p曙),包4舌問號鉤端蟲系3走體(L//7ferroga/iy);密蟲累^走體(jyepo"ewoWP.),包括蒼白密螺旋體(r.pa仏血w)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(J.cfe""co/a)、豬痢疾密螺S走體(7:/2_yod，ew^7'ae);或來源于寄生物，如癥蟲(尸/flwmoafew5pp.),包括惡性癡蟲(尸./a/c,^3Twm);弓形蟲(7bxo;/aww包括鼠弓形蟲(71.go"A力(例如SAG2、SAG3、Tg34);內變形蟲(五"tomoe6a^p.),包^舌痢疾內變形蟲(5.巴貝蟲(Ba/)ew'as/7/.)，包^舌果氏巴貝蟲(S.w/cro");錐蟲(T)y;7awc^omGfWP.),包括克香氏錐蟲(J.craz/);賈笫蟲(G/aniws;p.)，包括表吮賈第蟲(G./awMa);利什曼蟲(丄e/Awam'a^/7.)，包括碩大利什曼蟲(丄.mq/or);肺嚢蟲(尸"ewwoc，tos/t/.),包4舌卡氏肺嚢蟲(尸.cah",7);毛滴蟲(rhc/7omo"osspp.)，包4舌陰道毛滴蟲(T".vagz'"afc);血吸蟲(Sc/^astowa包括曼氏血吸蟲(S.ma似ow'),或來源于酵母，如假絲酵母(Ca"G^aw尸.)，包括白色假絲酵母(C.a/^ca似)；隱球酵母(O_y/^ococa^5p/.),包括新型隱球酵母(C."eq/bn77am)。結核分枝桿菌(M.fM6ercw/a^)的其它優(yōu)選特異性抗原是例如TbRal2、TbH9、TbRa35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCCl(WO99/51748)。結核分枝桿菌的蛋白還包括融合蛋白和其變體，其中結核分枝桿菌的至少兩個，優(yōu)選三個多肽融合成一個更大的蛋白。優(yōu)選的融合體包括Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、DPV畫MTI國MSL、Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV國MTI誦MSL-mTCC2、TbH9隱DPV-MTI(WO99/51748)。衣原體的最優(yōu)選抗原包括例如高分子量蛋白(HMW)(WO99/17741)、ORF3(EP366412)和推定的膜蛋白(Pmp)。組合物的其它衣原體抗原可選自WO99/28475所述的組。優(yōu)選的細菌組合物包含源自嗜血菌(7/aemc^/^/1^^;)的抗原，包括B型流感嗜血菌(//./"ywewzae)(例如PRP及其綴合物)、不定型的流感嗜血菌，例如OMP26、高分子量粘附素、P5、P6、D蛋白和脂蛋白D,以及絲束蛋白和絲束蛋白衍生的肽(US5,843,464)或多重拷貝變體或其融合蛋白。乙型肝炎表面抗原的衍生物是本領域熟知的，且尤其包括，在歐洲專利申請EP-A-414374、EP-A-0304578和EP198-474中所列出的PreSl、PreS2S抗原。在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明的疫苗制劑包含HIV-1抗原、gpl20,尤其是在CHO細胞中表達時。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含如上文所迷的gD2t。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，組合物包含源于人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，HPV被認為是生殖器疣的原因(HPV6或HPV11等)，且HPV病毒也是造成子宮頸癌的原因(HPV16、HPV18等)。生殖器疾的預防性或治療性組合物的特別優(yōu)選形式包含Ll顆粒或殼粒，和含有選自HPV蛋白El、E2、E5、E6、E7、Ll和L2的一種或多種抗原的融合蛋白。融合蛋白的最優(yōu)選形式是如WO96/26277中公開的L2E7,和GB9717953.5(PCT/EP98/05285)中公開的D蛋白(l/3)-E7。優(yōu)選的HPV子宮頸感染或癌癥的預防性或治療性組合物可包含HPV16或18抗原。例如，Ll或L2抗原單體或Ll或L2抗原一起呈現(xiàn)為病毒樣顆粒(VLP),或單獨的Ll蛋白單獨地存在于VLP或殼粒結構中。這種抗原、病毒樣顆粒和殼粒自身是已知的。參見例如WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792和WO93/02184?？砂瑔为毜幕蜃鳛槿诤系鞍椎钠渌缙诘鞍?，例如E7、E2或優(yōu)選E5，例如，其特別優(yōu)選的實施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。特別優(yōu)選的HPV16抗原包括早期蛋白E6或E7,其與D蛋白載體融合，形成HPV16的D蛋白-E6或E7融合體，或其組合；或E6或E7與L2的組合(WO96/26277)。或者，HPV16或18早期蛋白E6和E7可以單分子形式存在，優(yōu)選為D蛋白-E6/E7融合體。這種組合物可任選地包含HPV18的E6和E7蛋白的任一種或兩種，優(yōu)選為D蛋白-E6或D蛋白-E7融合蛋白或D蛋白E6/E7融合蛋白的形式。本發(fā)明的組合物可另外包含其它HPV毒抹的抗原，優(yōu)選為毒抹HPV31或33。(CS蛋白)、RTS,S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是一種雜合蛋白，含有惡性瘧原蟲環(huán)孢子(CS)蛋白的基本全部C-末端部分，該部分經乙型肝炎表面抗原preS2部分的四個氨基酸連接至乙型肝炎病毒表面(S)抗原。其完整結構在國際專利申請?zhí)朠CT/EP92/02591中公開，在要求了UK專利申請?zhí)?124390.7優(yōu)先權的編號WO93/10152下發(fā)表。當在酵母中表達時，RTS作為脂蛋白顆粒生產，而當其與HBV的S抗原共表達時，產生稱為RTS,S的混合顆粒。TRAP抗原在國際專利申請?zhí)朠CT/GB89/00895中描述，在WO90/01496下公開。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是其中抗原制備物包含RTS,S和TRAP抗原組合的瘧疾疫苗?？赡苁嵌嗥诏懠惨呙缃M分的候選物的其它瘧原蟲抗原是惡性瘧原蟲MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、鉗合蛋白、PffiMPl、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PffiXPl、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfsl6、Pfs48/45、Pfs230和它們在癡原蟲(尸/aw70^wmw.)中的類似物。本發(fā)明的一個實施方案是一種組合物，其包含RTS,S或CS蛋白或其片段，如RTS,S的CS部分，它們與一種或多種其它疾疾抗原組合，這些瘧疾抗原可選自例如MPS1、MSP3、AMA1、LSA1或LSA3。組合物還可包含抗肺瘤抗原，并用于癌癥的免疫治療性治療。例如，所述抗原可為腫瘤排斥抗原，例如針對前列腺癌、乳癌、結直腸癌、肺癌、胰腺癌、腎癌或黑素瘤癌的抗原。示例性的抗原包括MAGE1、MAGE3和MAGE4或例如公開于WO99/40188中的其它MAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(也稱為NYEos1)、SAGE和HAGE(WO99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami,1996,CurrentOpinionsinImmunology8,628-636頁；VandenEynde等,InternationalJournalofClinical&LaboratoryResearch(1997年提交)；Correale等(1997),JournaloftheNationalCancerInstitute89，293頁)。實際上，這些抗原在廣泛的腫瘤類型中表達，如黑素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌。用于本發(fā)明的MAGE抗原可與表達增強物或免疫融合配偶體一起作為融合蛋白表達。具體地i兌，Mage蛋白可融合至乙型流感嗜血菌的D蛋白或其脂質化衍生物。具體地說，融合配偶體可包含D蛋白的前1/3。此結構公開于WO99/40188。其它肺瘤特異性抗原包括zf旦不限于KSA(GA733)腫瘤特異性神經節(jié)苷脂，例如GM2和GM3或其與運載蛋白的綴合物；或者所述抗原可以是自身肽激素，如全長促性腺激素釋放激素(GnRH,WO95/20600),其是10個氨基酸長的短肽，用于治療許多癌癥，或用于免疫去勢。在一個優(yōu)選實施方案中，利用前列腺抗原，例如前列腺特異性抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS95(4)1735-17401998)、PSMA或稱為Prostase的抗原。Prostase是前列腺特異性絲氨酸蛋白酶(胰蛋白酶樣)，254個氨基酸長，具有保守的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體H-D-S和氨基末端前-原肽序列，顯示潛在的分泌功能(P.Nelson,LuGan,C.Ferguson,P.Moss,R.Gelinas，L.Hood&K.Wand,"Molecularcloningandcharacterisationofprostase,anandrogen-regulatedserineproteasewithprostaterestrictedexpression",載于Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999)96，3114-3119)。已經描述了推定的糖基化位點。預測的結構非常類似于其它已知的絲氨酸蛋白酶，表明成熟多肽折疊成單個結構域。成熟蛋白為224個氨基酸長，具有至少一個顯示被天然加工的A2表位。Prostase核苷酸序列和推斷的多肽序列和同源物公開于Ferguson等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999,96,3114-3119)和國際專利申請?zhí)朩O98/12302(以及相應的授權專利US5,955,306)、WO98/20117(以及相應的授權專利US5,840,871和US5，786,148)(前列腺特異性激肽釋放酶)和WO00/04149(P703P)。本發(fā)明提供含基于Prostase蛋白及其片段和同源物("衍生物")的含Prostase蛋白融合體的組合物。這種衍生物適用于適合治療前列腺腫瘤的治療性疫苗制劑。典型地，所述片段將含如在以上引用的專利和專利申請中公開的至少20個、優(yōu)選50個、更優(yōu)選100個連續(xù)氨基酸。再優(yōu)選的前列腺抗原稱為P501S,WO98/37814的序列標識號113。免疫原性片及其部分含如以上引用的專利申請中公開的至少20個、優(yōu)選50個、更優(yōu)選100個連續(xù)氨基酸。參見例如PS108(WO98/50567)。其它前列腺特異性抗原可乂人WO兆/37418和WO/004149得知。另一個是STEAP(PNAS9614523145287-121999)。在本發(fā)明范圍中有用的其它腫瘤相關抗原包括Plu-1(JBiol.Chem274(22)15633-15645,1999)、HASH-l、HasH隱2、Cripto(Salomon等，Bioessays199,2161-70，美國專利5654140)、Criptin(美國專利5981215)。另外，與癌癥治療特別相關的抗原還包括酪氨酸酶和存活蛋白。粘蛋白衍生的肽如Mucl參見例如US5744,144、US5827,666、WO8805054、US4,963,484。特別考慮的是Muc1衍生肽，其包含Muc1肽的至少一個重復單元，優(yōu)選至少兩個這種重復單元，其可被SM3抗體識別(US6054438)。其它粘蛋白衍生肽包括來自Muc5的肽。本發(fā)明抗原可為乳癌抗原，如Her-2/Neu、乳腺珠蛋白(美國專利5668267)或在WO00/52165、W099/33869、W099/19479、W098/45328中公開的抗原。Her2neu抗原特別地公開于美國專利5,801,005。優(yōu)選地，Her2neu包含完整胞外結構域(包含大約氨基酸l-645)或其片段，以及大約C末端580個氨基酸的至少免疫原性部分或完整胞內結構域。具體地說，胞內部分應包含磷酸化結構域或其片段。這種構建體公開于WO00/44899。一種特別優(yōu)選的構建體^^稱為ECDPD,第二種被稱為ECDPD。參見WOO(V44899。在此使用的Her-2neu可來源于大鼠、小鼠或人類。所述組合物可包含與腫瘤支持機制(例如血管生成、胂瘤侵入)相關的抗原，例如tie2、VEGF?？深A見的是，本發(fā)明的組合物可使用來源于博氏疏螺旋體屬(萬0廳e/^)的抗原。例如，抗原可包括:才亥酸、病原體々f生的抗原或抗原制備物、重組生產的蛋白或肽以及嵌合融合蛋白。具體地說，所述抗原是OspA。OspA可為借助于宿主細胞(大腸桿菌)的脂質化形式的完整成熟蛋白，稱為(Lipo-OspA),或者可為非脂質化的衍生物。此非脂質化衍生物包括具有流感病毒非結構蛋白(NS1)的前81個N-末端氨基酸的非脂質化NSl-OspA融合蛋白、完整OspA蛋白以及另一個MDP-OspA,MDP-OspA是攜帶3個額外的N-末端氨基酸的OspA的非脂質化形式。含變應原特異性抗原(例如Derpl)和變應原非特異性抗原(例如來源于人IgE的肽，包括但不限于stanworth十肽(EP0477231Bl))。本發(fā)明的組合物還可用于變態(tài)反應、癌癥或感染性疾病之外的慢性疾病的預防或治療。這種慢性疾病是諸如動脈硬化和Alzheimer病的疾病。本發(fā)明的組合物特別適合于諸如慢性病癥和癌癥的疾病的免疫治療性治療，而且適合于持續(xù)感染的治療。因此，本發(fā)明的組合物特別適合于感染性疾病的免疫治療，所述感染性疾病例如為結核病(TB)、AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染。另外，在AIDS背景下，提供一種治療易感或患有AIDS的個體的方法。該方法包括給予所述個體本發(fā)明的疫苗，由此降低由隨后的fflV感染引起的CD4+T細胞減少量，或者減慢或阻止已感染HIV的個體中的CD4+T-細胞減少。除了上述肺炎球菌抗原以外(包括或不包括肺炎球菌抗原)，其它抗原包括細菌(優(yōu)選莢膜)糖類。多糖抗原吸附到磷酸鋁上，便利地儲存于原液中一因此通過將所述原液與本發(fā)明的含油乳液即時混合直接產生本發(fā)明的疫苗組合物。優(yōu)選地，所述其它細菌糖類選自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組A莢膜糖類(MenA)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清組C莢膜糖類(MenC)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清組Y莢膜糖類(MenY)、腦膜炎奈瑟氏球菌血清組W-135莢膜糖類(MenW)、B組鏈球菌I組莢膜糖類、B組鏈球菌II組莢膜糖類、B組鏈球菌III組莢膜糖類、B組鏈球菌IV組莢膜糖類、B組鏈球菌V組莢膜糖類、金黃色葡萄球菌(&a/7/2少/ococc^m^e^)5型莢膜糖類、金黃色葡萄球菌8型莢膜糖類、得自傷寒沙門氏菌(&/附0"￡//"(^/2/)的Vi糖類、腦膜炎奈瑟氏球菌LPS、卡他莫4立菌(M.cato^r/^fc)LPS和流感嗜血菌LPS。所述LPS是指天然脂多糖(或脂寡糖)或其中脂質A部分已通過眾多已知方法中的任一種解毒的脂多糖(參見例如WO9W18837或WO98/33923)，或任何包含衍生于所述LPS的O-多糖的分子。所述腦膜炎奈瑟氏球菌LPS是指12種已知免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、LIO、Ll1或L12)中的1種或多種。特別優(yōu)選的組合是含以下組分的組合物l)綴合Hib、級合MenA和綴合MenC;2)綴合Hib、綴合MenY和綴合MenC;3)綴合Hib和綴合MenC;和4)綴合MenA、綴合MenC、綴合MenY和綴合MenW-135。在每種上述綴合物中的PS量可為每0.5mL人劑量各5或10貼。優(yōu)選地，Hib、MenA、MenC、MenW-135和MenY是TT綴合物。與多糖接種方法有關的問題是多糖本身為弱免疫原這一事實。為克服此問題，可將本發(fā)明的糖類與蛋白載體綴合，所述載體可提供旁觀T細胞輔助作用。因此，優(yōu)選本發(fā)明所用的糖類連接至這種蛋白載體。目前常用于產生糖類免疫原的這類載體的實例包括白喉類毒素和石皮傷風類毒素(分別為DT、DTCRM197和TT)、匙孔蜮血藍蛋白(KLH)、來自流感嗜血桿菌的D蛋白(EP594610-B)、來自腦膜炎奈瑟氏球菌(W.mem"g/tofa)的OMPC以及結核菌素的純化蛋白衍生物(PPD)。所述糖類可通過任何已知方法(例如Likhite的美國專利4，372,945和Armor等的美國專利4,474,757中的方法)連接至載體蛋白。優(yōu)選地，可進行CDAP綴合(WO95/08348)。優(yōu)選地，所述綴合物的蛋白:糖類(重量:重量)比例是0.3:1到1:1,更優(yōu)選0.6:1到0.8:1，最優(yōu)選約0.7:1。本發(fā)明包括提供抗肺炎球菌和不同病原體的保護作用的抗原組合。目前許多兒科疫苗以聯(lián)合疫苗形式給子，以減少兒童必須接受的注射次數(shù)。因此，對于兒科疫苗來說，來自其它病原體的其它抗原可以與本發(fā)明的肺炎球菌疫苗一起配制。例如，本發(fā)明的疫苗可以用公知的'三價，聯(lián)合疫苗配制(或同一時間分別給予)，該聯(lián)合疫苗包含白喉類毒素(DT)、破傷風類毒素(TT)和百日咳成分[通常是脫毒的百日咳類毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，以及任選的粘附素(pertactin,PRN)和/或凝集素1+2],例如市售疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKlineBeechamBiologicals)，其包含DT、TT、PT、FHA和PRN抗原，或帶有完整百日咳細胞成分，例如SmithKlineBeechamBiologicalss.a.銷售的TritanrixTM。聯(lián)合疫苗還可以包含其它抗原，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、脊髓灰質炎病毒抗原(例如滅活的三價脊髓灰質炎病毒-IPV)、卡他莫4立菌(Morajce〃aQtorr/a/,力外膜蛋白、非典型流感嗜血菌蛋白、腦膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白。(Moraxe〃ac加cwr/afc)蛋白抗原的實例為OMP106[WO97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)];OMP21;LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)];TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)];CopB[HelminenME等，(1993)Infect.Immun.61:2003-2010];UspAl和/或UspA2[WO93/03761(德州大學)];OmpCD;HasR(PCT/EP99/03824);PilQ(PCT/EP99/03823);OMP85(PCT/EP00/01468);lipo06(GB9917977.2);lipo10(GB9918208.1);lipoll(GB9918302.2);lipol8(GB9918038.2);P6(PCT/EP99/03038);D15(PCT/EP99/03822);OmplAl(PCT/EP99/06781);Hly3(PCT/EP99/03257)和OmpE?？砂诼?lián)合疫苗(特別是用于預防中耳炎)中的非典型流感嗜血菌抗原的實例包括絲束蛋白[(US5766608-俄亥俄州研究基金會)]和含來自該蛋白的肽的融合體[例如LBl(f)肽融合體；US5843464(OSU)或WO99/64067];OMP26[WO97/01638(Cortecs)];P6[EP281673(紐約州立大學)];TbpA和/或TbpB;Hia;Hsf;Hin47;Hif;Hmwl;Hmw2;Hmw3;Hmw4;Hap;D15(WO94/12641);D蛋白(EP594610);P2和P5(WO94/26304)。設想的其它組合是本發(fā)明的肺炎鏈球菌糖類和蛋白與病毒抗原的組合，所述病毒抗原例如來自流感病毒(減毒的、裂解的或亞單位的)[例如表面糖蛋白神經氨酸酶(NA)和血細胞凝集素(HA)]。參見例如ChaloupkaI.等,Eur.JournalClin.Microbiol.InfectDis.1996,15:121-127];RSV(例如F和G抗原或F/G融合體，參見例如SchmidtA.C.等，JVirol,2001年5月，4594-4603頁);PIV3(例如HN和F蛋白，參見Schmidt等，出處同上)；水疸病毒(例如減毒的、糖蛋白I-V等)以及MMR(麻滲、流行性肥腺炎、風滲)的任意(或全部)組分。本發(fā)明設想用于整體治療或預防中耳炎的優(yōu)選兒科聯(lián)合疫苗包含一種或多種肺炎鏈球菌糖類抗原(優(yōu)選綴合至D蛋白)、一種或多種肺炎球菌蛋白(優(yōu)選上述肺炎球菌蛋白)和一種或多種來自卡他莫拉菌和/或非典型流感嗜血菌的表面暴露抗原。D蛋白可有利地用作肺炎球菌糖類(如上所述)的蛋白載體，因為其自身為能夠產生B細胞介導的抗非典型流感嗜血菌(ntHi)保護作用的免疫原?？ㄋ蚍堑湫土鞲惺妊乖砂趤唵挝恍问降囊呙缰?，或者可作為存在于由細菌制備的外膜嚢泡(皰)表面上的抗原被加入。優(yōu)選抗原如上所述，在一個方面，本發(fā)明涉及含以下物質的組合物在生產免疫原性組合物中的用途(a)抗原，和(d)水包油乳液佐劑；和0)3D旨L其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述免疫原性組合物用于預防感染和/或疾病。因此，本發(fā)明的組合物用于能夠通過該組合物預防或緩解的感染和/或疾病，適宜地，其中所述抗原來源于與疾病相關的病原體(例如細菌或病毒)或與該病原體相關。來自甲型和乙型流感病毒、HPV抗原、RSVA和B、SARS、鏈球菌、VZV、鼻病毒、副流感病毒的抗原優(yōu)選用于本發(fā)明，例如裂解流感抗原、VZVgE、VZV正63和來自肺炎鏈球菌的PhtD。但是，可使用任意合適的抗原。在一個實施方案中，用于本發(fā)明的組合物不包含流感亞單位抗原和MF59tm佐剤。對于本發(fā)明的所有方面，優(yōu)選抗原包含CD4T細胞表位或B細胞表位，或適宜地包含這二者。流感病毒林和抗原按照本發(fā)明使用的流感病毒或其抗原性制備物可為裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物。在一個替代實施方案中，流感病毒制備物可包含另一類型的失活流感抗原，例如失活全病毒或純化的HA和NA(亞單位疫苗)，或流感病毒顆粒。在再另一個實施方案中，流感病毒可為減毒活流感病毒制備物。適宜地，按照本發(fā)明使用的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物為失活病毒制備物，其中病毒顆粒用溶解脂質包膜的去污劑或其它試劑破壞。適宜地，裂解病毒或其裂解病毒抗原性制備物如下制備用溶解濃度的有機溶劑或去污劑片段化感染性或失活的全流感病毒，隨后去除全部或大部分溶解劑和某些或大部分病毒脂質物質。所述其裂解病毒抗原性制備物指相比于裂解病毒可能已經受了一定程度的純化而保留了裂解病毒組分的大部分抗原特性的裂解病毒制備物。例如，當在卵中生產時，裂解病毒可由卵雜蛋白中去除，或者在細胞培養(yǎng)物中生產時，裂解病毒可由宿主細胞雜質中去除。裂解病毒抗原性制備物可包含一種以上病毒抹的裂解病毒抗原性組分。含裂解病毒的疫苗(叫啦l'裂解流感疫苗，)或含裂解病毒抗原性制備物的疫苗一般包含殘余的基質蛋白和核蛋白，有時包含脂質以及膜包膜蛋白。這種裂解病毒疫苗通常包含大部分或全部病毒結構蛋白，但不一定和它們在全病毒中存在的比例相同。在另一個實施方案中，流感病毒制備物為純化的亞單位流感疫苗形式。亞單位流感疫苗一般包含兩種主要的包膜蛋白HA和NA，可能具有超越全病毒體疫苗的額外優(yōu)勢，因為它們一般無反應原性，尤其是在年輕的接種者中。亞單位疫苗可重組生產，或者可由破裂的病毒顆粒純化。在另一個實施方案中，流感病毒制備物為病毒體形式。病毒體是球形的單層嚢泡，其保留了真實構象的功能性病毒包膜糖蛋白HA和NA,插入病毒體的磷脂雙層膜中。所述流感病毒或其抗原性制備物可為卵源的或組織培養(yǎng)源的。例如，本發(fā)明的流感病毒抗原或其抗原性制備物可來源于常規(guī)的含胚卵法，該方法在卯中培養(yǎng)流感病毒，并純化收集的尿嚢液。卵可在短時間內大量累積?；蛘?，它們可來源于任何使用組織培養(yǎng)物的新生產方法，以培養(yǎng)病毒或表達重組流感病毒表面抗原。適于培養(yǎng)病毒的細胞基質包括例如狗腎細胞，例如MDCK或MDCK克隆的細胞、MDCK樣細胞，猴腎細胞，例如AGMK細胞，包括Vero細胞，合適的豬細胞系，或適于生產疫苗用途的流感病毒的任意其它哺乳動物細胞類型。合適的細胞基質還包括人細胞，例如MRC-5細胞。合適的細胞基質不限于細胞系；例如原初細胞，如小雞胚成纖維細胞，還包括禽細胞系。流感病毒抗原或其抗原性制備物可通過眾多工業(yè)用方法中的任一種生產，例如在專利號DD300833和DD211444(通過引用結合到本文中)中描述的裂解流感病毒法。裂解流感病毒傳統(tǒng)上使用溶劑/去污劑處理產生，例如磷酸三正丁酯，或者二乙醚組合Tween(稱作"Tween-醚"裂解)，該方法仍在某些生產廠家中使用。目前使用的其它裂解劑包括去污劑或蛋白水解酶或膽汁鹽，例如在專利號DDI55875(通過引用結合到本文中)中描述的脫氧膽酸鈉?？捎米髁呀鈩┑娜ノ蹌┌栯x子去污劑，例如溴化鯨蠟基三曱銨(CTAB);其它離子去污劑，例如十二烷基硫酸鹽、?；敲撗跄懰猁}；或非離子去污劑，如上述的一種，包括TritonX-100(例如在Lina等，2000，Biologicals28,95-103描述的方法中)和TritonN-l01;或者任何兩種或更多種去污劑的組合。裂解疫苗的制備方法可包括眾多不同的過濾和/或其它分離步驟，如各種組合的超離心、超濾、區(qū)帶離心和層析(例如離子交換)步驟，以及任選的例如采用熱、曱醛或(3-丙酸內酯或紫外線的失活步驟，其可在裂解前或后進行。裂解過程可以分批、連續(xù)或半連續(xù)過程進行。用于裂解免疫原性組合物的優(yōu)選裂解和純化方法描述于WO02/097072。本發(fā)明的優(yōu)選裂解流感疫苗抗原制備物包括生產過程剩余的殘余量的Tween80和/或TritonX-100,但這些物質可在裂解抗原制備后加入或調整其濃度。優(yōu)選地，Tween80和TritonX-100都存在。疫苗劑量中這些非離子型表面活性劑的終濃度的優(yōu)選范圍為Tween80:0.01-1%,更優(yōu)選為約0.1%(體積/體積)TritonX-100:0.001-0.1%(重量/體積)，更優(yōu)選為0.005-0.02%(重量/體積)。在一個具體實施方案中，Tween80的終濃度在0.045%-0.09%(重量/體積)的范圍內。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的Tween80濃度在0.045%-0.2%(重量/體積)的范圍內，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。在另一個具體實施方案中，TritonX-100的終濃度在0.005%-0.017%(重量/體積)的范圍內。在另一個具體實施方案中，抗原作為2倍濃縮的混合物提供，其具有的TritonX-100濃度在0.005%-0.034%(重量/體積)的范圍內，在最終配制時必須用佐劑(或在對照制劑中用緩沖液)稀釋2倍。優(yōu)選地，流感病毒制備物在低水平硫柳汞存在下制備，或優(yōu)選地在沒有硫柳汞的情況下制備。優(yōu)選地，獲得的流感制備物在沒有有機汞防腐劑的情況下是穩(wěn)定的，具體地說，所述制備物不含殘余硫柳汞。具體地說，流感病毒制備物包含在沒有硫柳汞的情況下或在低水平硫柳汞(一般來說為5嗎/ml或以下)的情況下穩(wěn)定的血細胞凝集素抗原。具體地說，乙型流感毒^^朱的穩(wěn)定利用ot生育酚衍生物如a生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯，即VES)來實施。這種制備物及其制備方法公開于WO02/097072。優(yōu)選的組合物含3種失活的裂解病毒體抗原，它們由WHO推薦的適宜流感季的毒抹制備。優(yōu)選地，流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑包含在同一容器中。這被稱為'單瓶法，。優(yōu)選地，所述瓶為預填充注射器。在一個替代實施方案中，流感病毒或其抗原性制備物和水包油乳液佐劑包含在單獨的容器或瓶中，并在給予給受試者之前不久或給予給受試者時混合。這被稱為'雙瓶法'。作為實例，當疫苗為0.7ml總劑量體積的2組分疫苗時，濃縮抗原(例如濃縮三價失活裂解病毒體抗原)存在于1個瓶(335W)(抗原容器)中，預填充注射器含佐劑(360pl)(佐劑容器)。在注射時，使用含佐劑的注射器將含濃縮的三價失活裂解病毒體抗原的瓶中的內容物由瓶中取出，接著輕微混合注射器。在注射前，使用的針用肌內針替換，體積調整到530^11。一劑重配的佐劑化流感疫苗候選物相當于530^。本發(fā)明的優(yōu)選組合物包含具有CD4T細胞表位和任選的B細胞表位的抗原。HPV抗原在本發(fā)明的另一個方面，組合物包含源于人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，例如來自被認為導致生殖器疣的病毒(HPV6或HPV11等)，或者來自導致子宮頸癌HPV病毒(HPV16、HPV18等)。在一個方面，預防性或治療性組合物包含HPV16或18抗原。HPV16和HPV18的感染涉及癌癥的發(fā)展。本發(fā)明可使用不同HPV基因型的抗原組合，例如HPV16和HPV18抗原的組合，適宜地為VLP形式?？膳c16和/或18—起納入的其它VLP類型的抗原包括其它已知—引起癌癥的類型的抗原，例如HPV31、45、33、58和52。在一個方面，HPV抗原是Ll或L2抗原單體。在一個方面，本發(fā)明涉及與殼?；虿《緲宇w粒(VLP)—起存在的相同基因型的HPVLl和L2抗原的組合。在一個方面，HPV抗原是以VLP或殼粒結構形式存在的Ll蛋白(沒有L2抗原)。這類抗原、病毒樣顆粒和殼粒本身是已知的。參見例如WO94/00152,WO94/20137、WO94/05792和W093簡84。在一個方面，截短的Ll蛋白可用于本發(fā)明，例如作為在M)96/11272中公開的茶白。優(yōu)選地，使用Ll的C-末端截短物，例如HPV16的34個氨基酸C末端截短物，或其它HPV類型的等同截短物。在本發(fā)明的一個方面，組合物包含得自HPV16和HPV18連同HPV31和/或HPV45的HPV病毒樣顆?；驓ち５慕M合。在本發(fā)明的一個方面，組合物包含得自HPV16和HPV18連同HPV33和/或HPV58的HPV病毒樣顆?；驓ち５慕M合。在本發(fā)明的一個方面，組合物包含得自HPV16和HPV18的HPV病毒樣顆?；驓ち?，連同一種或多種引起癌癥的HPV類型的VLP或殼粒的組合，所述HPV類型例如為HPV31、33、45、52和58中的1種、2種、3種、4種或全部。本發(fā)明因此在一個方面涉及一種含HPV16、18、31和45的病毒樣顆粒的組合物，所述病毒樣顆粒與佐劑組合，所述佐劑含3DMPL和如本文所述的水包油乳液。在本發(fā)明的一個方面，組合物包含僅HPV16、18、31、33、45、52和58Ll的病毒樣顆?；驓ち５幕旌衔铩或L2蛋白可以融合蛋白的形式提供。特別適宜形式的生殖器疣預防或治療性組合物包含Ll顆?；驓ち：腿诤系鞍祝撊诤系鞍装环N或多種選自HPV6和HPV11蛋白的抗原，例如E6、E7、L1和L2。癌癥類型的HPV抗原可與生殖器疣類型的抗原組合，例如HPV16和/或18與HPV6和/或11。例如，設想了含HPV16、18、6和11的組合物。在本發(fā)明的一個方面，僅HPV16、18、31、33、45、52和58Ll的病毒樣顆?；驓ち５慕M合可用于和HPV6和/或HPV11的病毒樣顆粒或殼粒組合。在一個方面，可包含單獨或組合的早期蛋白，例如E7、E2或E5，或其可為融合蛋白；其實施方案包括含L1E7融合蛋白的VLP(WO96/11272)。在一個方面，融合蛋白是/^開于WO96/26277的L2E7或公開于GB9717953.5(PCT/EP98/05285)的D蛋白(l/3)-E7。在一個方面，HPV16抗原包含與D蛋白載體融合的早期蛋白E6或E7，以形成HPV16的D蛋白-E6或E7融合體，或其組合；或者E6或E7與L2的組合(WO96/26277)?；蛘撸琀PV16或18早期蛋白E6和E7可在一個分子中存在，例如D蛋白-E6/E7融合蛋白。這種組合物可任選包含HPV18的E6和E7之一或二者，例如為D蛋白-E6或D蛋白-E7融合蛋白或D蛋白E6/E7融合蛋白的形式。水包油乳液佐劑組分本發(fā)明的佐劑組合物包含水包油乳液佐劑，優(yōu)選地所述乳液包含可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%,并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1fim的直徑。為了使任意水包油組合物適于人給予，乳液系統(tǒng)的油相必須包含可代謝油。術語可代謝油的含義在本領域眾所周知?？纱x可定義為'能夠通過代謝被轉化，(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,第25版(1974))。所述油可為任意植物油、魚油、動物油或合成油，它們對接受者是無毒的，能夠通過代謝被轉化。堅果、種子和谷物是常用的植物油來源。合成油也是本發(fā)明的一部分，可包括商品化油，例如NEOBEE⑧等。特別合適的可代謝油是鯊烯。鯊烯(2,6,10,15,19,23-六曱基-2,6,10，14,18,22-二十四碳六烯)是一種不飽和油，大量存在于篁魚肝油中，少量存在于橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的油。鯊烯是可代謝油緣于以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(Merckindex,笫10版，編目流水號8619)。水包油乳液自身在本領域眾所周知，已表明可用作佐劑組合物(EP399843;WO95/17210)。適宜地，可代謝油以免疫原性組合物總體積的0.5%至20%(終濃度)的量存在，優(yōu)選以總體積的1.0%至10%的量存在，優(yōu)選以總體積的2.0%至6.0%的量存在。在一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0.5%、1%、3.5%或5%的最終量存在。在另一個具體實施方案中，可代謝油以免疫原性組合物總體積的約0.5%、1%、3.57%或5%的最終量存在。優(yōu)選地，本發(fā)明的水包油乳液系統(tǒng)具有亞孩么米范圍的小油滴粒度。適宜地，油滴的直徑大小在120-750nm的范圍內，更優(yōu)選直徑大小在120-600nm的范圍內。最優(yōu)選地，水包油乳液包含油滴，其至少70%(以強度計)的直徑低于500nm，更優(yōu)選至少80%(以強度計)的直徑低于300nm,更優(yōu)選至少卯％(以強度計)的直徑在120-200nm的范圍內。本發(fā)明的油滴粒度，即直徑，以強度給出。有幾種方法測定以強度計的油滴直徑大小。強度使用粒度測量儀檢測，適宜地通過例如MalvernZetasizer4000或優(yōu)選MalvernZetasizer3000HS的動態(tài)光散射檢測。詳細的方法在實施例n.2給出。第一個可能性是通過動態(tài)光散射(PCS-光子相關光語法)測定z平均直徑ZAD;該方法額外給出了多分散指數(shù)(PDI),ZAD和PDI這二者均用累積量算法計算。這些值不需要粒子折射率的信息。第二個方法是通過Contm或NNLS的另一種算法或自動化"Malvern"法(由粒度測量儀提供的默認算法)測定整體粒度分布來計算油滴直徑。多數(shù)情況下由于復雜組合物的粒子折射率是未知的，所以只能考慮強度分布，如果有需要，由該分布獲得強度平均值。水包油乳液包含甾醇。甾醇在本領域眾所周知，例如膽固醇是周知的，例如公開于MerckIndex,第11版，341頁，為動物脂肪中天然存在的甾醇。其它適宜的甾醇包括P-谷甾醇、豆甾醇、麥角甾醇、a-生育酚和麥角鈣化甾醇。所迷笛醇適宜地以免疫原性組合物總體積的0.01%至20%(重量/體積)的量存在，優(yōu)選以0.1%至5%(重量/體積)的量存在。優(yōu)選地，當甾醇為膽固醇時，其以免疫原性組合物總體積的0.02%至0.2%(重量/體積)的量存在，更優(yōu)選以0.5ml疫苗劑量體積的0.02%(重量/體積)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.07%(重量/體積)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的0.1%(重量/體積)的量存在。適宜地，甾醇是a-生育酚或其衍生物，例如a-生育酚琥珀酸酯(也稱為維生素E琥珀酸酯)。優(yōu)選地，a-生育酚以免疫原性組合物總體積的0.2%至5.0%(體積/體積)的量存在，更優(yōu)選以0.5ml疫苗劑量體積的2.5%(體積/體積)的量存在，或者以0.5ml疫苗劑量體積的0.5%(體積/體積)的量存在，或者以0.7ml疫苗劑量體積的1.7-1.9%(體積/體積)、優(yōu)選1.8%的量存在。為明晰起見，以體積/體積給出的濃度可通過應用以下轉換系數(shù)轉變?yōu)橐灾亓?體積表示的濃度5%(體積/體積)oc-生育酚濃度等于4.8%(重量/體積)a-生育酚濃度。水包油乳液還可含有乳化劑。以免疫原性組合物重量計(重量/重量)乳化劑可以0.01-5.0%的量存在，優(yōu)選以重量計(重量/重量)以0.1-2.0%的量存在。以總組合物的重量計(重量/重量)優(yōu)選的濃度為0.5-1.5%。乳化劑可適宜地為聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(Tween80)。在一個具體實施方案中，0.5ml疫苗劑量體積含1%(重量/重量)Tween80,0.7ml疫苗劑量體積含0.7%(重量/重量)Tween80。在另一個具體實施方案中，Tween80的濃度是0.2%(重量/重量)。水包油乳液佐劑可用于其它佐劑或免疫刺激劑，因此本發(fā)明的一個重要實施方案是含鯊烯或另一種可代謝油、a-生育酚和tween80的水包油制劑。水包油乳液還可包含span85和/或卵磷脂。典型地，水包油包含免疫原性組合物總體積的2-10%的鯊烯，2-10。/o的cx-生育酚和0.3-3%的Tween80,并可按照WO95/17210中描述的方法生產。優(yōu)選地，鯊烯:a-生育酚的比率等于或小于1,因為其提供了更穩(wěn)定的乳液。Span85(聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯)也可例如以1%的水平存在。3D國MPL組合物可包含另外的佐劑3脫-O-酰化單磷酰脂質A(3D-MPL)。3D-MPL是一種TRL-4配體佐劑，是脂質A的無毒衍生物。3D-MPL由Corixa公司以商標MPL⑧銷售，在整個文件中稱為MPL。主要促進具有IFNY(Thl)表型的CD4+T細胞應答。其可按照GB2220211A中公開的方法生產。在化學上，其是具有3、4、5或6條酰化鏈的3-脫酰單磷酰脂質A的混合物。優(yōu)選地，在本發(fā)明組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有的粒度使得其可通過0.22|um濾器除菌過濾。此制備描述于W094/21292和實施例II。3D-MPL可以例如每個組合物劑量1-100昭(重量/體積)的量使用，優(yōu)選以每個組合物劑量10-50jag(重量/體積)的量使用。3D-MPL的適宜量例如為每個組合物劑量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50昭(重量/體積)中的任一個。更優(yōu)選地，3D-MPL的量在每個組合物劑量25-75jig(重量/體積)的范圍內。通常，組合物劑量將在約0.5ml至約1ml的范圍內。典型的疫苗劑量為0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml或1ml。在一個優(yōu)選實施方案中，每ml疫苗組合物包含50fig3D-MPL的終濃度，或每0.5ml疫苗劑量包含25嗎3D-MPL的終濃度。在其它優(yōu)選實施方案中，每ml疫苗組合物包含35.7fig或71.4嗎3D-MPL的終濃度。具體地說，0.5ml疫苗劑量體積每劑含25昭或50昭3D-MPL。MPL的劑量適宜地能夠在人中增強針對抗原的免疫應答。具體地說，相比于無佐劑組合物，或相比于用另一種MPL量佐劑化的組合物，適宜的MPL量改善所述組合物的免疫效力，同時反應原性模式可接受。3DMPL為TRL-4配體，為脂質A的無毒衍生物。本發(fā)明設想使用其它合適的TRL-4配體替代3D-MPL,包括脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。還設想了脂質A的無毒衍生物，具體地說為單磷酰脂質A。合成的脂質A衍生物是已知的，其中一些被描述為TLR-4激動劑，其可能適用于本發(fā)明，包括但不限于OMl74(2-脫氧-6-o-p-脫氧J-[(R"-十二烷酰氧基四-癸?；被鵋-o-膦?；?p-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠-a-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-l,10-二醇,l,10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-l,10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO01/46127)用于本發(fā)明第一次接種的免疫原性組合物的免疫原性特性f'J組合物兩種組分中的一種(3D-MPL或水包油乳液佐劑)的對應組合物(本文稱為'普通組合物，)獲得的CD4T-細胞免疫應答，本發(fā)明組合物適宜地誘導抗至少一種組成抗原或抗原性組合物的改善的CD4T-細胞免疫應答。所述'改善的CD4T-細胞免疫應答，指在給予有佐劑免疫原性組合物之后在人類患者中獲得的CD4應答高于在給予無佐劑或沒有佐劑組合物兩種組分中的至少一種的相同組合物后獲得的免疫應答。例如，與給予含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物的免疫原性組合物之后誘導的應答相比，在給予含裂解流感病毒或其裂解流感抗原性制備物連同水包油乳液佐劑的免疫原性組合物時于人類患者中荻得較高的CD4T-細胞應答。這種制劑將有利地用于誘導抗流感病毒的CD4-T細胞應答，該應答能夠檢測由MHCII類分子提呈的流感表位。對于流感而言，優(yōu)選地，由本發(fā)明的佐劑化裂解流感病毒組合物誘導的所述免疫應答高于用任意其它無佐劑常規(guī)流感疫苗(例如亞單位流感疫苗或全流感病毒疫苗)誘導的免疫應答。具體地但非排它性地，所述'改善的CD4T-細胞免疫應答，在免疫學上"未初免的"患者(即對所述抗原為血清陰性的患者)中獲得。此血清陰性可能是從未面對這種抗原的所述患者(例如還沒有感染病毒或含所述抗原的細菌一所謂的'原初，患者)的結果，或者是在遭遇時不能對所述抗原應答的所述患者的結果。改善的CD4T-細胞免疫應答可通過;f企測產生任何以下細胞因子的細胞數(shù)來評價'產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFcc)的細胞'產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞'產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFN力的細胞'產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TNFoc、CD40L)的細胞'產生至少TNFoc和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFN力的細胞當和給予無佐劑組合物相比在給予有佐劑組合物后產生任何以上細胞因子的細胞的量較高時，將存在改善的CD4T-細胞免疫應答。通常，上文提及的5種狀況中的至少一種、優(yōu)選兩種將被實現(xiàn)。在一個具體實施方案中，與無佐劑組相比，有佐劑組中生產全部4種細胞因子的細胞將以更高量存在。由本發(fā)明佐劑化流感組合物賦予的改善的CD4T-細胞免疫應答實際上可在單次給予后獲得。例如在快速發(fā)展的爆發(fā)情況下單劑方法將有極為重大的意義。在某些情況下，尤其是對于老年人群，或者對于首次接種抗疾病如流感的小孩(9歲以下)，給予兩劑相同的該季組合物可能是有益的。第二劑所述相同組合物(仍被看作是'用于首次接種的組合物，)可在初始免疫應答正在發(fā)展的過程中給予，并有足夠的時間間隔。通常，第二劑組合物在首劑后數(shù)周或約1個月(例如2周、3周、4周、5周或6周)給予，以幫助觸發(fā)無應答或低應答個體的免疫系統(tǒng)。因此，本發(fā)明涉及含以下物質的組合物在生產免疫原性組合物中的用途(a)抗原，和(f)水包油乳液佐劑；和(g)3DMPL其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑，所述免疫原性組合物用于"l秀導抗所述抗原的改善的CD4T細胞應答。本發(fā)明還涉及一種諸導抗抗原的改善的CD4T細胞應答的方法，所述方法包括傳遞含以下物質的組合物(a)抗原，和(b)如本文定義的水包油乳液佐劑；和(C)3D-旨L。在一個具體實施方案中，與用無佐劑組合物或沒有佐劑組合物兩種組分中一種的組合物免疫的個體中請導的B記憶細胞應答相比，給予所述免疫原性組合物在給予有佐劑免疫原性組合物的患者中替代地或額外地誘導改善的B-記憶細胞應答。改善的B-記憶細胞應答意指在遭遇抗原時能夠分化為分泌抗體的漿細胞的外周血B淋巴細胞的頻率增加，這通過體外分化刺激檢測(參見實施例部分，例如ElispotB細胞記憶的方法)。在再另一個具體實施方案中，用有佐劑的首次接種用組合物接種對CD8應答無可檢測的影響。優(yōu)選地，所述改善的CD4T細胞應答在免疫應答受損受試者中荻得，例如老年個體，通常至少50、55、60或65歲或以上，或者具有高風險醫(yī)療狀況的55歲以下成人('高風險'成人)，或2歲以下的兒童。本申請人已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，含可代謝油、甾醇和乳化劑以及3DMPL的水包油乳液佐劑在免疫應答受損人群中有效促進T細胞應答。本申請人已表明，對于流感來說，根據在老年人群中進行抗流感再接種后流感疫苗保護作用的關聯(lián)性評價，與用無佐劑裂解疫苗接種相比，給予單劑如本發(fā)明所述的首次接種用免疫原性組合物能夠提供更好的血清保護作用。相比于無佐劑制劑獲得的免疫應答，要求保護的有佐劑制劑還能夠誘導抗流感病毒的改善的CD4T-細胞免疫應答。該觀察結果可能與^f妾種或面對流感抗原性接觸的感染時增加的應答性相關。而且，其還可能與交叉反應性相關，即對變體流感抹應答的能力較高。這種改善的應答可能在免疫受損的人群如老年人群(例如50、55、60、65歲和以上)以及尤其是高風險老年人群中特別有益。這可導致降低整體的發(fā)病率和死亡率，并防止肺炎和其它流感類疾病的緊急入院。這還可對嬰兒群體(5歲以下，優(yōu)選2歲以下)有益。而且，與用無佐劑制劑誘導的應答相比，其允許誘導時間更持久的CD4T細胞應答，例如在首次接種后1年仍存在。本發(fā)明人還已經能夠表明，相比于用無佐劑組合物獲得保護性抗體水平的個體，要求保護的有佐劑組合物能夠在更多的個體中不僅誘導而且保持抗疫苗中存在的全部3種毒抹的保護性抗體水平(例如參見表43)。因此，在再另一個實施方案中，要求保護的組合物能夠確?？沽鞲邢嚓P疾病的持續(xù)性免疫應答。具體地說，所述持續(xù)性指HI抗體免疫應答能夠在接種后至少3個月后、優(yōu)選至少6個月后滿足管理標準。具體地說，要求保護的組合物能夠在至少3個月后在〉70%的個體中、適宜地在>80%的個體中或適宜地在〉90%的個體中誘導針對疫苗中存在的至少一種流感^^朱、優(yōu)選所有毒株的保護性抗體水平。在一個具體方面，在接種后至少6個月獲得抗疫苗組合物中存在的至少一種、適宜地兩種或全部毒抹的〉90%的保護性抗體水平。采用流感得到的這些觀察結果適用于其它疾病和抗原，因為其已表明還用于HPV抗原(參見實施例XIII)。因此，本發(fā)明還涉及本發(fā)明組合物在免疫應答受損的人類個體途，所述免疫原性組合物用于接種免疫應答受損的人類個體或群體，例如高風險成人或老年群體。我們已確定，使用抗原連同本文定義的水包油乳液可產生針對變體抗原的交叉反應性應答。優(yōu)選地，CD4T-細胞免疫應答，例如在未初免受試者中獲得的改善的CD4T-細胞免疫應答，包括誘導交叉反應性CD4T輔助應答。具體地說，增加交叉反應性CD4T細胞的量。所述'交叉反應性'CD4應答指CD4T-細胞靶向流感抹之間的共有表位。對于流感而言，例如，可用的流感疫苗通常僅有效對抗具有相似抗原性特征的血細胞凝集素的流感病毒感染抹。當感染(循環(huán))性流感病毒已經歷了表面糖蛋白(具體地說是血細胞凝集素)的微小變化(例如點突變或點突變的累積，導致例如氨基酸改變)時(抗原漂移變體病毒抹)，疫苗仍可提供一些保護作用，但其可能僅提供有限的保護作用，因為新產生的變體可能逃脫先前流感感染或接種誘導的免疫性。抗原漂移是兩次大流行期間發(fā)生的年度流行的原因(Wiley&Skehel,1987,Ann.Rev.Biochem.56,365-394)。交叉反應性CD4T細胞的誘導為本發(fā)明組合物提供了額外的優(yōu)勢，因為其還可提供交叉保護作用，換句話說是抗異源感染的保護作用，所述異源感染即由為免疫原性組合物中包含的流感病毒抹的變體(例如漂移變體)的循環(huán)流感病毒林引起的感染。這在循環(huán)毒抹難以在卵中繁殖或難以在組織培養(yǎng)物中生產時可能是有利的，使漂移株用作備選工作抹。這在受試者以幾個月或一年間隔接受第一次和第二次接種時也可能有利，用于第二次免疫的免疫原性組合物中的流感株是用于首次接種的組合物中使用的毒抹的漂移變體抹。在實施例3中給出的臨床前數(shù)據例如顯示了根據體溫讀數(shù)確定的本發(fā)明組合物抗異型流感感染和疾病的保護能力。在再接種研究中獲得的臨床實驗數(shù)據適用相同的結論。在本發(fā)明的另一方面，提供本發(fā)明組合物抗由病原體引起的感染或疾病的保護作用的用途，所述病原體是由其獲得第一種組合物中抗原的病原體的變體。還提供本發(fā)明組合物抗由病原體引起的感染或疾病的保護作用的結果，所述病原體包含為本發(fā)明組合物中抗原的變體的抗原。變體病原體和/或抗原適宜地與第一種病原體和/或抗原具有共同的CD4T細胞表位和/或B細胞表位，但它們不完全相同。^叉^:^嫂cd4r-敘應的發(fā)^/「辨如4^^感瘦芬凝^#」在給予經典的三價流感疫苗后(3周)，對抗原性毒抹制備物(全病毒或裂解抗原)應答的外周血CD4T-細胞的頻率顯著增加，所述抗原性毒抹制備物與疫苗中存在的一種抗原(H3N^A/巴拿馬/20(H/99;H1N1:A/新?？屠锒嗄醽?20/99;B:B/山東/7/97)(參見實施例III)同源。如果用分類為漂移株(H3N2:A/悉尼/5/97，H1N1:A/北京/262/95,B:B/山梨/166/98)的流感抹再刺激外周血CD4T-細胞,則可以見到相當大的頻率增加。相反，如果由本領域的專家用分類為轉換抹(H2N2:A/新加坡/1/57;H9N2:A/香港/1073/99)的流感抹再刺激外周血CD4T-細胞,則在接種后沒有可觀測的增加。能夠同時識別同源和漂移的流感株的CD4T-細胞在本文件中已命名為"交叉反應性"。已在人中鑒別出不同流感抹共有的CD4T-細胞表位(GelderC等,1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497陽506)。在一個具體實施方案中，有佐劑組合物可提供額外利益，該利益提供了抗循環(huán)毒抹的更好保護作用，所述循環(huán)毒抹經歷了血細胞凝集素的大改變(例如基因重組，例如兩個不同物種之間的基因重組)(抗原轉變)，目前可用疫苗對其無效。其它佐劑組合物可包含另外的佐劑，適宜地例如為TRL-4配體佐劑或脂質A的無毒衍生物。適宜的TLR-4配體為脂多糖(LPS)和衍生物、MDP(胞壁酰二肽)和RSV的F蛋白。合成的脂質A衍生物是已知的，其中一些被描述為TLR-4激動劑，其包括但不限于OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基四-癸?；被鵠-4-0-膦酰基-(3-0-他喃葡糖基]-2-[(11)-3-羥基四癸?；被鵠-01-D-吡喃葡糖基二氫磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸酰基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基四癸?；被鵠癸-l,10-二醇,l,10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基四癸?；被鵠-4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基四癸酰基氨基]癸-l,10-二醇，1-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸)(WO01/46127)其它合適的TLR-4配體例如為脂多糖及其衍生物、胞壁酰二肽(MDP)和呼吸道合胞體病毒的F蛋白。用于本發(fā)明的另一種合適的免疫刺激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是分離自南美奎拉雅屬急樹(2"http://^/力Sapo"ahaAfo/^a)的急苷制備物，首先由Dalsgaard等在1974年描述("Saponinadjuvants",Archiv.fiirdiegesamteVimsforschung,44巻,SpringerVerlag,Berlin,243-254頁)具有佐劑活性。已通過HPLC分離了QuilA的純化片段，其保留了佐劑活性，沒有與QuilA相關的毒性(EP0362278),例如QS7和QS21(也稱為QA7和QA21)。QS-21是一種來源于查拉雅屬急樹(Qw7q/'aSapowan'aMo/Zwa)樹皮的天然急香，其i秀導CD8+細胞毒性T細胞(CTL)、Thl細胞和主要的IgG2a抗體應答，在本發(fā)明范圍內是優(yōu)選的皂苷。業(yè)已描述了QS21的具體制劑，它們是特別優(yōu)選的，這些制劑還包含甾醇(W096/33739)。構成本發(fā)明一部分的鬼苦可為水包油乳液形式(WO95/17210)。再接種本發(fā)明的一個方面提供抗原在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用抗原或其片段或變體與3DMPL和如本文定義的水包油乳液佐劑接種的人。通常，再接種于首次接種后至少6個月進行，優(yōu)選8-14個月后進行，更優(yōu)選約10-12個月后進行。優(yōu)選地，提供以下物質在生產免疫原性組合物中的用途(1)抗原和(2)水包油乳液佐劑MPL和如本文定義的水包油乳'液佐劑4妄種的人。優(yōu)選地，提供以下物質在生產免疫原性組合物中的用途(1)抗原和(2)水包油乳液佐劑，和(3)3D旨LMPL和如本文定義的水包油乳液佐劑接種的人。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供以下物質在生產免疫原性組合物中的用途(1)抗原和(2)水包油乳液佐劑，和(3)3DMPL所述免疫原性組合物用于再接種先前用所述抗原或其片段或變體接種的人。在一個具體實施方案中，用于再接種的組合物適宜地與用于首次接種的組合物共有共同的CD4T-細胞表位。就此方面而言，其被看作是用于首次接種的抗原的變體。用于再接種的免疫原性組合物(加強組合物)可包含與用于首次接種的免疫原性組合物相同類型的抗原制備物，例如亞單位/裂解/全失活病毒。或者，加強組合物可包含另一種類型的抗原制備物。例如，對于流感而言，首次接種可用裂解制備物，加強接種采用另一種失活的流感抗原，例如失活的全病毒或純化的HA和NA(亞單位疫苗)。加強組合物可有佐劑或無佐劑。對于流感而言，無佐劑的加強組合物可為肌內給予的Fluarix/(x-Rix。所述制劑包含3種由WHO推薦的適宜流感季毒^5^制備的失活裂解病毒體抗原。變體可為與用于首次接種的抗原性組合物共有共同的CD4T-細胞表位(一般被認為是由T細胞受體識別和結合的抗原性決定簇)的抗原，但其與該抗原性組合物不完全相同。變體可為與用于首次接種的抗原性組合物共有共同的B-細胞表位(一般被認為是由B細胞受體識別和結合的抗原性決定簇)的抗原，但其與該抗原性組合物不完全相同。T細胞和B細胞表位可卩吏用本領域眾所周知的技術預測，或者使用本文描述的技術由免疫應答推斷。所述水包油乳液佐劑優(yōu)選包含至少一種可代謝油，其量為總體積的0.5%-20%，并具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有低于1,的直徑。在一個具體實施方案中，用于再接種的免疫原性組合物(下文也稱為'加強組合物，)包含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物，它們與用于首次接種的裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細月包表位。一般來說，對于所有抗原來說，共同的CD4T-細胞表位意指可由相同的CD4細胞識別的不同抗原的肽/序歹']/表位(參見例如以下描述的表位GelderC等,1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等，1996JVirol.70(7):4787-90;GelderCM等，1995JVirol.199569(12):7497-506)。在流感背景下，在一個優(yōu)選實施方案中，流感抹可與大流行爆發(fā)相關，或具有與大流行爆發(fā)相關的潛力。具體地說，當疫苗是多價疫苗如二價疫苗或三價疫苗時，至少一種毒抹與大流行爆發(fā)相關，或者具有與大流行爆發(fā)相關的潛力。合適的毒;f朱為但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。通常，加強組合物在使用時于下一個流感季給予，例如在第一個免疫原性組合物之后約1年給予。加強組合物還可隨后每年給予(第三次、第四次、第五次接種等)。加強組合物可與笫一種組合物相同。適宜地，加強組合物包含毒抹或得自其的抗原性制備物，所述毒抹為用于首次接種的流感病毒的變體抹。用于再接種的流感抗原或抗原性組合物優(yōu)選包含佐劑或適宜地如上所述的水包油乳液。所述佐劑可為如上文所述的水包油乳液佐劑，其是優(yōu)選的，任選地包含額外的佐劑，例如TLR-4配體，如3D-MPL或皂苷，或者可為另一種合適的佐劑，例如鋁。對于本發(fā)明的所有抗原來i兌，相比于用無佐劑裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物笫一次接種后誘導的對等應答，再接種誘導以下的任一個、優(yōu)選兩個或全部'.(i)抗流感病毒或其抗原性制備物的改善的CD4應答，或(ii)改善的B細胞記憶應答或(iii)改善的體液應答。優(yōu)選地，用本文定義的有佐劑裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物再接種后誘導的免疫應答高于用無佐劑組合物再接種后誘導的對應應答。優(yōu)選地，在用有佐劑裂解流感病毒組合物首次接種的人群中，用無佐劑流感病毒、優(yōu)選裂解的流感病毒再接種后誘導的免疫應答高于在用無佐劑裂解流感病毒組合物首次接種的人群中的對應應答。在本發(fā)明的另一方面，提供以下物質在生產免疫原性組合物中的用途(1)來自笫一病毒抹或細菌菌抹的抗原，和(2)水包油乳液佐劑(3)3DMPL所述免疫原性組合物用于抗由病毒抹或細菌菌株引起的感染或疾病的保護作用，所述病毒抹或細菌菌株是所述第一病毒抹或細菌菌抹的變體。例如，對于流感而言，與對照疫苗賦予的保護作用相比，本發(fā)明的佐劑化組合物能夠誘導更好的抗漂移抹(下一流感季的流感抹)的保護作用。流感病毒林及其抗原對于含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物的組合物來說，所述組合物適宜地為單價的或多價的，例如二價或三價或四價。優(yōu)選地，裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物是三價的或四價的，具有來自3種不同流感毒4朱的抗原。任選地，至少一種毒株與大流行爆發(fā)相關，或者具有與大流行爆發(fā)相關的潛力。作為背景，在大流行之間的時間段內，與之前大流行的流感病毒相關的流感病毒傳播。病毒以和生命早期感染不同的免疫性水平在人之間傳播。在通常2-3年的時間段內，這種傳播促進對已改變得足以在一般群體中再引起流行病的新毒抹的選擇；此過程稱為'抗原漂移，。'漂移變體，在任一年中在不同的社區(qū)、地區(qū)、國家或洲都具有不同影響，盡管在幾年內其總體影響經常是相似的。換句話說，當出現(xiàn)人群對其沒有免疫性的新流感病毒時，發(fā)生流感大流行。典型的流感大流行引起肺炎和下呼吸道疾病的發(fā)病率增加，證據是住院率或死亡率增加。老年人或患有基礎性慢性疾病的人最有可能體驗此并發(fā)癥，而幼兒也可能患嚴重疾病。在不可預見的間隔內出現(xiàn)新流感病毒，其具有與之前季節(jié)流行的毒抹完全不同亞型的關鍵表面抗原血細胞凝集素。此時，產生的抗原可以先前于人中循環(huán)的毒株的對應蛋白的20%至50%變化。這可導致病毒逃逸'群體免疫，，并建立大流行。此現(xiàn)象叫做'抗原轉換，。一般認為，至少在過去已發(fā)生了大流行，當時不同物種的流感病毒如禽或豬流感病毒已穿過種間屏障。如果這些病毒具有人與人之間傳播的潛力，它們可在數(shù)月至一年內全球擴散，導致大流行。例如，在1957年(亞洲流感大流行)，H2N2亞型取代了H1N1病毒，H1N1病毒至少從首先分離到該病毒的1918年開始就在人群中循環(huán)。H2HA和N2NA在1957年至1968年之間經歷了抗原漂移，直至HA在1968年(香港流感大流行)被出現(xiàn)的H3N2流感病毒亞型替代，此后N2NA連同H3HA繼續(xù)漂移(Nakajima等，1991,Epidemiol.Infect.106,383-395)。給予其引起大流行爆發(fā)潛力的流感病毒株特征是與當前循環(huán)抹中的血細胞凝集素相比其包含新血細胞凝集素，其可伴有或不伴有神經氨酸酶亞型的改變；其能夠在人群中水平傳播；其對人是致病的。新血細胞凝集素可為長時間段內(可能數(shù)十年)在人群中還不明顯的血細胞凝集素，例如H2?；蛘咂淇蔀橹斑€沒有在人群中循環(huán)的血細胞凝集素，例如存在于鳥中的H5、H9、H7或H6。在任一種情況下，大部分或至少大比例的乃至整個群體以前都沒有遇到抗原，在免疫學上對抗原是原初態(tài)的。一般來說，在大流行環(huán)境下，某些群體被流感感染的風險增加。老年人、慢性疾病患者和小孩尤其易感，但許多年輕人和表面上健康的人也有風險。對于H2流感，1968年后出生的部分群體的風險增加。對這些群體重要的是盡快地和以簡單的方式有效地保護。風險增加的另一個人群是旅行者。今天，人們比以往任何時候都更常旅行，出現(xiàn)最多新病毒的地區(qū)中國和東南亞在近些年已成為受歡迎的旅行目的地。傳播模式的這種改變能使新病毒在約數(shù)周內而不是數(shù)月或數(shù)年內到達全球。因此，對于這些人群來說，在大流行情況下或潛在大流行的情況下特別需要接種保護來對抗流感。適宜的毒抹是但不限于H5N1、H9N2、H7N7、H2N2和H1N1。任選地，所述組合物可包含3價以上，例如兩種非大流行毒抹加一種大流行毒林?；蛘?，所迷組合物可包含3種大流行毒抹。在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種接種方案，其中首次接種使用含至少一種流感毒抹的裂解流感組合物進行，其中所述流感毒林可潛在地引起大流行爆發(fā)，再接種用流行抹或者經典株的循環(huán)毒抹進行。HA中的CD4表位此抗原漂移主要存在于病毒表面蛋白血細胞凝集素(HA)和神經氨酸酶(NA)的表位區(qū)。已知病毒用于逃避宿主免疫系統(tǒng)的適應性應答的不同流感林之間CD4和B細胞表位的任意差異都將在流感接種中起重要作用，并確實如此。已在人中鑒別出不同流感才朱共有的CD4T-細胞表位(參見例如GelderC等,1998,IntImmunol.10(2):211-22;GelderCM等,1996JVirol.70(7):4787-90;和GelderCM等，1995JViroi.199569(12):7497-506)。在一個具體的實施方案中，再接種使用含流感病毒或其抗原性制備物的加強組合物進行，所述流感病毒或其抗原性制備物與用于第一次接種的裂解流感病毒抗原或其裂解病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。因此，本發(fā)明涉及含裂解流感病毒或其裂解病毒抗原性制備物和如本文定義的水包油乳液佐劑以及3DMPL的免疫原性組合物在生產多劑量疫苗的首次接種組分中的用途，所述多劑量疫苗還包含作為加強劑量的流感病毒或其抗原性制備物，它們與第一次接種時所給予劑量的裂解流感病毒抗原或其裂解病毒抗原性制備物共有共同的CD4T-細胞表位。接種本發(fā)明的組合物可通過任意合適的傳遞途徑給予，例如皮內、粘膜如鼻內、口服、肌內或皮下。其它傳遞途徑在本領域眾所周知。肌內傳遞途徑對佐劑化流感組合物是優(yōu)選的。皮內傳遞是另一個適宜的途徑。任意合適的裝置都可用于皮內傳遞，例如在US4,886，499、US5,190，521、US5，328,483、US5,527,288、US4,270,537、US5,015,235、US5,141,496、US5,417,662中描述的短針裝置。皮內疫苗還可通過限制針進入皮膚的有效穿透長度的裝置給予，例如描述于WO99/34850和EP1092444的裝置及其功能等同物，這兩個文獻通過引用結合到本文中。快速注射裝置也是適宜的，其經液體快速注射器或經刺穿角質層并產生到達真皮的射流的針傳遞液體疫苗至真皮?？焖僮⑸溲b置描述于例如US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993，412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520，639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。噴射粉末/顆粒傳遞裝置也是適宜的，其使用壓縮氣體加速粉末形式的疫苗通過皮膚外層至真皮。另外，常規(guī)注射器可用于皮內給予的經典結核菌素皮內試驗法。另一個合適的給予途徑是皮下途徑。任意合適的裝置都可用于皮下傳遞，例如經典的針。優(yōu)選地，使用例如在WO01/05453、WO01/05452、WO01/05451、WO01/32243、WO01/41840、WO01/41839、WO01/47585、WO01/56637、WO01/58512、WO01/64269、WO01/78810、WO01/91835、WO01/97884、WO02/09796、WO02/34317中公開的無針快速注射器服務。更優(yōu)選地，所述裝置用液體疫苗制劑預填充?；蛘撸呙绫莾冉o予。典型地，疫苗局部給予于鼻咽部，優(yōu)選沒有吸入到肺中。理想的是使用將疫苗制劑傳遞入鼻咽部而沒有或基本沒有使其進入肺中的鼻內傳遞裝置。本發(fā)明疫苗的優(yōu)選鼻內給予裝置是噴霧裝置。適宜的商用鼻噴霧裝置包括Accuspray(BectonDickinson)。霧化器產生非常細小的霧滴，其可被輕易地吸入到肺中，因此不能有效到達鼻粘膜。因此不優(yōu)選霧化器。用于鼻內用途的優(yōu)選噴霧裝置的性能與使用者提供的壓力無關。這些裝置稱為壓力域裝置。只有在提供臨界壓力時才由噴嘴釋放液體。這些裝置更容易獲得液滴大小規(guī)則的噴霧。適用于本發(fā)明的壓力域裝置在本領域是已知的，描述于例如WO91/13281和EP311863B和EP516636,這些文獻通過引用結合到本文中。這種裝置可由PfeifferGmbH購買，還描述于Bommer,R.PharmaceuticalTechnologyEurope,1999年9月。優(yōu)選的鼻內裝置產生的液滴(使用水作為液體檢測)范圍為1-200fim,優(yōu)選10-120pm。小于10jim存在吸入風險，因此理想的是10以下的液滴不超過約5%。120jam以上的液滴擴散得不如較小的液滴好，所以理想的是120以上的液滴不超過約5%。雙劑量傳遞是用于本發(fā)明疫苗的鼻內傳遞系統(tǒng)的又一優(yōu)選特征。雙劑量裝置包含單劑疫苗的兩個亞劑量，每個鼻孔給予一個亞劑量。一般來說，兩個亞劑量存在于一個容器中，裝置的構造允許每次有效傳遞單個亞劑量。任選地，可使用單劑量裝置給予本發(fā)明疫苗。或者，本發(fā)明還設想了表皮或經皮接種途徑。在本發(fā)明的一個具體方面，首次給予的有佐劑免疫原性組合物可肌內給予，有佐劑或無佐劑的加強組合物可通過不同途徑給予，例如皮內、皮下或鼻內。在另一個具體實施方案中，首次給予的組合物可包含每個流感毒抹15ng的標準HA含量，加強組合物可包含低劑量的HA,即低于15iag，并根據給予途徑可以較小體積給予。接種群體接種的目標群體優(yōu)選為人群體或個體。接種的目標群體可為免疫應答受損的人。和健康成人相比，免疫應答受損的人一般不能很好地對抗原、尤其是流感抗原應答。優(yōu)選地，目標群體是未對流感初免的群體，他們或者是原初態(tài)的(例如相對于大流行毒抹)，或者先前對感染或接種不能應答。優(yōu)選地，目標群體是老年人，適宜地為55歲和以上，較年輕的高風險成人(即18-54歲)，例如在保健機構工作的人，或者具有高風險因素如心血管病和肺病或糖尿病的年輕成人。另一個目標群體是所有6個月和以上的兒童，尤其是6-23個月齡的兒童，他們經歷了相對高的流感相關住院率。優(yōu)選地，目標群體是65歲以上的老年人。接種方案、給藥和附加的效力標準各疫苗劑量中糖類(或其綴合物)抗原的量應選擇為在通常的疫苗中能誘導免疫保護性應答而又不引起明顯有害副作用的量。此量將隨使用的具體免疫原和其存在的方式而變化。通常，期望每個劑量含0.1-100iug糖類，優(yōu)選0.1-50貼，優(yōu)選0.1-10昭，其中1-5昭為最優(yōu)選的范圍。疫苗中蛋白抗原的含量通常為1-100pg的范圍內，優(yōu)選5-50嗎，最常用的范圍為5-25嗎。特定疫苗的成分最佳量可通過標準研究確定，標準研究包括觀察受試者中的適宜免疫應答。在初始接種后，受試者可接受間隔足夠的一次或幾次加強免疫。疫苗制^！^-"^殳4苗述于VaccineDesign("Thesubunitandadjuvantapproach"(PowellM.F.和NewmanM.J.編輯)(1995)PlenumPressNewYork)。Fullerton的美國專利4,235,877描述了脂質體中的囊化。流感抗原劑量對于流感來說，適宜地，本發(fā)明的免疫原性組合物在大部分情況下為標準0.5ml注射劑量，據據單輻射免疫擴散(SRD)(J.M.Wood等J.Biol.Stand.5(1977)237-247;J.M.Wood等,J.Biol.Stand.9(1981)317-330)檢測，含各個流感抹的15)Lig血細胞凝集素抗原組分。適宜地，疫苗劑量體積在0.5ml至1ml之間，具體地說是標準0.5ml或0.7ml疫苗劑量體積。根據原液樣品中的HA濃度，可常規(guī)地輕微調整劑量體積。適宜地，所述免疫原性組合物含低劑量的HA抗原一例如每流感株1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14嗎HA中的任一種。適宜的低劑量HA在每流感抹1-7.5iugHA之間，適宜地在每流感株3.5-5jagHA之間，例如每流感林3.75figHA，典型地約每流感才朱5HA。有利地，本發(fā)明的疫苗劑量，尤其是低劑量疫苗，可以比一般為每劑約0.5、0.7或1ml的常規(guī)注射裂解流感疫苗小的體積提供。本發(fā)明的小體積劑量優(yōu)選每劑不到500pl，更優(yōu)選每劑不到300pi,最優(yōu)選每劑不超過約200^或以下。因此，按照本發(fā)明一個方面，優(yōu)選的小體積疫苗劑量是在小體積中具有低抗原劑量的劑量，例如在約200^體積中有約15叫或約7.5昭HA或約3.0嗎HA(每毒林)。本發(fā)明的流感藥物優(yōu)選滿足疫苗的某些國際標準。國際上提出了檢測流感疫苗效力的標準。在下表1中顯示了有效抗流感的歐盟官方標準。理論上，為滿足歐盟要求，對疫苗中包含的所有流感林來說，流感疫苗僅需滿足表中的一項標準。本發(fā)明的組合物適宜地滿足這些標準中的至少一項。然而，在實踐中，所有病毒林必須滿足所述標準中的至少兩項或全部三項，特別是對于新型疫苗(例如經不同途徑傳遞的新型疫苗)而言。在某些情況下，兩項標準可能足夠了。例如，可以接受所有病毒抹滿足三項標準中的兩項，而部分但不是全部病毒抹滿足第三項標準(例如三種病毒株中的兩種)。對成年人群體(18-60歲)和老年人群體(大于60歲)的要求是不同的。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>*血清陽轉率定義為接種后針對每種疫苗株的血清血細胞凝集素抑制(HI)滴度增加達至少4倍的接種者的百分率。**轉變因子定義接種后針對每種疫苗抹的血清HI幾何平均滴度(GMT)的增加倍數(shù)。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗抹的)血清HI滴度等于或高于1:40的接種者的百分率，通?？杀豢醋髦甘颈Ｗo作用。再一方面，本發(fā)明提供一種針對疾病設計疫苗的方法，該疾病已知要通過CD4+T細胞活化治愈或治療，該方法包括1)選擇含CD4+表位的抗原，和2)組合所述抗原和在上文定義的水包油乳液佐劑與3DMPL,其中所述疫苗在所述哺乳動物中給予時能夠在所述哺乳動物中誘導增強的CD4T細胞應答。本申請的所有參考文獻(包括專利申請和已授予專利)的教導都完全通過引用結合到本文中。為避免疑惑，本發(fā)明人意圖為本文的術語'包含，在每種情況下都任選地可^皮術語"由……組成"替代。本發(fā)明將參考以下的非限制性實施方案進一步描述實施例I描述了在小鼠、雪貂和人研究中使用的免疫解讀方法。實施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐劑制劑的制備和表征。實施例HI描述了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行的臨床實驗。實施例IV描述了第二個臨床實驗一再接種實驗一在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行。實施例V顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究I和研究11)。檢測溫yiJ!i測、病毒脫落和CD4T-細胞應答。實施例VI顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在C57BI/6原初小鼠和初免小鼠中的臨床前評價。實施例VII顯示了有佐劑和無佐劑的裂解和亞單位流感疫苗在用異源毒林初免的C57BI/6小鼠中的臨床前評價。實施例VIII描述了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03佐劑、AS03+MPL佐劑或沒有外源佐劑。實施例IX顯示了有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究ni)。檢測溫度監(jiān)測、病毒脫落和HI滴度。實施例X顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗在90天和180天時的免疫原性持久性數(shù)據，所述制備物含AS03，有或沒有MPL佐劑。實施例XI顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03和MPL佐劑。實施例XII顯示了在65歲以上老年人群中用含裂解流感抗原制備物的疫苗進行的臨床實驗，所述制備物含AS03和兩個濃度的MPL佐劑。實施例XIII顯示了兩種有佐劑HPV疫苗在小鼠中的臨床前評價。檢測抗體和B細胞記憶應答。實施例I-免疫解讀方法I丄小鼠法使用血凝反應抑制測試(ffl)測定針對3種流感病毒抹的抗血細胞凝集素抗體滴度。ffl測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。熱失活血清預先用高嶺土和小雞RBC處理，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感株溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數(shù)。由于血清的第一個稀釋度是1:20,所以不可檢測水平記錄為等于10的滴度。遂##為、浙使用UNISTAT對接種后的ffl滴度進行統(tǒng)計學分析。用于分析方差的方法可如下簡述國數(shù)據的對數(shù)轉換國對各個群體(組)進行的Shapiro-Wilk檢驗，以便驗證組分布的正態(tài)性■Cochran檢驗，以便確定不同群體(組)之間的方差均一性國對各組進行的雙因素方差分析醒用于多重比較的TukeyHSD檢驗1丄2.月包內細月包因子染色該技術允許根據細胞因子生產定量抗原特異性T淋巴細胞效應子T細胞和/或生產IFN-y的效應子-記憶T細胞和/或生產IL-2的中樞記憶性T細胞。在免疫后7天收集PBMC。在分泌性抑制劑(Brefeldine)存在下體外再刺激淋巴樣細胞。然后使用熒光抗體(CD4、CD8、IFN-y和IL-2)通過常規(guī)免疫熒光法處理這些細胞。結果表示為CD4/CD8T細胞中細胞因子陽樣的細胞的頻率。在第二次免疫后7天對PBMC進行T細胞的胞內細胞因子染色。由小鼠收集血液，并合并在肝素化培養(yǎng)基RPMI+添加物中。對于血液，RPMI+添加物稀釋的PBL懸浮液按照推薦的方法(于室溫以2500rpm離心20分鐘)在Lympholyte-Mammal梯度上分層。去除分界面處的單核細胞，用RPMI+添加物清洗2次，用RPMI5%胎牛血清將PBMC懸浮液調整至2xl(^個細胞/ml。用WholeFI(1jugHA/毒才朱)以lxl()7個細胞/ml(管式FACS)的終濃度對PBMC進行體外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均為1pg/ml)的情況下于37。C溫育2小時。在抗原再刺激步驟后，在Brefeldin(1叫/ml)存在下于3TC過夜溫育PBMC,以抑制細胞因子分泌。IFN-y/IL-2/CD4/CD8染色如下進行清洗細胞懸浮液，重懸浮在含2%Fc封閉試劑(l/50;2.4G2)的50plPBS1%FCS中。于4'C溫育10分鐘后，加入抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的50|ul混合物，于4。C溫育30分鐘。在PBS1%FCS中清洗后，通過重懸浮在200piCytofix-Cytoperm(KitBD)中并于4。C溫育20分鐘使細胞透化。然后用PermWash(KitBD)清洗細胞，并用以PermWash稀釋的抗-IFN-yAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)的50混合物重懸浮。于4'C溫育最少2小時最長過4艾后，用PermWash清洗細胞并重懸浮在PBS1%FCS+l。/。多聚曱醛中。通過FACS進行樣品分析。門控(FSC/SSC)活細胞，對CD4+T細胞上的約20,000事件(淋巴細胞)或35,000個事件進行探測。針對CD4+和CD8+門控的群計算IFN-"或IL2+的百分率。1.2.雪貂法1.2丄血凝反應抑制測試(HI)滿餅使用血凝反應抑制測試(ffl)測定針對3種流感病毒抹的抗血細胞凝集素抗體滴度。ffl測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。血清首先用25。/。神經氨酸酶溶液(RDE)處理，并熱失活，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感林溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數(shù)。由于血清的第一個稀釋度是1:10,所以不可檢測水平記錄為等于5的滴度。誕坩夢為V^f使用UNISTAT對HI滴度(41天，攻擊前)進行統(tǒng)計學分析。用于分析方差的方法可如下簡述園數(shù)據的對數(shù)轉換國對各個群體(組)進行的Shapiro-Wilk檢驗，以便驗證組分布的正態(tài)性■Cochran檢驗，以便確定不同群體(組)之間的方差均一性國對單因素ANOVA的交互作用的檢驗醒用于多重比較的TukeyHSD檢驗1.2.2.體溫監(jiān)測在攻擊期間用傳感器并通過遙測法記錄監(jiān)測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹月空之前通過DSI(DataSciencesInternational,Centaumsweg123,5015TCTilburg,TheNetherlands)進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圏養(yǎng)在單獨的籠中。在攻擊前4天直至攻擊后7天每15分鐘記錄溫度。1.2.3.鼻清洗通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養(yǎng)皿中，并置于干冰上的樣品容器中。,,遂濕^病"#諒定所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染物。將50pl連續(xù)10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50jil培養(yǎng)基(IO孔/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100^MDCK細胞(2.4xlOS個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育5-7天。在5-7天溫育后，小心地取出培養(yǎng)基，加入100fil含1/20WST-1的培養(yǎng)基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色曱臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數(shù)成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞OD士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。1.3.評價人中免疫應答的測定1.3.1.血凝反應抑制測定使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta,USA(1991)描述的方法通過檢測HI抗體測定免疫應答。使用4個血凝反應抑制單位(4HIU)的適宜抗原和0.5%禽紅細胞懸浮液，用標準的和綜合驗證過的微量法對融化的冷凍血清樣品進行抗體滴度檢測。通過熱處理和受體破壞酶去除非特異性血清抑制劑。評價所荻血清的HI抗體水平。以1:10起始稀釋度開始制備連續(xù)稀釋度(乘以因數(shù)2),直至最終稀釋度1:20480。將顯示完全抑制(100%)血凝反應的最高稀釋度步驟視為滴定終點。所有實驗都以雙份進行。1.3.2.神經氨酸酶抑制測定在包被胎球蛋白的微量滴定板中進行測定。制備2倍連續(xù)稀釋的抗血清，與標準化量的曱型流感H3N2、H1N1或乙型流感病毒混合。測試基于由胎球蛋白酶促釋放神經氨酸的神經氨酸酶生物活性。在切下末端神經氨酸后，(3-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖暴露出來。向各孔加入來自落花生的辣根過氧化物酶(HRP)標記的花生凝集素，其特異性結合半乳糖結構?？稍谂c四曱基聯(lián)苯胺(TMB)的底物反應中檢測和定量結合凝集素的量。表明仍抑制病毒神經氨酸酶活性達至少50%的最高抗體稀釋度為NI滴度。1.3.3.中和抗體測定對融化的冷凍血清樣品進4亍中和抗體才企測。包含在血清中的抗體的病毒中和以微量中和實驗來測定。血清在實驗中無需進一步處理即可使用。各個血清以三重測定進行測試。將標準化量的病毒與連續(xù)稀釋的血清混合并溫育，以使抗體結合病毒。然后將含限定量的MDCK細胞的細胞懸浮液加入病毒和抗血清的混合物中，于33。C溫育。在溫育期后，通過小雞紅細胞的凝集反應顯現(xiàn)病毒復制。利用ReedandMuench的方法計算血清的50%中和滴度。1.3.4.通過細胞因子流式細胞儀(CFC)評價細胞介導的免疫性外周血抗原特異性CD4和CD8T細胞可在體外被再刺激，以產生IL-2、CD40L、TNF-a和IFN,如果與其對應抗原溫育。因此，抗原特異性CD4和CD8T細胞可在常規(guī)免疫熒光標記細胞表型以及胞內細胞因子生產后通過流式細胞儀計數(shù)。在本研究中，流感疫苗抗原以及來源于特定流感蛋白的肽用作再刺激流感特異性T細胞的抗原。結果表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性CD4或CD8T細胞的頻率。1.3.5.統(tǒng)計方法'在接種后的7天隨訪期(即接種日和隨后6天)以及整個過程中訴求的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同接種的關聯(lián)。.在接種后的21天隨訪期(即接種日和隨后20天)以及整個過程中主動訴求的局部和全身征兆和癥狀的百分率、強度以及同與接種的關聯(lián)。.整個研究過程中嚴重不良事件的發(fā)生。/.3.5.2/義要乾《對于體液免疫應答'在0天和21天血清血凝反應抑制(ffl)和NI抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒株的每一種測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B-抗體)。*在0天和21天中和抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒林的每一種測試。衍iJY輿芥95%H^/^.-'接種前和接種后具有95%置信區(qū)間(95%CI)的血清HI抗體的幾何平均滴度(GMT)21天時具有95%CI的血清陽轉率*21天時具有95%CI的轉變因子**21天時具有95%CI的血清保護率***.在所有時間點的血清NI抗體GMT(具有95%置信區(qū)間)*血清陽轉率定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HI滴度時增加達至少4倍的接種者百分率。"轉變因子定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數(shù)。***保護率定義為接種后(^十對每種疫苗抹的)血清HI滴度等于40的接種者百分率，通常將該百分率看作指示保護作用。對于細胞介導的免疫(CMI)應答在第0天和21天不同測試中每106當中細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試都定量CD4/CD8T細胞針對以下物質的應答*肽流感(pf)抗原(這些抗原的精確性質和來源不需要給出/解釋).裂解流感(sf)抗原'全流感(wf)抗原.產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFoc)的細胞'產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFoc、IFN力的細胞'產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TKFoc、IFNy)的細胞*產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、CD40L)的細胞'產生至少TNFa和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFN力的細胞/.m顛微々浙免疫原性分析基于總接種群體。對于每個治療組，計算以下參數(shù)(具有95%置信區(qū)間)'在第0天和21天時HI和NI抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)*在第0天和21天時中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)21天時的轉變因子21天時的血清陽轉率(SC),定義為相比于第0天在第21天時血清HI滴度增加達至少4倍的接種者百分率。21天時的保護率，定義為血清ffl滴度=1:40的接種者百分率。.在各個時間點(第0天、第21天)針對每個接種組和針對每種抗原(肽流感(pf)抗原、裂解流感(sf)抗原和全流感(wf)抗原)總結CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率(描述統(tǒng)計)。*在各5種不同測試中對于每個接種組和每種抗原(pf、sf和wf)，在時間點(接種后-接種前)之間個體應答差異的描述統(tǒng)計。'使用無參數(shù)檢驗(Kruskall-Wams檢驗)比較3組之間的局部差異，在各5種不同測試中計算每種抗原的統(tǒng)計學p-值。所有顯著性檢驗都是雙尾的。低于或等于0.05的P-值被看作是統(tǒng)計學顯著的。實施例II—水包油乳液和佐劑制劑的制備和表征除非另有說明，否則在隨后的實施例中使用的油/水乳液由水相和油相組成，有機相由2種油(a-生育酚和鯊烯)組成，水相為含Tween80作為乳化劑的PBS。除非另有說明，否則在隨后的實施例中使用的水包油乳液佐劑制劑都制成含以下的水包油乳化組分(給出終濃度)2.5%鯊烯(體積/體積)、2.5%a-生育酚(體積/體積)、0.9%聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯(體積/體積)(Tween80),參見WO95/17210。該乳液在隨后的實施例中稱為AS03,如下制備為2倍濃縮物。II.l.乳液SB62的制備II丄l.實驗室規(guī)模的制備將Tween80溶解在磷酸緩沖鹽水(PBS)中，獲得2%的PBS溶液。為提供100ml的2倍濃縮乳液，渦旋5gDLa生育酚和5ml鯊烯，以徹底混合。加入90mlPBS/Tween溶液，徹底混合。然后將獲得的乳液通過注射器，最后使用M110S微流控設備微射流。獲得的油滴具有約120-180nm的大小(表示為通過PCS;f全測的Z均值)。將其它佐劑/抗原組分加入為單一混合物的乳液中。IU.2.放大規(guī)模的制備通過在強攪拌下混合由疏水組分(a-生育酚和鯊烯)組成的油相和含水溶性組分(Tween80和PBSmod(改良型)，pH6.8)的水相，制備SB62乳液制備物。在攪拌的同時，將油相(1/10總體積)轉移至水相(9/10總體積)，于室溫攪拌混合物15分鐘。然后在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(15000PSI,8個循環(huán))，以產生亞微米油滴(分布在100-200nm之間)。獲得的pH在6.8土0.1之間。然后使SB62乳液通過0.22pm膜過濾除菌，將除菌的乳化原液冷凍儲存于2-8。C的Cupac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣或氬氣)通入SB62乳化半成品容器的死體積中達至少15秒。SB62乳液的最終組成如下Tween80:1.8%(體積/體積)19.4mg/ml;鯊烯5%(體積/體積)42.8mg/ml;a-生育酚5%(體積/體積)47.5mg/ml;PBS-mod:NaCl121mM,KC12.38mM,Na^HPC^7.14mM,KH2P041.3mM;pH6.8±0.1。II.2.檢測油滴粒度的動態(tài)光散射n.2丄簡介油滴直徑的大小按照以下方法并在以下實驗條件下測定。油滴粒度檢測以強度檢測提供，并表示為通過PCS檢測的z均值。II.2.2.樣品制備對水包油乳液佐劑進行粒度檢測，所述水包油乳液佐劑為按照放大規(guī)模方法制備的SB62、AS03和AS03+MPL(50jug/ml)，后兩種臨使用前制備。樣品的組成在下文給出(參見章節(jié)11.2.4)。樣品用PBS7.4稀釋4000倍至8000倍。作為對照，用10mMNaCl稀釋PL-Nanocal粒度標準品100nm(目錄號6011-1015)。11.2.3.MalvernZetasizer3000HS粒度檢測所有的粒度檢測都用兩臺MalvernZetasizer3000HS檢測。樣品以合適的稀釋度(通常為4000倍至20000倍的稀釋度，取決于樣品濃度)在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測，并采用兩種光學模式-或者真實的粒子折射率0和假想折射率0。-或者真實的粒子折射率1.5和假想折射率0.01(按照在文獻中可見的值，對乳液采用適合的光學模式)。技術條件是-激光波長532nm(Zeta3000HS)。隱激光功率50mW(Zeta3000HS)。-于90。檢測的散射光(Zeta3000HS)。-溫度25C,-持續(xù)時間由軟件自動確定，-次數(shù)3次連續(xù)纟全測，-z均值直徑通過累積量分析-粒度分布通過Contin或自動化方法。自動化Malvern算法使用累積量、Contin和非負最小二乘(NNLS)算法的組合。由于Mie理論，強度分布可轉變?yōu)轶w積分布。11.2.4.結果(參見表2)表2<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>(*)如下制備注射用水、PBS10x濃縮液、250jalSB62乳液和25叫MPL混合在一起，以達到280nl終體積。z均值直徑(ZAD)大小以樣品中各種粒度的散射光量來度量。該值與樣品的單模式分析相關，主要用于重現(xiàn)目的。計數(shù)率(CR)是散射光的檢測結果其對應于每秒成千上萬的光子。多分散性(Poly)指數(shù)是分布的寬度。其是分布廣泛性的無量綱檢測結果。Co"f/";fp《動化為\浙；已按照以上闡述并帶有些微改變的方法制備和評價兩種另外的SB62制備物(2倍濃縮的AS03):在為獲得用于Zetasizer3000HS的最佳計^:率值而確定的兩個稀釋度10000x和20000x，在用于Malvern分析的塑料比色皿中檢測樣品，光學模式與以上實施例中使用的相同。結果示于表3。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>用MalvernZetasizer3000HS和兩種光學模式檢測不同稀釋度的SB62制劑。以上評價的制劑的粒度ZAD(即通過累積量分析獲得的強度平均值)約為150-155nm。當使用累積量算法時，我們觀察到稀釋度對ZAD和多分散性沒有影響。II.3.含MPL的AS03的制備IL3丄MPL液體懸浮液的制備MPL(在整個文件中使用，其是3D-MPL即3-0-脫酰單磷酰脂質A的縮寫)原液由MPL⑧凍干粉制備。MPL原液是穩(wěn)定的原料濃縮(約1mg/ml)水分散體，其隨時可用于疫苗或佐劑配制。制備過程的示意圖在圖2中給出。對于最大批量12g,MPL原液制品儲存在無菌玻璃容器中。MPL的分散由以下步驟組成-將MPL粉末懸浮在注射用水中-通過加熱解聚任意大的聚集物(熱處理)-通過微射流將粒度縮小至100nm至200urn-用Sartoclean預過濾裝置0.8/0.65)iim預過濾制品-于室溫除菌過濾制品(SartobranP裝置，0.22fim)MPL粉末通過微射流凍干，產生穩(wěn)定的膠體水性分散體(MPL粒度小于200nm)。MPL凍干升分末分散在注射用水中，以便獲得粗制的10mg/ml懸浮液。然后在^t覺拌下對懸浮液進行熱處理。冷卻至室溫后，開始微射流處理，以便降低粒度。使用微流控裝置M110EH,以限定壓力通過微射流相互作用腔連續(xù)循環(huán)分散液達最小通過量(循環(huán)次數(shù)ivJ進行微射流。代表循環(huán)次數(shù)的纟效射流持續(xù)時間基于檢測的流速和分散體積計算。對于給定壓力下的給定設備，獲得的流速可在一個至另一個相互作用腔之間以及特定相互作用腔的整個活動周期中有所變化。在本實施例中，使用的相互作用腔是F20Y型微流控器。由于纟效射流效力與壓力-流速對相關，所以處理時間可在一批至另一批之間變化。1次循環(huán)需要的時間基于流速計算。所認定的流速是就在將MPL導入裝置前用注射用水檢測的流速。1次循環(huán)被定義為MPL總體積通過裝置1次所需要的時間(以分鐘表示)。如下計算獲得n次循環(huán)需要的時間nx要處理的MPL的量(ml)/流速(ml/分鐘)由此相應地修改循環(huán)次數(shù)。描述了對所用的優(yōu)選設備和相互作用腔要實施的最小循環(huán)量(n皿J。根據nmin循環(huán)后進行的粒度檢測結果確定要實施的總循環(huán)量?；跉v史數(shù)據確定粒度限制(d^)。檢測通過光子相關光譜法(PCS)技術實現(xiàn)，dum表示為單模式結果(Z均值)。在該限度之下，可在n^循環(huán)后終止微射流。在該限度之上，繼續(xù)微射流，直至獲得滿意的粒度減小，最多再進行50個循環(huán)。如果在微射流后不立即開始過濾，則將分散的MPL儲存在+2至+8。C，等待轉移至過濾區(qū)域。在微射流后，用注射用水稀釋分散液，通過0.22濾器在層流下除菌過濾。最終的MPL濃度是1mg/ml(0.80-1.20mg/ml)。II.3.2.AS03+MPL佐劑化疫苗的制備單瓶法向AS03佐劑制劑加入MPL,終濃度在每劑疫苗10-50嗎之間。將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween、TritonX-100和VES(維生素E琥珀酸酯，即a-生育酚琥珀酸酯)的SB62混合物加入注射用水中。量計入流感抹中存在的去污劑，以便達到目標終濃度750ng/mlTween80、HOpg/mlTritonX-100和100pg/mlVES。在5分鐘攪拌后，加入15)Lig的每種目標流感抹(例如在經典3價疫苗中的毒抹H1N1、H3N2和B)。在15分鐘攪拌后，加入250plSB62乳液，然后加入25嗎或50貼MPL。制備過程的示意圖在圖3中給出。表4給出了每個人體劑量中含MPL的AS03的最終組成。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>承PBSmodl0x濃縮液pH6.8-KH2P(VN^HPCVNaCl、KC1陽HC1**MPL是每劑25嗎或50嗎II.3.3.AS03+MPL佐劑化的疫苗的制備雙瓶法可通過混合2倍濃縮的抗原或抗原制備物和AS03(SB62250pl)或AS03+MPL(SB62250|ul+25pg或50嗎MPL)佐劑，由雙瓶法制備相同制劑。在此情況下，其如下進行。AS25-佐劑化流感疫苗的生產由3個主要步驟組成1)配制無佐劑的三價半成品(2x濃縮)并分裝入抗原容器中2)制備AS03+MPL佐劑3)即時重配AS03+旨1^佐劑化裂解病毒疫苗。7)潔斜無佐W的三,"f4品f^^裙)并》襲入戎j容器^3種單價原液的體積基于配制前各個單價原液中檢測的HA含量，并基于1100ml的目標體積。濃縮的磷酸緩沖鹽水以及Tween80、TritonX-100和a-生育酚氬琥珀酸酯的預混合物稀釋在注射用水中。然后將3種濃縮的單價原液(A/新喀里多尼亞、A/紐約、B/江蘇)連續(xù)稀釋入獲得的磷酸緩沖鹽水/Tween80-TritonX-100-a-生育酚氫琥珀酸酯溶液(pH7.4,137mMNaCl,2.7mMKC1,8.1mMNa2HP04,1.47mMKH2P04,990貼/mlTween80,150|ig/mlTritonX-100和130jag/mloc-生育酚氫琥珀酸酯)中，以便具有終濃度39.47嗎A毒株(HINI、H3N2)的HA/ml三價半成品(15HA/A毒抹/380^三價半成品)和46jigB毒抹的HA(n.5|igHA/B毒抹/380fil三價半成品)。在加入每種單價原液之間，于室溫攪拌混合物達10-30分鐘。在加入最后一種單價原液后，攪拌15-30分鐘，檢查pH,并用HC1或NaOH將pH調節(jié)至7.2±0.2。抗原的三價半成品無菌分裝入3-ml無菌I型(歐洲藥典)玻璃瓶中。每瓶含470pi體積(380pi+90pi過充)。2」#務爿^3/M尸丄炎游^濕并》裝入佐浙容器f。通過混合兩種組分制備佐劑AS03/MPL:SB62乳液(章節(jié)IL1.2中的方法)和MPL(章節(jié)II.3.1中的方法)。1倍濃縮的PBSmod(通過將10x濃縮的PBSmod稀釋在注射用水中制備)和SB62原液和1mg/ml的MPL原液。測定MPL濃度，以達到10-50嗎的最終含量，適宜地為每個最終人用疫苗劑量約25pg?；旌衔镉谑覝財嚢?-30分鐘，用NaOH(0.05或0.5M)/HC1(0.03M或0.3M)將pH調節(jié)至6.8±0.1。于室溫再攪拌5-30分鐘后，將混合物通過0.22jim膜過濾除菌。實施無菌惰性氣體(氮氣)通入，以在最少1分鐘的過程中在分裝容器中產生惰性頂空氣體。無菌AS03+MPL佐劑儲存在+2-8。C，直至無菌分裝入1.25-ml無菌I型(歐洲藥典)玻璃注射器中。每個注射器含80pi超量體積(320pl+80jul過充)。在注射時，將含佐劑的預填充注射器的內容物注入含濃縮的三價失活裂解病毒體抗原的小瓶中。在混合后，將內容物吸入到注射器中，針用肌內針替換。1劑重配的AS25佐劑化流感候選疫苗相當于0.7mL。II.4.在水包油乳化制劑中含流感抗原和任選的MPL的免疫原性組合物的制備向II.l的SB62乳液中加入等體積的2倍濃縮的裂解流感抗原(FluarixTM)(15嗎每種毒株的HA)并混合。適宜時將其與50嗎/mlMPL混合，獲得最終制劑。實施例HI—在65歲以上的老年人中用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗進行的臨床實驗(Explo-Flu-OOl)在2003年于65歲以上的老年人群中進行I期開放隨機研究，以便評價含佐劑AS03的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。在肌內給予1劑AS03佐劑化疫苗或WV疫苗后21天檢測體液免疫應答(即抗血細胞凝集素抗體滴度、中和抗體滴度和抗神經氨酸酶抗體滴度)和細胞介導的免疫應答(CD4和/或CD8T細胞應答)。FluarixTM用作參比。111.1.研究設計3組受試者平行地肌內接受以下疫苗■1組50名受試者接受1劑重配和佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03)■1組50名受試者接受1劑全病毒流感疫苗(FluWVV)■1組50名受試者接受1劑Fluarix(Fluarix)=對照接種程序在第0天注射1次流感疫苗，收集血樣，在21天進行解讀分析(HI抗體測定、NI抗體測定、中和抗體測定和CMI分析)，并得出研究結論。在該研究中使用的標準3價裂解流感疫苗一FluanxTM是一種在2003年由GlaxoSmithKlmeBiologicals開發(fā)并生產的商品化疫苗。111.2.疫苗組成和給予(表5)ni.2丄疫苗制備佐^化的^^瘦芬AS03佐劑化的流感疫苗候選物是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(335pl)(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含SB62乳液的預填充I型玻璃注射器(335pl)(佐劑容器)組成。在注射時，抗原容器的內容物借助于SB62乳液預填充注射器被取出，接著輕微混合注射器。SB62乳液與疫苗抗原混合重配AS03佐劑。在注射前，使用的針被肌內針替換，并將體積調整到500iul。1劑重配的AS03佐劑化流感疫苗相當于0.5ml,含在已注冊的FluarixTM/ot-Rix⑧疫苗中的每種流感病毒抹的15昭HA,并包含10.68mg莖烯、11.86mgDL-a生育酚和4.85mg聚山梨醇酯80(Tween80)。斜務AS03佐劑化的流感疫苗的生產包括3個主要步驟l)配制無佐劑的3價半成品并分裝入抗原容器中3種單價原液的體積基于配制前各個單價原液中檢測的HA含量，并基于800ml的目標體積。濃縮的磷酸緩沖鹽水以及Tween80、TritonX-100和a-生育酚氬琥珀酸酯的預混合物稀釋在注射用水中。然后將3種濃縮單價原液(毒抹A/新喀里多尼亞-、毒抹A/巴拿馬-、毒抹B/山東-)連續(xù)稀釋入獲得的磷酸緩沖鹽水/Tween80-TritonX-100-a-生育酚氬琥珀酸酯溶液(pH7.4,137mMNaCl,2.7mMKC1,8.1mMNa2HP04,1.47mMKH2P〇4,1500嗎/mlTween80,220pg/mlTritonX-100和200|xg/mlot-生育酚氫琥珀酸酯)中，以便具有終濃度60叱A毒抹的HA/ml三價半成品(15嗎HA/A毒林/250jul三價半成品)和70嗎B毒抹的HA(17.5HA/B毒抹/250pi三價半成品)。在加入每種單價原液之間，于室溫攪拌混合物達10分鐘。在加入最后一種單價原液后，攪拌15分鐘，檢查pH，并用HC1或NaOH將pH調節(jié)至7.2士0.1。將抗原的3價半成品無菌分裝入3-mlI型無菌玻璃瓶中。每瓶含34%體積超出量(335^總體積)。賴備麥^濕并》襲入佐麻容器f水相:在攪拌的同時，將902mlTween80與44105mlPBS曙mod緩沖液混合(用HC1調節(jié)后pH=6.8)。油相:在攪拌的同時，將2550ml鯊烯加入2550mlot-生育酚中。混合7jc相和油相:在攪拌的同時，將5000ml油相(1/10總體積)轉移至45007ml水相(9/10總體積)?；旌衔镉谑覝財嚢?5分鐘。皿在微流控器的相互作用腔中對獲得的混合物施加剪切力、沖擊力和空化力(1S000PSI，8個循環(huán))，以產生亞^f效米液滴(分布在100-200nm之間)。獲得的pH在6.8士0.1之間。除菌過濾:使SB62乳液通過0.22jim膜過濾除菌，將無菌乳化原液冷凍儲存于2-8'C的C叩ac容器中。將無菌惰性氣體(氮氣或氬氣)通入SB62乳化半成品容器的死體積中達至少15秒。給出的所有成分的量都用于制備50L乳液，并以體積給出。實際上，量以成分的密度計量。PBS的密度被視為等于1。SB62乳液的最終組成如下表5<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>然后將無菌SB62乳化原液無菌分裝入1.25-ml無菌I型玻璃注射器中。每個注射器含34%的體積超出量(335^總體積)。3)AS03佐劑化的裂解病毒疫苗的即時重配。在注射時，含濃縮3價失活裂解病毒體抗原的瓶的內容物借助于含SB62乳液的注射器由瓶中取出，接著輕微混合注射器。SB62乳液與疫苗抗原混合重配AS03佐劑。III.2.2.疫苗組成(表6)和給予表6<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>該研究總共招錄了148名受試者49名受試者在FluAS03組，49名受試者在Fluarix組，50名受試者在FluWVV組?？偨臃N群體的平均年齡在接種時為71.8歲，標準偏差6.0歲。受試者的平均年齡和性別分布在3個疫苗組之間是相似的。ni.4.安全性結論在研究群體(即65歲以上的老年人)中給予AS03佐劑化的流感疫苗是安全的，在臨床上是良好耐受的。ni.5.免疫原性結果對總接種群體的免疫原性進行分析。in.5丄體液免疫應答為了評價由AS03佐劑化的疫苗誘導的體液免疫應答，計算每個治療組的以下參數(shù)(具有95%置信區(qū)間)*在第0天和21天時HI和NI抗體滴度的幾何平均滴度(GMT).在第0天和21天時中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT)21天時的血清陽轉率(SC),定義為相比于第0天在第21天時的血清ffl滴度增加達至少4倍的接種者百分率。21天時的轉變因子，定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數(shù)。21天時的保護率定義為血清HI滴度=1:40的接種者百分率。///.5丄7我i勿^凝桌,在謬^吝a)HI幾何平均滴度(GMT)具有95%CI的ffl抗體的GMT示于表7(抗HI抗體的GMT)。3個組中針對所有疫苗抹的接種前抗體GMT處于相同范圍內。在接種后，抗血細胞凝集素抗體水平顯著增加。在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗抹的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FluWVV組之間的95。/。CI有一些重疊。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>N-結果可用的受試者數(shù)目；95%CI=95%置信區(qū)間；LL=下限；UL=上限;MIN/MAX=最小/最大；PRE-接種前第O天；PI(D21"接種后第21天b)抗HI抗體滴度的轉變因子、血清保護率和血清陽轉率(與人中保護作用的關聯(lián))結果示于表8。/一寬^f代表相比于第0天在第21天時針對各個疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數(shù)。轉變因子根據病毒抹和疫苗由6.1至13.6變化。此轉變因子大大地優(yōu)于歐洲官方要求的2.0倍GMT增加。i清保^卓代表在第21天時血清HI滴度>40的受試者比例。在研究開始時，所有組的一半受試者(范圍在34.0%-69.4%之間)對所有毒抹都具有保護性抗體水平。在第21天時，3個組中對不同病毒抹的血清保護率在88.0%至100%的范圍內。就保護作用而言，這意味著超過88%的受試者在接種后具有>40的血清HI滴度，被認為具有抗3種毒抹的保護作用。該比率大大地優(yōu)于歐洲官方要求的>60歲老年人群中60%的血清保護率。i清/^脊舉代表相比于第0天在第21天時血清HI滴度具有達至少4倍增加的受試者比例。對3種毒抹的整體應答率在3個組中基本上是相等的。為了被認為有效和符合歐盟標準，疫苗應當在=60歲的老年人群中誘導超過30%的血清陽轉率。在該研究中，3個組的血清陽轉率超過50%。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>總結'在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗株的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FluWVV組之間的95。/。CI有一些重疊。'轉變因子根據病毒林和疫苗由6.1至13.6變化。此轉變因子大大優(yōu)于歐洲官方要求的2.0倍GMT增加。.在第21天時，3個組中對不同病毒抹的血清保護率在88.0%至100%的范圍內。該比率大大優(yōu)于歐洲官方要求的>60歲老年人群中60%的血清保護率。'在該研究中，3個組的血清陽轉率超過50%。對3種毒抹的整體應答率在3個組中基本上是相等的。為了更好地表征老年人中針對流感接種的免疫應答，評價針對中和抗原的血清抗體應答。結果示于表9(血清保護率和抗中和抗體滴度的幾何平均滴度(GMT》和表10(在接種后21天抗中和的血清陽轉率(增加倍數(shù)=4))。檢測免疫前和免疫后血清中抗3種流感才朱的中和抗體滴度。測定以下參數(shù)'接種前和接種后具有95%置信區(qū)間(95%CI)的血清中和抗體的幾何平均滴度(GMT).在21天時具有95%CI的血清陽轉率，定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗株的HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>組1:Flu疫苗混合佐劑2x濃縮的Flu疫苗；組2:Flu疫苗Flu疫苗；組3:Flu疫苗FluWVV疫苗；N-結果可用的受試者數(shù)目；n/%=滴度在特定范圍內的受試者的數(shù)目/百分率；95。/。CI-95。/o置信區(qū)間；LL-下卩艮；UL=上限；PRE-接種前第O天；PI(D21)-接種后第21天表io<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>組1:Flu疫苗(DFLU58A16)混合佐劑(D621024A8)2x濃縮的Flu疫苗；組2:Flu疫苗(18854B9)Flu疫苗；組3:Flu疫苗(DFLU59A2)FluWW疫苗；N=接種前和接種后結果可用的受試者數(shù)目；11=應答者數(shù)目；%=應答者百分率(n/NxiO0);95%CI=精確的95%置信區(qū)間；LL=下限；UL=上限；主要發(fā)現(xiàn)是.對于3種疫苗，在21天時，對兩種A毒抹獲得100%的血清保護率。對于B毒抹，3組中的血清保護率在92%至100%的范圍內。.接種后，3個組中針對所有毒抹的GMT都有顯著增加。然而，有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3個疫苗;^朱的中和抗體的GMT比在FluWVV中高，盡管Fluarix組和FluWVV組之間的95。/。CI有一些重疊。*對于血清陽轉率，針對3種毒抹的總體應答率在3個組中基本上是相等的。在所有組中，結果都與針對抗血細胞凝集素抗體進行分析所獲得的結果相一致。///.5丄3Y—經^^躇(7V4;戎沐諒產為了更好地表征老年人群中對流感接種的免疫應答，評價對神經氨酸酶抗原的血清抗體應答。與ffl抗體滴度類似，測定以下終點GMT(采用對數(shù)滴度轉化平均值的反對數(shù)).血清陽轉率，定義為相比于第0天在21天時對每種疫苗林的HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率。在表11(抗NA抗體GMT)和表12(接種后的NA血清陽轉率(笫21天)(4倍增加》中顯示了NI抗體的GMT和血清陽轉率具有95%CI。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>FluAS03:與AS03佐劑(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)Fluarix:Flu疫苗(18854B9)FluWVV:FluWW疫苗(DFLU59A2)PRE=接種前，PI(D21)=接種后第21天95%CI、LL和UL-95。/。置信區(qū)間、下限和上限表12<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>FluAS03:與AS03佐劑(D621024A8)混合的Flu疫苗(DFLU58A16)，F(xiàn)luarix:Flu疫苗(18854B9),FluWVV:FluWW疫苗(DFLU59A2)N-接種前和接種后結果可用的受試者數(shù)目；n-應答者數(shù)目；%=應答者比例(n/Nx100);95%CI=精確的95%置^言區(qū)間；LL=下限；UL=上限主要發(fā)現(xiàn)是.對血細胞凝集素觀察到的GMT和血清陽轉率的值高于對神經氨酸酶觀察到的值。*在3個組中針對所有疫苗林的接種前抗體GMT都在相同范圍內。在接種后，抗神經氨酸酶抗體水平顯著增加。至于HI抗體滴度，在接種后有一種趨勢在FluAS03和Fluarix組中針對全部3種疫苗株的HI抗體的GMT較高，盡管Fluarix組和FluWVV組之間的95%CI有一些重疊。'關于血清陽轉率，在3個組中以及對3種毒^^來說，針對3種毒抹的總體應答率基本上相等。我們的結果表明，在該研究中抗流感接種的健康老年人發(fā)展出針對神經氨酸酶抗原的良好抗體應答，無論哪種流感疫苗。但是，針對神經氨酸酶抗原的應答低于針對血細胞凝集素抗原的應答。m.5.2.細胞免疫應答可在體外再刺激外周血抗原特異性CD4和CD8T細胞，以產生IL-2、CD40L、TNF-a和IFNy,如果與其對應抗原溫育。因此，抗原特異性CD4和CD8T細胞可在常規(guī)免疫熒光標記細胞表型以及胞內細胞因子生產后通過流式細胞4義計數(shù)。在本研究中，流感疫苗抗原以及來源于特定流感蛋白的肽用作抗原來再刺激流感特異性T細胞。在表13-18中提供了CD4和CD8T細胞應答的結果。表13以產生至少兩種不同細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后的CD40L/IL2/TNF-ot/IFN-y的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>組1:FluAS03:Flu疫苗Fluarix,與AS03佐劑混合組2:Fluarix:Flu疫苗FluarixTM組3:FluWW:FluWVV疫苗SD-標準偏差；Min、Max-最小，最大Ql-第一四分位數(shù)；03=第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目P-值-Kruskall-Wallis檢驗(非參數(shù)方法)，測試3組之間于第21天時的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)表14以產生至少兩種不同細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后M的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表15以產生至少CD40L和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后M的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>complextableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>表16已產生至少IFNY和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后^的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表17以產生至少IL2和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后^的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表18以產生至少TNFa和另一種細胞因子的細胞表示的抗原特異性CD4T-細胞應答對接種前和接種后M的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>結果還表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8T細胞的頻率，并示于圖4和圖5。在相似的分析中，使用漂移抹(A/HlNl/北京/262/95(HlNld)、A/H3N2/悉尼/5/97(H3N2d)、B/山梨/166/98(Bd》或轉換抹(A/新加坡/1/57(H2N2)、A/香港/1073/99(H9N2》的流感抗原評價交叉反應性CD4T-細胞應答。結果表示為細胞因子陽性的CD4T細胞的頻率，示于圖6。主要發(fā)現(xiàn)是*用Fluarix和全病毒接種稍微加強CD4T-細胞應答。用FluAS03接種誘導強CD4T-細胞應答(圖4),其在統(tǒng)計學上是顯著的。對于用裂解抗原或全病毒在體外刺激后以及研究的所有細胞因子(IL-2、IFNy、TNFot和CD40L)得出相同的結論。'大部分個體具有抗全流感病毒的CD8T-細胞應答，但是接種對CD-8T細胞應答沒有可檢測的影響(即接種前=接種后)，無論哪一個研究組(圖5)。用Fluarix接種僅誘導低水平的交叉反應性CD4T-細胞應答(圖6)。用FluAS03接種誘導抗漂移流感抹的強CD4T-細胞應答，其在統(tǒng)計學上是顯著的(圖6)?；緵]有檢測到抗轉換抹的應答。III.5.3.B-細胞ELISPOT記憶瓜5.3./踏為了更好地表征由AS03佐劑化的流感疫苗誘導的CMI應答，評價使用流感疫苗株或抗人免疫球蛋白體外誘導分化為漿細胞的B-細胞Elispot記憶應答，以便計數(shù)抗流感或分泌IgG的漿細胞。結果描述于表19和表20以及圖7。選擇22名首次接受1劑FluAS03疫苗的受試者和21名首次接受1劑Fluarix疫苗的受試者中的一部分,以使用B隱細胞記憶Elispot技術評價接種對流感特異性記憶B細胞的影響。測定以下終點'在第0天和第21天已通過B-細胞Elispot檢測了所有受試者中的流感特異性記憶B細胞。結果表示為每百萬個(106)抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。'接種后(第21天)和接種前(第0天)之間的差異也表示為每百萬個(l06)抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。各個接種組在第0天和第21天的描述統(tǒng)計表示為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。第21天和第0天之間(接種后-接種前)個體差異的描述統(tǒng)計為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細月包的頻率。Wilcoxon檢驗用于對比兩個組之間的局部差異，計算針對3種毒抹(A/新喀里多尼亞、A/巴拿馬和B/山東)中的每種的統(tǒng)計學p-值。瓜5.3.3潛耒相比于Fluaiix組，存在一種有利于AS03佐劑化的疫苗的趨勢。對于A/新嚷里多尼亞抹，相比于Fluarix存在有利于FluAS03的統(tǒng)計學顯著差異(p-值-0.021)。對亍A/巴拿馬和B/山東抹沒有觀察到兩個組之間的統(tǒng)計學差異。表19B-以及10621天)頻細胞記憶對接種前(第0天)和接種后(第21天)的描述統(tǒng)計個產IgG漿細胞(一部分受試者)中抗原-漿細胞的接種后(第率的推論統(tǒng)計<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>組1:Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐劑組2:Flu疫苗FluarixSD=標準偏差Min、Max:最小,最大Ql=第一四分位數(shù)Q3=第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目P-值=Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)，測試2組之間于第21天時的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。表20B-細胞記憶對106個產IgG漿細胞(一部分受試者)中抗原特異性漿細胞頻率在接種后(第21天)和接種前(第0天)之間的^^的描述統(tǒng)計和推論統(tǒng)計<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>組1:Flu疫苗Fluarix+AS03水包油乳液佐劑組2:Flu疫苗FluarixSD=標準偏差Min、Max-最小，最大Ql=第一四分位數(shù)Q3-第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目P-值-Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)，測試2組之間于第21天時的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IIL6.整體結論ni.6丄反應原性和安全性結果盡管流感免疫顯著降低了肺炎和相關死亡的風險，但老年人接種僅提供了23-72%的抗流感疾病的保護作用。疫苗抗原和有效佐劑的制劑是一種增強對亞單位抗原的免疫應答的有吸引力方法。本研究設計用于評價(l)用水包油乳液即AS03佐劑化的流感疫苗在健康老年人中安全性和反應原性，(2)抗體和細胞介導的免疫應答。反應原性數(shù)據表明，用AS03佐劑化的流感疫苗比其它兩種疫苗誘發(fā)更多的局部和全身癥狀。但是，對于主動訴求的不良事件，未觀察到3種疫苗之間的差異。由這些結果可得出結論，候選疫苗的反應原性和安全性是令人滿意的，在臨床上是可接受的。III.6.2.免疫原性結果就免疫應答而言，3種疫苗超出了歐洲官方對每年注冊的裂解病毒體流感疫苗的要求("關于協(xié)調流感疫苗要求的指引說明"，用于免疫學評價年度毒抹變化-CPMP/BWP/214/96)。在本研究中測試的3種流感疫苗在健康老年人中是免疫原性的，這些老年人對流感血細胞凝集素發(fā)展出良好的抗體應答，并中和抗原(表21)。表21<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>對于細胞介導的免疫(CMI)應答，用AS03佐劑化的流感疫苗誘導的CD4應答(包括漂移抹)顯著強于其它兩種疫苗(Fluarix和全流感病毒疫苗)。但是，接種對CD8應答沒有可檢測的影響。關于B細胞記憶應答，相比于無佐劑疫苗，存在有利于有佐劑流感疫苗的趨勢。實施例IV—用含裂解流感抗原制備物和AS03佐劑的疫苗在65歲以上的老年中的臨床實驗一Explo-Flu-002為評價含佐劑AS03的GlaxoSm池KlineBiologicals流感候選疫苗在先前于2003年在Explo-Flu-OOl臨床實驗中接種候選疫苗的65歲以上老年人群中的反應原性和免疫原性，已進行了開放、可控的i/n期研究。對于免疫原性和安全性評價，F(xiàn)luarixTM疫苗(在比利時稱為oc-nxTM)已用作參比。IV.1.目標在肌內給予1劑AS03佐劑化的疫苗之后21天，檢測體液免疫應答(即抗血細胞凝集素抗體滴度)和細胞介導的免疫應答(CD4和/或CD8T細胞應答)和B記憶細胞應答。FluanxTM用作參比。目標是1)確定AS03佐劑化的Flu(40名受試者)相對于Fluarix(18名受試者)是否證實了其對流感抗原接種個體的CD4-和/或CD8-介導免疫性的最強免疫刺激活性；2)使用縱向分析研究AS03做佐劑對2004年接種前的免疫應答(正是2003年首次接種后1年的應答)的影響。IV.2.研究設計、疫苗組成和終點■40名〉65歲的受試者，他們先前在2003年的Explo-Flu-OOl臨床實驗中接受了1劑AS03佐劑化的流感疫苗(FluAS03)?！?個約20名65歲以上受試者的對照組，他們先前在2003年的Explo-Flu-OOl臨床實驗中接受了1劑Fluarix(Fluarix)。IV.2丄疫苗組成疫苗組成類似于用于研究Explo-Flu-001的疫苗組成，只是包含在疫苗(2004年疫苗)中的流感沖朱不同。毒抹如下A/新喀里多尼亞/20/99(IVR-116)(HlNl)-A/新喀里多尼亞/(HlNl)-類似毒抹A/懷俄明/3/2003(X-147)(H3N2)=A/福建(H3N2)-類似毒抹B/江蘇/10/2003=B/上海-類似毒抹IV.2.2.免疫原性(ffl)終點GMT(采用對數(shù)滴度轉化平均值的反對數(shù))'轉變因子(相比于第0天在第21天時血清HIGMT的增加倍數(shù)).血清陽轉率(相比于第0天在第21天時對每種疫苗抹的HI滴度具有達至少4倍增加的接種者百分率)'保護率(在第21天時血清HI滴度>1:40的接種者百分率)IV.2.3.CMI-終點在第O天和第21天每106個細胞中針對4種不同細胞因子的細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試都定量針對以下的CD4/CD8T細胞應答國以下3種抗原的混合物醒新喀里多尼亞抗原麗懷俄明抗原國江蘇^元原在5種不同測試(細胞因子)中由以下表示的抗原特異性CD4T細胞和CD8T細胞應答1.產生至少兩種不同細月包因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞2.產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞3.產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFN力的細胞4.產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TKFa、CD40L)的細胞5.產生至少TNFot和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFNy)的細胞IV.2.4.CMI分析首個CMI分析基于總接種群體(FluAS03組N=40名受試者，F(xiàn)luarix組N=18名受試者)。縱向分析基于Explo-Flu-OOl(裂解蛋白)和Explo-Flu-002(混合的flu抗原)研究的動態(tài)群體a接種前FluAS03組N=36名受試者，F(xiàn)luarix組N=15名受試者。腿接種后_接種前FluAS03組N=34名受試者，F(xiàn)luarix組N=15名受試者。(a)通過對每種抗原、每種細胞因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統(tǒng)計總結CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)對每種抗原、每種細胞因子和每個疫苗組在時間點(接種前和接種后)之間的個體應答差異的描述統(tǒng)計制表。(c)對于接種后和(接種后-前)的時間點，使用非參數(shù)Wilcoxon檢驗比較兩個疫苗組之間的局部差異，并就4種不同細胞因子計算以下的統(tǒng)計學p-值-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和3種毒;f朱的混合物的CD4T-細胞應答畫針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和3種毒林的混合物的CD8T-細胞應答(d)非參數(shù)檢驗(Wilcoxon-檢驗)還用于-依據各個疫苗組中Explo-Flu-001和Explo-Flu-002之間特異性CD4的頻率研究接種前(第0天)免疫應答的動力學-依據在Explo-Flu-OOl和Explo-Flu-002研究的每一個中2個疫苗組之間的特異性CD4的頻率研究接種前(第0天)免疫應答的動力學-依據各個疫苗組中Explo-Flu-OOl和Explo-Flu-002之間特異性CD4的頻率差異(接種后-接種前)研究免疫應答的動力學-依據在Explo-Flu-OOl和Explo-Flu-002研究的每一個中2個疫苗組之間的特異性CD4的頻率差異(接種后-接種前)研究免疫應答的動力學所有顯著性檢驗都是雙尾的。小于或等于0.05的P-值被認為是統(tǒng)計學顯著的。IV.3.結果結果表示為CD4或CD8T細胞亞群中細胞因子陽性的CD4或CD8T細胞的頻率。IV.3丄抗原特異性CD4T-淋巳細胞通過對每種抗原、每種細胞因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統(tǒng)計總結抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。在表22中顯示了對于每種抗原、各5種不同的細胞因子和每個疫苗組在時間點(接種后-接種前)之間CD4T-淋巴細胞應答個體差異的描述統(tǒng)計。表22接種后(在第21天)和接種前(在第0天)之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答差異的描述統(tǒng)計(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max:最小，最大Ql-第一四分位數(shù)Q3-第三四分位數(shù)N=結果可用的測試受試者的數(shù)目疫苗誘導的CD4T細胞顯示出能夠持續(xù)至少1年，因為用Fluaiix接種的個體和前一年用Fluarix/AS03接種的個體之間相比，接種前CD4T-細胞應答水平存在可觀測的差異。結果還示于圖8，表明了再接種之前和之后針對裂解流感病毒抗原的CD4T-細胞應答。DO對應于首年接種后12個月，因此指示持續(xù)性。相比于接種后2個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異(依據Wilcoxon檢驗)，幾乎所有的p-值都小于O.O5,被認為是統(tǒng)計學上顯著的(參見表23),這有利于FluAS03組。表23推論統(tǒng)計在第21天由2個疫苗組之間的Wilcoxon秩和檢驗獲得的抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p值(總接種群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)測試第21天時2個組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。通過Wilcoxon檢驗對比2個組之間抗原特異性CD4-T淋巴細胞應答頻率的個體差異(接種后-接種前)，以下抗原-細胞因子組合出現(xiàn)小于0.05并被認為是統(tǒng)計學顯著的p-值混合的流感病毒抗原-alldouble、混合的流感病毒抗原-IFNy和江蘇-IFNy，這有利于FluAS03組(表24)。<table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)測試2個組之間的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IV.3.2.抗原特異性CD8T-淋巴細胞通過對每種抗原、每種細月色因子、每個疫苗組和每個時間點(接種前和接種后)的描述統(tǒng)計總結抗原特異性CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率，類似于對CD4T細胞應答采用的方法。通過Wilcoxon檢驗對比接種后2個組之間抗原特異性CD8T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都高于0.05,被認為不是統(tǒng)計學顯著的。通過Wilcoxon檢驗對比2個組之間抗原特異性CD8T-淋巴細胞應答頻率的個體差異(接種后-接種前)的差異，所有p-值都高于0.05,被認為不是統(tǒng)計學顯著的。IV.3.3.動力學分析接種前(于2003年首次接種后1年)的免疫應答通過對表25中每種細胞因子和每個疫苗組和兩個研究的每一個的描述統(tǒng)計、對表27中的兩個研究的每一個和每個疫苗組的描述統(tǒng)計，總結接種前抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。推理統(tǒng)計在表26和表28中給出。表25對接種前(第0天)特異性CD4T淋巴細胞應^#種的描述統(tǒng)計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table>SD-標準偏差Min、Max:最小，最大Ql=第一四分位數(shù)Q3-第三四分位數(shù)N二結果可用的受試者數(shù)目通過Wilcoxon檢驗對比2個研究之間針對各個疫苗組的抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，僅對于FluAS03組和采用TNFoc細胞因子的情況出現(xiàn)小于0.05并被認為是統(tǒng)計學顯著的p-值(有利于Explo-Flu-002)(參見表26)。表26推理統(tǒng)計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同研究之間第0天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max-最小，最大Ql-第一四分位數(shù)Q3=第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目，通過各個研究的Wilcoxon檢驗對比2個疫苗組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異，Explo-Flu-002的所有p值都小于0.05，被認為是統(tǒng)計學顯著的(有利于FluAS03)(參見表28)。表28推理統(tǒng)計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同組之間第21天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>P-值:Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)測試2個組之間在第"天的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IV.3.4.動力學分析接種后減去接種前的免疫應答通過對表29中每種細胞因子和每個疫苗組和每個研究的描述統(tǒng)計、對表31中的每個研究和每個疫苗組的描述統(tǒng)計，總結在(接種后-接種前)時間點的抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。推理統(tǒng)計在表30和表32中給出。表29接種后(第21天)和接種前(第0天)之間特異性CD4T淋巴細胞應^^種的描述統(tǒng)計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max-最小，最大Ql=第一四分位數(shù)(33=第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目通過各個疫苗組的Wilcoxon檢驗對比2個研究之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異,FluAS03組的所有p-值都小于0.05，被認為是統(tǒng)計學顯著的(有利于Explo-Flu-001)(參見表30)。表30對接種后(第21天)和接種前(第0天)之間差異的推理統(tǒng)計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同研究之間第21天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)測試2個組之間第21天的局部差異(Wil眼on秩和檢驗)。表31對接種后(第21天)和接種前(第0天)之間特異性CD4T淋巴細胞應答接種差異的描述統(tǒng)計(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>SD=標準偏差Min、Max:最小，最大Ql=第一四分位數(shù)Q3-第三四分位數(shù)N-結果可用的受試者數(shù)目通過各個研究的Wilcoxon檢驗對比2個疫苗組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞頻率的差異，僅Explo-Flu-OOl的p值小于0.05,被認為是統(tǒng)計學顯著的(有利于FluAS03)(參見表32)。表32推理統(tǒng)計來自Wilcoxon秩和檢驗的不同組之間第21天抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的p-值(動力學)<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>P-值Wilcoxon檢驗(非參數(shù)方法)測試2個組之間在第21天的局部差異(Wilcoxon秩和檢驗)。IV.4.HI滴度結果示于圖9和表33-36。表3i3:抗HI滴度的幾何平均滴度(GMT)和血清陽性率(GMT針對接種的受試者計算)<table>tableseeoriginaldocumentpage113</column></row><table>N=受試者總數(shù)GMR-幾何平均比率(第21天/第O天滴度比率的平均對數(shù)的反對數(shù))95%(:1=95%置信區(qū)間表35:抗HI滴度的血清保護率(所有接種的受試者)<table>tableseeoriginaldocumentpage114</column></row><table>N=接種前和接種后結果可用的受試者數(shù)目n-應答者數(shù)目%=應答者比例(n/Nx100)95%CI=精確的95%置信區(qū)間；LL=下P艮，UL=上限IV.5.整體結論由此臨床研究證實，就流感特異性CD4T細胞的頻率而言，另外就至再接種研究的DO(ExploFlu002，即±1年后)為止首次Flu-AS03接種(在ExploFlu001中的初免接種)激發(fā)的免疫應答的持久性而言，佐劑化疫苗Flu-AS03優(yōu)于對等的無佐劑疫苗Fluarix。而且，該應答能夠識別新疫苗中存在的漂移流感抹，并識別2004年流感疫苗的毒林。與第一年接種相反，在再^^妻種先前用佐劑化FluarixTM接種的個體時顯示出比無佐劑FluarixTM^^妾種的個體增加的HI滴度響應性?？捎^察到一種趨勢抗H1N1和H3N2毒抹的HI滴度增加至1.5-2倍，抗B毒抹的HI滴度具有已表明的統(tǒng)計學增加。實施例V—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價第一個研究-新制劑AS03和AS03+MPL的效力V.l.基本原理和目標就感染的敏感性和臨床應答這二者而言，雪貂模型中的流感感染酷似人流感。在先前未進行病毒抹免疫的情況下，雪貂對曱型流感和乙型流感這二者的感染極為敏感。因此，其為研究由給予的流感疫苗賦予的保護作用提供了極佳的模型系統(tǒng)。該研究研究了有佐劑或無佐劑的各種3價裂解疫苗在用同源毒抹攻擊的雪貂中減輕病征(體溫)和減少鼻分泌物中病毒脫落的效力。該實驗的目標是表明有佐劑流感疫苗相比于普通(無佐劑)疫苗的效力。終點是1)主要終點減少同源攻擊后鼻清洗液中的病毒脫落；2)次要終點通過IHA分析體液應答以及監(jiān)測初免和攻擊前后的溫度。V.2.實驗設計V.2丄治療/組另寸(表37)由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(地中海雪貂(A/wWe/flf;wto^w/wra))(6只雪貂/組)。雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCID5(/ml)初免。在第21天，用全人劑量(500fxg疫苗劑量，15嗎HA/毒抹)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/巴拿馬/2007/99和B/山東/7/97的組合肌內注射雪貂。然后在第41天通過鼻內途徑用同型毒抹H3N2A/巴拿馬/2007/99(4.51LogTCIDVml)攻擊雪貂。表37<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>X-100和VES的混合物(量計入毒林中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750Tween80、110昭TritonX-100和100貼VES。攪拌5分鐘后，按順序加入15嗎每種毒林H1N1、H3N2和17.5)ngB毒抹，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4°C。賴麻Z'佐浙必,襲,^^'斜力/「5^^,將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750|ugTween80、110昭TritonX-100和100叱VES。攪拌5分鐘后，加入15嗎每種毒抹H1N1、H3N2和17.5(tigB毒林，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250piSB62乳液(如在實施例III中的教導制備)。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。浙浙3.'^AWJ+^尸丄^炎^/^三,襲席流^'賴^/將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750|ugTween80、110jigTritonX-100和100昭VES。攪拌5分鐘后，加入15!ig每種毒抹HlNl、H3N2和17.5|igB毒抹，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250iulSB62乳液(如在實施例II.l中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入得自如實施例II.3.1詳述制備的懸浮液的25pgMPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。備注在每種制劑中，加入PBS10倍濃縮液至等滲，在最終體積中為1倍濃縮液。計算H20的體積以達到目標體積。V.2.3.解讀〖表38)表38<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>111=單獨的^0=混合的V.3.結果結果的示意圖在圖IO和圖11中給出。V.3丄溫復監(jiān)測用傳感器并通過遙測記錄(按照在1.2.2中詳述的方法)監(jiān)測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通過DSI進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圈養(yǎng)在單獨的籠中。在攻擊前3天直至攻擊后5天每15分鐘記錄溫度，由日中計算出平均值。基線至基線體溫的結果示于圖10A(顯示了-l至+3天的結果)和10B(顯示了-2至+3天的結果)。在攻擊后，僅在用三價裂解普通疫苗或PBS免疫后觀察到體溫峰值。在用AS03或AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗免疫后未觀察到峰值。V.3.2.病毒脫落(圖11)對每組6只動物進行鼻清;先液的病毒滴定。通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養(yǎng)皿中，并置于-80。C(干水)的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50jil連續(xù)10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50pl培養(yǎng)基(IO孑L/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100|LilMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育，直至對照細胞達到細胞匯合，例如5-7天。在6-7天溫育后，小心地取出培養(yǎng)基，加入100jil含1/20WST-1的培養(yǎng)基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色曱臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數(shù)成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞0D士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。相比于三價裂解普通疫苗或PBS,用AS03或AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗在攻擊后觀察到較低的病毒脫落。采用AS03的保護作用比AS03+MPL稍好(參見攻擊后第2天)。由于每組的動物數(shù)量少，所以不能確定統(tǒng)計學顯著性。V.3.3.實驗結論相比于三價裂解普通疫苗，用AS03或AS03+MPL為佐劑的三價裂解疫苗觀察到針對全部3種毒抹的較高體液應答(HI滴度)(對3種毒株中的2種(即H3N2和B毒抹)至少為2倍)。就在雪貂中的保護效力而言，AS03和AS03+MPL制劑顯示出額外的利益(較低的病毒脫落和溫度)(圖10和11)。攻擊后，用AS03或AS03+MPL為佐劑的三價裂解疫苗免疫后沒有觀察到體液應答的加強。第二個研究一在雪貂中的異型攻擊研究表明測試的新制劑的效力V.4.基本原理和目標本研究研究了有佐劑或無佐劑的各種三價裂解疫苗的效力(依據其減輕病征(體溫)的能力)，以及其對異源攻擊后免疫雪貂鼻分泌物中的病毒脫落的作用。V.5.實驗設計由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(i也中海雪貂(A/orte/a;wto廠/z^/wra))(6只雪貂/纟且)。測i式4個小纟且*Fluadx*三價裂解疫苗AS03*三價裂解疫苗AS03+MPL*PBS雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCIDs。/ml)初免。在第21天，用全人劑量(500嗎疫苗劑量，l5iigHA/毒林)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/巴拿馬/2007/99和B/山東/7/97(17.5嗎HA)的組合肌內注射雪貂。然后在第43天通過鼻內途徑用異種亞型毒林H3N2A/懷俄明/3/2003(4.51LogTCID50/ml)J丈擊雪貂。V.6.結果結果的示意圖在圖12和圖13中給出。V.6丄溫度監(jiān)測在攻擊期間用傳感器并通過遙測記錄監(jiān)測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔前通過DSI進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圏養(yǎng)在單獨的籠中。結果(圖12)表明-在初免前后觀察一組與另一組之間的高可變性?；€看起來在-盡管體溫存在高可變性，但僅在PBS(6/6雪貂)、三價裂解普通疫苗(5/6雪貂)和以AS03為佐劑的三價裂解疫苗(2/6雪貂)免疫的雪貂中于攻擊后觀測到峰值。在用以AS03+MPL為佐劑的三價裂解疫苗免疫后未觀測到峰值(0/6雪貂)。-就發(fā)熱預防而言，AS03抗異源毒株看起來不如AS03+MPL有效。我們不能斷定佐劑間差異是源于不同的攻擊前抗體水平的可能性。V.6.2.病毒脫落(圖13)通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養(yǎng)皿中，并置于-8(TC(干水)的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50pl連續(xù)10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50pl培養(yǎng)基(IO孑L/稀釋度)的微量滴定板中。然后將100piMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于35。C溫育，直至對照細胞達到細胞匯合，例如達5-7天。在6-7天溫育后，小心地取出培養(yǎng)基，加入100pl含1/20WST-1的培養(yǎng)基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色曱臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數(shù)成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞0D士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。*義者的病毒應遂4全測初免前1天至初免后7天12只血貂的病毒脫落。結果以混合方式表示。在初免后7天觀測所有雪貂中的病毒清除。攻去y^的病毒應落檢測6只雪貂/組由攻擊前1天至攻擊后7天的病毒脫落。攻擊后2天，相比于用三價裂解普通疫苗和PBS免疫的雪貂，在用AS03和AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗免疫的雪貂中觀測到統(tǒng)計學顯著較低的病毒滴度(與普通疫苗相比，佐劑組AS03/AS03+旨1^的差異分別為1.25/1.22log和1.67/1.64log)。在第50天，在鼻清洗液中未檢測到病毒。V.6.3.血凝反應抑制測試(HI滴度)(圖14A和B)在初免前1天、初免后21天、免疫后22天和攻擊后14天收集血清樣品。使用血凝反應抑制測試(ffl)測定針對H3N2流感病毒(疫苗抹和攻擊抹)的抗血細胞凝集素抗體滴度。ffl測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。血清首先用25。/。神經氨酸酶溶液(RDE)處理，并熱失活，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感毒4朱溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的最高血清稀釋度的倒數(shù)。由于笫一個血清稀釋度為1:10，所以將不可檢測的水平記錄為等于5的滴度。潛果'結果示于圖14A和14B。在用H3N2A/巴拿馬免疫后，在用AS03或AS03+MPL佐劑化三價裂解疫苗免疫的雪貂中觀測到的體液應答(ffl滴度)比用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)免疫雪貂后觀測到的體液應答高。在用AS03或AS03+MPL佐劑化的H3N2A/巴拿馬免疫的雪貂中觀測到相似的ffl滴度。僅在用含A/巴拿馬H3N2毒林、AS03或AS03+MPL佐劑化的疫苗免疫后觀測到針對異源毒株A/懷俄明H3N2的交叉反應性HI滴度(在用三價裂解普通疫苗免疫后未觀測到)。在用異源毒一朱A/巴拿馬H3N2免疫并用A/懷俄明H3N2攻擊的雪貂中觀測到A/懷俄明特異性HI滴度的增強。正如所料，與同源攻擊相反，異源攻擊導致用AS03和AS03+MPL佐劑化的A/巴拿馬H3N2免疫的雪貂中A/巴拿馬特異性ffl滴度增加。V.6.4.該實驗的結論正如所料，與同源攻擊后的情況(無加強)相比，在異源攻擊后》見測到抗H3N2ffl滴度的加強。但是，在異源和同源攻擊后觀測到相似的保護作用(病毒脫落)。實施例VI—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在C57BI/6初免小鼠中的臨床前評價VI.l.實騶、沒計和目標與Fluarix普通(無佐劑)疫苗相比，在Explo-Flu-OOl臨床研究(參見實施例III)中觀察到針對三價流感裂解疫苗AS03的CD4T細胞應答顯著較高。在這兩個組之間未觀察到CD8T細胞和體液應答這二者的差異。目標是選擇解讀方式，以在小鼠中誘導類似于人中觀察到的CMI應答。具體地說，目標是通過使用裂解疫苗AS03或裂解疫苗AS03+嫌1^在小鼠中顯示出比裂解普通疫苗高的CMI應答。VI丄l.治療/組別由HarlanHorst,Netherland獲得6誦8周齡的雌性C57BI/6小鼠(15只小鼠/組)。測試組是-三^f介裂解普通疫苗-三價裂解疫苗AS03-三價裂解疫苗AS03+MPL畫PBS小鼠在第0天用異種亞型毒抹(5叫HA全失活H1N1A7約翰內斯堡/82/96、H3N2A/悉尼/5/97、B/哈爾濱/7/94)初免。在笫28天，用l.5|ugHA三價裂解疫苗(A/新喀里多尼亞/20/99、A/巴拿馬"O07/99、B/山東〃/9"普通疫苗或有佐劑疫苗(參見以下組別)肌內注射小鼠。VI.1.2.疫苗制劑的制備在每種制劑中，加入PBSIO倍濃縮液以達到等滲，在最終體積中為1倍濃縮液。計算H20的體積以達到目標體積。襲庫三,普遞(^￡炎湖劍,'制劑1(達500pi):將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒株中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750|ugTween80、110昭TritonX-100和100嗎VES。5分鐘撹拌后，加入15)Lig每種毒抹HlNl、H3N2和B，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則々者存于4°C。^^逸涵#乙濕佐浙^^3佐^/化^襲庫三#浙浙.'將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750|igTween80、110|ugTritonX-100和100ngVES。攪拌5分鐘后，加入15嗎每種毒抹H1N1、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250piSB62乳液(如在實施例I1.1中的教導制備)。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。^A^3^A^Z^佐^/^三,襲游賴W將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有750Tween80、110嗎TritonX-100和100|LigVES。攪拌5分鐘后，加入15叱每種毒株H1N1、H3N2和B，每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250plSB62乳液(如在實施例II.l中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25pgMPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。VL1.3.解讀CM/》V:CD4/C亂/L-2/層g染悉」在免疫后7天收集初免小鼠的PBMC。它們在混合物/組別中測試。VI.2.結果通過使用C57BI/6初免小鼠和作為再刺激抗原的全失活病毒1|ig/ml，確定顯示出較高CD4和CD8+T細胞頻率以及較低背景的條件。結果示于圖15(CD4T-細胞應答)和圖16(CD8T-細胞應答)。在這些條件下，有可能誘導*相比于裂解普通疫苗針對裂解AS03疫苗的較高的CD4T細胞應答，如在人中所觀察到的。'相比于裂解普通疫苗針對裂解AS03+MPL疫苗的較高的CD4T細月包應答。'在裂解普通疫苗和裂解AS03疫苗之間相似的CD8T細胞應答，如在人中所觀察到的。*與裂解AS03疫苗或裂解普通疫苗相比針對AS03+MPL的CD8T細胞應答較高的趨勢。實施例vn—有佐劑和無佐劑的裂解和亞單位流感疫苗在異源毒林初免C57BI/6小鼠中的臨床前評價VII.l.實驗沒計和目的與Fluarix普通(無佐劑)疫苗相比，在Explo-Flu-001臨床研究(參見實施例III)中觀察到針對三價流感病毒裂解AS03疫苗的CD4T細胞應答顯著4支高。在這兩個組之間未觀察到CD8T細胞和體液應答這二者的差異。使用異源毒抹初免的C57BI/6小鼠開發(fā)出一種動物模型，該模型重現(xiàn)了在人中觀察到的相似的免疫模式。對于ICS(胞內細胞因子染色)，再刺激用失活全病毒進行。目的是比較GlaxoSmithKline商用裂解疫苗(FluarixTM)相對于亞單位疫苗(Chiron的疫苗FluadTM)誘導的CMI應答以及用AS03或AS03+MPL或另一種水包油乳液佐劑(OW)佐劑化的這些疫苗獲得的CMI應答。VII丄l.治療/組別由HarlanHorst,Netherland獲得6-8周齡的雌性C57BI/6小鼠(24只小鼠/組)。小鼠在第0天用異種亞型毒抹(5嗎HA全曱醛失活H1N1A/約翰內斯堡/82/96、H3N2A/悉尼/5/97、B/哈爾濱/7/94)鼻內初免。在第29天，用1.5pgHA三價裂解(A/新喀里多尼亞/20/99、A/懷俄明/3/2003、B/江蘇/10/2003)普通疫苗或有佐劑疫苗(參見以下表39中的組另'J)肌內注射小鼠。表39<table>tableseeoriginaldocumentpage127</column></row><table>*FluarixTM**如在以下部分中的闡述生產的OWVIL1.2.疫苗制劑的制備OW的制備按照在ChironBehringFluAd疫苗中包含的說明書小冊子中公布的處方，制備叫做OW的水包油乳液。將注射用水、36.67mg檸檬酸和627.4mg檸檬酸鈉二水合物混合在一起，將體積調整至200ml。將470mgTween80與94.47ml該緩沖液混合，此混合物叫做"溶液A"。通過在磁力攪拌下混合3.9g鯊烯和470mgSpan85制備油性混合物。然后將溶液A加入油性混合物中，荻得的終體積是100ml。然后，混合物首先通過18GxlV2針，然后被以兩個樣品放入Ml10S農i流控器(得自Microfluidics)中，以減小油滴大小。當每個樣品獲得約150nm的粒度時，合并兩個樣品，經0.2|Lim濾器過濾。在TO時對合并的樣品獲得143nm的z均值，多分散性為0.10,在4。C儲存4個月后獲得145nm的z均值，多分散性為0.06。該粒度使用Zetasizer3000HS(得自Malvem)在以下技術條件下獲得-激光波長532nm(Zeta3000HS)-激光功率50mW(Zeta3000HS)-于90。檢測的散射光(Zeta3000HS)-溫/^:25C-持續(xù)時間由軟件自動確定-次數(shù)3次連續(xù)檢測-z均值直徑利用累積量分析將PBS10倍濃縮液(l倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375pg/mlTween80、55^g/mlTritonX-100和50貼/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15iug每種毒抹HlNl、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。邀2尉崎考f/m/」,將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375pg/mlTween80、55pg/mlTritonX-100和50|Lig/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15船每種毒林H1N1、H3N2和B,每次加入之間攪拌10分鐘。攪拌15分鐘后，加入250^OW乳液。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。逸3WWf7m/」,將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375嗎/mlTween80、55|ug/mlTritonX畫100和50pg/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15嗎每種毒林H1N1、H3N2和B，每次加入之間攪拌IO分鐘。攪拌15分鐘后，加入250SB62乳液。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH14)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒株中存在的去污劑)加入注射用水中，以達到終濃度375fxg/mlTween80、55jag/mlTritonX-100和50Hg/mlVES。攪拌5分鐘后，加入15jig每種毒林HlNl、H3N2和B，每次加入之間攪拌IO分鐘。攪拌15分鐘后，加入250^SB62乳液。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25pgMPL。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4"C。邀5^賴W(^,f7w/,'混合等體積的PBS和FluAdTM/GripguardTM疫苗(商用疫苗)。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則〗諸存于4'C。逸6W賴麻f對于7w/"將250piPBSmodpH7.4加入1劑500的Aggripal(商用疫苗)中。攪拌15分鐘后，加入250|LilSB62(按照對大規(guī)^莫生產詳述的方法制備)。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。邀7的賴W「/,f/m/入將PBSmodpH7.4加入1劑500pl的Aggripal(商用疫苗)中(以達到終體積1ml)。攪拌15分鐘后，加入250piSB62(按照對大M^莫生產詳述的方法制備)。然后加入25(LigMPL。攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。將250jxlPBSmodpH7.4加入1劑500jil的Aggripal中。攪拌15分鐘后，加入250pl如對組2制備的OW,攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4°C。邀9的斜W^于7w/"混合等體積的PBSmodpH7.4和Aggripal。攪拌制劑15分鐘如果不立即給予的話則儲存于4。C。VIU.3.解讀(表40)CMI(ICS):免疫后7天。IHA/中和測定免疫后21天。表40<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>在免疫后7天由24只小鼠/組收獲PBMC,在混合物/組別中測試。VII.2.結果VII.2丄體液免疫性在鼻內異源初免后14天和免疫后16天檢測24只動物/組的血清中抗3種疫苗抹的血凝反應抑制活性。對于3種毒抹和所有組，在免疫后觀測到加強的HI滴度。*對于相同佐劑和3種毒^^朱，亞單位疫苗和裂解疫苗i秀導相似的HI滴度。'對于3種毒林，和AggripalOW相比對Fluad觀測到相似的HI滴度。*對于H1N1和B毒株，沒有觀察到Fluarix和Aggripal之間的差異。*對于3種毒株，與普通流感疫苗相比，用有或沒有MPL的AS03佐劑化流感疫苗(裂解疫苗或亞單位疫苗)時觀察到統(tǒng)計學上顯著較高的HI滴度。*與普通流感疫苗相比，用OW佐劑化的流感疫苗(裂解疫苗或亞單位疫苗)中僅對A/懷俄明毒抹的ffl滴度在統(tǒng)計學上顯著較高。VII.2.2.細胞介導的免疫應答(在免疫后7天的ICS)0>/71勿應^吝一恩77J:豐在免疫后7天收集24只小鼠/組的PBMC，并在1個混合物/組中測試。失活的三價全病毒(lpg/ml)用作再刺激抗原。結果示于圖17上部。就表達IL-2、IFN-Y或這兩種細胞因子的流感全病毒特異性CD4+T細胞而言(圖17上部):1.GSK佐劑顯示出和先前觀測(實施例VI)相同的趨勢AS03+MPL優(yōu)于AS03,AS03又優(yōu)于用普通疫苗獲得的結果。對于裂解疫苗或亞單位疫苗這二者均觀察到此趨勢。2.無論哪種制劑(普通疫苗、AS03或AS03+MPL)，裂解疫苗都誘導比亞單位疫苗高的CD4+T細胞應答。3.Fluad(亞單位+水包油乳液OW—參見制備部分)看起來誘導與Fluarix普通疫苗相似的頻率。4.制劑三價裂解疫苗/AS03或三價裂解疫苗/AS03+MPL誘導高于制劑亞單位/水包油乳液OW的CD4+T細胞應答。CDSr勿/^^多一恩/77"謬在免疫后笫7天由24只小鼠/組收集PBMC,并在1個混合物/組中測試。失活的三價全病毒(lpg/ml)用作再刺激抗原。就表達IL-2、IFN，或兩種細胞因子的流感全病毒特異性CD8+T細^^而言(圖n下部)*該實驗的截取值相對較高，原因是對PBS陰性對照組觀測到的背景高。'但是，與其它疫苗制劑相比，對于用三價裂解疫苗/AS03+MPL免疫的小鼠觀測到較高的特異性CD8T細胞應答。VII.3.結果概述和結論獲得以下結果1)在免疫后7天通過ICS獲得的流感病毒特異性CD4+T細胞表明1.與Fluarix相比對Fluad獲得相似的應答。2.與無佐劑疫苗相比，對于裂解流感疫苗(如在人中觀測到的)和亞單位疫苗(Aggripal)(在人中未評價)這二者來說，有佐劑制劑均誘導較高的免疫應答。補加MPL的水包油乳液佐劑AS03(組4和組9)產生比水包油乳液佐劑AS03(組3和組8)高的應答。3.與裂解疫苗/AS03相比，針對裂解疫苗/AS03+MPL的CD4應答有較高的趨勢(圖17)。4.由裂解疫苗誘導的應答優(yōu)于用亞單位疫苗獲得的應答(對比組1-4和組5-9)。5.裂解疫苗，無論用有還是沒有MPL的AS03啦文佐劑(組3和4),都顯示出比亞單位疫苗(Fluad(組5)或者Aggripal+OW(組7》高的CD4+T細胞應答。2)在免疫后7天通過ICS獲得的流感病毒特異性CD8+T細胞表明，在裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗(如在人中觀測到的)之間未觀測到差異。與裂解疫苗/AS3和普通裂解疫苗相比，使用裂解疫苗/AS3+MPL獲得的CD8+T細胞應答有較高的趨勢。3)對于相同佐劑和3種毒抹，亞單位疫苗和裂解疫苗誘導相似的HI滴度。對于3種毒^朱，與普通流感疫苗相比，當流感疫苗(亞單位疫苗或裂解疫苗)用AS03或AS03+MPL喉支佐劑時觀察到統(tǒng)計學上顯著較高的滴度(僅對于A/懷俄明毒抹流感疫苗OW〉普通流感疫苗)。實施例VIII—用含裂解流感抗原制備物和有或沒有MPL佐劑的AS03的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗vni丄實驗設計在65歲以上(>65歲)老年人群中進行開i文、隨機、可控的I期研究，以便評價與FluarixTM疫苗(在比利時稱為a-RixTM)相比肌內給予的含佐劑AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。評價3個平行組1組50名受試者接受1劑重配和AS03佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03)1組50名受試者接受1劑重配和FluAS03+MPL佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03+MPL)1組50名受試者接受1劑FluarixTM(Fluarix)VIII.2.疫苗組成和給予在3種疫苗中使用的毒抹是已由WHO推薦用于2004-2005北半球流感季的毒株，即A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亞/3/2003(H3N2)和B/江蘇/10/2003。同F(xiàn)luarixTM/a-RixTM—樣，商用疫苗用作對比物，有佐劑疫苗(AS03或AS03+MPL)每劑含每種流感病毒抹的15(ig血細胞凝集素(HA)。有佐劑流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含佐劑(AS03或AS03+MPL》々預填充I型玻璃注射器組成。它們如在實施例II中的詳述制備。用于有佐劑流感候選疫苗配制的3種失活裂解病毒體抗原(單^介原液)與用于配制商用FluarixTM/a-Rix的活性成分完全相同。AW3在^/化的^銪；AS03佐劑化的流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原(335W)和含SB62乳液(335jal)的預填充I型玻璃注射器(佐劑容器)組成。AS03候選疫苗的描述和組成闡述于實施例III。佐浙/七W^麥.'簡而言之，AS03+MPL佐劑化的流感疫苗候選物是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶(抗原容器)中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原(335pl)和含AS03+MPL佐劑(360iil)的預填充I型玻璃注射器(佐劑容器)組成。在注射時，抗原容器的內容物通過使用含AS03+MPL佐劑的注射器由瓶中被取出，接著輕^f鼓混合注射器。在注射前，使用的針被肌內針替換，并將體積調整到530^。1劑重配的AS03+MPL佐劑化流感候選疫苗相當于530pl。為在AS03+MPL佐劑化疫苗重配時獲得每種流感抹的15pgHA,與FluarixTM(即30HA/ml)相比，失活的裂解病毒體抗原在抗原容器中被濃縮2倍(即60jigHA/ml)。1劑重配的佐劑化流感疫苗的組成與表45(參見實施例XI)中導良告的相同，只是流感株不同。兩種疫苗都肌內給予。VIII.3.CMI目標、終點和結果CM目標是確定相對于無任何佐劑的組合物，用AS03或AS03+MPL佐劑化的制劑之間哪種免疫原性組合物對流感抗原接種個體的CD4和CD8介導免疫性具有最強的免疫刺激活性。Vin.3丄CMI終點和結果在笫0天和第21天每106個細胞中針對5種不同細胞因子的細胞因子陽性CD4/CD8細胞的頻率。每個測試定量針對以下的CD4/CD8T細胞應答-以下3種抗原的混合物-新喀里多尼亞抗原-懷俄明抗原-江蘇抗原射經'在5種不同測試中用以下細胞表示的抗原特異性CD4和CD8-T-細胞應答(a)產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、IFNy、TNFa)的細胞(b)產生至少CD40L和另一種細胞因子(IL-2、TNFa、IFN力的細胞(c)產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、TNFa、IFN力的細胞(d)產生至少IFNy和另一種細胞因子(IL-2、TNFoc、CD40L)的細胞(e)產生至少TNFa和另一種細胞因子(IL-2、CD40L、IFN力的細胞CMZ^吝為、浙CMI分析基于總接種群體。(a)對于每個治療組，針對每個接種組、每個時間點(笫0天、第21天)和每種抗原新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇以及合并的3種不同毒抹，測定CD4/CD8T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)針對各5種不同的細胞因子，在時間點(接種后-接種前)之間對各個接種組和各種抗原的應答的個體差異的描述統(tǒng)計。(c)就5種不同細胞因子對比3組的以下方面-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇以及合并的3種毒抹的CD4T-細胞應答-針對新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇以及合并的3種毒抹的CD8T-細胞應答(d)非參數(shù)檢驗(Kruskall-Wallis檢驗)用于對比3組間的局部差異，針對各5種不同細胞因子計算各種抗原的統(tǒng)計學p-值。(e)Wilcoxon檢驗分別用于檢驗FluAS03+MPL對Fluarix、FluAS03+MPL對FluAS03以及FluAS03對Fluarix之間的2組成對比較。(f)所有顯著性檢驗都是雙尾的。小于或等于0.05的P-值被認為是統(tǒng)計學顯著的。VIII.3.2.CMI結果結T細胞的頻率，r-脈s勿顛辦(a)與在實施例III中所實施的類似，針對每個接種組、每個時間點(第0天、第21天)和每種抗原(合并的、新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇)，測定抗原特異性CD4T-淋巴細胞分泌應答的頻率。(b)通過Kruskall-Wallis檢驗對比3個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.05,被認為是統(tǒng)計學顯著的。(c)通過Wilcoxon檢驗對比FluAS03+MPL和Fluarix組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.05,被認為是統(tǒng)計學顯著的。(d)通過Wilcoxon枱二險對比FluAS03和Fluarix組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞的頻率差異，所有p-值都小于0.05，被認為是統(tǒng)計學顯著的。(e)通過Wilcoxon檢驗對比Flu和FluAS03+MPL組之間抗原特異性CD4T-'淋巴細l包的頻率差異，所有p-值都大于0.05,纟皮i/v為不是統(tǒng)計學顯著的。在好鳳.^凝辨^-凝神;^之河CD4r-沐s敘應的個沐^^(a)與已在實施例III中實施的類似，針對各5種不同細胞因子每個接種組和每種抗原在時間點(接種后-接種前)之間的CD4T-淋巴細胞應答的個體差異做描述統(tǒng)計。(b)通過Kruskall-Wallis檢驗對比3個組之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.001，被認為是高度統(tǒng)計學顯著的。(c)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03+MPL和Fluarix之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.05,被認為是統(tǒng)計學顯著的。(d)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03和Fluarix之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都小于0.001，被認為是高度統(tǒng)計學顯著的。(e)使用Wilcoxon檢驗對比FluAS03+MPL和FluAS03之間抗原特異性CD4T-淋巴細胞應答的接種后-接種前個體差異，所有p-值都大于0.05，被認為不是統(tǒng)計學顯著的。VIII.4.B細胞記憶應答目標、終點和結果研究的目標是研究與老年人群中的Fluarix相比，在用含佐劑AS03+MPL或AS03的流感候選疫苗進行1次肌內接種時，對流感病毒抗原特異性的記憶B細胞的頻率是否被顯著誘導。記憶B細胞的頻率通過B細胞Elispot測定評價。VIII.4.1.B細胞記憶應答終點終點是(a)在笫0、21天時就百萬(106)個產IgG漿細胞中的特異性抗原漿細胞頻率而言，在所有受試者中都通過B細胞ELISPOST檢測在體外培養(yǎng)記憶B細胞中產生的細胞。(b)在接種后(笫21天)和接種前(第0天)之間的差異也表示為每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。VIIL4.2.B細胞記憶應答結果測定每百萬(106)個抗體形成細胞中流感特異性抗體形成細胞的頻率。結果表明，通過Wilcoxon檢驗獲得的FluAS03+MPL和Fluarix組之間流感病毒抗原特異性記憶B細胞的頻率對B/江蘇毒抹而言顯著(p〈0.05)較高，而對其它兩種毒抹(A毒抹新喀里多尼亞和懷俄明)則不會這樣。還測定了對流感抗原特異性的記憶B細胞在時間點(接種后-接種前)之間的個體差異。結果表明，通過Kruskall-Wallis檢驗獲得的FluAS03+MPL和Fluarix組之間流感病毒抗原特異性記憶B細胞的頻率在時間點(接種后-接種前)之間的個體差異對B/江蘇毒抹而言顯著(p〈0.05)較高，而對其它兩種毒抹(A毒林新喀里多尼亞和懷俄明)不會這樣。結果示于圖18。實施例IX—有佐劑和無佐劑的流感疫苗在雪貂中的臨床前評價(研究III)IX.l.基本原理和目標^研究對比無佐劑的(FluarixTM)或用AS03+MPL佐劑化的GSK商用三1^介裂解流感疫苗和兩種其它商用亞單位疫苗-Fluad,Chiron的佐劑化亞單位疫苗(佐劑為Chiron的MF59佐劑)，-Agrippal,Chiron的無佐劑商用亞單位疫苗，其在本研究中用AS03佐劑做佐劑。本實驗的目標是評價這些疫苗在用異源毒抹攻擊的雪貂的鼻分泌物中減輕病征(體溫和病毒脫落)的能力。終點是1)主要終點在異源攻擊后減輕鼻清洗液中的病毒脫落2)次要終點通過IHA分析體液應答，并監(jiān)測初免和異源攻擊前后的溫度。IX.2.實驗設計IX.2丄治療/組由MISAYConsultancy(Hampshire,UK)獲得14-20周齡的雌性雪貂(地中海雪貂(A/wWe/firpwtohi^/wra))。雪貂在第0天用異種亞型毒抹H1N1A/斯德哥爾摩/24/90(4LogTCID5。/ml)鼻內初免。在第21天，用全人劑量(lml疫苗劑量，15嗎HA/毒株)的H1N1A/新喀里多尼亞/20/99、H3N2A/懷俄明/3/2003和B/江蘇/10/2003的組合肌內注射雪貂。然后在第42天用異型毒林H3N2A/巴拿馬/2007/99(4.51LogTCID5。/ml)通過鼻內途徑攻擊雪貂。組別(6只雪貂/組)描述于表41。要實施的解讀方式詳述于表42。表41<table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>IX.2.2.疫苗制劑的制備三,襲游普遞「尤佐W」斜刺,配辦成7附/.'將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有375)iigTween80、55|ugTritonX-100和50|igVES。攪拌5分鐘后，加入15昭每種毒抹H1N1、H3N2和17.5嗎B毒林，每次加入之間攪拌10分鐘。制劑于室溫攪拌15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4。C。^AWJ+^尸丄炎^/^^三#襲,賴襲'私敎成/w/將PBSIO倍濃縮液(I倍濃縮時為pH7.4)以及含Tween80、TritonX-100和VES的混合物(量計入毒抹中存在的去污劑)加入注射用水中。達到的去污劑量如下每1ml有375jugTween80、55jagTritonX-100和50jigVES。攪拌5分鐘后，加入15昭每種毒抹H1N1、H3N2和B，每次加入之間攪拌IO分鐘。攪拌15分鐘后，加入250SB62乳液(如在實施例II.l中的教導制備)。再攪拌混合物15分鐘，之后立即加入25MPL。于室溫攪拌制劑15分鐘，如果不立即給予的話則儲存于4'C。F/"薩辦鴕艦7附/,在PBS緩沖液pH7.4中配制FluAdTM疫苗的2倍稀釋液。爿g^;^/TMAW3賴/六癡教成7m/.'將250plPBS緩沖液pH7.4加入1劑AggripaFM中?；旌虾?，加入250jilSB62乳液(如在實施例II.l中的詳述制備)?；旌衔镉谑覝財嚢?。IX.2.2.解讀表42<table>tableseeoriginaldocumentpage141</column></row><table>In-單獨的ZPo-混合的IX.3.結果(圖19-22)IX.3丄溫度監(jiān)測用傳感器并用通過遙測記錄監(jiān)測個體溫度。檢查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通過DSI進行新校準。在這些檢測期間所有動物都獨立地圏養(yǎng)在單獨的籠中。由攻擊前2天直至攻擊后4天每15分鐘記錄溫度，由日中計算出平均溫度。結果示于圖19。錄'攻擊后，用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)或亞單位疫苗FluadTM(其含MF59水包油乳液)免疫雪貂后觀測到體溫峰值。在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗和用AS03佐劑化的亞單位AgrippalTM免疫雪貂后均未觀測到峰值。總之，對于裂解和亞單位測試疫苗，均顯示出含AS03的疫苗在攻擊后防止體溫升高的附加價值，相反含MF59的疫苗于攻擊后的雪貂中不能防止此體溫升高。IX.3.2.病毒脫落對每組6只動物進行鼻清洗物的病毒滴定。通過在清醒動物的兩個鼻孔中給予5mlPBS進行鼻清洗。將接種物收集在培養(yǎng)亞中，并置于干冰(-80。C)上的樣品容器中。所有鼻樣品都首先通過SpinX濾器(Costar)除菌過濾，以去除任何細菌污染。將50MJ連續(xù)10倍稀釋的鼻清洗液轉移至含50nl培養(yǎng)基(IO孑IV稀釋度)的微量滴定板中。然后將100piMDCK細胞(2.4x105個細胞/ml)加入每個孔，并于3rc溫育5-7天。在5-7天溫育后，小心地取出培養(yǎng)基，加入100pl含1/20WST-1的培養(yǎng)基，再溫育18小時。在存活細胞還原WST-1時產生的黃色甲臘染料的強度與病毒滴定實驗結束時存在于孔中的存活細胞數(shù)成比例，并通過在合適波長(450nm)檢測各孔的吸光度定量。截取值定義為未感染對照細胞的OD平均值一0.3OD(0.3OD相當于未感染對照細胞OD士3個標準偏差)。OD〈截取值時定義為陽性得分，相反，OD〉截取值時定義為陰性得分。病毒脫落滴度通過"ReedandMuench"測定，并表示為LogTCID50/ml。潛果結果示于圖20。與用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)或FluadTM亞單位疫苗免疫雪貂后觀察到的非常低的病毒脫落減少相比，用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或用AS03佐劑化的Agri卯aFM亞單位疫苗攻擊后觀察到較低的病毒脫落。與針對體溫升高所討論的相類似，相比于含MF59的疫苗觀察到含AS03疫苗的附加價值。IX.3.3.ffl滴度使用血凝反應抑制測試(HI)測定針對H3N2流感病毒沖朱的抗血細胞凝集素抗體滴度。HI測試的原理是基于特異性抗流感抗體通過流感病毒血細胞凝集素(HA)抑制小雞紅細胞(RBC)血凝反應的能力。血清首先用2S。/。神經氨酸酶溶液(RDE)處理并熱失活，以去除非特異性抑制劑。在預處理后，將2倍稀釋度的血清與4個血凝單位的每種流感抹溫育。然后加入小雞紅細胞，并記錄凝集抑制。滴度表示為完全抑制血凝反應的血清最高稀釋度的倒數(shù)。由于血清的笫一個稀釋度是1:10，所以不可檢測水平記錄為等于5的滴度。潛果'在用H3N2A/懷俄明免疫后，與用無佐劑(普通)三價裂解疫苗(FluarixTM)或FluadTM亞單位疫苗免疫雪貂后觀察到的體液應答相比，在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或AS03佐劑化的AgrippalTM亞單位疫苗免疫的雪貂中觀測到較高的體液應答(HI滴度)(圖21)。在用H3N2A/懷俄明免疫后，與用三價裂解普通疫苗或Fluad免疫的雪貂相比，在用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或AS03佐劑化的AgrippaFM免疫的雪貂中還觀測到針對用做攻擊抹的漂移抹H3N2A/巴拿馬的較高體液應答(HI滴度)(圖22)。用我們的佐劑(AS03或AS03+嫌1^)觀測到的針對異源毒抹的此交叉反應與用AS03+MPL佐劑化的三價裂解疫苗或AS03佐劑化的AgrippaFM亞單位疫苗免疫并隨后用此異源毒抹攻擊的雪貂中觀測到的保護作用相關聯(lián)。由含AS03疫苗誘導的針對異源毒抹的此交叉反應性不由MF59佐劑化的疫苗(FluAdTM)誘導。實施例X—用含裂解流感抗原制備物和有或無MPL佐劑的AS03的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗在第90天和180天的免疫原性持久性數(shù)據X.l.研究設計于65歲以上(>65歲)的老年人群中進行開放、隨機、可控的I期研究，以便評價與FluarixTM疫苗(在比利時稱為ot-RixTM)相比肌內給予的含佐劑AS03或AS03+MPL的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性。該研究遵循在實施例VIII中報告的研究。評《介三個平^亍組1組50名受試者接受1劑重配和AS03佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03)1組50名受試者接受1劑重配和FluAS03+MPL佐劑化的SV流感疫苗(FluAS03+MPL)1個對照組50名受試者接受1劑FluarkTM(Fluarix)X.2.免疫原性結果X.2丄體液免疫應答終點和結果為了評價由AS03和AS03+MPL佐劑化的疫苗誘導的體液免疫應答及其持久性，針對各個治療組計算以下參數(shù)。在笫0、21、90和WO天針對在疫苗中提供的3種流感病毒抹的每一種單獨測試的血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度(抗-H1N1、抗-H3N2和抗-B-抗體)。.在第0、21、90和180天具有95。/。CI的血清HI抗體GMT*在第21、90和180天具有95。/。CI的血清陽轉率*在第21天具有95%CI的轉變因子*在第0、21、％和180天具有95%0的血清保護率潛采具有95%CI的ffl抗體的GMT示于圖23。3個組中針對全部3種疫苗抹的抗體的接種前GMT處于相同范圍內。在接種后，抗血細胞凝集素抗體水平顯著增加。但是，接種后針對3種疫苗抹的抗體的接種后GMT對所有疫苗而言都仍在相同的范圍內。在第21天，對于A/新喀里多尼亞和B/江蘇毒抹來說，觀察到和Fluarix相比有利于2種有佐劑疫苗的輕4敫趨勢，在兩種有佐劑疫苗中，用FLUAS03觀察到針對A/懷俄明和B/江蘇毒抹的較高GMT。在第90天觀察到相同的趨勢。在笫180天，對3種疫苗來說，針對3種疫苗抹的抗體GMT在相同范圍內。在60歲以上的受試者中，所有流感疫苗都滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒林變化的協(xié)調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在接種后3個月(90天)和6個月(180天)，無論哪個所考察的研究組，血清保護率都仍高于歐洲官方要求的最低60%的保護率。在第90天,在3個疫苗組中對所有疫苗抹都仍達到歐洲官方要求的30%的最低血清陽轉率，F(xiàn)luarix的A/新喀里多尼亞株除外。在第180天，用3種疫苗對A/懷俄明和B/江蘇抹仍可達到該血清陽轉率，但對A/新喀里多尼亞抹不行(表43和表44)。表43以血清血凝反應抑制滴度高于或等于1:40的接種者百分率表示的血清保護率(免疫原性的ATP群體)21:40<table>tableseeoriginaldocumentpage146</column></row><table>N-結果可用的受試者數(shù)目n/%=滴度在特定范圍內的受試者的數(shù)目/百分率PRE-接種前滴度PI(D21)=在第21天采接種后血樣PI(D90)=在第％天采接種后血樣PI(D180)=在第180天采4妄種后血樣表44代表血凝反應抑制(HI)抗體滴度的血清陽轉率，定義為相比于第0天在各個接種后時間點的血清HI滴度具有至少達4倍增加的接<table>complextableseeoriginaldocumentpage147</column></row><table>N=接種前和接種后結果可用的受試者數(shù)目n/%=具有至少達4倍增加的受試者數(shù)目/百分率95%CI=精確的95%置信區(qū)間；LL=下限，UL-上限X.2.2.CMI應答終點和結果為了評價由有佐劑疫苗誘導的細胞免疫應答及其持久性，針對各個治療組計算以下參數(shù)在各個時間點(笫0、21、90和180天)在不同測試中每106個細胞中細胞因子陽性的CD4/CD8細胞的頻率(在第0天和21天單獨考察的以及合并的新喀里多尼亞、懷俄明和江蘇抗原；在第90天和180天單獨考察的以及合并的新喀里多尼亞、懷俄明、江蘇和紐約抗原)。Alldouble:產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IFN卞IL-2、TOF-a)的細胞。CD40L:產生至少CD40L和另一種細胞因子(IFN卞IL-2、TNP-a)的細胞。IFN-y:產生至少IFN-y和另一種細胞因子(CD40L、IL-2、TNF-a)的細胞。IL-2:產生至少IL-2和另一種細胞因子(CD40L、IFN誦y、TNF國a)的細月包。TNF-a:產生至少TNF-a和另一種細胞因子(CD40L、IFN卞IL-2)的細胞。潛^主要發(fā)現(xiàn)是(圖24):(a)接種后21天，相比于Fluarix組，在2個有佐劑的疫苗組中細胞因子陽性的CD4T細胞(IL-2、CD40L、TNF-a和IFN-力的頻率顯著較高。但是，在兩種佐劑之間沒有顯著差異。(b)有佐劑疫苗和Fluarix之間的所有統(tǒng)計差異至第90天和笫180天都得以保持，在第180天以下幾項除外'對于Alldouble、CD40L、IFN-y和IL2(僅懷俄明抹)和對于Alldouble、CD40L和TNF-a(僅紐約才朱)，在FluAS03/MPL和Fluarix之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學顯著差異，'對于IL2(僅江蘇株)，在FluAS03和Fluarix之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學顯著差異，(c)至第90天和第l80天，證實在兩種有佐劑的疫苗之間沒有統(tǒng)計學顯著的差異。(d)對于兩種有佐劑的疫苗，針對所研究的所有細胞因子(IL-2、CD40L、TNF-a和IFN-力，接種前和接種后(笫21天)之間CD4T-淋巴細胞應答的差異顯著高于FluarixTM。但是，在兩種佐劑之間沒有檢測到顯著差異。(e)接種對CD8應答沒有可檢測的影響，無論哪一個治療組。實施例XI—用含裂解流感抗原制備物以及AS03和MPL佐劑的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗XI丄研究設計和目標在65歲以上(>65歲)老年人群中進行開放、可控的1/1I期研究，以便評價含AS03+MPL佐劑的GlaxoSmkhKlineBiologicals流感候選疫苗的反應原性和免疫原性，所述老年人群先前于2004年用相同候選疫苗接種。為進行免疫原性和安全性評價，F(xiàn)luarixTM疫苗(在比利時稱為a-RixTM)用作參比。評價2個平行組l組約50名受試者，他們先前已在先前的臨床實驗中接受了1劑重配的佐劑化流感疫苗1個對照組(Fluarix)約50名受試者，他們在先前的臨床實驗當中已預先接受了1劑Fluarix此研究的1個目標是評價在首次劑量給予后約1年給予佐劑化流感疫苗FluAS03+MPL進行的再接種的體液免疫應答(抗血細胞凝集素和抗-MPL滴度)。為比較目的，已在先前實驗中接受Fluarix的受試者接受1劑商用疫苗，并構成該實驗的對照組。XI.2.疫苗組成和給予在3種疫苗中使用的毒抹是已由WHO推薦用于2005-2006北半球流感季的毒抹，即A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1)、A/新加利福尼亞/7/2004(H3N2)和B/江蘇/10/2003。同F(xiàn)iuarixTM/a-RixTM—樣，商用疫苗用作對比物，AS03+MPL佐劑化的疫苗(后文簡稱為"有佐劑疫苗")每劑含每種流感病毒抹的15昭血細胞凝集素(HA)。有佐劑的流感候選疫苗是一種2組分疫苗，由在I型玻璃瓶中提供的濃縮3價失活裂解病毒體抗原和含AS03+MPL佐劑的預填充I型玻璃注射器組成。它們已按照實施例II中詳述的方法制備。在注射時，將含佐劑的預填充注射器的內容物注入含濃縮三價失活裂解病毒體抗原的瓶中。在混合后將內容物吸入到注射器中，針用肌內針—,換。1劑重配的佐劑化流感候選疫苗相當于0.7ml。佐劑化流感候選疫苗是無防腐劑的疫苗。1劑重配的佐劑化流感疫苗的組成在表45中給出。兩種疫苗都肌內給予。表45重配有佐劑(AS03+MPL)流感候選疫苗的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>XI.3.免疫原性結果XU丄抗-HA體液免疫應答終點和結果在0天和21天血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度，分別對疫苗中提供的3種流感病毒抹的每一種測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B-抗體)。衍4f^"且順.'(f)接種前和接種后具有95%置信區(qū)間(95%CI)的血清HI抗體的幾何平均滴度(GMT)(g)21天時具有95%CI的血清陽轉率*(h)21天時具有95%CI的血清轉變因子**(i)21天時具有95%CI的血清保護率****血清陽轉率定義為針對每種疫苗抹的接種前HI滴度<1:10且接種后滴度>1:40的接種者百分率，或接種前滴度>1:10且接種后滴度增加至最少4倍的接種者百分率。**血清轉變因子定義為相比于第0天在第21天時針對每種疫苗抹的血清HIGMT的增加倍數(shù)。***保護率定義為接種后(針對每種疫苗林的)血清HI滴度>40的接種者百分率，通常將該百分率看作指示保護作用。潛果正如所料，在接種前2個組中的大部分受試者對3種毒抹已經是血清陽性的。針對全部3種疫苗抹的接種前GMT在2個組中處于相同范圍內。相比于Fluarix組，在FluAS03+MPL組中針對全部3種疫苗抹的接種后GMT有較高的趨勢，盡管95%CI是重疊的(圖25)。在60歲以上的受試者中，2種流感疫苗滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求[關于用于免疫學評價年度毒抹變化的協(xié)調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)](表46)。<table>tableseeoriginaldocumentpage152</column></row><table>N-受試者總數(shù)；％=在第21天時滴度處于特定范圍內的受試者百分率；CI=置信區(qū)間實施例XII—用含裂解流感抗原制備物、以AS03和兩個不同濃度的MPL佐劑化的疫苗在65歲以上老年人群中進行的臨床實驗xn丄研究設計和目標與在成人(18-40歲)中給予的FluarixTM(在比利時稱為a-RixTM)相比，對在老年人群(65歲及以上)中給予的含各種佐劑的GlaxoSmithKlineBiologicals流感候選疫苗的細胞介導免疫應答來說，開放的隨機I/II期研究表現(xiàn)出非劣效性。"^H介4個平^亍組(a)在一個對照組中的75名成人(18-40歲)，他們接受1劑FluarixTM(Fluarix組)(b)200名老年受試者(65歲及以上)，按照3:3:2隨機分為3組國一組75名受試者，他們接受以AS03+MPL為佐劑的流感疫苗(濃度1-25叫)畫一組75名受試者，他們接受以AS03+MPL為佐劑的流感疫苗(濃度2-50昭)-具有50名受試者的參比Flu組，他們接受1劑FluarixTM#要踏首要目標是就產生至少兩種不同細胞因子(CD40L、IL-2、TNF-a、IFN-y)的流感特異性CD4T-淋巴細胞的頻率而言，與在成人(18-40歲)中給予的FluarixTM相比，在老年受試者(65歲或以上)中給予的流感佐劑化疫苗在接種后21天表現(xiàn)出非劣效性。次要目標是(a)評價在老年人(65歲及以上)中肌內給予疫苗后的21天當中用佐劑化候選流感疫苗接種的安全性和反應原性。FluarixTM用作參比。(b)評價用佐劑化流感候選疫苗接種后21、90和180天的體液免疫應答(抗血細胞凝集素滴度)。FluarixTM用作參比。#三踏第三目標是評價用佐劑化流感疫苗接種后21、90和180天的細胞介導的免疫應答(產生IFN-y、IL-2、CD40L和TNF-oc以及記憶B-細胞應答)。FluarixTM用做參比。XII.2.疫苗組成和給予用AS03+MPL(每劑25!^g)系統(tǒng)佐劑化的流感疫苗也用于在實施例XI中闡述的研究。用AS03+MPL(每劑50嗎)系統(tǒng)佐劑化的流感疫苗具有相同組成，只是MPL濃度加倍。方法與實施例VIII中針對AS03+MPL佐劑化流感疫苗描述的方法相同，唯一的區(qū)別是MPL濃度加倍。對照全劑量Fluarix,通過IM給予。每名受試者進行4次預定p逸訪于0、21、90和180天的每次隨訪時收集血樣，以評價免疫原性。接種程序在笫0天進行1次流感疫苗注射。xii.3.免疫原性結果XII.3丄CM終點和結果蘭,終》旨在第21天在產生至少兩種不同細胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-oc和CD40L)的測試中，依據每106個細胞中流感特異性CD4T-淋巴細胞頻率的所有受試者的CMI應答為評價CMI應答，如下分析流感特異性CD4的頻率使用涉及對數(shù)變換滴度的ANCOVA模型依據佐劑化疫苗和FluYNG接種的組之間流感特異性CD4的頻率獲得GM比率。ANCOVA模型包括作為固定效果的疫苗組和作為回歸量的接種前對數(shù)變換滴度。GM比率及其98.75%CI來源于模型中相反的對應組的指數(shù)變換。調整的GM的98.75%CI通過以上ANCOVA模型的組最小平方法的98.75%CI的指數(shù)變換獲得。在用"合并的抗原II"體外再刺激后于第21天產生至少兩種細胞因子(IL-2、IFN-y、TNF-a和CD40L)的流感特異性CD4T-淋巴細胞的已調整GM和GM比率(及其98.75%CI)示于表47。對于每種佐劑化流感疫苗，GM比率的雙側98.75%CI的上限遠低于2.0的臨床限度。這表明了相比于在18-40歲的成人中給予的FluarixTM疫苗，給予給老年受試者的兩種佐劑化流感疫苗就流感特異性CD40的接種后頻率而言的非劣效性。表47第21天產生至少兩種細胞因子的流感特異性CD4的已調整GM比率(免疫原性的ATP群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage155</column></row><table>已調整的GM-根據基線滴度調整的幾何平均抗體；N-接種前和接種后結果可用的受試者數(shù)目；98.8%CI=調整的GM比率的98.8%置信區(qū)間(Ancova模型對基線調整)；LL-上P艮；UL-下限。潛果-y吝迷為Vfr藶2"主要發(fā)現(xiàn)是*接種前CMI應答如果在年輕人中比在老年人中高.接種后)o流感疫苗對年輕成人(18-40歲)中的CMI應答有加強作用o已接受佐劑化流感疫苗的老年人中的CMI應答與年輕成人中的CMI應答相當。'當我們對比Fluarix(18-40歲)和F1U/AS03+MPL(濃度l)時，除了IFNy之外，對于所有測試，與Fluarix(18-40歲)相比，接種前和接種后之間針對所研究的所有細胞因子(IL-2、CD40L、TNF-a和IFN-力的CD4T淋巴細胞應答差異在采用佐劑化疫苗時都顯著較高。應當指出的是，體外刺激用Flu抹(i)B/江蘇，(ii)A/H3N2/紐約和(iii)A/H3N2/懷俄明進行，而不是包含在疫苗中的A/HlNl/新喀里多尼亞。但是，來自一部分受試者的包含A/HlNl/新喀里多尼亞疫苗林的初步數(shù)據表明結果是相似的。潛果-一##_￡乾^羞為了評價第三終點，在第0、21、90和180天檢測流感特異性CD4/CD8T-淋巴細胞和記憶B細胞的頻率?？偨Y了對于每種抗原、每個疫苗組在第0和21天的流感特異性細胞因子陽性CD4/CD8T-淋巴細胞的頻率(描述統(tǒng)計)。非參數(shù)檢驗(Wilcoxon檢驗)用于對比兩個組之間的局部差異(佐^必處^'^家^/^cr^:),計算在各個測試中針對每種抗原的統(tǒng)計學p-值。在各個測試中針對每個接種組和每種抗原計算21天/0天(接種后/接種前)之間的應答個體差異的描述統(tǒng)計。非參數(shù)檢驗(Wilcoxon檢驗)用于對比個體差異(接種后/接種前接種)，計算每個不同檢驗中每種抗原的統(tǒng)計學p-值。用于對比流感特異性CD4T-淋巴細胞頻率差異的Wilcoxon檢驗的p-值示于表48。表48推理統(tǒng)計由Kruskal-Wallis檢驗獲得的CD4T細胞在各個時間點的p-值(免疫原性的ATP群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage156</column></row><table>組1:用AS03+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度1)組2:用ASO3+MPL佐劑化的流感疫苗(濃度2)主要結論是(a)流感特異性CD4的接種前GM頻率在所有老年受試者組中都是相似的，但在18-40歲的成人中較優(yōu)。(b)在用佐劑化疫苗接種的老年受試者中和在FluarixTM接種的18-40歲成人中，流感特異性CD4T淋巴細胞的接種后(第21天)頻率是相似的。(c)與FluarixTM相比，在用佐劑化疫苗接種后，老年受試者中流感特異性CD4T淋巴細胞的接種后(第21天)頻率顯著較高。(d)流感特異性CD8T細胞的接種前和接種后GM頻率在所有組中都基本相似。雄遂^瘦^吝弟^的伴/介在第0、21、90和1S0天血清血凝反應抑制(HI)抗體滴度，針對疫苗中提供的3種流感病毒株的每一種單獨測試(抗-HlNl、抗-H3N2和抗-B抗體)。抗所有疫苗抗原的HI抗體的截取值在分析前由實驗室確定(等于1:10)。血清陰性受試者是其抗體滴度低于截取值的受試者。血清陽性受試者是其抗體滴度大于或等于截取值的受試者。低于測定截取值的抗體滴度以一半截取值的任意值給出。基于HI抗體滴度，計算以下參數(shù)(j)在第0天和21天的ffl抗體的幾何平均滴度(GMT),采用對數(shù)滴度轉換平均值的反對數(shù)計算(k)第21天時的血清轉變因子(SF),定義為相比于第0天在笫21天時血清HIGMT的增加倍數(shù)。(I)第21天時的血清陽轉率(SC),定義為接種前HI滴度<1:10且接種后滴度>1:40的接種者百分率，或接種前滴度>1:10且接種后滴度有最少達4倍增加的接種者百分率。(m)第21天時的血清保護率(SPR),定義為血清HI滴度>1:40的接種者的百分率。分別獲得每個組的GM的95%CI。首先獲得對數(shù)轉換滴度平均值的95%CI,假定對數(shù)轉換滴度以未知方差正態(tài)分布。然后通過對數(shù)轉換滴度平均值的95%CI的指數(shù)轉換獲得GM的95%CI。具體抗體檢測的缺失的血清學結果不被替換。因此，在給定時間點無血清學結果的受試者不影響該時間點的測定分析。雄濕身^^吝趁^卩厲27和襲49)全部3種疫苗抹的HI抗體的接種前GMT在4個治療組中都處于相同范圍內。在接種后，相比于相同群體中的標準Fluarix,增加老年人中體液應答的2種佐劑有明顯的作用。GMT是'對于AS03+MPL(濃度2),針對H1N1的GMT顯著較高，*對于兩種佐劑，針對H3N2和B的GMT顯著較高，接種后21天，F(xiàn)luarix(18-40歲)受試者對新喀里多尼亞和B/江蘇抹的HI應答較高。如表49所示，在60歲以上的受試者中，佐劑化流感疫苗超出了歐洲官方對每年注冊的裂解病毒體流感疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒株變化的協(xié)調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在接種后，就ffl抗體的血清保護率而言，F(xiàn)luarixO65歲)組和以下組具有統(tǒng)計學差異'對于A/新嚷里多尼亞林，F(xiàn)luAS03+MPL(濃度2)對于各個疫苗抹，2種佐劑化流感疫苗組的血清保護率相比于Fluarix(1840歲)組處于相同范圍內。就ffl抗體的血清陽轉率而言，F(xiàn)luarix(>65歲)組和以下組具有統(tǒng)計學差異'對于A/新喀里多尼亞林的FluAS03+MPL(濃度2)'對于B/江蘇才朱的FluAS03+MPL(濃度1)對于各個疫苗抹，2種佐劑化流感疫苗組的血清陽轉率相比于Fluarix(18-40歲)組處于相同范圍內，新喀里多尼亞株除外。表49在第21天的血清保護率、血清陽轉率和轉變因子(免疫原性的ATP群體)<table>tableseeoriginaldocumentpage159</column></row><table>N-受試者總數(shù)；％=在21天時滴度處于特定范圍內的受試者百分率；CI-置信區(qū)間XII.3.2.免疫原性結論(a)相比于18-40歲的成人，老年人中的流感特異性CD4的接種前頻率明顯較差。在用FluarixTM接種后，相比于年輕人，老年人中的接種后頻率(笫21天)仍較差。相反，相比于在18-40歲成人中用FluarixTM接種，在用佐劑化疫苗接種老年受試者后表現(xiàn)出流感特異性CD4的接種后頻率的非劣效性。(b)關于依據HI抗體應答的體液免疫應答，所有流感疫苗都滿足歐洲官方對每年注冊的流感失活疫苗的要求["關于用于免疫學評價年度毒抹變化的協(xié)調流感疫苗要求的指引說明"(CPMP/BWP/214/96)]。在老年人中，有佐劑疫苗介導至少一種趨勢針對流感血細胞凝集素的體液免疫應答比FluarixTM高。表50總結了相比于FluarixTM在老年受試者中由有佐劑疫苗介導的針對每種疫苗林的體液免疫應答之間的差顯著異。相比于用FluarixTM接種的18-40歲成人，用有佐劑疫苗接種的老年受試者顯示出一種趨勢在第21天時抗A/紐約林的接種后GMT和血清轉變因子較高。表50在老年受試者中佐劑化疫苗和Fluarix之間體液免疫應答的顯著差異<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table>注意溫度在晚上記錄。在一天中的其它時間應另外進行溫度才企測，記錄最高溫度。表52成人中訴求癥狀的強度等級<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>*發(fā)熱定義為腋下體溫>37.5匸(99.5°F)局部注射部位發(fā)紅/肺脹的最大強度如下記錄0是0mm;l是〉0至^20mm;2是〉20至《50mm;3是〉50mm。如下記錄發(fā)熱的最大強度1是>37.5至^38.0。C;2是〉38.0至<39.0。C;3是〉39.0。C。研究者針對所有其它AE進行強度判斷，其它AE即主動訴求的癥狀，包括在研究當中報告的SAE。評價基于研究者的臨床判斷。記錄的每種AE的強度指定為以下的一種類別1(輕^斂)=受試者容易耐受的AE,引起最低的不適，且不干擾每天的活動；2(中等)=不適足以干擾每曰正?；顒拥腁E;3(嚴重)=阻礙每日正常活動的AE(在成A/青少年中，這種AE例如會阻礙上班/上學，應必須給予正確的治療)。XII.4.2.不良事件(AE)的記錄就局部和全身癥狀這二者來說，發(fā)現(xiàn)采用佐劑化疫苗在老年受試者中觀察到的反應原性比相同群體中用FluarixTM觀察到的高。但是，其顯示出與成人群體中觀察到的水平相似。相比于用Fluarix在老年受試者中觀察到的反應原性，用有佐劑疫苗接種后癥狀的發(fā)病率和強度增加(圖28)。在所有情況下，癥狀都快速消退。3級癥狀表現(xiàn)出一種趨勢與接受其中MPL為較低濃度的有佐劑疫苗的組別相比，在接受最高MPL濃度佐劑化疫苗的組別中較高。但是，在所有情況下，癥狀都快速消退。實施例XIII—使用AS03+MPL佐劑化的HPV疫苗在小鼠中的臨床前研究XIII.1.簡介用含各2.5嗎的4種不同抗原HPV16L1、HPV18L1、HPV31Ll和HPV45Ll的佐劑化混合物(為病毒樣顆粒形式)注射BALB/C小鼠。對于HPV16而言，每種L1蛋白都是除去34個氨基酸(或其它序列中的等同區(qū)域)的C-末端截短物。例如WO03/077942所述在桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達和純化HPV蛋白。四價VLP組合與2種不同佐劑中的1種組合。測試的佐劑是1氫氧化鋁和3-DMPL的混合物(稱為AS04)。2AS03+3D-MPL的混合物，基本如實施例2所述制備。佐劑AS04用于僅含HPV16和HPV18Ll病毒樣顆粒的疫苗，該疫苗在如TheLancet,364巻，947期，2004年11月13日，1757-1765所述的II期臨床實驗中測試。因此，其為與AS03+3D-MPL對比提供了良好的基礎。該佐劑可如例如WO01/17751和WO00/23105所述制備。對疫苗的每種組分進行抗體滴度分析。另外，在總IgG分子群中對HPV16和HPV18特異性的B記憶細胞進行分析。XIII.2.材料和方法xin.2丄動物模型用2.5叱HPV-16/18/31/45Ll在1條腿肌內免疫(第0天和28天)2組BALB/c小鼠(n=10),HPV-16/18/31/45Ll用AS04(Al(OH)350嗎+MPL5jig)或基本如實施例2制備的AS03+3D-MPL的混合物(含50pl乳液+MPL5iug)配制。XIII.2.2.抗HPV-16/18/31/45Ll血清學Ig使用HPV-16Ll(批號E16L1P093)、HPV-18Ll(批號E18L1P079)、HPV-31Ll(批號EA31L1P329)和HPV-45Ll(批號EA45L1P328)作為包被抗原，通過ELISA進行抗HPV-16/18/31/45Ll抗體的定量。HPV-16/18/31/45Ll和抗體溶液以50pl/孔使用；僅飽和溶液以100pl/孔使用。HPV-16/18/31/45Ll用PBS稀釋至終濃度0.5|ig/ml,并于4°C過^支吸附至96孔孩i量滴定板(MaxisorbImmuno-plate,Nunc,Denmark)的孔。在去除包被溶液后，接著將平板與含1%牛血清白蛋白的PBS(飽和緩沖液)于37。C溫育1小時。在去除飽和溶液后將在稀釋緩沖液(飽和緩沖液+0.1%Tween20)中稀釋2倍的小鼠血清加入包被平板，并于37。C溫育1小時30分鐘。用PBS0.1%Tween20清洗平板4次，并向每孔加入在飽和緩沖液中稀釋的綴合生物素的抗小鼠Ig1/1000(Dako),于37。C溫育1小時30分鐘。在清洗步驟后，加入在飽和緩沖液中稀釋1/3000的抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶復合物(Dako,UK)，再于37。C溫育30分鐘。如上清洗平板4次，于室溫與鄰苯二胺(SigmaMO,USA)0.04%H2020.03%的0.1%Tween200.05M檸檬酸鹽緩沖溶液pH4.5溫育20分鐘。加入H2S042N終止反應，于490/630nm對平板讀數(shù)。虹/&4諒射#使用連接計算機的微量滴定板讀板器檢測光密度(OD)。數(shù)據用SoftMaxPro軟件捕獲。為了滴定每個樣品，每個板上包含標準品。使用4參數(shù)邏輯對數(shù)函數(shù)計算標準曲線。通過標準曲線的內插計算每個測試樣品稀釋度的抗體濃度。通過平均落入標準曲線工作范圍(20-80%OD)中的所有稀釋度的值獲得抗體滴度。ELISA滴度以EU/ml表示。XIII.2.3.B記憶細胞ELISPOT在笫2次免疫后33天或75天，處死小鼠，通過Lymphoprep梯度分離脾細胞。然后將PBMC重懸浮在含添加物(丙酮酸鈉1mM、MEM非必需氨基酸、Pen/Strep、谷氨酰胺和P-2巰基乙醇)、5%胎牛血清、50U/mlrhlL-2(eBioscience)和3|iig/mlCpG(硫代磷酸化CpGODN-7909-5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'國SEQIDNO.l)的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco)中。其它CpG序列也適用于此B記憶細胞評價法。細胞以106個細胞/1111的終濃度、以5ml/平底6孔培養(yǎng)5天。在采用乙醇的活化步驟后，用10嗎/mlHPV-16/18Ll或用PBS稀釋至1/200的山羊抗小鼠Ig(GAM;Sigma)包被硝酸纖維素板(Multiscreen-IP;Millipore)。在采用完全培養(yǎng)基的飽和步驟后，將100pl的2.106個細胞/ml加入HPV-16/18Ll包被的平板，將100pi106和5.10s個細胞/ml加入GAM板。在37。C溫育2小時后，平板于4°C過夜儲存。用PBS0.1%Tween20清洗平板4次，將在PBS1%BSA5%FCS(稀釋緩沖液)中稀釋至1/200的抗小鼠IgBiot分配入平板，并于3rc溫育2小時。在清洗步驟后，加入用稀釋緩沖液稀釋至1/550的E對ravidinHRP(Sigma)，再于"。C溫育1小時。如上清洗平板，并于室溫與AEC(Sigma)溶液溫育10分鐘。通過在自來水下輕孩么淋洗板終止反應。在干燥后，平板用自動化ELISPOT圖象分析系統(tǒng)(ZeissKS400)讀取。對HPV-16/18Ll特異性的B記憶細胞的百分率對應于HPV-16/18Ll陽性斑點相比于總IgG斑點的比率。XIII.3.血清學結果(表53-55)表53<table>tableseeoriginaldocumentpage165</column></row><table>表55—B細胞記憶<table>tableseeoriginaldocumentpage166</column></row><table>XIII.4.結論在測試的動物模型系統(tǒng)中，AS03+3D-MPL佐劑對抗體生產和B細胞記憶這二者表現(xiàn)出的免疫原性結果等于(或者有時大于)用AS04產生的結果，這取決于評價的HPV類型。權利要求1.一種免疫原性組合物，所述免疫原性組合物包含(a)抗原或抗原性組合物，(b)水包油乳液佐劑；和(c)3DMPL，其中所述水包油乳液包含可代謝油、甾醇和乳化劑。22.權利要求1-21中任一項的組合物、用途或方法，其中所述免疫原性組合物包含具有B細胞表位的抗原。23.抗原在生產免疫原性組合物中的用途，所述免疫原性組合物用于再接種先前用抗原或抗原性組合物或其片段或變體、3D-MPL和水包油乳液佐劑接種的個體。24.權利要求23的用途，其中所述用于再接種的抗原與用于先前接種的抗原或抗原性組合物共有共同的CD4T-細胞表位。25.權利要求23或24的用途，其中所述用于再接種的抗原或抗原性組合物有佐劑。26.權利要求25的用途，其中所述佐劑是權利要求1-10中任一項定義的水包油乳液。27.權利要求25或26的用途，其中所述佐劑還包含3D-MPL。28.—種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括組合本文定義的水包油乳液、抗原或抗原性組合物以及3D-MPL。29.權利要求1-14中任一項的免疫原性組合物，所述組合物與藥物可接受的載體組合。30.—種用于藥物的組合物，所述組合物包含(a)抗原(b)本文定義的水包油乳液佐劑；和(c)3DMPL。31.權利要求1-30中任一項的組合物、用途或方法，其中所述抗原或抗原性制備物選自流感病毒、HPV。32.權利要求31的組合物、用途或方法，其中所述流感抗原選自裂解流感病毒、全流感病毒、亞單位流感病毒、流感病毒顆粒及其抗原性制備物。33.權利要求31的組合物、用途或方法，其中所述HPV抗原與癌癥或生殖器疣相關。34.權利要求33的組合物、用途或方法，其中所述癌癥相關的HPV是HPV16型和/或HPV18型。35.權利要求34的組合物、用途或方法，其中得自引起癌癥的HPV類型的一種或多種另外抗原與HPV16和/或18抗原一起^f吏用，所述抗原選自以下HPV類型HPV31、45、33、58和52。36.權利要求34或35的組合物、用途或方法，其中所述抗原為病毒樣顆粒形式。全文摘要本發(fā)明涉及流感疫苗制劑和用于免疫對抗各種疾病的接種方案。具體地說，本發(fā)明涉及含水包油乳液佐劑和3D-MPL的疫苗制劑、其在藥物中的用途，尤其是其在增強對各種抗原的免疫應答方面的用途，并涉及制備方法，其中所述水包油乳液包含甾醇、可代謝油和乳化劑。文檔編號A61K39/39GK101180078SQ200680017556公開日2008年5月14日申請日期2006年3月21日優(yōu)先權日2005年3月23日發(fā)明者E·J·哈農,J·斯蒂芬尼申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司