專利名稱：組蛋白脫乙酰酶抑制劑使癌細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑敏感的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)一般涉及組蛋白脫乙酰酶(deacetylase)抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受 體(EGFR)抑制劑的組合用于治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是世界上癌癥死亡的首要病因。盡管化療在晚期 (advanced)階段已經(jīng)帶來了一定的存活益處，標(biāo)準(zhǔn)的雙-藥組合產(chǎn)生了明顯毒 性并需要靜脈施用。由于肺癌生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展，所以開發(fā)了針對(duì)參與增生、 凋亡和血管發(fā)生的靶蛋白的小分子抑制劑。靶向治療劑如伊馬替尼(imatinib) 和曲司珠單抗(trastuzumab)在過表達(dá)所述靶蛋白的慢性髓樣白血病、胃腸基 質(zhì)腫瘤(GIST)和乳腺癌中帶來了持續(xù)的存活益處。表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR) 超家族，包括四種不同受體EGFR/erbB-l、 HER2/erbB-2、 HER3/erbB-3和 HER4/erbB-4被最早鑒定為實(shí)體肺瘤的潛在治療靶。這些受體在配體結(jié)合后， 形成同二聚體和異二聚體，使酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域活化，通過影響細(xì)胞周期進(jìn) 展、凋亡、血管發(fā)生和轉(zhuǎn)移，啟動(dòng)了癌癥發(fā)展和進(jìn)展中的級(jí)聯(lián)事件。EGFR 在很多人類上皮惡性腫瘤(malignancies)包括NSCLC中是過表達(dá)的。
鑒于EGFR分子網(wǎng)絡(luò)在癌癥中的生物學(xué)重要性，合成了多種分子來抑制 EGFR的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在這些新藥中最有前景的是吉非替尼(gefitinib) (ZD 1839， IRESSA , AstraZeneca, UK)、和厄洛替尼(erlotinib) (OSI 774, TARCEVA , Genentech， USA)。它們二者都是有口服活性的選擇性EGFR酪 氨酸-激酶抑制劑(EGFR-TKI)，且證實(shí)對(duì)表達(dá)EGFR的多種人癌細(xì)胞系有抗 腫瘤活性。同樣，有大量文獻(xiàn)報(bào)道，它們二者在臨床I期研究中都可以作為 單獨(dú)的制劑使用，所述研究包括化療耐受的NSCLC患者，其中約10%有反 應(yīng)。上述效果在大型II期臨床試驗(yàn)中得到證實(shí)，這些試驗(yàn)顯示，之前未治療 的晚期NSCLC患者19-26%有反應(yīng)，對(duì)一或多種在先化療組合失敗的患者 12-18%有反應(yīng)。最近，在National Cancer Institute Canada進(jìn)行的試驗(yàn)中才艮道 了厄洛替尼作為二線或三線療法的存活益處。
在用吉非替尼的II期試驗(yàn)中，未檢測(cè)到在EGFR蛋白表達(dá)和對(duì)治療的反 應(yīng)之間的相關(guān)性?；槛[狀細(xì)胞癌的患者盡管EGFR的表達(dá)率比腺癌患者高， 但他們的反應(yīng)率較低。近來的報(bào)道顯示在EGFR基因的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域中 的特異性錯(cuò)義和缺失突變與吉非替尼敏感性顯著相關(guān)。然而，雖然已報(bào)道客 觀反應(yīng)高達(dá)18%并且40%的未經(jīng)過選擇的吉非替尼治療的NSCLC患者有癥 狀改善，在未經(jīng)過選擇的US患者中這些突變的低頻率提示，其它機(jī)制也涉 及對(duì)吉非替尼的反應(yīng)。EGFR與細(xì)胞粘附分子包括整聯(lián)蛋白和E-4丐粘著蛋白 (E-cad， CDH1)相互作用。E-cad是鈣依賴性上皮細(xì)胞粘附分子，它在腫瘤侵 襲和轉(zhuǎn)移潛力中起重要作用。E-cad表達(dá)下降與患NSCLC的患者中的胂瘤 細(xì)胞分化、晚期以及存活下降有關(guān)。E-cad-介導(dǎo)的細(xì)胞粘附需要細(xì)胞內(nèi)通過 P-， a-和y-連環(huán)蛋白的相互作用連接到肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。EGFR的活化會(huì)造 成膜定位丟失以及E-cad和(3-連環(huán)蛋白的蛋白體(proteosomal)降解。E-cad也 涉及EGFR及其下游靶的調(diào)控。E-cad抑制EGFR和其它RTK的配體依賴性 活化。另 一方面，E-cad對(duì)鄰近細(xì)胞的作用導(dǎo)致AKT的PI 3-激酶-依賴性活 化和AKT到核的快速易位(translocation)。 E-cad也通過EGFR的配體-非依 賴性活化刺激MAPK途徑。在轉(zhuǎn)錄水平，c^/表達(dá)通過wnt/(3-連環(huán)蛋白信 號(hào)傳導(dǎo)，經(jīng)ERK或小窩蛋白(caveolin)的EGFR信號(hào)傳導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄因子AP-2， 基礎(chǔ)螺旋-環(huán)-螺旋E12/E47因子，和通過多種鋅指轉(zhuǎn)錄因子包括Slug/Snai
家族，SIP1和TF8 (ZEB-l, ZFHX1A, AREB6,犯F1)來調(diào)控。這些鋅指轉(zhuǎn)錄 因子通過與兩種5'-CACCTG (E-盒)啟動(dòng)子序列相互作用來調(diào)控多種基因的 表達(dá)。此種調(diào)控經(jīng)與CtBP相互作用而被促進(jìn)，其募集組蛋白脫乙酰酶 (HDAC),導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮和基因沉默。在肺癌細(xì)胞系中用制滴菌素A (trichostatin A, TSA)抑制HDAC導(dǎo)致E-cad活化。
至今，已經(jīng)鑒定十一種哺乳動(dòng)物HDAC并將它們分為3類(I-ni類)。 HDAC抑制劑是新發(fā)現(xiàn)的 一類治療劑，它們通過染色質(zhì)重構(gòu)和基因表達(dá)調(diào)控 促進(jìn)血液和實(shí)體惡性腫瘤的分化和凋亡。鑒定了幾種HDAC抑制劑，包括 苯甲酰胺(MS-275),短鏈脂肪酸(即苯基丁酸鈉(Sodium phenylbutyrate));異 羥將酸(hydroxamic acid)(即辛二酰苯氨定羥將酸(suberoylanilidine hydroxamic acid)和制滴菌素A);含2-氨基-8-氧代-9，10-環(huán)氧-癸?；糠值?環(huán)四肽(即trapoxin A)和無2-氨基-8-氧代-9,10-環(huán)氧-癸?；糠值沫h(huán)肽(即 FK228)。這些中的大部分正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。MS-275 (Schering AG)是正在
進(jìn)行血液和實(shí)體胂瘤的I期研究的苯曱酰胺HDAC抑制劑。MS-275被迅速 吸收并有100小時(shí)的半壽期；在施用MS-275之后組蛋白乙?；母淖兂掷m(xù) 數(shù)周。
非常需要確定會(huì)從EGFR抑制劑受益的患者，并確定可提高耐受EGFR 抑制劑的癌細(xì)胞的反應(yīng)性的療法，尤其是當(dāng)其用于表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞時(shí)。 特別是，需要發(fā)現(xiàn)提高表達(dá)EGFR的癌細(xì)胞系對(duì)EGFR抑制劑的敏感性的 治療策略。發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及治療患癌癥的患者的方法。此方法包括給患 者施用至少一種組蛋白脫乙酰酶(HD AC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因子受 體(EGFR)抑制劑的組合。 一方面，此組合被先后(sequentially)施用。例如， 在此方面，至少基本部分(a substantial portion)的HDAC抑制劑可以在施用基 本部分的EGFR抑制劑之前施用。 一方面，HDAC抑制劑是MS-275并且 EGFR抑制劑是吉非替尼。此方面，劑量策略(dosingregime)可以包括每周口 服2mg/m2MS-275共4周，之后每天口服250mg吉非替尼共4周。另一方 面，此組合在基本相同的時(shí)間段施用。例如，此方面，劑量策略可以包括每 周口服2mg/m2MS-275共4周，同期內(nèi)，每天口服250mg吉非替尼共4周。
本發(fā)明的另 一 個(gè)實(shí)施方案涉及治療患表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑-耐受的癌癥的患者的方法，該方法是通過使癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感來進(jìn) 行治療。此方法包括給患者施用至少一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和 至少一種EGFR抑制劑的組合。此實(shí)施方案的一方面，此方法還包含在施用 所述治療組合物之前評(píng)價(jià)所述癌癥以預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑的抗性的步驟。例 如，評(píng)價(jià)癌癥的步驟可包括(a)檢測(cè)患者的肺瘤細(xì)胞樣品中選自如下的生物 標(biāo)記物的水平(i)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的擴(kuò)增水平；(ii)EGFR基因 的多體性水平(a level of polysomy); (iii)人酪氨酸激酶受體型受體(HER2)基因 的擴(kuò)增水平；和(iv)HER2基因的多體性水平；(b)比較腫瘤細(xì)胞樣品中生物 標(biāo)記物的水平和所述生物標(biāo)記物的選自如下的對(duì)照水平(i)已確定與對(duì) EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的所述生物標(biāo)記物的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì) EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的所述生物標(biāo)記物的對(duì)照水平；和(c)選擇被預(yù)測(cè)不 會(huì)從治療性施用EGFR抑制劑受益的患者，或被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和
9EGFR抑制劑的組合受益的患者，條件是所述生物標(biāo)記物在所述患者腫瘤細(xì) 胞中的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的所迷生 物標(biāo)記物的對(duì)照水平，或條件是所述生物標(biāo)記物在所述患者腫瘤細(xì)胞中的水 平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似或低于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的所述生物標(biāo) 記物水平。
此實(shí)施方案的另一方面，此方法還包含如下步驟(a)檢測(cè)肺瘤細(xì)胞樣品 中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)蛋白表達(dá)的水平；(b)比較腫瘤細(xì)胞樣品中EGFR 蛋白表達(dá)的水平和EGFR蛋白表達(dá)的選自如下的對(duì)照水平(i)已確定與對(duì) EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗 性相關(guān)的對(duì)照水平；和(c)選擇;波預(yù)測(cè)不會(huì)從治療性施用EGFR抑制劑受益的 患者，或被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者，條 件是所述患者腫瘤細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于已確定與對(duì) EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的EGFR蛋白表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是所述患 者腫瘤細(xì)胞中EGFR蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似或低于已確定與對(duì)EGFR 抑制劑的抗性相關(guān)的EGFR蛋白表達(dá)的水平。
此實(shí)施方案的另一方面，此方法包括其他步驟(d)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中 E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平；(e)比較腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平 和E-4丐粘著蛋白表達(dá)的選自如下的對(duì)照水平(i)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的 敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水 平；和(f)選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者， 條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于已確定 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是 所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確定與對(duì) EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平。
此實(shí)施方案的的另一方面，此方法包括其他步驟(d)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品 中TF8的至少一種組分表達(dá)的水平；(e)比較腫瘤細(xì)胞樣品中TF8的至少一 種組分表達(dá)的水平和TF8的至少一種組分表達(dá)的選自如下的對(duì)照水平(i) 已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR 抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和(f)選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR 抑制劑的組合受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中TF8的至少一種組分 表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的TF8的至
少一種組分表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中TF8的至少一種 組分表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的TF8 的至少 一種組分表達(dá)的水平。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及治療患耐受至少一種表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)抑制劑的癌癥的患者的方法，該方法包括給患者施用至少 一種組蛋白 脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少一種EGFR抑制劑的組合，其中所述癌癥是 上皮惡性胂瘤。
在本發(fā)明的任何一個(gè)實(shí)施方案中，HDAC抑制劑可包括但不限于異羥肟 酸，羧酸，苯曱酰胺，環(huán)氧化物，短鏈脂肪酸，含有2-氨基-8-氧代-9，10-環(huán) 氧—癸?；糠值沫h(huán)四肽，和無2-氨基-8-氧代-9,10-環(huán)氧-癸?；糠值沫h(huán)肽。 異羥肟酸可包括但不限于辛二酰苯氨定羥肝酸，TSA，和SAHA。羧酸可包 括但不限于丁酸，丙戊酸(valproicacid),和4-苯基丁酸。苯曱酰胺可包括但 不限于N-acetyldinaline和MS-275。環(huán)氧化物可包括但不限于trapoxin, depeudecin,和縮酚酸肽(d印sipeptide)FK 228。在優(yōu)選實(shí)施方案中，HDAC 抑制劑是MS-275。 一方面，MS-275以如下劑量策略施用，其包括以每周口 服2 mg/m2共4周或每二周口服4 mg/m2共4周來施用MS-275 。
在本發(fā)明的任何一個(gè)實(shí)施方案中，EGFR抑制劑可包括但不限于吉非替 尼，厄洛替尼，吉非替尼的激動(dòng)劑和厄洛替尼的激動(dòng)劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中， EGFR抑制劑是吉非替尼或厄洛替尼。吉非替尼可以例如以包括每天口服 (PO)250 mg的劑量策略施用。厄洛替尼可以例如以包括每天口服(PO)150 mg 的劑量策略施用。
在本發(fā)明的上述任何一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥可包括但不限于上皮惡性腫 瘤(epithelial malignancy),月市癌(例如非小細(xì)胞月申癌)。 一方面，所述癌癥對(duì) EGFR抑制劑耐受。例如， 一方面，癌癥包括與對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性 細(xì)胞相比，EGFR基因的拷貝數(shù)增加得少或不增加或HER2基因的拷貝數(shù)增 加得少或不增加或具有其組合的癌性細(xì)胞。 一方面，癌癥包括與對(duì)EGFR抑 制劑敏感的癌性細(xì)胞相比，EGFR蛋白表達(dá)降低的癌性細(xì)胞。 一方面，癌癥 包括與對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性細(xì)胞相比，E-4丐粘著蛋白基因表達(dá)水平下 降的癌性細(xì)胞。 一方面，癌癥包括與對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性細(xì)胞相比， TF8的至少一種組分表達(dá)的水平升高的癌性細(xì)胞。此組分可包括ZEB1。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及選擇癌癥患者的方法，該患者被預(yù)測(cè)會(huì)從
治療性施用至少 一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因 子受體(EGFR)抑制劑的組合受益。該方法包括如下步驟(a)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞 樣品中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平；(b)比較腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白表 達(dá)的水平和E-鈣粘著蛋白表達(dá)的選自如下的對(duì)照水平(i)已確定與對(duì)EGFR 抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān) 的對(duì)照水平；和(c)選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受 益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低 于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的對(duì)照水平， 或條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確 定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平。
本發(fā)明的另 一種實(shí)施方案涉及選擇癌癥患者的方法，該患者被預(yù)測(cè)會(huì)從 治療性施用至少 一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因 子受體(EGFR)抑制劑的組合受益。該方法包括如下步驟(a)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞 樣品中鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò)增的水平；(b)比較腫瘤細(xì)胞樣品中鋅指轉(zhuǎn)錄因子 基因擴(kuò)增的水平和鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò)增的選自如下的對(duì)照水平(i)已確定 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制 劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和(c)選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑 制劑的組合受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò)增 的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因 子基因擴(kuò)增的對(duì)照水平，或條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò) 增的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的鋅指轉(zhuǎn)錄因 子基因擴(kuò)增的水平。
附圖簡(jiǎn)述
圖IA是顯示HDAC抑制劑通式結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖IB顯示HDAC抑制性化學(xué)物質(zhì)的例子。TSA(1)和SAHA(2)是異羥肟 酸；丁酸(3),丙戊酸(4)和4-苯基丁酸(5)是羧酸；MS-275(6)和 N-acetyldinaline(7)是苯曱酰胺；depeudecin(8)和trapoxine A(9)是環(huán)氧化物； 也顯示了 apicidin( 10)和縮酚酸肽FK228( 11)。
圖2顯示用吉非替尼單獨(dú)處理或用吉非替尼和MS-275的組合處理對(duì) HI75細(xì)胞的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通常涉及治療患癌癥的患者的方法，所述癌癥特別是表達(dá)表皮生 長(zhǎng)因子受體(EGFR)并耐受EGFR抑制劑如吉非替尼的癌癥。本發(fā)明人已經(jīng) 發(fā)現(xiàn)耐受EGFR的癌癥如耐受EGFR的非小細(xì)胞肺癌(NSCL)在用組蛋白脫
包括給所述患者施用包括組蛋白脫乙酰酶抑制劑和EGFR抑制劑的組合型 治療。 一個(gè)實(shí)施方案中，所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑和所述EGFR抑制劑以 先后順序施用。該方法也包括評(píng)價(jià)患者癌癥對(duì)于EGFR抑制劑的敏感性或抗 性，該評(píng)價(jià)是通過相對(duì)于對(duì)EGFR抑制劑-敏感的或耐受的肺瘤細(xì)胞對(duì)照， 檢測(cè)到患者肺瘤細(xì)胞樣品中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因(即編碼EGFR的 基因)的擴(kuò)增水平和/或表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的多體性水平或其缺 乏。本發(fā)明的方法可另外或可選包括相對(duì)于EGFR抑制劑-敏感的或耐受的 腫瘤細(xì)胞對(duì)照，檢測(cè)到肝瘤細(xì)胞樣品中E-4丐粘著蛋白或轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的提 高或ZEB-1蛋白或轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的下降。
癌癥治療。NSCLC細(xì)胞系被用作鑒定提高EGFR抑制劑在NSCLC中的作用 的潛在分子及其開發(fā)策略的^f莫型。用Western印跡分析和實(shí)時(shí)RT-PCR，本 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在五抹對(duì)EGFR抑制劑敏感的UCCC細(xì)胞系中有E-鈣粘著蛋白 表達(dá)。E-鉤粘著蛋白表達(dá)受鋅指抑制蛋白抑制。用實(shí)時(shí)RT-PCR發(fā)現(xiàn)，鋅指 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)在吉非替尼-耐受的細(xì)胞系中升高、在吉非替尼-敏感的細(xì)胞系 中缺乏。E-4丐粘著蛋白的過表達(dá)在對(duì)吉非替尼耐受的NSCLC細(xì)胞系中提高 了它們的敏感性。在最耐受的細(xì)胞系中單獨(dú)誘導(dǎo)或通過HDAC抑制劑 MS-275誘導(dǎo)E-鈣粘著蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致了類似于含EGFR突變的細(xì)胞系中 所發(fā)現(xiàn)的凋亡效果。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)E-鈣粘著蛋白的表達(dá)，及ZEBl預(yù)測(cè)了對(duì) EGFR酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)，并且用HDAC抑制劑預(yù)處理逆轉(zhuǎn)了對(duì) EGFR抑制劑的抗性。簡(jiǎn)言之，本發(fā)明人已經(jīng)評(píng)價(jià)了 E-cad及它的調(diào)控分子 在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)，并已經(jīng)發(fā)現(xiàn)E-cad表達(dá)在對(duì)EGFR抑制劑吉非 替尼耐受的細(xì)胞系中是缺乏的或下降的并在敏感細(xì)胞系中是活化的。
本發(fā)明人也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)EGFR抑制劑耐受的細(xì)胞系有TF8的高表達(dá)。具 體地，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過恢復(fù)E-cad表達(dá)、通過用HDAC抑制劑MS-275 致敏(priming)細(xì)胞，以及通過用EGFR抑制劑和HDAC抑制劑的組合治療處 理細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)了 NSCLC細(xì)胞系對(duì)吉非替尼的敏感性。本發(fā)明人在本文建議 了在患肺癌及其它類型的實(shí)體腫瘤的患者中克服對(duì)EGFR抑制劑的抗性的 首選已知策略。
本發(fā)明也包括給患者施用EGFR抑制劑和HDAC抑制劑的組合治療， 所述患者被預(yù)測(cè)特別會(huì)從這種治療受益，所述患者包括有對(duì)EGFR抑制劑無 反應(yīng)歷史的患者和被預(yù)測(cè)對(duì)用EGFR抑制劑治療反應(yīng)差或無反應(yīng)的患者(例 如基于確定抗性或敏感性的試驗(yàn))。PCT公開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng)描述 了選擇患者的特別優(yōu)選的方法，所述患者被預(yù)測(cè)對(duì)用EGFR抑制劑治療有反 應(yīng)或無反應(yīng)，本文全文引入此申請(qǐng)作為參考。本發(fā)明中，本發(fā)明人建議了可 用于確定患者的這些標(biāo)準(zhǔn)，這些患者^L預(yù)測(cè)會(huì)^人EGFR抑制劑和HDAC抑 制劑的組合受益。特別地，被預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑治療耐受(無反應(yīng))的患者， 如用PCT公開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng)描述的方法所鑒別的患者，可特別 受益于本發(fā)明的治療方法。另外，即使被預(yù)測(cè)很可能對(duì)EGFR抑制劑治療有 反應(yīng)(敏感)的患者也可用本發(fā)明方法治療。
特別地，如PCT公開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng)所述，將如下標(biāo)記物的 組合用于鑒定會(huì)對(duì)EGFR抑制劑敏感或耐受的患者(l)檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受 體(EGFR)基因(即編碼EGFR的基因)的擴(kuò)增水平；(2)檢測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)基因的多體性水平；(3)檢測(cè)HER2基因的基因擴(kuò)增水平；(4)檢測(cè) HER2基因的多體性水平；(5)檢測(cè)EGFR基因中的突變；(6)檢測(cè)EGFR蛋白 表達(dá)；和(7)檢測(cè)磷酸化的Akt表達(dá)。例如，此出版物公開了有腫瘤細(xì)胞的 患者，該腫瘤細(xì)胞顯示了對(duì)EGFR基因而言EGFR基因的擴(kuò)增和/或高多體 性(本文通常也指EGFR基因拷貝數(shù)上升或EGFR拷貝數(shù)增加)，和/或?qū)ER2 基因而言HER2基因的擴(kuò)增和/或高多體性(本文通常也指HER2基因拷貝數(shù) 上升或HER2拷貝數(shù)增加)，所述患者被預(yù)測(cè)特別對(duì)EGFR抑制劑治療有反 應(yīng)，因此是使用此線治療的最佳候選者。相比而言，患EGFR和/或HER2 基因拷貝數(shù)增加得少或不增加的腫瘤的患者被預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑處理的 結(jié)果差。這些患者可能是用本發(fā)明來治療的特別好的候選者。此出版物還公 開，對(duì)于EGFR陰性的患者(即僅基于EGFR結(jié)果未被預(yù)測(cè)對(duì)于EGFR抑制
劑有反應(yīng))，如果這些患者的腫瘤有HER2基因擴(kuò)增和/或HER2基因多體性 (例如高水平三體性或低或高水平的多體性)，所述患者比無HER2基因擴(kuò)增
的患者的結(jié)果好。進(jìn)一步地，對(duì)于僅基于EGFR結(jié)果預(yù)測(cè)對(duì)于EGFR抑制劑 有反應(yīng)的患者，從這些患者腫瘤中的HER2基因擴(kuò)增和/或高多體性可預(yù)測(cè)他 們比無HER2基因擴(kuò)增者對(duì)EGFR抑制劑治療有甚至更高的敏感性。此出版 物還公開，EGFR蛋白表達(dá)可用于預(yù)測(cè)患者用EGFR抑制劑治療的結(jié)果，所 用的評(píng)估規(guī)則依賴于樣品中表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度和所占部分，其中在計(jì) 分方案中上50%(即表示陽(yáng)性/高EGFR表達(dá)者)的有腫瘤細(xì)胞的患者在用 EGFR抑制劑治療時(shí)比在較低表達(dá)組中的那些有好很多的結(jié)果(例如較好的 反應(yīng)時(shí)間，較慢的進(jìn)展速度和較長(zhǎng)的存活時(shí)間)。進(jìn)一步地，PCT公開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng)證明，檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)與HER2或EGFR基因擴(kuò)增 或多體性的組合比檢測(cè) 一 種標(biāo)記物或不檢測(cè)標(biāo)記物可以顯著更好地預(yù)測(cè) EGFR抑制劑治療對(duì)患者的結(jié)果。另一組EGFR基因增加得少或不增加(即 "FISH-陰性")和EGFR蛋白表達(dá)低/無(即"IHC-陰性")的癌癥患者，他們占總 NSCLC群體的約30%，似乎從EGFR抑制劑得不到任何臨床益處(無/很低的 反應(yīng)率，進(jìn)展的時(shí)間短和存活時(shí)間短)。這些患者可能也是用本發(fā)明組合療 法治療的好的候選者。最后，兩個(gè)其它生物標(biāo)記物，稱為突變的EGFR基因 或磷酸化的Akt表達(dá)，可與任何上述生物標(biāo)記物和方案組合來提高檢測(cè)被預(yù) 測(cè)對(duì)EGFR抑制劑治療有反應(yīng)的患者的能力。例如，PCT公開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng)證明，檢測(cè)EGFR基因的突變與EGFR蛋白表達(dá)、EGFR 基因擴(kuò)增和/或多體性、和/或HER2基因擴(kuò)增和/或多體性的組合，可用于選 擇會(huì)從EGFR抑制劑治療獲得臨床益處的患者。檢測(cè)磷酸化的Akt (即活化 的Akt)與檢測(cè)EGFR蛋白表達(dá)和/或檢測(cè)EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的組合 可用于選擇會(huì)從EGFR抑制劑治療荻得臨床益處的患者。因此，通過任何這 些標(biāo)準(zhǔn)選出的對(duì)EGFR抑制劑治療反應(yīng)差或無的患者是用本發(fā)明方法治療 的特別好的候選者。
另外或可選地，有E-cad表達(dá)下降或缺乏的腫瘤細(xì)胞的患者也顯示EGFR 抑制劑-耐受的癌癥的表型，并且是本發(fā)明公開的組合治療的候選者。另外 或可選地，有TF-8表達(dá)活化或增強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞的患者也顯示EGFR抑制劑-耐受的癌癥的表型，并且是本發(fā)明公開的組合治療的候選者。
然而，本發(fā)明不限于任何上述的這些候選患者，因?yàn)槿魏伟┌Y患者都可 從使用本發(fā)明公開的組合治療受益。
下面將描述本發(fā)明的各個(gè)定義和方面，但本發(fā)明不限于任何可用于證明 或舉例目的的具體實(shí)施方案。
在本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明包括治療患癌癥的患者的方法，包 括給所述患者施用有效量的包含至少 一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑的治療組
合物和有效量的包含至少一種EGFR抑制劑的治療組合物的組合。該方法也 包括治療患對(duì)至少一種EGFR抑制劑耐受的癌癥的患者的方法，其包括給所 述患者施用有效量的包含至少一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑的治療組合物和 有效量的包含至少一種EGFR抑制劑的治療組合物的組合，其中所述癌癥是 上皮惡性腫瘤。
此組合可以先后或同時(shí)施用。有效治療癌癥的要施用的EGFR抑制劑和 HDAC抑制劑的用藥方法、劑量策略和量在本領(lǐng)域是已知的，并且可以由本 領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行常規(guī)優(yōu)化來確定要使用的每種化合物的優(yōu)選用藥方法、劑 量策略和量。這些組合治療可涉及在施用EGFR抑制劑之前、之間和/或之 后施用HDAC抑制劑。施用EGFR抑制劑可與施用HDAC抑制劑在時(shí)間上 隔開最多數(shù)周，并且可在之前或在之后，但施用EGFR抑制劑更通常會(huì)在最 多48個(gè)小時(shí)內(nèi)伴隨施用HDAC抑制劑，并且最常在不到24個(gè)小時(shí)內(nèi)，包 括從0到24小時(shí)及更長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以30分鐘為單位的任何倍數(shù)(例如30分鐘， 1小時(shí)，卯分鐘，2小時(shí)等)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用基本部分的包含至少一種EGFR抑制劑的 治療組合物之前施用至少基本部分的包含至少 一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑 的治療組合物。基本部分包括超過50%總遞送劑量的組蛋白脫乙酰酶抑制劑 的量，并且甚至更優(yōu)選包括超過約60。/。的總遞送劑量，優(yōu)選超過約70%的總 遞送劑量，優(yōu)選超過約80%的總遞送劑量，優(yōu)選超過約90%的總遞送劑量， 并且最優(yōu)選約100%的總遞送劑量。特別優(yōu)選的劑量策略包括在優(yōu)選的較長(zhǎng) 時(shí)間內(nèi)施用約100%的包含至少一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑的治療組合物， 之后在優(yōu)選的較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)施用約100%的包含至少一種EGFR抑制劑的治療 組合物。
另 一種優(yōu)選的實(shí)施方案包括在基本相同的時(shí)間段施用所述組合，即其中 至少基本部分的包含至少 一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑的治療組合物與基本 部分的包含至少一種EGFR抑制劑的治療組合物一起施用。基本部分包括超
過50%的總遞送劑量的組蛋白脫乙酰酶抑制劑的量，并且甚至更優(yōu)選包括超
過約60%的總遞送劑量，優(yōu)選超過約70%的總遞送劑量，優(yōu)選超過約80% 的總遞送劑量，優(yōu)選超過約90%的總遞送劑量，并且最優(yōu)選約100%的總遞 送劑量。
"治療有效量"意味著在施用給哺乳動(dòng)物特別是人用于治療癌癥時(shí)足以 有效治療癌癥的量。哺乳動(dòng)物的癌癥"治療"或"療法"包括如下的一或更多方 面抑制癌癥生長(zhǎng)(例如控制其發(fā)展)，防止癌癥傳播(例如防止轉(zhuǎn)移)，緩解 癌癥(例如使癌癥退化(regression))，防止癌癥復(fù)發(fā)，和減輕癌癥癥狀。因此， 治療益處或治療不一定是治愈具體疾病或狀況，而是優(yōu)選包括如下結(jié)果，最 通常包括緩解疾病或狀況，去除疾病或狀況，減少與疾病或狀況有關(guān)的癥狀，
導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移的肺瘤生長(zhǎng))，和/或防止疾病或狀況。治療患者的本領(lǐng)域一般技 術(shù)人員和/或經(jīng)過訓(xùn)練的臨床醫(yī)生可容易地評(píng)估有益作用。術(shù)語(yǔ)"疾病"指任何 偏離哺乳動(dòng)物正常健康的狀況(deviation)，包括存在疾病癥狀的狀態(tài)，以及 已出現(xiàn)偏離(例如感染，基因突變，遺傳缺陷等)但癥狀還不明顯的狀況。根 據(jù)本發(fā)明，本文公開的方法適用于脊推動(dòng)物種(Vertebmte)哺乳動(dòng)物類 (Mammalia)的患者，包括并且不限于靈長(zhǎng)類動(dòng)物，牲畜和家養(yǎng)寵物(例如陪 伴動(dòng)物(companion animal))。 最通常,患者是人類患者。
EGFR抑制劑和/或HDAC抑制劑可用對(duì);故治療對(duì)象和該對(duì)象狀況合適 的任何途徑施用。施用途徑包括但不限于注射施用，包括靜脈、腹膜內(nèi)、肌 肉、和皮下注射，經(jīng)粘膜或經(jīng)皮遞送，表面局部用藥(applications)、噴鼻劑 (nasal spray)、栓劑(suppository)等，或可優(yōu)選口服施用。配制劑可以任選為 脂質(zhì)體配制劑，乳劑(emulsion)， #皮-沒計(jì)透過粘膜來施用藥物的配制劑或經(jīng) 皮配制劑。對(duì)上述每種施用方法合適的配制劑例如見Remington: The Science and Practice of Pharm， 20th ed.， A. Gennaro， ed., Lippincott Williams & Wilkins， Philadelphia, Pa., U.S.A。典型的配制劑可以是口服或靜脈輸注的溶液。典型 的劑型可以是(用于口服施用的)片劑，用于靜脈輸注的溶液，和可重建為靜 脈輸注溶液的凍干粉末，但本發(fā)明包括任何合適的劑型。試劑盒可包含 HDAC抑制劑和EGFR抑制劑，也以例如在常見的外包裝中包裝在一起的劑 型。
制劑之外常規(guī)的藥物賦形劑及其它常規(guī)的無藥學(xué)活性劑(inactive agent)。另
的活性試劑(active agent)。這些其它的活性試劑可包括一或多種其它的藥學(xué) 活性試劑。所述組合物可以呈氣體、液體、半液體或固體的形式，以適于要 用的施用途徑來配制。對(duì)于口服施用，通常使用膠嚢和片劑。對(duì)于腸胃外施 用，通常重建如本文所述制備的凍干粉末。所述組合物還可包含稀釋劑如 乳糖，蔗糖，磷酸二鈣，或羧曱基纖維素；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂，硬脂酸鈣和 滑石粉；和粘合劑如淀粉，天然樹膠，如阿拉伯樹膠，明膠，葡萄糖，蜂蜜， 聚乙烯吡咯烷酮，纖維素及其衍生物，聚維酮(povidone)，交聚維酮及其它 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的粘合劑。液體藥物施用組合物例如，可通過將本文定 義的活性化合物與任選的藥物輔劑(adjuvant)溶解，分散，或者混合于載體中 形成溶液或懸液來制備，所述載體例如水，鹽水，葡萄糖水溶液，甘油，乙 二醇，乙醇等等。需要時(shí)，要施用的藥物組合物也可包含微(minor)量的輔助 物質(zhì)如濕潤(rùn)劑，乳化劑，或增溶劑，pH緩沖劑等等，例如，乙酸鹽，檸檬 酸鈉，環(huán)糊精衍生物，無水山梨糖醇單月桂酸酯，三乙醇胺乙酸鈉，三乙醇 胺油酸，及其它這類試劑。制備這種劑型的實(shí)際方法是本領(lǐng)域已知的，或?qū)?本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。要施用的組合物或配制劑在任何時(shí)候都包含足夠 量的本發(fā)明HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑來降低體內(nèi)的這種活性，從而 治療受試者的疾病狀況。
劑型或組合物可選包含0.005%到100。/。(重量比)的一或多種本發(fā)明的 HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑，其余包含如本文所述的那些其它物質(zhì)。 對(duì)于口服施用，可藥用的組合物可以任選包含任何一或多種通常使用的賦形 劑，如藥物級(jí)別的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，滑石粉(talcum)，纖維 素衍生物，聚羧曱纖維素鈉(sodiumcrosscarmellose)，葡萄糖，蔗糖，碳酸鎂， 糖精鈉(sodium saccharin),滑石粉。這些組合物包括溶液，懸液，片劑，膠 嚢，粉末，吸入劑(inhaler)干粉末，和持續(xù)釋放配制劑如但不限于植入物和 微嚢化的(microencapsulated)遞送系統(tǒng)，以及生物可降解的生物相容性聚合 物，如膠原蛋白，乙烯乙酸乙酯，聚酐，聚乙醇酸，聚原酸酯，聚乳酸(polylactic add)及其它。制備這些配制劑的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。組合物可 選包含0.01%-100%(重量比)，可選0.1-95%, 1-95%的一或多種本發(fā)明的 HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑。
本發(fā)明HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑的鹽，優(yōu)選鈉鹽，可以用防止 機(jī)體迅速去除化合物的載體，如定時(shí)釋放(time release)的配制劑或包衣來制
物劑型可以是固體，凝膠或液體。固體劑型的例子包括但不限于片劑，膠嚢， 顆粒，和散裝(bulk)粉末。口服片劑的更具體的例子包括壓縮的，可咀嚼酡 劑(lozenge)和可以帶腸包衣的(enteric-coated)、糖包衣的或薄膜包衣的片劑。 膠嚢的例子包括硬或軟明膠的膠嚢。顆粒和粉末可以非發(fā)泡或發(fā)泡 (effervescent)形式提供。每種都可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組分組合。 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的HDAC抑制劑以固體劑型優(yōu)選膠嚢或片劑提 供。片劑，丸劑，膠囊，錠劑(troch)等等可以任選包含一或多種如下成分或 類似性質(zhì)的化合物粘合劑；稀釋劑；崩解劑；潤(rùn)滑劑；助流劑(glidant); 甜味劑；和調(diào)味劑(flavoring agent)?？捎玫恼澈蟿┑睦影ǖ幌抻谖⒕?纖維素，黃蓍膠樹膠(tragacanth),葡萄糖溶液，阿拉伯膠漿(acacia mucilage), 明膠溶液，蔗糖和漿糊(starch paste)。可用的潤(rùn)滑劑的例子包括但不限于滑 石，淀粉，硬脂酸鎂或鈣，石松粉(lyc叩odium)和硬脂酸?？捎玫南♂寗┑?例子包括但不限于乳糖，蔗糖，淀粉，高嶺土(kaolin),鹽，甘露醇和磷酸二 鈣?？捎玫闹鲃┑睦影ǖ幌抻谀z體二氧化硅?？捎玫谋澜鈩┑睦?包括但不限于聚羧曱纖維素鈉，淀粉甘醇酸鈉(sodium starch glycolate),海藻 酸，玉米淀粉，土豆淀粉，膨潤(rùn)土，曱基纖維素，瓊脂和羧曱基纖維素。可
于水的FD和C染料，其混合物；和混懸于水合氧化鋁(aluminahydrate)中的 不溶于水的FD和C染料。可用的甜味劑的例子包括但不限于蔗糖，乳糖， 甘露醇和人造甜味劑如環(huán)己氨基磺酸鈉(sodium cydamate)和糖精鈉，以及任 何數(shù)量的噴霧干燥的(spray-dried)香料(flavor)?？捎玫恼{(diào)味劑的例子包括但不 限于從植物如水果提耳又的天然香料及產(chǎn)生愉悅感(pleasant sensation)的化合 物的合成混合物，如，但不限于薄荷和水楊酸曱酯。可用的濕潤(rùn)劑的例子包 括但不限于丙二醇單硬脂酸酯，無水山梨糖醇單油酸酯，二甘醇單月桂酸酯 (diethylene glycol monolaurate)禾口聚氧乙少希十二步克基醚(polyoxyethylene lauryl ether)?？捎玫闹雇滤?anti-emetic)包衣的例子包括但不限于脂肪酸，脂肪， 蠟，蟲膠，銨化蟲膠和鄰苯二甲酸乙酸纖維素酯?？捎玫谋∧ぐ碌睦影?括但不限于羥乙基纖維素，羧曱基纖維素鈉，聚乙二醇4000和鄰苯二曱酸乙酸纖維素酯。如需要口服施用，化合物的鹽可以任選在保護(hù)其不受胃的酸 性環(huán)境作用的組合物中提供。例如，可在腸包衣中配制組合物，該包衣使組 合物在胃中保持完整性并在腸中釋放活性化合物。組合物也可與抗酸藥
(antacid)或其他這類成分組合配制。本發(fā)明的化合物也可作為酏劑(elixir), 懸液，糖漿，威化餅干(wafer)， sprinkle, 口香糖等等的組分施用。除了活性 化合物之外，糖漿可任選包含蔗糖作為甜味劑并包含一些防腐劑，染料，著 色料(coloring)和香料。
劑的組合物，所述HDAC抑制劑例如，異羥肟酸如辛二酰笨氨定羥肟酸， TSA和SAHA (NVP-LAQ-824， PXD-1-1);羧酸如丁酸，丙戊酸，和4-苯基 丁酉殳；笨曱醜胺^口 N-acetyldinaline和MS-275; 3不IU匕4勿^口 trapoxins， depeudecin，縮酚酸肽FK228;短鏈脂肪酸；含有2-氨基-8-氧代-9，10-環(huán)氧-癸?；糠值沫h(huán)四肽，和無2-氨基-8-氧代-9,10-環(huán)氧-癸?；糠值沫h(huán)肽。見

圖1。特別優(yōu)選的HDAC抑制劑是MS-275。
HDAC抑制劑的優(yōu)選施用量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來選擇，并包括本領(lǐng)域 已知對(duì)治療癌癥有效的量。用HDAC抑制劑治療癌癥的合適方法和HDAC 抑制劑的合適用量的例子是本領(lǐng)域已知的，如，例如見美國(guó)專利公開號(hào) 20040132825,美國(guó)流水號(hào)10/692,523， Bacopoulos等，名為"METHODSOF TREATING CANCER WITH HDAC INHIBITORS", 2003年10月24日提交， 其全文引入本文作為參考。HDAC抑制劑的合適劑量包括HDAC抑制劑的 已確認(rèn)的劑量，如本文所列的和本領(lǐng)域已知的文獻(xiàn)所述。MS-275的優(yōu)選施 用量，例如，包括約0.01毫克每平方米(mg/m"的最小量和約l，OOO mg/m2 的最大量，并且可包括如下的范圍約0.1 mg到約lOOmg,約0.2mg到約 90 mg，約0.3 mg/m 到約70 mg/m2，約0.4 mg/m2到約50 mg/m2,約0.5 mg/m2 到約30 mg/m2,約0.6 mg/m2到約20 mg/m2，約0.7 mg/m2到約15 mg/m2， 約0.8 mg/m2到約10 mg/m2,約0.9 mg/m2到約5 mg/m2。其它優(yōu)選施用的量 包括約0.1 mg/m2，約0.5 mg/m2,約1 mg/m2，約1.5 mg/m2,約2 mg/m2， 約2.5 mg/m2,約3 mg/m2，約3.5 mg/m2，約4 mg/m2，約4.5 mg/m2,約5. mg/m2, 約5.5 mg/m2,約6 mg/m2,約6.5 mg/m2，約7 mg/m2，和約7.5 mg/m2。可 在任何時(shí)間段，例如每日，每2-6天，每?jī)芍?，每月，或每周施用所述劑量?在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的HDAC抑制化合物可被口服施用，但也可通
過靜脈和肌肉注射施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，以四周內(nèi)按照每周口服2 mg/m2 共三周或每?jī)芍芸谠耹 4 mg/m2來施用HDAC抑制劑如MS-275 。
與本發(fā)明方法相容的含EGFR抑制劑的治療組合物包括含EGFR抑制劑 的組合物?，F(xiàn)在有兩類主要的EGFR抑制劑抗-EGFR家族酪氨酸激酶抑制 齊'K小分子)和抗-EGFR單克隆抗體。小分子的例子包括EGFR-特異的且可逆 的抑制劑如，例如，吉非替尼(IRESSA ,ZD1839),厄洛替尼(TARCEVA , OSI-774, CP-358)，或PKI-166; EGFR-特異的且不可逆的抑制劑，如EKI-569; PAN-HER(人EGF受體家族)可逆的抑制劑，如GW2016 (革巴向EGFR和 Her2/neu);和PAN-HER不可逆的抑制劑，如CI-1033 (4-苯氨基喹唑啉)。單 克隆抗體的例子包括C225(CETUXIMAB), ABX-EGF(人)(Abgenics， San Francisco, CA), EMD-72000(人源化的)，h-R3(人源化的)，和MDX-447(雙特 異性的，EGFR-CK64)。治療性組合物也包括與吉非替尼和厄洛替尼具有基 本相同生物活性的藥物。特別優(yōu)選的EGFR抑制劑是吉非替尼和/或厄洛替 尼。EGFR抑制劑的優(yōu)選施用量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員來選擇，并包括本領(lǐng)域 已知對(duì)治療其它癌癥有效的量。EGFR抑制劑的合適劑量是EGFR抑制劑已 確認(rèn)的劑量，如本文所列的和本領(lǐng)域已知的文獻(xiàn)所述。用EGFR抑制劑治療 癌癥的合適方法和EGFR抑制劑的合適用量的例子是本領(lǐng)域已知的，如，例 如見美國(guó)專利公開號(hào)20030114504,美國(guó)流水號(hào)10/228,544， Webster等，名 為"COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER"， 2002年8月27日提交，其全文引入本文作為參考。優(yōu)選的施用或治療量包 括約5 mg的最小量和約20,000 mg的最大量，并且可包括如下的范圍約 20 mg到約15,000 mg，約40 mg到約10,000 mg,約80 mg到約5000 mg， 約120 mg到約2000 mg,約180 mg到約1500 mg,約200 mg到約1000 mg, 約250 mg到約800 mg，約300 mg到約700 mg,約400 mg到約600 mg。 其它優(yōu)選量包括約10 mg,約50 mg,約100 mg,約150 mg，約200 mg, 約250 mg，約300 mg,約350 mg，約400 mg,約450 mg，約500 mg,約 550 mg,約600mg,約650 mg，約700 mg,約750 mg,約800mg，約850 mg，約900mg，約950mg，約1000mg,約1200 mg，約1400mg,約1600 mg，約1800 mg,約2000 mg,約2200 mg，約2400 mg，約2600 mg，約 2800 mg,約3000 mg,約3500 mg,約4000 mg，約4500 mg,約5000 mg， 約5500 mg，約6000mg,約6500 mg,約7000mg,約8000 mg,約10,000
mg,約12,000 mg,和約15,000 mg?？稍谌魏螘r(shí)間段，優(yōu)選每月，更優(yōu)選 每周，甚至更優(yōu)選每天給予所述劑量。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的EGFR抑制化合物可被口服施用，但也可 通過靜脈和肌肉注射施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，EGFg抑制劑是吉非替尼， 并且每周一次口服施用約2,000 mg的藥丸(bolus)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述EGFR抑制劑是吉非替尼，并以每天約250 mg施用。在另一個(gè)實(shí)施方案 中，所述抑制劑是厄洛替尼，并以每天約150mg 口服施用。
施用任何HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑的時(shí)間段是本領(lǐng)域已知的和/ 或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，其包括約l天，約2天，約3天，約4天，約 5天，約6天，約1周，約1周半，約2周，約2周半，約3周，約3周半， 約4周，約5周，約6周，約8周，約10周，約15周，約20周，約25周， 約30周，約40周，以及約52周。所述HDAC抑制劑和/或EGFR抑制劑可 選在間插有一或多個(gè)休息時(shí)間段(rest period)(即不施用HDAC抑制劑和/或 EGFR抑制劑)的多個(gè)連續(xù)時(shí)間段內(nèi)施用。休息時(shí)間段也是本領(lǐng)域已知的和/ 或可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，其包括約l天，約2天，約3天，約4天，約 5天，約6天，約1周，約l周半，約2周，約2周半，約3周，約3周半， 約4周，約5周，約6周，約8周，約10周，約15周，約20周，約25周， 約30周，約40周，以及約52周。
用本發(fā)明方法治療的優(yōu)選癌癥包括上皮惡性腫瘤，特別是表達(dá)EGFR的 任何癌癥(腫瘤)。待治療的優(yōu)選癌癥是耐受EGFR抑制劑的癌癥，并且一方 面可以是耐受EGFR抑制劑的上皮惡性腫瘤。在耐受EGFR抑制劑的癌癥中， 癌癥可包括幾乎無或根本無拷貝數(shù)增加(低/無基因擴(kuò)增或多體性)的腫瘤(癌 性細(xì)胞)，EGFR蛋白低表達(dá)的腫瘤(在合適的計(jì)分方案的下部50。/。，見PCT公 開號(hào)WO 2005/117553的申請(qǐng))，或特別是EGFR基因增加得少或不增加和 EGFR蛋白低/無表達(dá)的組合。耐受EGFR的癌癥也包括EGFR增加得少或不 增加并且是P-Akt陽(yáng)性的的腫瘤，或有EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性但是P-Akt 陰性的肺瘤。耐受EGFR的癌癥也包括符合上述差或無反應(yīng)者的一或多種其 他標(biāo)準(zhǔn)的無EGFR突變的肺瘤。
在另 一種優(yōu)選的耐受EGFR的癌癥中，所述癌癥優(yōu)選包含E-鈣粘著蛋白 基因表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性細(xì)胞下降的癌性細(xì)胞。在另 一種優(yōu)選的耐受EGFR的癌癥中，所述癌癥優(yōu)選包含鋅指轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平
相對(duì)于對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性細(xì)胞提高的癌性細(xì)胞。優(yōu)選的鋅指轉(zhuǎn)錄因 子是TF8。另一種優(yōu)選的待治療的癌癥是肺癌，特別優(yōu)選的是源自表皮細(xì)胞 的肺癌，如非小細(xì)胞肺癌。
本發(fā)明方法也包括治療患耐受EGFR抑制劑的癌癥的患者的方法，其包 括使耐受至少一種EGFR抑制劑的癌細(xì)胞致敏的步驟，其包括給所述患者施 用有效量的包含至少 一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑的治療組合物和有 效量的包含至少 一種EGFR抑制劑的治療組合物的組合。
本發(fā)明方法也包括另一步驟，其包括評(píng)價(jià)癌癥以預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑的 敏感性或抗性的步驟。該方法包括評(píng)價(jià)任一種預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑治療反應(yīng) 差或無的上述標(biāo)記物。例如， 一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)癌癥對(duì)EGFR抑制劑的 敏感性或抗性的步驟包括a)檢測(cè)待測(cè)患者肺瘤細(xì)胞樣品中的表皮生長(zhǎng)因子 受體(EGFR)基因擴(kuò)增水平和/或表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因多體性水平；
b) 將胂瘤細(xì)胞樣品中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水平與選自下組的EGFR 基因擴(kuò)增和/或多體性的對(duì)照水平比較i)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性 相關(guān)的對(duì)照水平；和ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和
c) 選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用所述組合受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì) 胞中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水平低于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏 感性相關(guān)的EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的對(duì)照水平，或條件是所述患者腫 瘤細(xì)胞中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確定與對(duì)EGFR 抑制劑的抗性相關(guān)的EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水平?？苫谌缟嫌懻?的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行其它評(píng)價(jià)腫瘤的類似步驟。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)癌癥對(duì)EGFR抑制劑的敏感性或抗性的步驟 可以另外或可選包括檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平；比較 腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平和E-鈣粘著蛋白表達(dá)的對(duì)照水平， 該對(duì)照水平是已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平或是已確 定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用 所述組合受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平 統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá) 的對(duì)照水平，或條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué) 上類似已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平。
在另 一個(gè)實(shí)施方案中，評(píng)價(jià)癌癥對(duì)EGFR抑制劑的敏感性或抗性的步驟
可以另外或可選包括-險(xiǎn)測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中TF8的至少一種組分的表達(dá)水 平；比較肺瘤細(xì)胞樣品中TF8的至少一種組分的表達(dá)水平和TF8的至少一 種組分表達(dá)的對(duì)照水平，該對(duì)照水平是已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相
被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用所述組合受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中 TF8的至少一種組分的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏 感性相關(guān)的TF8的至少一種組分表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是所述患者肺瘤細(xì) 胞中TF8的至少一種組分表達(dá)的水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確定與對(duì)EGFR抑制劑 的抗性相關(guān)的TF8的至少一種組分表達(dá)的水平。待;險(xiǎn)測(cè)的TF8的優(yōu)選組分 是ZEB1。
獲得患者樣品的合適方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。患者樣品可包括 來自患者的任何體液或組織，其可包含腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的蛋白。更具體 地，根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"待測(cè)樣品"或"患者樣品"通常用于指任何類型的樣品， 所述樣品包含將用本發(fā)明方法評(píng)價(jià)的細(xì)胞或從細(xì)胞分泌的產(chǎn)物，包括但不限 于分離的細(xì)胞的樣品，組織樣品和/或體液樣品。本發(fā)明中最常見的樣品是組 織樣品。根據(jù)本發(fā)明，分離的細(xì)胞的樣品是細(xì)胞標(biāo)本，它通常在懸液中或與 可能在體內(nèi)連接組織中細(xì)胞的結(jié)締組織脫離，其已經(jīng)用任何合適方法從器 官，組織或液體收集，所述方法導(dǎo)致收集適量用本發(fā)明方法評(píng)價(jià)的細(xì)胞。細(xì) 胞樣品中的細(xì)胞不一定是同 一類型的，但可用純化方法來富集被優(yōu)選評(píng)價(jià)的 細(xì)胞類型。可以例如，通過刮拭(scraping)組織，加工組織樣品來釋放個(gè)體細(xì) 胞，或從體液分離，來獲得細(xì)胞。
盡管組織樣品類似分離的細(xì)胞的樣品，在本文它被定義為身體的器官或 組織的切片，其通常包括多種細(xì)胞種類和/或使細(xì)胞抱團(tuán)(hold together)的細(xì)胞 骨架結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解在一些例子中，術(shù)語(yǔ)"組織樣品"可與"細(xì)胞樣 品"交替使用，但該術(shù)語(yǔ)優(yōu)選用于描述比細(xì)胞樣品更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。組織樣品 可從活檢獲得，例如，包括切割，切片或打孔。
體液樣品，如組織樣品一樣，包含要評(píng)價(jià)的細(xì)胞，并且是用任何適合取 樣具體體液的方法獲得的液體。適于取樣的體液包括但不限于血液，粘液，
^青液，唾液，乳汁，膽汁和尿。
通常，基于要評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的器官或組織的可及性(accessibility)和 結(jié)構(gòu)和/或要評(píng)價(jià)的癌癥種類來選擇樣品類型(即細(xì)胞，組織或體液)。例如，
如果要評(píng)價(jià)的器官/組織是乳房，樣品可以是活檢的上皮細(xì)胞樣品(即細(xì)胞樣 品)或活檢的乳房組織樣品(組織樣品)。本發(fā)明特別可用于評(píng)價(jià)患肺癌，特別 是非小細(xì)胞肺癌的患者，在這種情況下，典型的樣品是患者的肺部腫瘤切片。 可在原發(fā)肺瘤，轉(zhuǎn)移胂瘤，局部復(fù)發(fā)肺瘤，原位導(dǎo)管癌，或其它腫瘤中 測(cè)定本發(fā)明腫瘤細(xì)胞中的基因拷貝數(shù)?？稍谛迈r，冷凍，固定或用其它方法 保存的實(shí)體腫瘤中測(cè)定標(biāo)記物。它們可在以下部位測(cè)定胞漿或核的腫瘤拔二
取物中；或在肺瘤的膜(membranes)中，包括但不限于血漿，線粒體，高爾基 體或核膜中；在核基質(zhì)中；或在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器及它們的提取物中，包括 但不限于核糖體，核仁，線粒體，高爾基體。
一旦從患者獲得樣品，就如本文公開的評(píng)價(jià)該樣品對(duì)EGFR抑制劑的敏 感性或抗性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使組織，細(xì)胞或其部分(例如組 織切片，細(xì)胞組分如核酸等)與一或多種核酸接觸。這種方法可包括基于細(xì) 胞的測(cè)定或不基于細(xì)胞的測(cè)定。通常用任何合適方法，如混合，雜交或組合， 以可用合適技術(shù)檢測(cè)靶基因的方式，使表達(dá)靶基因的組織或細(xì)胞與檢測(cè)試劑 (例如探針，引物或其他可檢測(cè)標(biāo)記物)接觸。
用對(duì)所用檢測(cè)技術(shù)合適的任何方法來制備患者樣品。在一個(gè)實(shí)施方案 中，可使用新鮮，冷凍，固定或用其它方法保存的患者樣品。例如，可以通 過在例如石蠟中固定患者組織來制備患者腫瘤細(xì)胞。固定的組織可切片，然 后接觸探針來檢測(cè)探針與靶基因的雜交。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，通過雜交分析來檢測(cè)本發(fā)明基因。核酸雜交筒單涉 及使探針(例如寡核苷酸或更大的多核苷酸)與靶核酸在探針及其互補(bǔ)靶可通 過互補(bǔ)堿基配對(duì)形成穩(wěn)定雜合雙鏈的條件下接觸。本文所用的雜交條件指標(biāo) 準(zhǔn)雜交條件，此時(shí)核酸分子被用于鑒定相似的核酸分子。對(duì)這種標(biāo)準(zhǔn)雜交條 4牛的描述見例如,Sambrook等,TWo/eci/Aar C7om'wgv ^ Z^6on3tor>> Afoww"/, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989. Sambrook等，同上，本文將它們?nèi)囊胱?為參考(特別見9.31-9.62頁(yè))。另外，計(jì)算允許不同程度核苷酸錯(cuò)配的雜交所 需的合適雜交和洗滌條件的公式見例如，Meinkoth等，1984, S/oc/zem. 138,267-284; Meinkoth等,同上，本文將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖?。將不形?雜合雙鏈的核酸從雜交的核酸洗脫，然后檢測(cè)雜交的核酸，通常通過一全測(cè)連 接的可檢測(cè)標(biāo)記來進(jìn)行。通常意識(shí)到通過提高溫度或降低含核酸的緩沖液的 鹽濃度來使核酸變性。在低嚴(yán)格條件(例如低溫和/或高鹽)下，即使在退火序 列不完全互補(bǔ)時(shí)，也會(huì)形成雜合雙鏈(例如DNA:DNA， RNA:RNA,或 RNA:DNA)。因此在較低的嚴(yán)格度，雜交的特異性下降。相反，在較高的嚴(yán) 格度(例如較高溫度或較低的鹽度)，成功雜交要求錯(cuò)配較少。
本文所指的高嚴(yán)格度雜交和洗滌條件指可分離與在雜交反應(yīng)中用作探 針的核酸分子具有至少約90%核酸序列一致性的核酸分子的條件(即允許約 10%或更少核苷酸錯(cuò)配的條件)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用Meinkoth等，1984, 所oc/7em. 138, 267-284的公式(本文將它們?nèi)囊胱鳛閰⒖?，來計(jì)算 達(dá)到這些特定核苷酸錯(cuò)配水平的合適雜交和洗滌條件。根據(jù)DNA:RNA或 DNA:DNA雜合體是否形成，所述條件會(huì)有不同。計(jì)算的DNA:DNA雜合體 的解鏈溫度比DNA:RNA雜合體低10。C。在具體實(shí)施方案中，DNA:DNA雜 合體的嚴(yán)格雜交條件包括在6X SSC (0.9 M Na+)的離子強(qiáng)度、約20°C到約 35°C之間的溫度雜交，更優(yōu)選溫度在約28。C到約40°C之間，甚至更優(yōu)選， 在約35。C到約45。C之間。在具體實(shí)施方案中，DNA:RNA雜合體的嚴(yán)格雜 交條件包括在6X SSC (0.9 M Na+)的離子強(qiáng)度、約30。C到約45。C之間的溫 度雜交，更優(yōu)選溫度在約38。C到約50。C之間，甚至更優(yōu)選，在約45。C到 約55°C之間。這些值是基于對(duì)含多于約100個(gè)核苷酸，0%曱酰胺且G+C 含量約40%的分子的解鏈溫度的計(jì)算。可選的，Tm可如Sambrook等見上文 (9.31到9.62頁(yè))所述根據(jù)經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。
用與樣品核酸連接的一或多種標(biāo)記檢測(cè)雜交的核酸。可用多種本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知方式中的任何一種摻入所述標(biāo)記。適用于本發(fā)明的可檢測(cè)標(biāo)記包 括任何用光譜法，光化學(xué)，生物化學(xué)，免疫化學(xué)，電學(xué)，光學(xué)或化學(xué)方式可 檢測(cè)的組合物。本發(fā)明可用的標(biāo)記包括熒光染料(例如熒光素，德克薩斯紅 (texasred),羅丹明，綠色熒光蛋白等等)，放射性標(biāo)記(例如3H， 1251, 35S, 14C, 或3￥),和比色標(biāo)記(colorimetric label)。檢測(cè)這些標(biāo)記的方式是本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的。因此，例如，可用照相膠片或閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)放射性標(biāo)記，可 用光檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)光來檢測(cè)熒光標(biāo)記物。通過直接目測(cè)(visualizing)顯色標(biāo)記 來^r測(cè)比色標(biāo)記。優(yōu)選地，通過熒光標(biāo)記來^^測(cè)雜交核酸，并最優(yōu)選在FISH 分析中檢測(cè)。
根據(jù)本發(fā)明，分離的多核苷酸或分離的核酸分子是已經(jīng)從其天然環(huán)境取 出的核酸分子(即已經(jīng)過人的操作)，其天然環(huán)境是天然發(fā)現(xiàn)所述核酸分子的 基因組或染色體。因此，"分離的"不一定反映該核酸分子被純化的程度，而
是表示該分子不包括天然發(fā)現(xiàn)所述核酸分子的完整基因組或完整染色體。如 用于本發(fā)明檢測(cè)基因(例如通過與基因雜交)的方法中的那些多核苷酸，通常 是靶基因的 一部分，其適于用作鑒定給定樣品(例如細(xì)胞樣品)中的全長(zhǎng)基因 (或其部分)的雜交探針或PCR引物。分離的核酸分子可包括基因或基因的部 分(例如調(diào)控區(qū)或啟動(dòng)子)。包含基因的分離的核酸分子不是包含此基因的染 色體片段，而是包含與此基因有關(guān)而不是與在相同染色體上天然發(fā)現(xiàn)的其它 基因有關(guān)的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)。分離的核酸分子也可包括在其它核酸側(cè)翼(即
在序列的5'和/或3'末端)的具體核酸序列，所述其它核酸在正常情況下不在 該具體核酸序列側(cè)翼(即異源序列)。分離的核酸分子可包括DNA, RNA(例 如mRNA)或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。盡管術(shù)語(yǔ)"核酸分子"主要 指物理核酸分子，而術(shù)語(yǔ)"核酸序列"主要指核酸分子上核苷酸的序列，這兩 個(gè)術(shù)語(yǔ)可交叉使用，特別是對(duì)于能編碼蛋白的核酸分子或核酸序列而言。本 發(fā)明的分離的核酸分子優(yōu)選用重組DNA技術(shù)(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò) 增，克隆)或化學(xué)合成來制備。如果多核苷酸是寡核苷酸探針，該探針通常 長(zhǎng)度為約5到約50或約500個(gè)核苷酸，或約10到約40個(gè)核苷酸，或約15 到約40個(gè)核苷酸，或?yàn)镮O到IOOO個(gè)核苷酸范圍內(nèi)的任何整數(shù)倍增的長(zhǎng)度(即 10, 11, 12, 13...999， 1000)。
根據(jù)本發(fā)明，探針是如上所述通常大小從約8個(gè)核苷酸到數(shù)百個(gè)核苷酸 的核酸分子。通常通過用這種分子與靶核酸序列在嚴(yán)格雜交條件雜交來鑒定 樣品中的這種靶核酸序列。雜交條件見上文的詳細(xì)描述。
PCR引物也是核酸序列，但PCR引物通常是在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中使用 的相當(dāng)短的寡核苷酸。PCR引物和雜交探針可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員用靶序列 的序列信息容易地開發(fā)并制造出來。(見例如，Sambrook等，見上文或Glick 等，見上文)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法也可包括檢測(cè)細(xì)胞中是否有E-cad和/ 或TF8的組分如ZEB1的表達(dá)水平改變(調(diào)控，修飾)的步驟。本文中，術(shù)語(yǔ)"表 達(dá)"可指檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄和/或檢測(cè)基因編碼的蛋白的翻譯。檢測(cè)基因或蛋白的 表達(dá)是指積極(actively)確定基因或蛋白表達(dá)與否的行動(dòng)。這可以包括測(cè)定所 述表達(dá)是否相對(duì)對(duì)照上調(diào)，下調(diào)，或無改變。轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白的表達(dá)用多種 本領(lǐng)域已知方法中的任何一種來測(cè)定。對(duì)于RNA表達(dá)，方法包括但不限于 提取細(xì)胞mRNA并用標(biāo)記探針作Northern印跡，所述探針與編碼一或多種
本發(fā)明基因的全部或部分的轉(zhuǎn)錄物雜交；用基因特異性引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒?br> 應(yīng)(PCR),和逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增從一或多種本發(fā)明基 因表達(dá)的mRNA,之后用任何一種方法定量檢測(cè)產(chǎn)物；從細(xì)胞提取總RNA, 然后標(biāo)記并用于探測(cè)在多種表面中的任一種上排列、且編碼本發(fā)明所有或部 分基因的cDNA或寡核香酸；原位雜交；和檢測(cè)報(bào)道基因。對(duì)蛋白翻譯的測(cè) 定包括用于檢測(cè)和/或測(cè)定來自細(xì)胞或細(xì)胞提取物的蛋白的任何合適方法。這 些方法包括^旦不限于免疫印跡(例如Western印跡)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA),放射免疫測(cè)定(RIA),免疫沉淀，免疫組化(IHC)，免疫熒光，熒 光活化的細(xì)胞分選(FACS)和免疫焚光顯微術(shù)。
人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR); E-釣粘著蛋白；和TF8基因的核苷酸序 列是本領(lǐng)域已知的，例如可用GenBank登錄號(hào)AY588246(引入本文作為參考) 查到。核苷酸探針和抗體也是本領(lǐng)域已知的，并可用作檢測(cè)EGFR， E-鈣粘 著蛋白，和TF8(ZEB1)基因和蛋白的探針。
在本發(fā)明方法中，將腫瘤細(xì)胞樣品中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水 平與選自如下的EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的對(duì)照水平比較(i)已確定與對(duì) EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗 性相關(guān)的對(duì)照水平。選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用本發(fā)明組合療法受益的患 者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的水平統(tǒng)計(jì)學(xué) 上類似已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性 的對(duì)照水平，或條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中EGFR基因擴(kuò)增和/或多體性的 水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的EGFR基因擴(kuò)增 和/或多體性的水平。
在另一個(gè)可選的或另外的本發(fā)明方法中，比較腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著 蛋白的表達(dá)水平和選自如下的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的對(duì)照水平(i)已確定與對(duì) EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗 性相關(guān)的對(duì)照水平。選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用本發(fā)明組合療法受益的患 者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似已確 定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是 所述患者腫瘤細(xì)胞中E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(less than or reduced from)已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的E-鈣粘著蛋白的表達(dá) 水平。
在另一個(gè)可選的或另外的本發(fā)明方法中，比較腫瘤細(xì)胞樣品中TF8組 分，優(yōu)選ZEB1的表達(dá)水平和與選自如下的TF8組分表達(dá)的對(duì)照水平(i) 已確定與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和(ii)已確定與對(duì)EGFR 抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平。選擇被預(yù)測(cè)會(huì)從治療性施用本發(fā)明組合療法 受益的患者，條件是所述患者腫瘤細(xì)胞中TF8組分的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似 已確定與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的TF8組分表達(dá)的對(duì)照水平，或條件是 所述患者腫瘤細(xì)胞中TF8組分的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于已確定與對(duì)EGFR抑 制劑的敏感性相關(guān)的TF8組分的表達(dá)水平。
更具體地，根據(jù)本發(fā)明，"對(duì)照水平"是基因擴(kuò)增和/或多體性和/或基因 轉(zhuǎn)錄或翻譯的對(duì)照水平，其可包括與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的水平或 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的水平性。因此，可以確定，基于基因擴(kuò)增和 /或多體性的對(duì)照或基線水平，患者樣品是否更可能對(duì)EGFR抑制劑治療敏 感或耐受。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者被分成六類，其每種細(xì)胞的拷貝數(shù)漸次 上升(1)二體性(在>90%的細(xì)胞中兩種靶的拷貝^2個(gè))；p)低三體性(在 240%細(xì)胞中所述基因拷貝^2個(gè)和在10-40%細(xì)胞中有3個(gè)拷貝)；(3)高三體 性(在240%細(xì)胞中所述基因拷貝^2個(gè)和在^40%細(xì)胞中有3個(gè)拷貝)；(4)低多 體性(在10-40%細(xì)胞中所述基因拷貝^4個(gè))；(5)高多體性(在240。/。細(xì)胞中所述 基因拷貝^4個(gè))；和(6)基因擴(kuò)增(GA),這通過緊密的(tight)EGFR基因簇的存 在和每個(gè)細(xì)胞中基因/染色體的比率^2，或在^10。/。的被分析細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞 平均有215個(gè)EGFR拷貝來定義。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有EGFR和/或HER2 的高基因拷貝數(shù)或拷貝數(shù)增加的患者(如基因擴(kuò)增和/或多體性，包括高三體 性，低多體性或高多體性)更可能對(duì)EGFR抑制劑治療有較高反應(yīng)率，疾病 進(jìn)展速率較低，進(jìn)展時(shí)間較長(zhǎng)，并且長(zhǎng)期存活率較高。多體性或基因拷貝數(shù) 總體增加越高，預(yù)測(cè)的結(jié)果越好。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在患者腫瘤細(xì)胞中存在HER2 基因擴(kuò)增和/或多體性賦予EGFR陽(yáng)性患者(例如顯示出EGFR基因拷貝數(shù)增 加的患者)更敏感的表型，給EGFR陰性患者(例如EGFR基因拷貝數(shù)增力口得 少或不增加的患者)帶來更好結(jié)果。
確立基因擴(kuò)增，多體性和/或基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的對(duì)照水平的方法，是基于 樣品類型，獲得樣品的組織或器官，和待評(píng)價(jià)的患者狀態(tài)進(jìn)行選^奪。優(yōu)選地， 所述方法是與用于評(píng)價(jià)患者樣品的方法相同的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用 與所評(píng)價(jià)的細(xì)胞相同的細(xì)胞類型來確立對(duì)照水平。在優(yōu)選實(shí)施方案中，從來
自已知對(duì)EGFR抑制劑耐受或敏感的患者或細(xì)胞系的對(duì)照樣品確立對(duì)照水
平。 一方面，對(duì)照樣品得自匹配個(gè)體的群體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"匹配個(gè)體"指 一或多種對(duì)被評(píng)價(jià)的細(xì)胞類型或肺瘤生長(zhǎng)合適的特征匹配的對(duì)照個(gè)體。例 如，對(duì)照個(gè)體可與被評(píng)價(jià)的患者在性別，年齡，種族或任何可影響對(duì)照個(gè)體
和患者基線的相關(guān)生物或社會(huì)因素(例如預(yù)先存在的條件(preexisting conditions),特定物質(zhì)的消費(fèi)，其他生物或生理因素的水平)的基礎(chǔ)上匹配。 為建立對(duì)照水平，獲得來自數(shù)個(gè)匹配個(gè)體的樣品并以對(duì)被試樣品相同的方式 評(píng)價(jià)。用于取得對(duì)照樣品(例如群體)以建立合適對(duì)照水平的匹配個(gè)體數(shù)目可 由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，但應(yīng)該是統(tǒng)計(jì)學(xué)上合適建立適于與被評(píng)價(jià)的患者 (即被試患者)比較的基線的數(shù)目。從對(duì)照樣品獲得的值用任何適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué) 分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，從而用本領(lǐng)域建立這些值的標(biāo)準(zhǔn)方法來建立合適 基線水平。
本領(lǐng)域技術(shù)人員了解，在進(jìn)行測(cè)定時(shí)不一定每個(gè)測(cè)定都要建立對(duì)照水 平，而是可參照有關(guān)敏感和耐受患者(反應(yīng)者和無反應(yīng)者)之前測(cè)定的對(duì)照水 平(如用任何上述方法確立的對(duì)照水平)的存儲(chǔ)信息形式來建立基線或?qū)φ铡?這種存儲(chǔ)信息形式可包括，例如，但不限于，有關(guān)敏感和耐受的腫瘤/患者的 群體或個(gè)體數(shù)據(jù)的參照?qǐng)D表(reference chart),列表(listing)或電子文檔，或有 關(guān)對(duì)待評(píng)價(jià)患者有用的基因擴(kuò)增或多體性對(duì)照水平的數(shù)據(jù)的任何其它來源。
本發(fā)明方法包括EGFR抑制劑，HDAC抑制劑，或其激動(dòng)劑，或與EGFR 抑制劑或HDAC抑制劑具有基本相似生物活性的藥物的用途。本文使用的 激動(dòng)劑是具有以下特征的化合物能促進(jìn)(agonize)(例如刺激，誘導(dǎo)，增加， 增強(qiáng)或模擬)天然存在的或參照的蛋白或化合物的生物活性。更具體地，激 動(dòng)劑可包括但不限于模擬或增強(qiáng)天然或參照化合物的活性的化合物，蛋白， 肽，或核酸，其還包括任何同系物(homologue)，才莫擬物(mimetic),或藥物/ 化合物/肽設(shè)計(jì)或選擇的任何合適產(chǎn)物，它們的特征是能促進(jìn)(例如刺激，誘 導(dǎo)，增加，增強(qiáng))天然存在的或參照的化合物的生物活性。與此相對(duì)，拮抗 劑指任何抑制(例如拮抗，減少，下降，阻斷，逆轉(zhuǎn)或改變)上述天然存在的 或參照的化合物的作用的化合物。更具體地，拮抗劑能以相對(duì)于所述參照化 合物的活性的方式來作用，從而以拮抗(antagonistic)(例如抵抗，逆轉(zhuǎn)，反向 (in contrary to))參照化合物天然作用的方式降低天然或參照化合物的生物活 性。所述拮抗劑包括但不限于任何化合物，蛋白，肽，或核酸(包括核酶和
反義核酸)或提供拮抗作用的藥物/化合物/肽設(shè)計(jì)或選擇的產(chǎn)物。
可用多種本領(lǐng)域已知方法制備作為藥物設(shè)計(jì)產(chǎn)物的激動(dòng)劑和拮抗劑。用
于設(shè)計(jì)本發(fā)明所用模擬物或其它化合物的多種藥物設(shè)計(jì)方法，公開在Maulik 等,1997, M /ecM/(ar 5z'otec/zwo/ogy: T72erapew"c ^p/ "c加'ow51 cr"d浙ateg7'&s， Wiley-Liss， Inc.中，其全文引入本文作為參考。激動(dòng)劑或拮抗劑可用多種方 法，例如，從分子多樣性策略(可快速構(gòu)建大的化學(xué)多樣性分子文庫(kù)的相關(guān) 策略的組合)，天然或合成化合物的文庫(kù)，特別是化學(xué)或組合文庫(kù)(即序列或 大小不同但具有類似結(jié)構(gòu)模塊(buildingblock)的化合物文庫(kù))獲得，或通過合 理的，有針對(duì)性的或隨機(jī)的藥物設(shè)計(jì)獲得。見例如，Maulik等，見上文。
分子多樣性策略中，大的化合物文庫(kù)是用生物、酶和/或化學(xué)方法合成的， 例如，從肽、寡核苷酸、天然或合成的甾族化合物、糖和/或天然或合成的有 機(jī)非甾族分子合成。開發(fā)分子多樣性策略的關(guān)鍵參數(shù)包括亞基多樣性，分子 大小，和文庫(kù)多樣性。篩選此類文庫(kù)的通常目的是通過先后應(yīng)用組合選#^來 獲得對(duì)目標(biāo)革巴有高親和力的配體，然后通過隨機(jī)的或有針對(duì)性的設(shè)計(jì)策略來 優(yōu)化引導(dǎo)(lead)分子。對(duì)分子多樣性方法的詳細(xì)描述見Maulik,等，同上。
與本文所述的HDAC抑制劑或EGFR抑制劑具有基本類似生物活性的
測(cè)量或觀察到的、參照化合物所展示或顯示(performed)的任何功能的藥物。
本發(fā)明另 一個(gè)實(shí)施方案包括包含如下的分析試劑盒(a)檢測(cè)選自如下的 生物標(biāo)記物或生物標(biāo)記物組合的水平的工具E-鈣粘著蛋白的表達(dá)水平；和 /或TF8的組分，優(yōu)選ZEB1的表達(dá)水平；和(b)包含E-鈣粘著蛋白轉(zhuǎn)錄物和/ 或蛋白的預(yù)定對(duì)照水平的信息；和/或包含TF8轉(zhuǎn)錄物和/或蛋白的組分，優(yōu) 選ZEB1的預(yù)定對(duì)照水平的信息。此試劑盒還可包含^r測(cè)選自如下的生物標(biāo) 記物或生物標(biāo)記物組合的水平的工具(i)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因的擴(kuò) 增水平；(ii)EGFR基因的多體性水平；(iii)人酪氨酸激酶受體-類受體(HER2) 基因的擴(kuò)增水平；(iv)HER2基因的多體性水平；(v)EGFR蛋白的表達(dá)水平； (vi)磷酸化Akt蛋白的表達(dá)水平。也可包含合適的對(duì)照。
在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)E-鈣粘著蛋白或TF8組分，或檢測(cè)EGFR或 HER2基因或蛋白或其它生物標(biāo)記物的工具，通常是可用于本發(fā)明方法的任 何類型的試劑。這種檢測(cè)工具包括但不限于在雜交嚴(yán)格條件與基因(例如 EGFR基因)雜交的探針，對(duì)E-鈣粘著蛋白肽或TF8肽的組分有反應(yīng)性的抗
體，和與E4丐粘著蛋白轉(zhuǎn)錄物或TF8 RNA轉(zhuǎn)錄物的組分雜交的標(biāo)記探針。 這些基因的核酸序列和這些蛋白的蛋白序列是本領(lǐng)域已知的，并且可用于制 備這些檢測(cè)試劑。
標(biāo)簽可以是任何允許檢測(cè)用于檢測(cè)目的基因的試劑的合適標(biāo)簽，并且包括但 不限于任何用光譜法，光化學(xué)，電學(xué)，光學(xué)或化學(xué)工具檢測(cè)的組合物或標(biāo)記。 本發(fā)明有用的標(biāo)簽包括熒光染料(例如熒光素，德克薩斯紅，羅丹明，綠色 熒光蛋白等等)，放射性標(biāo)記(例如3h, 125i，35s，14C,或"p)，和比色標(biāo)記。
另夕卜，本發(fā)明分析試劑盒的檢測(cè)工具可固定在基底(substrate)上。此基底 可包括適于固定檢測(cè)試劑的任何基底，如在任意前述檢測(cè)方法中使用的基 底。簡(jiǎn)而言之，適于固定檢測(cè)工具的基底包括任何固體支持物，如任何固體 有機(jī)的，生物聚合物或無機(jī)的支持物，其可與檢測(cè)工具鍵合，但不會(huì)明顯影 響檢測(cè)目標(biāo)靶分子的檢測(cè)工具的活性和/或能力。舉例的有機(jī)固體支持物包括 聚合物如聚苯乙烯，尼龍，酚-曱醛樹脂，和丙烯酸共聚物(例如聚丙烯酰胺)。
本發(fā)明試劑盒還可包括施用本發(fā)明EGFR抑制劑和HDAC抑制劑的組 合療法的預(yù)先確定的說明書，并且在一些實(shí)施方案中，還可包括要施用給患 者的EGFR抑制劑和/或HDAC抑制劑的劑量。
如下的實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明的具體實(shí)施方案及其多種用途。列舉它 們僅為了舉例的目的不應(yīng)用來限制本發(fā)明。
實(shí)施例
在本文舉出的所有實(shí)施例中使用如下材料和方法。 材料和方法
細(xì)胞培養(yǎng)物，藥物和MTS分析。使用二十抹NSCLC細(xì)胞系鱗狀細(xì)胞 (NCI-H157, HCC95, HCC15和H441),大細(xì)胞(large-cell) (H460, H1299, H2126 和作為H460衍變細(xì)胞的H1264)，腺細(xì)胞(Calu3, A549, H2122, H1648, H520, HCC78, HCC193, H2009, HCC44和H3255)以及細(xì)支氣管肺泡細(xì)胞(H358和 H322)。 NSCLC細(xì)胞系HCC78， H2126， HCC95, H1299, HCC193, HCC44, HCC15, H2009得自UTSW,而H3255是Bruce Johnson博士的禮物。所有細(xì) 胞系都在RPMI培養(yǎng)基1640中在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。吉非替尼是AstraZenec 的禮物，MS-275是NihonScheringK.K的禮物。將儲(chǔ)存液在二甲基亞砜中制 備并儲(chǔ)存在-20。C。在每次實(shí)驗(yàn)前將藥物在新鮮培養(yǎng)基中稀釋，使最終的二
曱基亞砜濃度〈0.1。/o。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)自R&D Systems Inc.(Minneapolis, MN)。用MTS(3-(4,5-二曱基噻唑-2-基)-5-(3-羧曱氧苯基)-2-(4-硫苯基)2H-四 氮唑，內(nèi)鹽(inner salt))分析(Promega， Madison, WI)評(píng)估生長(zhǎng)抑制。簡(jiǎn)言之， 將2xl03個(gè)NSCLC細(xì)胞置入96-孔平底微量滴定板的每個(gè)孔中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng) 物為50-80%匯合時(shí)加入吉非替尼。在溫育4天后，將溶于RPMI 1640的50|il 2 mg/ml四氮唑鹽MTT(Promega)溶液，加入每個(gè)孔。將孩i量滴定板在37°C 溫育4小時(shí)。用自動(dòng)讀板儀測(cè)量每個(gè)孔的吸光率。用Slide Write程序分析數(shù) 據(jù)來確定藥物的IC5Q。細(xì)胞裂解和Western印跡和免疫組化。在裂解緩沖液 (10 mM Tris'HCl， pH 7.5/150 mM NaCl/0.5% IGEPAL/0.5 mM PMSF/10嗎/ml 亮抑蛋白酶肽/5 |ag/ml胃酶抑制劑A/2.1 |ig/ml抑蛋白酶肽)在冰上破裂細(xì)胞。 超聲后，使用Bradford分析作蛋白定量。蛋白裂解物(30-50 (ig)在7.5%-10% 聚丙烯酰胺上用凝膠電泳分離，并用PVDF膜(Bio-Rad Laboratories, Inc.， Richmond, CA)通過Western印跡分析。以1:1 ,OO(H吏用抗-EGFR和磷-特異 性EGFR(pY 1068), (Cell Signaling, Beverly, MA)。分別使用稀釋度為1:3000 和 1:5000 的 E-cad 和 卩肌動(dòng)蛋白抗體(BD Biosciences Pharmingen/Transduction Laboratories, San Jose, CA; Sigma-Aldrich, #A5316， Saint Louis， MS)。用辣根過氧化物酶-偶聯(lián)第二抗體和化學(xué)熒光(Amersham Biosciences, Inc.)檢測(cè)。在經(jīng)過切片且石蠟包埋的細(xì)胞系中添加稀釋度1/100 的與所述分子胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域反應(yīng)的抗-E-cad抗體(小鼠單克隆抗體，克隆36， Transduction Laboratories, Lexington, KY)。 用Biocare Medical (Walnut Creek， CA)去封閉室(decloaking chamber)在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原提取 (retrieval)。用3%過氧化物的無水曱醇溶液進(jìn)行過氧化物封閉(blocking)。用 Powerblock (Biogenics, San Ramon, CA)或親和素/生物素封閉物(block)進(jìn)行 封閉。在37。C溫育第一抗體1小時(shí)后，在室溫加入第二抗體(Dako生物素 化多聯(lián)抗小鼠免疫球蛋白，含40%人血清)，作用30分鐘。之后加鏈霉親和 素辣根過氧化物酶復(fù)合物和二氨基聯(lián)苯胺色原。然后用蘇木精復(fù)染玻片并蓋 上蓋玻片。
RNA，引物和定量實(shí)時(shí)RT-PCR。用RNAeasy (Qiagen) A人NSCLC細(xì)胞 系制備總RNA。在制備中，在cDNA合成前，用無RNase的DNase 1(10 mg/ml， Qiagen)處理所有樣品。部分RT-PCR反應(yīng)是從0.3 mg總RNA合成cDNA。
用SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen)、 GeneAmp 5700 Sequence Detector (Applied Biosystems)通過動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行定量實(shí)時(shí)RT-PCR分析，所述 Detector允許在同 一試管中進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)(通過熒光)。擴(kuò)增數(shù)據(jù)用 GENEAMP 5700 SDS軟件分析，在設(shè)定的循環(huán)閾值(Ct值)轉(zhuǎn)換成循環(huán)數(shù)并且 相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品定量。用成人肺的RNA(Clontech Lab. Inc)或胎兒肺的 RNA(Stratagene)作為所有實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。用20, 100, 500 mg的標(biāo)準(zhǔn)品。在每 個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用無模板的對(duì)照作為對(duì)照。為使cDNA添加量標(biāo)準(zhǔn)化，用產(chǎn)物的 相對(duì)產(chǎn)生量除以管家基因(3-肌動(dòng)蛋白的產(chǎn)生量。所有樣品一式三份。
細(xì)胞周期分析。將NSCLC細(xì)胞以0.5 x 106細(xì)胞/孔的密度接種在6孔板。 24小時(shí)后將吉非替尼加入培養(yǎng)基中，另外溫育細(xì)胞72小時(shí)，之后如上所述 分析這些細(xì)胞。^人亞(sub)-G,細(xì)胞級(jí)分評(píng)估凋亡百分比。
實(shí)施例1
如下實(shí)施例描述了 E-cad在吉非替尼-敏感的和吉非替尼-耐受的NSCLC 細(xì)月包系中的表達(dá)。
用MTT測(cè)定分析吉非替尼對(duì)21抹NSCLC和一抹子宮細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑 制。在這21抹NSCLC中，六抹細(xì)胞系H3255, H358， H322, Calu3, H1648, HCC78的IC50<lpM,而六抹細(xì)胞系HCC15, H157, H460, H520和H1264 (H460的復(fù)制(duplicate)細(xì)胞系)的ICS(^1(^M。這種對(duì)吉非替尼的多樣生長(zhǎng) 應(yīng)答被用于鑒定在這組細(xì)胞系中差異表達(dá)的基因。
用實(shí)時(shí)RT-PCR,在E-cad的表達(dá)和對(duì)吉非替尼的敏感性之間檢測(cè)到正 相關(guān)0=0.76, pO.OOOl)。在含有EGFR突變L858R的最敏感細(xì)胞系H3255 (IC5()= 0.015pM)中檢測(cè)到最高的E-cad表達(dá)。在從20林細(xì)胞系開發(fā)的微陣列 中檢測(cè)到E-cad表達(dá)的正相關(guān)(產(chǎn)0.74， p=0.0002)。在蛋白水平，在U林 NSCLC細(xì)胞系的western印跡分析中評(píng)價(jià)E-cad的表達(dá)。如前所示，EGFR 表達(dá)和對(duì)吉非替尼的敏感性之間無相關(guān)。然而，在E-cad表達(dá)的有或無和對(duì) 吉非替尼的敏感性或抗性之間分別有100%相關(guān)。
用免疫組化，在兩抹對(duì)吉非替尼敏感的細(xì)胞系(A431和Calu3)和兩林對(duì) 吉非替尼耐受的細(xì)胞系(H520和HI57)中評(píng)價(jià)E-鈣粘著蛋白的表達(dá)。在敏感 細(xì)胞系中，4全測(cè)到E-cad在膜和胞質(zhì)定位的強(qiáng)表達(dá)，而在兩4朱耐受細(xì)胞系中 無表達(dá)。實(shí)施例2
如下實(shí)施例描述了 E-cad調(diào)控分子在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)。
已知Wnt途徑涉及對(duì)E-cad表達(dá)的調(diào)控。在IC5o<l(iM的細(xì)胞系(H3255, H358, H322， Calu3, H1648, HCC78)和IC50>1(^M的細(xì)胞系(H157， H520, H460和H1264)的微陣列的Affimetrix數(shù)據(jù)中篩選Wnt/E-cad途徑中分子 (Wntl， Wnt5A, Wnt5B， Wnt6, Wnt7A，巻毛型(frizzled),軸蛋白(axin)l, disheveled, GSK3， a連環(huán)蛋白，卩連環(huán)蛋白，丫連環(huán)蛋白和E-cad)的表達(dá)。 相比耐受細(xì)胞系，E-cad在敏感細(xì)胞系中上調(diào)倍數(shù)最高(200倍)。在wnt途徑 中的其它分子在敏感和耐受細(xì)胞系中無一具有類似的差異表達(dá)。
E-cad調(diào)控涉及四種鋅指轉(zhuǎn)錄因子TF-8, slug, snail和SIP1。對(duì)細(xì)胞系 微陣列數(shù)據(jù)的評(píng)價(jià)顯示，與其它三種分子slug， snail和SIP1相比，TF-8在 敏感和耐受細(xì)胞系中表達(dá)差異最大(10.4倍)。
用RT-PCR確證了 TF-8的表達(dá)。在20抹NSCLC細(xì)胞系中在TF-8表 達(dá)和對(duì)吉非替尼的敏感性之間檢測(cè)到負(fù)相關(guān)(r;0.74, p=0.0002)。在從20抹 細(xì)胞系開發(fā)的微陣列中也檢測(cè)到這種在TF-8表達(dá)和吉非替尼-敏感性之間的 負(fù)相關(guān)(產(chǎn)0.71,p-0.0004)。
實(shí)施例3
如下實(shí)施例描述了 E-4丐粘著蛋白對(duì)在NSCLC細(xì)胞系中吉非替尼誘導(dǎo) 的凋亡的作用。
評(píng)價(jià)吉非替尼在對(duì)吉非替尼敏感和耐受的NSCLC細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡 和細(xì)胞死亡的作用。當(dāng)用10 吉非替尼處理細(xì)胞系，在最每文感的細(xì)胞系 H3255中檢測(cè)到凋亡和細(xì)胞死亡增長(zhǎng)了 35倍。在相同濃度，在不太敏感的 細(xì)胞系(H322,H358和Calu3)中凋亡和細(xì)胞死亡增長(zhǎng)了 2.3-3.4倍，而在更耐 受的細(xì)胞系(H460， H520， H157和A549)中未檢測(cè)到凋亡或壞死作用。
通過用編碼E-cad的腺病毒轉(zhuǎn)染吉非替尼-耐受的細(xì)胞系H157來評(píng)估 E-cad在NSCLC細(xì)胞系對(duì)吉非替尼的凋亡反應(yīng)中的作用。選擇此細(xì)胞系是 由于它缺乏E-cad表達(dá)、存在EGFR并且耐受吉非替尼。用E-cad轉(zhuǎn)染H157 細(xì)胞系，開發(fā)了兩個(gè)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系H157-E-cad-3和H157-E-cad-8。將 用GFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的H157細(xì)胞系用作對(duì)照。用western印跡確認(rèn)E-cad表
達(dá)。與H157-E-cad-3細(xì)胞系相比，在H157陽(yáng)E-cad-3細(xì)胞系中檢測(cè)到E-cad 的較高表達(dá)。以前的研究顯示了 EGFR和E-cad的相互作用。我們?cè)u(píng)Y介了 E-cad的異位表達(dá)在EGFR磷酸化和對(duì)EGF的反應(yīng)中的作用。E-cad的異位 表達(dá)不會(huì)導(dǎo)致EGFR活化(磷酸化)。然而，在用EGF處理的經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中 檢測(cè)到磷酸化增長(zhǎng)了兩倍。
評(píng)價(jià)E-cad異位表達(dá)對(duì)細(xì)胞存活的作用。在兩抹細(xì)胞系H157-Ecad-8和 H157-Ecad-3中檢測(cè)到，與對(duì)照細(xì)胞系H157-GFP相比，凋亡細(xì)胞比活細(xì)胞 的比率分別增長(zhǎng)了三和九倍(8.8:87.8%分別比21:69%和43.5:48.4%)。對(duì)吉非 替尼的反應(yīng)進(jìn)一步提高。用10|_iM吉非替尼處理細(xì)胞系48小時(shí)，用膜聯(lián)蛋 白V和碘化丙錠(propridiumiodine)評(píng)價(jià)凋亡和壞死。用吉非替尼處理時(shí)，與 對(duì)照細(xì)月包系H157-GFP相比，分別在H157-E-cad-3和H157-E-cad-8細(xì)胞系 中檢測(cè)到凋亡細(xì)胞比活細(xì)胞的比率增長(zhǎng)了 6和13倍(分別為8.4:87.4%比 31.5:55.3%; 8.4:87.4比49.8:37.8%),壞死細(xì)胞比活細(xì)胞的比率增長(zhǎng)了 3和9 倍(ll.5:88.1 t匕26.1:70.6; 11.5:88.1 t匕52.9:45.8)。
這些數(shù)據(jù)表明恢復(fù)E-cad表達(dá)導(dǎo)致凋亡增加，并且它恢復(fù)了吉非替尼對(duì) 耐受吉非替尼的細(xì)胞系的作用。
實(shí)施例4
如下實(shí)施例顯示了組蛋白脫乙酰酶HDAC抑制劑逆轉(zhuǎn)了對(duì)吉非替尼的 抗性。
已知通過用TSA抑制HDAC在NSCLC中恢復(fù)了 E-鈣粘著蛋白表達(dá)。 本發(fā)明者確定用HDACi預(yù)處理NSCLC細(xì)胞系是否會(huì)導(dǎo)致基因和蛋白表達(dá) 的改變并提高對(duì)吉非替尼的敏感性。在吉非替尼-耐受的NSCLC細(xì)胞系 H157, H520和H460中評(píng)價(jià)MS-275的IC。在0.5和4 jaM之間檢測(cè)這些細(xì) 胞系的IC25.75。在這些細(xì)胞系中評(píng)價(jià)E-cad表達(dá)。在用4或10 MS-275 處理后24小時(shí)，在被測(cè)的所有細(xì)胞系檢測(cè)到E-cad表達(dá)有8-12倍上調(diào)。之 后，發(fā)明者評(píng)價(jià)了用MS-275預(yù)處理NSCLC肺癌細(xì)胞系在它們對(duì)吉非^奪尼 的反應(yīng)中的作用。在用吉非替尼處理的24小時(shí)之前，用HDAC抑制劑，獨(dú) 自用MS-275,獨(dú)自用gefitinb或與MS-275 —起處理NSCLC細(xì)胞系H157， H520， H460和H1703。在這些細(xì)胞系中先用MS-275、之后用吉非替尼檢測(cè) 到有協(xié)同作用。使用劑量增加的MS-275。當(dāng)細(xì)胞系先后用兩種藥物處理時(shí)， 細(xì)胞死亡比用每種藥物單獨(dú)處理高了數(shù)倍。圖2顯示了用吉非替尼單獨(dú)作用
或用吉非替尼和MS-275的組合治療處理，對(duì)于H175細(xì)J3包的凋亡和壞死細(xì) 胞總和比活細(xì)胞的調(diào)整(adjusted)比率的作用。
每篇本文引用的參考文獻(xiàn)全文引入作為參考。
參考文獻(xiàn)
Jemal et al., C4 C露e"C"". 54(1):8-29, 2004. Parkin, T7ze丄"wc^ 0"co/ogy 2:533-543， 2001. Hirsch et al" C騰e7- 41 Suppl l:S29-42, 2003. Arteaga.，五;cp Ce//Aes 284:122-130, 2003.
Yarden and Sliwkowski，胸仏v M / CW/腸/. 2:127-137， 2001.
Jorissen et al.， Exp Ce// h 284:31-53, 2003.
Levitzki and Gazit, 5W認(rèn)e 267:1782-8， 1995.
Fukuoka et al., /C7/w <9腳/. 21:2237-2246, 2003.
Kris et al.， J無Md A膨.290， 2149-2158， 2003.
Perez-Soler et al"尸rac. Jw. Soc. C7/". 6>,/.， 26>.. 310a (1235) 2001.
Shepherd et al., Jowrwa/C7z.m'ca/ (9 co/ogy, 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 22， No MS (July 15 Supplement), 2004: 7022.
Lynch et al.，混wg/J"M^ 350:2129-39, 2004.
Paez et al" 6We"ce (Wash DC) 304:1497-500, 2004.
Pao et al"尸roc7VW/Jc。d Sc/ t/SJ 101(36):13306-11, 2004.
Cappuzzo et al.， JAto/ Qwcer /mt 96:2004.
Reginato et al.， Ce〃所o/. 5(8):733-40, 2003.
D體strei et al" Deve—聰《129(17):3983-94, 2002.
Al Moustafa et al"丄呵C騰e廣37:49-56, 2002.
Qian et al.,五M6C^ 23:1739-84， 2004.
Pece et al.,/所o/ C7zew 274(27):19347-51, 1999..
Pece and Gutkind, J脂C/z亂275(52):41227-33, 2000.
Bremnes et al" /C"" Omco/. 20:2417-2428, 2002.
Kintner， Ce// 69: 225-236, 1992.
Jiang, & /^Vg 83: 437-446， 1996.
Ohira et al.，尸roc Ato/爿cad <Scz, "SJ. 100:10429-10434,2003.
Conacci-Sorrell et al" JCe〃說o/. 163(4):847-57， 2003.
Lu et al.， C聽w CW/. 4(6):499陽(yáng)515， 2003.
Batsche et al., AfoZ Ce〃所o/. 18(7):3647-58,1998.
Bolosetal.,乂 Ce//5W. 116:499—511,2003.
van G畫sven et al.， J說o/ Oz亂278:26135-26145, 2003.
Comijn et al" Mo/ Ce〃 ；7(6): 1267-78, 2001.
Verschueren et al" J腸/CTzew. 274:20489-98, 1999.
Sekido et al" M / CW/腺.14:5692-700, 1994.
Cano et al"淑Ce〃腸/. 2:76—83， 2000.
Hajra et al., C騰er版62:1613-1618, 2002.
Chi腿durai,嵐Ce〃 9， 213-224， 2002.
Postigo and Dean,尸toc.胸/, JcW. 5W. J7SJ 96， pp. 6683—6688， 1999.
de Ruijter et al.,腸c/z,丄370:737-749, 2003.
Marks et al" J淑/ C薦e〃ra/ ~/^油,,92:1210-6, 2000.
Zelent et al" C/zw 10: 4622-4629, 2004.
Gore et al" 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings Vol 22, No 14S (July 15 Supplement): 3026, 2004.
Huelsken et al" C群.. Ge威Dev. 11， 547-553, 2001. Cowley et al.， J尸aAo/. 179:183-7, 1996. Suzuki et al"丄朋g Ca臟r.;42(l):35-41, 2003. Cappuzzo et al"<9腳/. 21(14):2658-63， 2003. Fricke et al., (9腳/ogy 66(2): 150-9, 2004. Satoh et al.，飾ce". 27(l):47-55, 2003. Rosivatz et al.,/"〃Ca膨r 111(5):711-9， 2004. Ozawaet al.,五MSO, 8: 1711—1717， 1989. DiGiuseppe et al"丄ewA:謹(jǐn)fl 13:1243—1253, 1999.
Cl，'mnaiyan et al.. Jowrna/ o/ CY/zi/co/ 0"co/ogy， 2004 ASCO Annual Meeting Proceedings (Post-Meeting Edition). Vol 22, No I4S (My 15 Supplement): 3029, 2004.
權(quán)利要求
1.治療患癌癥的患者的方法，其包括給該患者施用至少一種組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的組合。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述組合被先后施用。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中在施用基本部分的EGFR抑制劑之前施用 至少基本部分的HDAC抑制劑。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是MS-275并且其中所 述EGFR抑制劑是吉非替尼。
5. 權(quán)利要求4的方法，其劑量策略包括每周口服2 mg/m2 MS-275共4 周，之后每天口服250mg吉非替尼共4周。
6. 權(quán)利要求2的方法，其中所述組合在基本相同的時(shí)間段施用。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述劑量策略包括每周口服2mg/m2MS-275 共4周，同時(shí)地，每天口服250mg吉非替尼共4周。
8. 上述權(quán)利要求任一的方法，其中所述HDAC抑制劑選自由異羥肟酸， 羧酸，苯曱酰胺，環(huán)氧化物，短鏈脂肪酸，含有2-氨基-8-氧代-9,10-環(huán)氧-癸?；糠值沫h(huán)四肽，和無2-氨基-8-氧代-9，10-環(huán)氧-癸酰基部分的環(huán)肽組成 的組。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述異羥肟酸選自由辛二酰苯氨定羥肟酸， TSA ，和SAHA組成的組。
10. 權(quán)利要求8的方法，其中所述羧酸選自由丁酸，丙戊酸，和4-苯基 丁酸組成的組。
11. 權(quán)利要求8的方法，其中所述苯曱酰胺選自由N-acetyldinaline和 MS-275組成的組。
12. 權(quán)利要求8的方法，其中所述環(huán)氧化物選自由trapoxin， depeudecin， 和縮S^酸肽FK 228組成的組。
13. 權(quán)利要求l-7任一的方法，其中所述HDAC抑制劑是MS-275。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中MS-275以如下劑量策略施用，其包括每 周口服2 mg/m2MS-275共4周或每二周口服4 mg/m2 MS-275共4周。
15. 權(quán)利要求1-7任一的方法，其中所述EGFR抑制劑選自由吉非替尼, 厄洛替尼，吉非替尼的激動(dòng)劑和厄洛替尼的激動(dòng)劑組成的組。
16. 權(quán)利要求l-7任一的方法，其中所述EGFR抑制劑是吉非替尼或厄 洛替尼。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述吉非替尼以包括每天口服(PO)250mg 在內(nèi)的劑量策略施用、并且其中所述厄洛替尼以包括每天口服(PO)150 mg 在內(nèi)的劑量策略施用。
18. 上述權(quán)利要求任一的方法，其中所述癌癥是上皮惡性腫瘤。
19. 權(quán)利要求l-17任一的方法，其中所述癌癥是肺癌。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述癌癥是非小細(xì)胞肺癌。
21. 上述權(quán)利要求任一的方法，其中所述癌癥對(duì)EGFR抑制劑耐受。
22. 上述權(quán)利要求任一的方法，其中所述癌癥包括癌性細(xì)胞，所述癌性 細(xì)胞與對(duì)EGFR抑制劑敏感的癌性細(xì)胞相比，EGFR基因的拷貝數(shù)增加得少 或不增加，或HER2基因的拷貝數(shù)增加得少或不增加，或具有這兩方面特征。
23. 權(quán)利要求1-21任一的方法，其中所述癌癥包括與對(duì)EGFR抑制劑敏 感的癌性細(xì)胞相比，EGFR蛋白表達(dá)降低的癌性細(xì)胞。
24. 權(quán)利要求l-23任一的方法，其中所述癌癥包括與對(duì)EGFR抑制劑敏 感的癌性細(xì)胞相比，E-4丐粘著蛋白基因表達(dá)水平下降的癌性細(xì)胞。
25. 權(quán)利要求l-24任一的方法，其中所述癌癥包括與對(duì)EGFR抑制劑敏 感的癌性細(xì)胞相比，TF8的至少一種組分的表達(dá)水平升高的癌性細(xì)胞。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述組分包括ZEB1。
27. 通過使癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感、來治療表皮生長(zhǎng)因子受體 (EGFR)抑制劑耐受型癌癥患者的方法，該方法包括給該患者施用至少一種組 蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少 一種EGFR抑制劑的組合。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中所述方法還包含在施用所述治療組合物之 前評(píng)價(jià)癌癥以預(yù)測(cè)其對(duì)EGFR抑制劑的抗性的步驟。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述評(píng)價(jià)癌癥的步驟包括a)檢測(cè)患者的腫瘤細(xì)胞樣品中選自如下的生物標(biāo)記物的水平i) 表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因擴(kuò)增水平；ii) EGFR基因多體水平；iii) 人酪氨酸激酶受體型受體(HER2)基因擴(kuò)增水平；和iv) HER2基因多體水平；b) 將所述生物標(biāo)記物在腫瘤細(xì)胞樣品中的水平與該生物標(biāo)記物選自如下的對(duì)照水平進(jìn)行比較ii)該生物標(biāo)記物與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和c) 選出患者，所述患者是，當(dāng)所述生物標(biāo)記物在患者腫瘤細(xì)胞中的水平 在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于該生物標(biāo)記物與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平 時(shí)，或者當(dāng)所述生物標(biāo)記物在該患者腫瘤細(xì)胞中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似或低 于該生物標(biāo)記物與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的水平時(shí)，不會(huì)A/v治療性施用 EGFR抑制劑受益的患者，或會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益 的患者。
30. 權(quán)利要求28的方法，其還包括a) 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)蛋白表達(dá)的水平；b) 將腫瘤細(xì)胞樣品中EGFR蛋白表達(dá)的水平與選自如下的EGFR蛋白 表達(dá)的對(duì)照水平進(jìn)行比較i) 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和ii) 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和c) 選出患者，所述患者是，當(dāng)所述EGFR蛋白表達(dá)在患者腫瘤細(xì)胞中 的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于該蛋白表達(dá)的與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì) 照水平時(shí)，或者當(dāng)所述EGFR蛋白表達(dá)在患者胂瘤細(xì)胞中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 類似或低于該蛋白表達(dá)的與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的水平時(shí)，不會(huì)從治 療性施用EGFR抑制劑受益的患者，或會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑 的組合受益的患者。
31. 權(quán)利要求29的方法，還包括如下步驟d) 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平；e) 將E-鈣粘著蛋白表達(dá)在腫瘤細(xì)胞樣品中的水平與該蛋白表達(dá)的選自 如下的對(duì)照水平進(jìn)行比較i) 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和ii) 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和f) 選出患者，所述患者是，當(dāng)所述E-鈣粘著蛋白表達(dá)在患者腫瘤細(xì)胞 中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于該蛋白表達(dá)的與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的 對(duì)照水平時(shí)，或者當(dāng)所述E-鈣粘著蛋白表達(dá)在患者腫瘤細(xì)胞中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似于該蛋白表達(dá)的與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的水平時(shí)，會(huì)從 HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者。
32. 權(quán)利要求29的方法，還包括如下步驟d) 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中TF8的至少一種組分表達(dá)的水平；e) 將腫瘤細(xì)胞樣品中TF8的至少一種組分表達(dá)的水平與該組分選自如 下的對(duì)照表達(dá)水平進(jìn)行比較i) 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和ii) 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和f) 選出患者，所述患者是，當(dāng)所述TF8的至少一種組分在患者腫瘤細(xì) 胞中的表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于該組分與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的 對(duì)照表達(dá)水平時(shí)，或者當(dāng)所述TF8的至少一種組分在患者肺瘤細(xì)胞中的表達(dá) 水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上類似于該組分與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的表達(dá)水平時(shí)， 會(huì)從HDAC抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者。
33. 選擇癌癥患者的方法，該患者會(huì)受益于至少一種組蛋白脫乙酰酶 (HDAC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑組合的治療性施 用，該方法包括a) 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞樣品中E-鈣粘著蛋白表達(dá)的水平；b) 將E-鈣粘著蛋白表達(dá)在腫瘤細(xì)胞樣品中的水平與該蛋白表達(dá)的選自 如下的對(duì)照水平進(jìn)行比較i) 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和ii) 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和c) 選出患者，所述患者是，當(dāng)所述E-鈣粘著蛋白表達(dá)在患者腫瘤細(xì)胞 中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于該蛋白與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照表 達(dá)水平時(shí)，或者當(dāng)所述E-鈣粘著蛋白表達(dá)在患者腫瘤細(xì)胞中的水平在統(tǒng)計(jì)學(xué) 上類似于該蛋白與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的表達(dá)水平時(shí)，會(huì)從HDAC 抑制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者。
34. 選擇癌癥患者的方法，該患者會(huì)受益于至少一種組蛋白脫乙酰酶 (HDAC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑組合的治療性施 用，該方法包括a)檢測(cè)胂瘤細(xì)胞樣品中鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò)增的水平；b) 將腫瘤細(xì)胞樣品中鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因擴(kuò)增的水平以該基因選自如下的對(duì)照擴(kuò)增水平進(jìn)行比較i) 與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照水平；和ii) 與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的對(duì)照水平；和c) 選出患者，所述患者是，當(dāng)鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因在患者腫瘤細(xì)胞中的擴(kuò)增水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于該基因與對(duì)EGFR抑制劑的敏感性相關(guān)的對(duì)照擴(kuò)增水平時(shí)，或者當(dāng)鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因在患者腫瘤細(xì)胞中的擴(kuò)增水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 類似于該基因與對(duì)EGFR抑制劑的抗性相關(guān)的擴(kuò)增水平時(shí)，會(huì)從HDAC抑 制劑和EGFR抑制劑的組合受益的患者
35.治療癌癥患者的方法，該方法包括給該患者施用至少一種組蛋白脫 乙酰酶(HDAC)抑制劑和至少 一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的組合， 其中所述癌癥是耐受至少一種表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的上皮惡性胂瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了組蛋白脫乙酰酶抑制劑和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)抑制劑的組合用于治療癌癥的用途。
文檔編號(hào)A61K31/435GK101175492SQ200680016308
公開日2008年5月7日 申請(qǐng)日期2006年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者丹尼爾·錢, 哈里·A·德拉布金, 小保羅·A·邦恩, 羅伯特·M·格米爾, 薩米爾·E·威塔 申請(qǐng)人:科羅拉多大學(xué)董事會(huì)