專(zhuān)利名稱：：防止和治療阿爾茨海默病的肽偶聯(lián)物組合物和方法防止和治療阿爾茨海默病的肽偶聯(lián)物組合物和方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及防止和治療淀粉樣形成(amyloidogenic)疾病，尤其是阿爾茨海默病的組合物和方法。發(fā)明背景阿爾茨海默病(AD)以進(jìn)行性的記憶受損和認(rèn)知衰退為特征。其標(biāo)志性的病理?yè)p傷為特定腦區(qū)域的淀粉樣蛋白沉積(老年斑)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元喪失。該淀粉樣蛋白沉積由40至43個(gè)氨基酸殘基的淀粉樣卩肽(A(3)構(gòu)成，它們?yōu)榈矸蹣忧绑w蛋白(APP)的蛋白酶解產(chǎn)物。神經(jīng)原纖維纏結(jié)為細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白的絲狀聚集物(Selkoe,Sc認(rèn)e—275:630-631,1997)。AD的發(fā)病機(jī)理并沒(méi)有完全清楚，但預(yù)期是多因素事件。A(3在腦組織中的積累和聚集被認(rèn)為在疾病過(guò)程中起關(guān)鍵作用，也稱為淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)(Golde,BrainPathol,15:84-87,1995)。根據(jù)該假說(shuō)，A卩尤其是A卩42傾向于形成多種形式的聚集體，從小的寡聚體至大的伸長(zhǎng)的纖維蛋白原結(jié)構(gòu)。這些聚集體為神經(jīng)毒性的并且引起與該疾病早期階段的記憶喪失和認(rèn)知衰退有關(guān)的突觸病理學(xué)(Kleme,Neurobiol.Aging:25:569-580,2004)。最近的出版物指出在多重轉(zhuǎn)基因小鼠模型中A卩的減少也防止纟田胞內(nèi)tau沉積(Oddoetal.,Proc.腸謂，43:321-332,2004)。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提示細(xì)胞外的淀粉樣蛋白沉積可能引起隨后的神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成，而其反過(guò)來(lái)可導(dǎo)致神經(jīng)元丟失。用A(3抗原免疫APP轉(zhuǎn)基因小鼠可減少腦部AP沉積并緩解疾病進(jìn)展。這首先由Shenk"a/.,Nature,400:173-177,1999報(bào)道，現(xiàn)在已為大量的涉及不同轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、多種活性疫苗以及用A(3特異的單克隆抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫的研究所確證(Bard"a/.,NatureMed—6:916-919,2000;Janusefa/.，Nature.408:979-982,2000;Morgana/"Nature:408:982-985,2000;DeMattose"/"Proc.Natl.Acad.Sci—98:8850-8855,2001;Bacskai"J.Neurosci—22:7873-7878,2002;Wilcock"a/.,JLNeumm.,23:3745-3751,2003)。與這些動(dòng)物數(shù)據(jù)一致，三份發(fā)表的對(duì)生前接受了聚集前A卩(1-42)免疫原(AN1792,Betabloc)主動(dòng)免疫的患者死后人腦組織的評(píng)估顯示了局部老年斑的清除(Nicoll"W.,NatureMed—9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004;Masliah"a/.,Neurology—64:129-131，2005)。這些數(shù)據(jù)共同表明有效引起針對(duì)A(3抗原的抗體應(yīng)答的疫苗對(duì)AD中發(fā)現(xiàn)的病理性老年斑有效。但是，疫苗或抗體有效性的才幾制仍不明確。公眾域內(nèi)最先進(jìn)的基于免疫治療的AD計(jì)劃曾為采用AN1792(Betabloc)的主動(dòng)免疫II期疫苗試驗(yàn)，其中AN1792為由聚集前Ap(l-42)組成的與佐劑QS-21TM(Antigenics,NewYork,NY)共給藥的疫苗。在2002年1月，當(dāng)有4名患者顯示與腦膜腦炎一致的癥狀時(shí)，這項(xiàng)研究被沐ih(Senior，LancetNeurol..1:3,2002)。最后，298名經(jīng)治療的患者有18名出現(xiàn)了腦膜腦炎跡象(Orgogozo"Neurology.61:46-54,2003)。在腦炎和抗體滴度之間沒(méi)有相關(guān)性，曾有報(bào)導(dǎo)稱這種作用的很可能的引發(fā)機(jī)制為針對(duì)自身免疫原，尤其是針對(duì)Ap42肽的中間和羧基端部分的T細(xì)胞的活化(Monsonego"a/.,J.Clin.Invest"112:415-422,2003)。作為對(duì)這種結(jié)論的支持，對(duì)出現(xiàn)腦炎的兩名疫苗接受者腦組織的死后一全查顯示,在一名患者中有大量的CD4+T細(xì)胞的腦膜滲透(Nicoll"a/.,NatureMe^，9:448-452,2003),而在另一名患者中則有大量的CD4+、CD8+、CD3+、CD5+、CD7+T細(xì)胞的腦膜滲透(FerrerW"/.,BrainPathol14:11-20,2004)。目前的證據(jù)提示在被動(dòng)或主動(dòng)免疫后血漿A(3水平的增加反映出外周滲透(penpheralsmk)的啟動(dòng)可作為后來(lái)腦A卩降低的前兆。外周滲透指腦和血漿Ap儲(chǔ)庫(kù)平衡的變化，該變化導(dǎo)致中樞AP凈外流至外周(參見(jiàn)，侈寸3口Deaned(J.Ne腦scL25:11495-11503,2005;DeMattosefa/.,Pro.Natl.Acad.Sci.USA—98:8931-8932,2001)。其它的研究提示在抗A(3免疫治療后觀察到血漿Ap的這種升高是實(shí)現(xiàn)隨后中樞AP降低所必須的(Cribbs"a/.,7thInternationalConferenceonAD/PD,Sorrento,Italy,2005)。因此，當(dāng)AP內(nèi)的兩個(gè)氨基酸被置換(例如出現(xiàn)在Dutch和Iowa突變中的那些)時(shí)，該肽就不再能穿過(guò)中樞到達(dá)外周區(qū)室(Davis"a/.,Ne翻編Aging,出版中，2005年8月18日可在網(wǎng)絡(luò)上獲得)。當(dāng)表達(dá)這種突變體形式的A(3和Swedish突變的小鼠被免疫時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血漿A(3的升高并且沒(méi)有觀察到隨后腦A(3的降低。與此相反，表達(dá)野生型人A(3序列加上Swedish突變的小鼠應(yīng)答主動(dòng)免疫，伴有血漿AP的升高和隨后中樞Ap的降低(Cribbs"a/.,7thInternationalConferenceonAD/PD,Sorrento,Italy,2005)。因此，預(yù)計(jì)能夠產(chǎn)生導(dǎo)致血漿A|3水平升高的免疫應(yīng)答的任何活性疫苗免疫原可用于治療阿爾茨海默病以及以升高的腦A卩水平為特征的相關(guān)疾病。本發(fā)明申請(qǐng)人出人意料地發(fā)現(xiàn)去除了T細(xì)胞表位以避免自身T細(xì)胞應(yīng)答的抗原具有免疫原性并可升高血漿A卩水平。這代表了產(chǎn)生安全有效的AD疫苗的潛在手段。本發(fā)明的申請(qǐng)人提供了這種抗原以及用作AD疫苗的制劑。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，包含AP的免疫原性片段，所述AP的免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位，能以針對(duì)A(3的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一方面，這種組合物包含AP的線性8氨基酸肽(8-mer)。在另一方面，這種組合物包含散布有至少一個(gè)間隔物的多價(jià)線性8-mer或多價(jià)分枝的多抗原肽(MAP)。所述藥物組合物可用作AD和相關(guān)的淀粉樣蛋白病的疫苗。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物為A卩血漿升高劑，包含A|3的免疫原性片段，所述免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位，能以針對(duì)升高血漿AP水平的AP的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。該藥物組合物可用作AD和相關(guān)的以升高的腦A卩水平為特征的淀粉樣蛋白病的疫苗。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述藥物組合物連接至載體分子以形成偶聯(lián)物，其中該載體協(xié)助引起包括針對(duì)AP片段的抗體的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該載體為腦膜炎奈瑟球菌(A^Menflwem"g"k/^)的外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。在本發(fā)明其它的實(shí)施方案中，所述藥物組合物與藥物可接受的佐劑一起給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該佐劑為氧化鋁佐劑(Merck明礬佐劑，MAA)或基于急戒的佐劑(ISCOMATRIX⑧，CSLLtd.,Parkville,Australia)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了防止或治療與患者腦中Ap的淀粉樣沉積有關(guān)的疾病的方法。這些疾病包括阿爾茨海默病、唐氏綜合征、認(rèn)知受損或其它形式的老年性癡呆。該方法包括給予A卩的免疫原性片段，所述Ap的免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位，選自線性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一個(gè)間隔物的多價(jià)線性肽和多價(jià)分枝的多抗原肽(MAP)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫原性片段包含具有聚乙二醇(PEG)間隔物的多價(jià)線性肽。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該免疫原性片段包含偶聯(lián)至OMPC的多價(jià)分枝的MAP,A卩(3-10)/(21-28)偶聯(lián)物，構(gòu)建體No.12,圖6A。這些方法需要向需要這種治療的患者給予有效劑量的缺乏T細(xì)胞表位的AP免疫原性片段，這將以針對(duì)Ap的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。所述抗體應(yīng)答能夠升高血漿AP水平。在該實(shí)施方案的另一方面，該待給藥的免疫原性片段被連接到載體分子。在該實(shí)施方案的另一方面，該免疫原性片段與佐劑一起給藥。附圖筒要說(shuō)明圖1顯示了衍生自A卩(1-42)(SEQIDNO:l)的合成的8氨基酸肽(8-mer)(SEQIDNO:2-36),從中選4奪肽進(jìn)4亍線性肽掃描以鑒定Ap的表位。圖2顯示了所選的用于偶聯(lián)至KLH(圖2A)和OMPC(圖2B)的8-mcr。圖3顯示了圖2中描述的所選的A卩偶聯(lián)物在第一次(PD1)、第二次(PD2)和第三次(PD3)給藥后的免疫原性。圖4顯示了從之前用AP(3-10)-KLH偶聯(lián)物(SEQIDNO:40)免疫的豚鼠提取的血清與人AD腦組織的交叉反應(yīng)性。圖4A顯示抗AP單克隆抗體6F3D(它識(shí)別A(3的氨基酸8-17)的免疫反應(yīng)性。染色模式揭示在該人腦中的廣泛的淀賴4羊蛋白沉積病理學(xué)。圖4Bi正實(shí)該同一腦與來(lái)自經(jīng)免疫的豚鼠在免疫接種前的免疫前血清之間缺乏免疫反應(yīng)性。圖4C顯示來(lái)自經(jīng)免疫的豚鼠的血清的免疫反應(yīng)性。圖5顯示代表性的多價(jià)線性8-mer肽，它們是基于豚鼠實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例3)各8-mer的免疫原性選出的。這些偶聯(lián)物按所述的方法合成并偶聯(lián)至OMPC(實(shí)施例l.J和l.K)。圖6顯示代表性的多價(jià)分枝的MAP偶聯(lián)物，它們是基于豚鼠實(shí)驗(yàn)中(實(shí)施例3)各8-mer的免疫原性選出的。圖6A顯示代表性的二價(jià)MAP,圖6B顯示代表性的溴乙酰基半胱氨酸MAP。這些偶聯(lián)物按所述的方法合成并偶聯(lián)至OMPC(實(shí)施例2)。圖7顯示在用偶聯(lián)至OMPC的A(3(l-18)肽注射1(PD1)或2(PD2)次后從恒河侯收集的血清的抗A(340滴度，其中所述A(3(l-18)肽被配制在作為佐劑的單獨(dú)的Merck明礬中或Merck明礬力。上IMX(ISCOMATRIX,CSL,Ltd.,Parkville,Australia)中。圖8顯示在給予AP偶聯(lián)物后血漿AP水平的升高。圖8A顯示，與給予單體構(gòu)建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)后相比，在給予包含偶聯(lián)至OMPC的A卩(3-10)/(21-28)(構(gòu)建體No.12,圖6A)后超過(guò)三倍的升高(口，構(gòu)建體No.12,圖6A;氣A卩(3-10)(SEQIDNO69),▲,A卩(21-28)(SEQIDNO:73)。圖8B顯示血漿水平與滴度水平無(wú)關(guān)(口，構(gòu)建體No.12，圖6A;，A卩(3-10)(SEQIDNO69),▲,A卩(21-28)(SEQIDNO:73)。定義術(shù)語(yǔ)"8-mer"指8氨基酸肽，它對(duì)應(yīng)于A卩片段、天然A卩肽的類(lèi)似物或肽才莫擬物。一個(gè)或多個(gè)8-mer可以與至少一個(gè)間隔物結(jié)合以形成多價(jià)線性肽或形成多價(jià)分枝的MAP。術(shù)語(yǔ)"AP偶聯(lián)物"指的是，通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方式與載體例如鑰孔血藍(lán)蛋白或月莫炎奈瑟:昧菌(A^Mena外月莫蛋白復(fù)合物(OMPC)連接的A卩的8-mer或免疫原性片段。術(shù)語(yǔ)"A卩肽"指本文描述的任何A卩肽，包括1"旦不限于線性8-mer、具有至少一個(gè)間隔物的多價(jià)線性肽以及多價(jià)分枝的多抗原肽(MAP)。術(shù)語(yǔ)"表位"指B和/或T細(xì)胞應(yīng)答的抗原上的位點(diǎn)。B細(xì)胞表位可由連續(xù)氨基酸或通過(guò)蛋白三級(jí)折疊而并置的非連續(xù)氨基酸形成。從連續(xù)氨基酸形成的表位通常在暴露于變性溶劑時(shí)仍保留，而通過(guò)三級(jí)折疊形成的表位通常在用變性溶劑處理時(shí)喪失。T細(xì)胞表位由能夠與宿主MHC分子形成復(fù)合物的肽組成。用于人I類(lèi)MHC分子的T細(xì)胞表位負(fù)責(zé)誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，通常包含9至11個(gè)氨基酸殘基，而用于人II類(lèi)MHC分子的表位負(fù)責(zé)CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，通常包含12個(gè)或更多個(gè)氨基酉臾歹戔基(BjorkmanwNalure_329:506-512,1987;Maddene/1Cell75:693-708;BataliaandCollins;EngelhardAmiuRevImmunol—12:181-207-622.1995;Madden,A醒RevImm漏L13:587-622.1995)。與T細(xì)胞不同，B細(xì)胞能夠識(shí)別少至長(zhǎng)4個(gè)氨基酸的肽。正是T細(xì)胞受體識(shí)別的T細(xì)胞表位/MHC復(fù)合物導(dǎo)致T細(xì)胞活化。用在本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)"A卩的免疫原性片段"或"缺乏T細(xì)胞應(yīng)答的A(3免疫原性片段"指能夠誘導(dǎo)針對(duì)Ap的抗體的形式的免疫應(yīng)答，但該應(yīng)答不包括針對(duì)自身抗原A卩的T細(xì)胞應(yīng)答的8-mer或A卩片段。術(shù)語(yǔ)"免疫學(xué)的"或"免疫"或"免疫原性"應(yīng)答指針對(duì)脊推動(dòng)物中的抗原的體液(抗體介導(dǎo)的)和/或細(xì)胞(通過(guò)抗原特異性T細(xì)胞或它們的分泌產(chǎn)物介導(dǎo)的)應(yīng)答。這種應(yīng)答可為通過(guò)給予免疫原誘導(dǎo)的主動(dòng)免疫或通過(guò)給予抗體誘導(dǎo)的被動(dòng)免疫。術(shù)語(yǔ)"多價(jià)肽"指具有多于1個(gè)抗原決定簇的肽。術(shù)語(yǔ)"藥物組合物"指適合向哺乳動(dòng)物個(gè)體給藥的化學(xué)或生物組合物。用在本文時(shí)，它指包含本發(fā)明描述的A卩的8-mer、免疫原性片段和A卩偶聯(lián)物的組合物，任選地與或不與佐劑一起給藥。發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明如之前所述，臨床前研究提示，引起抗AP多克隆抗體應(yīng)答的主動(dòng)免疫對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠(過(guò)表達(dá)淀粉樣前體蛋白)中AD相關(guān)的病理和認(rèn)知癥狀具有效力(Bard"a/.,NatureMed—6:916-919,2000;Janus"/.,Nature，408:979-982,2000;Morgan"a/.,Nature:408:982-985，2000;DeMattosProc.Natl.Acad.Scl98:8850-8855,2001;Bacskai"/.,J.Neurosci一22:7873-7878,2002;Wilcoc，"a/.,J.Ne脆sci一23:3745-3751,2003)。這些臨床前研究得到一項(xiàng)臨床試驗(yàn)的支持，其中聚集體形式的AP42被用作主動(dòng)免疫原。這項(xiàng)研究的初步證據(jù)表明，在治療后有病理(Nicoll"a/.,NatureMed.r9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004;Masliaha/"Neurology:64:129-131,2005)和認(rèn)知政善(GilmanWa/.:Neurology，64(9):1553-1562,2005)。盡管這些研究結(jié)果是鼓舞人心的，并且與臨床前研究一致，但該治療被證明是不安全的，并在大約6%的經(jīng)治療患者中出現(xiàn)腦膜腦炎后終止(OrgogozoWa/.,Neurology.61:46陽(yáng)54:2003、—因此，亟需能夠激發(fā)有效免疫應(yīng)答并避免不利安全問(wèn)題的主動(dòng)免疫方法。在了(Nicoll,"a/.:NatureMed.:9:448-452,2003;Ferrer"a/.,BrainPathoL14:11-20,2004),暗示存在針對(duì)自身肽AP42的T細(xì)胞應(yīng)答。但是，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員意識(shí)到在保持合適的抗體應(yīng)答(B細(xì)胞介導(dǎo)的)時(shí)需要避免針對(duì)自身的T細(xì)胞應(yīng)答，但還未知生產(chǎn)具有這種性質(zhì)的試劑的方法。這個(gè)問(wèn)題由于缺乏預(yù)測(cè)性的動(dòng)物模型或其它能對(duì)這些活性有效預(yù)測(cè)的臨床前測(cè)定法而變得復(fù)雜。為此，本發(fā)明的申請(qǐng)人采用了T和B細(xì)胞表位的不同性質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)用于本發(fā)明的表位。通過(guò)將線性肽大小限制至8氨基酸，并且如果需要，還移除任何潛在的C末端T細(xì)胞錨定殘基，來(lái)設(shè)計(jì)疫苗構(gòu)建體。因而，本方面的一個(gè)方面是鑒別有免疫原性但缺乏T細(xì)胞表位的A卩片段，以用作AD疫苗。在本申請(qǐng)之前，還不是明確知道AP肽的哪些氨基酸片段會(huì)產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答，同時(shí)也缺乏T細(xì)胞表位。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到本領(lǐng)域中以前的教導(dǎo)沒(méi)有預(yù)測(cè)到例如8-mer會(huì)產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答以及沒(méi)有將有用的片段與Ap肽的不同區(qū)域區(qū)分開(kāi)。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利No.6,808,712和6,787,144。本發(fā)明的其它方面包括鑒別A卩血漿升高劑，它包含A卩的缺乏T細(xì)胞表位的免疫原性片段，以針對(duì)A(3的抗體的形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答并提高血漿A卩水平。這類(lèi)試劑可用作AD疫苗，并用于以升高的腦A卩水平為特征的相關(guān)淀粉樣蛋白病。在申請(qǐng)人的發(fā)明之前，尚不清楚或者i兌無(wú)法預(yù)測(cè)A卩的哪些免疫原性片段會(huì)導(dǎo)致血漿A卩水平升高。不希望被任何理論所束綽，但據(jù)信本文描述的A|3血漿升高劑起以針對(duì)AP的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的作用，根據(jù)A|3清除的外周滲透理論，所述免疫應(yīng)答產(chǎn)生升高水平的血漿AP，從而導(dǎo)致隨后腦A卩的降低。另外，盡管各個(gè)Ap的8-mer或免疫原性片段可能能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，從而使得血漿A卩水平升高，但申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)至OMPC的多價(jià)分枝的MAP,A卩(3-10)/(21-28)(構(gòu)建體No.12,圖6A),相對(duì)于其組成部分的單體構(gòu)建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)或A卩(21-28)(SEQIDNO:73)來(lái)說(shuō),在升高血漿A卩水平方面尤其有效。淀賴—羊蛋白病本發(fā)明提供了預(yù)防和治療以淀粉樣蛋白沉積的積累為特征的疾病的組合物和方法。淀粉樣蛋白沉積包含聚集成不溶物的肽。該肽的性質(zhì)在不同的疾病中有變化，但是在大多數(shù)情況下，該聚集物具有P片層結(jié)構(gòu)且可用剛果紅染色。以淀粉樣沉積為特征的疾病包括晚期或早期發(fā)作的阿爾茨海默病(AD)。在兩種疾病中，淀粉樣沉積包括稱為淀粉樣蛋白卩(A(3)的肽，它在患病個(gè)體的腦中積累。因此，術(shù)語(yǔ)"淀粉樣蛋白病"也指以升高的腦AP水平為特征的疾病。治療劑用在本發(fā)明中的治療劑以針對(duì)A卩的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)可以是主動(dòng)的，如當(dāng)給予免疫原以在個(gè)體中誘導(dǎo)與Aj3有反應(yīng)性的抗體或T細(xì)胞時(shí)；也可以是一皮動(dòng)的，如當(dāng)給予本身結(jié)合個(gè)體中的A卩的抗體時(shí)。用于防止或治療諸如AD的淀粉樣蛋白病的治療劑包括A卩的肽片段，它可為任何天然存在的形式(即Ap39、AP40、A卩42、Ap42或A|343)。這些序列在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，例如，參見(jiàn)Hardyetal.,TINS20:155-158,1997。當(dāng)用在本文時(shí)，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療劑為免疫原性片段，它缺乏T細(xì)胞表位，但能以針對(duì)A|3的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。A|3的免疫原性片段可以是8-mer、具有至少一個(gè)PEG間隔物的多價(jià)線性A卩偶聯(lián)物或多價(jià)分枝的MAPA(3偶聯(lián)物的形式。治療劑可以藥物組合物的形式給藥。在另一實(shí)施方案中，治療劑為A卩血漿升高劑，其能以針對(duì)A卩的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且在個(gè)體中升高血漿A(3水平。這類(lèi)試劑可包括天然存在的肽片段或可以包括一個(gè)或多個(gè)置換、添加或缺失，以及可以包括合成或非天然存在的氨基酸?？稍诒疚膶?shí)施例描述的測(cè)定法中篩選有預(yù)防和治療效果的片段和構(gòu)建體。盡管在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述治療劑包含A卩的肽片段，但是，這些試劑也可以包括不必與AP有顯著氨基酸序列相似性，然而可用作A卩模擬物且誘導(dǎo)類(lèi)似免疫應(yīng)答的肽和其它化合物。例如，可篩選適用于本發(fā)明的形成P折疊片層的肽和蛋白。類(lèi)似地，可篩選適用于本發(fā)明的組合庫(kù)和其它化合物。于它們用作免疫原。、這類(lèi)載;包括血;1白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、免疫球蛋白分子、卵清蛋白、破傷風(fēng)類(lèi)毒素蛋白，或來(lái)自其它諸如白喉、大腸桿菌、霍亂或幽門(mén)螺旋桿菌(//./^/on)等病原菌的類(lèi)毒素，或減毒的毒素衍生物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為膜炎奈瑟球菌外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。本發(fā)明也關(guān)注這類(lèi)治療劑在藥物組合物中的用途，該藥物組合物包含任選地與佐劑一起給藥的A卩的8-mer或免疫原性片段，它們可以被連接到載體。適合的佐劑包括鋁鹽(明礬)、諸如3De-O-?；瘑瘟柞Ｖ珹(MPL)的脂質(zhì)，或基于皂戒的佐劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述佐劑為鋁佐劑(Merck明礬佐劑，MAA)或基于皂戒的佐劑(ISCOMATRIX,CSLLtd,Parkville,Australia。治療方案本發(fā)明用于預(yù)防或治療AD和其它淀粉樣蛋白病的組合物的有效劑量將隨很多因素而變化，這些因素包括但不限于給藥方式、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、所給予的其它藥物以及處理是治療性的(即在疾病癥狀出現(xiàn)后)還是預(yù)防性的(即防止疾病癥狀出現(xiàn))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，患者為人，并且治療劑通過(guò)注射給藥。免疫原或治療劑的使用量也將依賴于佐劑是同時(shí)給藥還是序貫給藥，在沒(méi)有佐劑時(shí)使用較高的劑量。免疫原或治療劑的給藥量會(huì)有變化，但每次注射0.5-50jng肽(基于A卩肽含量)的量被考慮用于人用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道如何配制包含本文描述類(lèi)型的抗原的組合物。給藥方案由初級(jí)免疫及隨后的設(shè)定間隔的加強(qiáng)注射構(gòu)成。初級(jí)免疫和加強(qiáng)免疫之間的間隔、加強(qiáng)注射之間的間隔以及加強(qiáng)免疫的次數(shù)將取決于抗體滴度和疫苗誘導(dǎo)的時(shí)長(zhǎng)。它也將取決于抗體應(yīng)答的功能有效性，即防止AD出現(xiàn)或在AD患者中表現(xiàn)出治療效果所需的抗體滴度水平。典型的方案由原始設(shè)定的在1、2和6個(gè)月時(shí)的注射組成。另一方案由在1和2個(gè)月時(shí)的初始注射組成。對(duì)于任一種方案，加強(qiáng)注射將每6個(gè)月或每年進(jìn)行一次，這取決于抗體滴度和持續(xù)時(shí)間。給藥方案也可以是基于需要，如通過(guò)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答來(lái)確定。鑒別AD疫苗表位為了確定A(3肽的哪些8氨基酸片段("8-mer")足以產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答，申請(qǐng)人系統(tǒng)性地用小的(8氨基酸)交疊合成肽(SEQIDNO:2-37)掃描了全長(zhǎng)AP42，該小的交疊合成肽衍生自顯示在圖1的天然存在的AP序列(SEQIDNO.1)。合成用作抗原、跨越全長(zhǎng)Ap42的29個(gè)交疊的8氨基酸肽(圖2A)。為了改善溶解性，通過(guò)加入三聯(lián)賴氨酸(SEQIDNO:52、53、54、56、59、60、62、64和65)或谷氨酰胺(EEE)(SEQIDNO:50、51和61)殘基或使用聚乙二醇(PEG)(SEQIDNO:55和63)間隔物對(duì)幾種肽進(jìn)行修飾。為此，將跨越對(duì)應(yīng)于殘基(ll-18)和(13-20)的A卩序列的肽制備成多種形式，第一種形式在N末端具有6-氨基己酸(Aha)間隔物和用于化學(xué)交聯(lián)的官能團(tuán)，而其它形式在C末端具有Aha和官能團(tuán)。作為對(duì)照，申請(qǐng)人包括進(jìn)了較長(zhǎng)肽，Ap(l-18)。用在本文時(shí)，免疫原性肽可以是衍生自天然存在的即野生型的或合法產(chǎn)生。這種變體的一個(gè)實(shí)例為EV底物IDNO:66),為對(duì)應(yīng)于A卩(l-42)的肽，其中野生型Ap的位置1和2被改變。用在疫苗制劑中的AP偶聯(lián)物對(duì)用于配制疫苗的AP偶聯(lián)物的選擇是基于8-mer的免疫原性。為了確定物種中帶有與人A(3序列相同的序列的8-mer的免疫原性，將29種肽(圖2A)偶聯(lián)至KLH以形成A卩偶聯(lián)物并在豚鼠中測(cè)試(圖3)。作為對(duì)照免疫原，將AP(l-18)-KLH(SEQIDNO:37)包括在該分析中。如實(shí)施例3.B中所描述的，用配制在明石凡和50|LigISCOMATRIX(CSL,Ltd.,Parkville,Austmlia)中的偶聯(lián)的免疫原免疫豚鼠。為了區(qū)分免疫原性的和非免疫原性的A(342片段，將豚鼠以4周的間隔期免疫三次。在免疫后三周，收集血樣并通過(guò)ELISA測(cè)試針對(duì)A(34Q肽的抗體滴度。這些滴度顯示在圖3中，分別為給藥1次后(PD1)、給藥2次后(PD2)和給藥3次后(PD3)。在首次注射后(PD1),如所述18-mer對(duì)照一樣，一些肽區(qū)域引起了顯著的抗體滴度。具體地，對(duì)應(yīng)于AP氨基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的A(3偶聯(lián)物都產(chǎn)生了超過(guò)1:800的滴度。在第二次注射后(PD2),A卩偶聯(lián)物中的15個(gè)引起超過(guò)1:1000的抗體滴度。對(duì)給藥3次后(PD3)的分析進(jìn)一步證實(shí)，A卩的某些區(qū)域相對(duì)于其它區(qū)域有更高的免疫原性。11區(qū)域表現(xiàn)超過(guò)1:6000的滴度。這些包括對(duì)應(yīng)于AP氨基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的區(qū)域。這些區(qū)域中，5個(gè)區(qū)域?yàn)楦呙庖咴缘?>1:10000),包括區(qū)域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。該凄t據(jù)提示A卩的某些8氨基酸區(qū)域?yàn)楦呙庖咴缘?，而其它區(qū)域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)為非免疫原性的(滴度<1:300)。這些結(jié)果也證實(shí)，盡管Ap偶聯(lián)物能夠引起A(340肽特異的抗體應(yīng)答，但不是所有的Ap片段具有同等的免疫原性。A卩肽-KLH偶聯(lián)物的免疫反應(yīng)性為了證實(shí)在用A(3肽-KLH偶聯(lián)物免疫后的豚鼠中生成的免疫血清與人AD有關(guān)，進(jìn)行了研究以評(píng)估來(lái)自用Ap(3-10)-KLH(SEQIDN〇40)偶聯(lián)物免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反應(yīng)性。通過(guò)免疫組織化學(xué)測(cè)試在第二次注射A(3(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯(lián)物后4周時(shí)從豚鼠收集的血清樣品與人AD腦組織的反應(yīng)性(實(shí)施例4)。如圖4所示，A卩(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯(lián)物產(chǎn)生的免疫原性應(yīng)答產(chǎn)生抗體應(yīng)答，其直接針對(duì)人AD腦組織。圖4A顯示單克隆抗A卩抗體6F3D(VectorLaboratories)的免疫反應(yīng)性。如所顯示的，該腦具有廣泛的AP沉積，其具有預(yù)期的人AD的典型方式。圖4B顯示免疫前的豚鼠血清缺乏免疫反應(yīng)性。圖4C顯示在兩次注射A(3(3-10)-KLH(SEQIDNO:40)偶聯(lián)物之后該相同豚鼠血清的陽(yáng)性免疫反應(yīng)性?？傊摂?shù)據(jù)證實(shí)通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)的免疫原性包含針對(duì)該AD組織中發(fā)現(xiàn)的人A卩驚人發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展至證實(shí)這種應(yīng)答以與治療應(yīng)用一致的方式被控制。生成OMPC偶聯(lián)物和多抗原性偶聯(lián)物基于豚鼠中的免疫原性、A(342氨基酸序列內(nèi)肽片段的相對(duì)位置、AP片段的溶解性和采用OMPC作為載體蛋白的可行性，申請(qǐng)人選擇了7種8-mer(圖2B)用于OMPC偶聯(lián)。這些肽片段對(duì)應(yīng)于A(3的以下氨基酸區(qū)域l國(guó)8、2陽(yáng)9、3-10、7-14、17-24、21-28和33-40。本文描述的發(fā)明包括多價(jià)肽偶聯(lián)物，如那些顯示在圖5、6A和6B中的。多價(jià)分枝的MAP-OMPC偶聯(lián)物(圖6A和6B)通過(guò)采用基于賴氨酸的骨架來(lái)生成，而多價(jià)線性8-mer-OMPC偶聯(lián)物(圖5)則采用PEG接頭來(lái)制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，與也可用在本發(fā)明中的常規(guī)氨基酸接頭相比，PEG接頭具有免疫原性較低和肽溶解性較大的優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫原性片段為偶聯(lián)至OMPC的多價(jià)MAP。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這種偶聯(lián)物并非是肽與載體是1:1比例。相反，多個(gè)肽以球形方式附著到每個(gè)OMPC分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解的是，多價(jià)線性構(gòu)建體和MAP的使用將增強(qiáng)溶解性、制劑穩(wěn)定性、免疫原性和多克隆應(yīng)答的多樣性。OMPC偶聯(lián)物疫苗的免疫原性為了評(píng)估Ap肽-OMPC偶聯(lián)物的免疫原性并進(jìn)一步評(píng)估佐劑對(duì)這種疫苗構(gòu)建體的好處，申請(qǐng)人著手在恒河猴中的研究。用Ap(l-18)-OMPC(劑量基于AP肽含量)偶聯(lián)物接種恒河猴，該偶聯(lián)物配制在Merck明礬佐劑(MAA)或MAA和ISCOMATRIX(CSL,Ltd.,Parkville，Australia)中。收集血樣并用于確定針對(duì)Ap40的抗體滴度。對(duì)該進(jìn)行中的研究的中間分析證實(shí)在第一次給藥后(PD1),接受含5昭疫苗的明礬的猴沒(méi)有出現(xiàn)任何可檢測(cè)的滴度，而那些接受含30pg疫苗的明礬的猴出現(xiàn)了低的A(340特異滴度。接受明礬和ISCOMATRIX⑧制劑的所有猴都出現(xiàn)了顯著的抗體滴度。在給藥2次后(PD2)，在僅有明礬中的兩種劑量的A卩偶聯(lián)物產(chǎn)生類(lèi)似的滴度水平，而接受明鞏和ISCOMATRIX⑧的組出現(xiàn)了相對(duì)于僅有明礬組高10倍的抗體滴度。這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)AP-OMPC偶聯(lián)物在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中有免疫原性。該數(shù)據(jù)還證明這種偶聯(lián)物疫苗的有效性被基于皂甙的佐劑如ISCOMATRIX⑧顯著增強(qiáng)。實(shí)施例實(shí)施例1制備A(3偶聯(lián)物本實(shí)施例描述A卩肽片段的制備，所述A卩肽片段隨后用于A卩偶聯(lián)物以針對(duì)A|3的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。A.制備A卩(8-mer)肽(SEQIDNO:37-65;圖2A)合成打算偶聯(lián)至馬來(lái)酰亞胺衍生的載體蛋白的肽，在羧基末端具有半胱氨酸殘基。在原始肽序列和羧基末端半胱氨酸之間并入間隔物Aha(6-氨基己酸)作為結(jié)構(gòu)元件，以在偶聯(lián)過(guò)程中最小化對(duì)載體蛋白的空間可及性。此外，以EEE、KKK或PEG為代表的增溶殘基被引入序列14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29中的C末端。PEG單元作為0-(N-Fmoc-2-氨乙基)-0'-(2-羧乙基)-十一二醇[Fmoc-NHCH2CH2O(CH2CH2O)10CH2CH2OCH2CH2CO2H]引入。從RinkAmideMBHA樹(shù)脂開(kāi)始，采用制造商(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)提供的Fmoc化學(xué)操作在自動(dòng)肽合成儀上通過(guò)固相合成來(lái)制備AP肽。在組裝之后，結(jié)合樹(shù)脂的肽被脫保護(hù)并采用94.5%三氟乙酸、2.5%1,2-乙二辟u(mài)醇(ethanedithiol)、1%三異丙基石圭步克(tnisopropylsilane)和2.5%H20的混合物從樹(shù)脂切下。在處理兩小時(shí)后，過(guò)濾反應(yīng)物、濃縮并用乙醚研磨得到的油狀物。將固體產(chǎn)物過(guò)濾，溶于50%乙酸氾2〇中并冷凍干燥。通過(guò)在C-18支持物上采用0.1%TFA/H20/乙腈梯度通過(guò)RPHPLC實(shí)現(xiàn)對(duì)半純產(chǎn)物的純化。通過(guò)分析HPLC評(píng)估級(jí)分。合并純級(jí)分(〉98%)并冷凍干燥。通過(guò)氨基酸分析和質(zhì)譜分析證實(shí)同一性。B.制備A卩肽-KLH偶聯(lián)物(SEQIDNO:37-65;圖2A)為了制備KLH偶聯(lián)物，將2mg的具有C末端半胱氨酸的A(3肽(8-mer)懸浮在1ml商品化的馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)緩沖液(83mM磷酸鈉、0.1MEDTA、0.9MNaCl、0.02%疊氮鈉,pH7.2)(PierceBiotechnology,Rockford,IL)中。將2mg商品化的馬來(lái)酰亞胺活化的KLH(PierceBiotechnology,Rockford,IL)樣品加至肽，并使其在25。C反應(yīng)4小時(shí)。通過(guò)采用100,000Da透析袋的徹底的PBS緩沖液透析從未反應(yīng)的肽和試劑中分離出偶聯(lián)物。在70小時(shí)酸水解后通過(guò)氨基酸分析評(píng)估引入偶聯(lián)物中的肽的量。肽濃度一皮確定為在0.24和0.03mg/ml之間。C.合成溴乙?；腁卩肽(SEQIDNO:67-77;圖2B)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的t-Boc固相合成，采用引入氨基酸的雙偶聯(lián)法在AppliedBiosystems430A型自動(dòng)分析4義上來(lái)制備溴乙?；碾?。/人對(duì)甲基二苯甲胺樹(shù)脂開(kāi)始，引入羧基末端氨基酸t(yī)-Boc-Lys(Fmoc)-OH，隨后引入序列中后面的氨基酸。將Aha作為間隔物引入到所有這些序列，將PEG單元引入序列35和37以幫助水溶。將PEG單元作為0-(N-Boc-2-氨乙基)-O'-(N-二羥乙酰基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH2CH20(CH2CH20)6CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H]引入。氨基末端通過(guò)偶聯(lián)乙酸來(lái)加帽。在組裝原始序列之后，通過(guò)用哌啶處理移除羧基末端賴氨酸s氨基的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。之后，使N^氨基基團(tuán)與淡乙酸酐在作為溶劑的二氯曱烷中反應(yīng)30分鐘。通過(guò)用液體氫氟酸和作為清除劑的10%茴香醚處理，完成肽的脫保護(hù)和從樹(shù)脂支持物移除肽。采用0.1%TFA/乙腈梯度在反相C-18硅膠柱上通過(guò)制備HPLC純化所述肽。通過(guò)分析HPLC和質(zhì)譜分析證實(shí)了肽的同一性和均一性。D.合成溴乙?；亩r(jià)MAP,構(gòu)建體No.8,圖6A溴乙?；亩嗫乖?MAP)的合成類(lèi)似于實(shí)施例l.C中所描述的合成方法。在將羧基末端的Fmoc-Lys(ivDde)-OH[ivDde=1,(4,4-二甲基畫(huà)2,6-二氧-亞環(huán)己基)-3-曱基-丁基]偶聯(lián)至MBHA樹(shù)脂后，采用哌啶移除a氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)并通過(guò)引入t-Boc-Lys(Fmoc)-OH繼續(xù)合成。在t-Boc基團(tuán)脫保護(hù)后，用以下的t-Boc保護(hù)的氨基酸延伸序列Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E,并通過(guò)在ABI合成儀上偶聯(lián)乙酸來(lái)給氨基末端加帽。用哌啶除去側(cè)鏈賴氨酸Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并通過(guò)引入以下被保護(hù)的基團(tuán)在ABI合成儀上延伸賴氨酸的W臂Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D,并通過(guò)偶聯(lián)乙酸給氨基末端加帽。通過(guò)用含5%酰肼的二甲基曱酰胺處理5分鐘移除ivDde保護(hù)基團(tuán)，以提供羧基末端賴氨酸上未阻斷的Ns氨基基團(tuán)，如實(shí)施例i.c所述，所述isr氨基基團(tuán)被溴乙酸酐進(jìn)一步處理。從樹(shù)脂切下肽。它隨后的純化和表征如實(shí)施例l.C所述。E.合成溴乙?；腗AP,構(gòu)建體No.11和12，圖6AMAP構(gòu)建體No.11和12的制備如同實(shí)施例l.D中所描述的。F.合成半胱氨酸多價(jià)MAP,構(gòu)建體No.9,圖6A從MBHA樹(shù)脂開(kāi)始，在ABI自動(dòng)合成4義上組裝以下的t-Boc保護(hù)的氨基酸C、Lys(Fmoc)、Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E，然后用乙酸偶聯(lián)。除去賴氨酸的1^氨基Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并通過(guò)引入以下的t-Boc保護(hù)的氨基酸然后偶聯(lián)乙酸來(lái)繼續(xù)合成Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。樹(shù)脂結(jié)合肽的分離、純化和表征如實(shí)施例l.C。注意在HF切割中，不是使用實(shí)施例l.C的10%茴香醚而是對(duì)甲酚:對(duì)硫代曱酚的1:1混合物作為清除劑。G.合成半胱氨酸二價(jià)MAP,構(gòu)建體No.10、13和14，圖6A如實(shí)施例6.F所述制備二價(jià)MAP，構(gòu)建體No.10、13和14,圖6A。將PEG單元作為0-(N-Boc-2-氨乙基)-0'-(N-二羥乙酰基-2-氨乙基)己二醇[Boc-NHCH2CH20(CH2CH20)6CH2CH2NHCOCH2OCH2C02H]引入。H.合成溴乙?；亩鄡r(jià)MAP,構(gòu)建體No.16,圖6B采用ABJ自動(dòng)合成儀，使Fmoc-Lys(t-Boc)-OH偶聯(lián)至MBHA樹(shù)脂。在除去賴氨酸W氨基的t-Boc保護(hù)基團(tuán)后，通過(guò)引入以下的t-Boc保護(hù)的氨基酸延伸序列Aha、Y、G、S、D、H、R、F、E,然后偶聯(lián)乙酸。通過(guò)用哌啶手動(dòng)處理除去賴氨酸的NaFmoc保護(hù)基團(tuán)。通過(guò)引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH，然后引入以下的t-Boc保護(hù)的氨基酸(在ABI合成儀上)并偶聯(lián)乙酸來(lái)進(jìn)一步處理序列Aha、H、H、V、E、Y、G、S、D。如之前所述除去賴氨酸FmocNa氨基保護(hù)基團(tuán)，并通過(guò)引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH,然后引入以下t-Boc保護(hù)的氨基酸并偶聯(lián)乙酸來(lái)繼續(xù)合成Aha、K、N、S、G、V、D、E、A。除去賴氨酸上的NaFmoc<呆護(hù)，并通過(guò)引入Fmoc-Lys(t-Boc)-OH,然后引入以下t-Boc保護(hù)的氨基酸并偶聯(lián)乙酸來(lái)繼續(xù)合成Aha、V、V、G、G、V、M、L、G。在除去賴氨酸NaFmoc保護(hù)基團(tuán)后，使樹(shù)脂結(jié)合肽與溴乙酸酐反應(yīng)，如實(shí)施例l.C所述。分離和表征終產(chǎn)物如同實(shí)施例l.C所述。I.合成多價(jià)MAP,構(gòu)建體No.15和17,圖6B如實(shí)施例l.F和l.H所述合成MAPAp偶聯(lián)物，構(gòu)建體No.15和17,圖6B。J.合成溴乙?；亩鄡r(jià)線性肽，構(gòu)建體No.1,圖5從MBHA樹(shù)脂開(kāi)始，采用t-Boc化學(xué)在ABI自動(dòng)合成儀上合成原始序列，如實(shí)施例6.A所述。采用BOP試劑作為偶聯(lián)劑，中間的PEG單元被作為Fmoc-l-氨基-4,7,10-三嗜烷13-十三胺琥珀酸[Fmoc-NHCH2CH2CH20(CH2CH20)2CH2CH2CH2NHCOCH2CH2C02H]引入。哌啶被用于使Fmoc基團(tuán)脫保護(hù)。氨基末端的溴乙?；鐚?shí)施例l.C所述。分離和表征期望的產(chǎn)物如實(shí)施例l.C所述。K.合成多價(jià)線性A卩肽，構(gòu)建體No.2、5、6和7,圖5如實(shí)施例l.J所述合成多價(jià)線性A卩肽，構(gòu)建體No.2、5、6和7。實(shí)施例2AP肽化學(xué)偶聯(lián)至OMPC本實(shí)施例介紹將來(lái)源于人A|342的肽化學(xué)偶聯(lián)至純化的膜炎奈瑟球菌B型外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。該偶聯(lián)的化學(xué)性質(zhì)為卣乙?；苌碾暮蛶€基衍生的膜復(fù)合物蛋白之間的反應(yīng)。如上所述合成淀粉樣肽，溴乙?；倌軋F(tuán)在二價(jià)線性表位肽的N末端，或者在單價(jià)線性和分枝的MAP形式的C末端或通過(guò)賴氨酸殘基的s氨基連接。通過(guò)由6-氨基己酸(Aha)組成的間隔物分開(kāi)BrAc基團(tuán)和成熟肽。參見(jiàn)以上描述的序列。將描述代表性肽AP(3-10)的偶聯(lián)。按照標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)菌操作，在層流環(huán)境中進(jìn)行含OMPC溶液的所有操作。A.OMPC的石克醇化從例如Fu的用于生產(chǎn)PedvaxHIB⑧和肺炎球菌偶聯(lián)疫苗的美國(guó)專(zhuān)利No.5,494,808中描述的方法獲得純化的無(wú)菌OMPC，采用試劑N-乙?；甙腚装彼崃虼鷥?nèi)酯(NAHT,Aldrich,St.Louis,MO)在其表面易接近的賴氨酸殘基的一部分上硫醇化。在4。C下，水中的117mgOMPC通過(guò)289,000xg離心60分鐘而沉淀，棄去上清。將鼓泡通入N2的活化溶液(0.11M硼酸鈉，pHll)加入離心管，以玻璃攪拌棒取出沉淀。將懸浮液轉(zhuǎn)移至玻璃Dounce勻漿器，以30次抽動(dòng)使其重懸。洗滌離心管，并將洗滌液用Doimce勻漿器30次抽動(dòng)來(lái)洗滌。將重懸的沉淀和洗滌液合并在清潔的容器中，得到10mg/mL濃度的OMPC。將固體DTT和EDTA溶解在鼓泡通入N2的活化溶液中，并以0.106mgDTT/mgOMPC和0.57mgEDTA/mgOMPC的比例加入反應(yīng)容器。在溫和攪拌后，NAHT被溶解在鼓泡通入N2的水中，并以0.89mgNAHT/mgOMPC的比例加入至反應(yīng)中。在環(huán)境溫度下在N2罩中避光反應(yīng)3小時(shí)。結(jié)束時(shí)，如上所述OMPC被沉淀并通過(guò)在鼓泡通入N2的偶聯(lián)物緩沖液(25mM硼酸鈉(pH8.5)、0.15MNaCl)中進(jìn)行Dounce勻漿重懸為6mg/mL來(lái)洗滌沉淀。對(duì)于最后的重懸，將OMPC按以上方式沉淀并在鼓泡通入N2的偶聯(lián)緩沖液中通過(guò)Dounce勻漿重懸為10mg/mL。取出等^f分試^^羊用于通過(guò)Ellman測(cè)定確定游離巰基，大量的產(chǎn)物被避光存貯在冰上，直至使用。測(cè)量的巰基含量為0.2至0.3|umol/mL。B.A{3肽偶聯(lián)至OMPC肽的官能團(tuán)BrAc含量被認(rèn)為是1:1(摩爾比)。稱取足夠的肽以使BrAc相對(duì)于總巰基摩爾過(guò)量1.6摩爾。用于每個(gè)偶聯(lián)的總的目標(biāo)OMPC蛋白為15mg。肽以2.6mg/mL被重懸在鼓泡通入N2的偶聯(lián)緩沖液中，緩慢加入硫醇化的OMPC溶液。避光反應(yīng)，在環(huán)境溫度下孵育約22小時(shí)。在環(huán)境溫度下用5倍摩爾過(guò)量的N-乙基馬來(lái)酰亞胺將殘留的游離OMPC巰基基團(tuán)淬滅18小時(shí)。按照偶聯(lián)操作平行進(jìn)行僅有硫醇化OMPC的對(duì)照。完成淬滅后，將偶聯(lián)物和對(duì)照轉(zhuǎn)移至100,000Da分子量截止透析單元，并相對(duì)于至少更換5次偶聯(lián)緩沖液徹底透析。完成透析后，將樣品轉(zhuǎn)移至15ml聚丙烯離心管并在4。C下以2,280xg離心5分鐘除去任何聚集物。取出等份試樣用于分析，大量產(chǎn)物被儲(chǔ)存在4。C。C.分析A卩肽-OMPC偶聯(lián)物通過(guò)改進(jìn)的Lowry測(cè)定確定總蛋白，通過(guò)定量氨基酸分析(AAA)來(lái)分析偶聯(lián)物和對(duì)照樣品。根據(jù)對(duì)酸水解新生的肽-OMPC鍵釋放的獨(dú)特殘基S-羧曱基高半胱氨酸的定量，確定肽與OMPC摩爾比。由水解穩(wěn)定殘基確定OMPC特定濃度，所述水解穩(wěn)定殘基不存在于肽序列，因而是OMPC蛋白所獨(dú)有的。假定對(duì)于每摩爾SCMHC為1摩爾的肽，則SCMHC/OMPC的比例就等于肽/OMPC含量。采用肽分子量和平均OMPC質(zhì)量40,000,000Da，從該比例可計(jì)算肽的加載量。偶聯(lián)的共價(jià)性質(zhì)通過(guò)采用4-20%Tns-甘氨酸凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)的SDS-PAGE分析來(lái)定性確定，其中觀察到考馬斯染色的偶聯(lián)物條帶相對(duì)于對(duì)照泳動(dòng)性向上偏移。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>A(3偶聯(lián)物的免疫原性本實(shí)施例描述了能以針對(duì)AP的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的A{3偶聯(lián)物的配制和給藥。A.配制疫苗偶if關(guān)物將A卩肽-KLH偶聯(lián)物疫苗配制在ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville,Australia)中。所有的A卩肽-OMPC偶聯(lián)物疫苗配制在明磯中，無(wú)論有沒(méi)有第二種佐劑如基于皂甙的佐劑ISCOMATRIX(CSLLtd.,Parkville,Australm)均可。所有樣品操作都在無(wú)菌條件下進(jìn)行。對(duì)于明礬制劑，偶聯(lián)物以指定的肽濃度被1倍鹽水稀釋并與對(duì)應(yīng)于制備在無(wú)菌鹽水(150mM無(wú)菌氯化鈉溶液)中的900pg/mLMerck明礬的兩倍明磯(Merck,產(chǎn)品號(hào)39943)混合。因此，疫苗中的覃巴濃度為450fig/mLMerck明礬或一倍的Merck明礬。對(duì)于動(dòng)物研究，靶肽(抗原)濃度如下小鼠-12.1昭/mL(劑量0.1mL);猴-10嗎/mL或60|ig/mL(劑量0.5mL)以及豚鼠-12.5|ig/mL(劑量0.4mL)。將該混合物在室溫下孵育兩小時(shí)。為了獲得該注射劑量，將明礬吸收的偶聯(lián)物用一倍的明礬稀釋以達(dá)到目標(biāo)肽濃度。當(dāng)需要第二種佐劑即ISCOMATRD^時(shí)，對(duì)于小鼠研究目標(biāo)濃度為10叱/ML,對(duì)于猴研究，目標(biāo)濃度為0、100或200pg/mL以及對(duì)于豚鼠為125昭/mL。1.ISCOMATRIX⑧的制備采用盒式膜(Slide隱A隱Lyzer⑧DialysisCassett，10KMWCO,Pierce,Rockford,IL)，將ISCOMATRIX⑧在2-8。C透析進(jìn)無(wú)菌鹽水溶液。在透析過(guò)程中無(wú)菌鹽水溶液更換2-3次。完成透析后，采用注射器式濾器(0.22(iMMillex-GV注射器式濾膜，Millipore,Billerica,MA)無(wú)菌過(guò)濾ISCOMATRIX⑧。無(wú)菌的經(jīng)透析的ISCOMATRIX⑧的濃度通過(guò)RP-HPLC確定。將ISCOMATRIX⑧無(wú)菌保存在2-8匸，直至使用。2.A卩肽-OMPC偶聯(lián)物和Merck明礬的制備將A卩肽-OMPC偶聯(lián)物儲(chǔ)備液稀釋進(jìn)無(wú)菌IX鹽水溶液。然后將稀釋的AD肽-OMPC偶聯(lián)物儲(chǔ)備液加至含2XMerck明礬的IX無(wú)菌鹽水溶液中并在室溫下在旋轉(zhuǎn)輪上混合1小時(shí)。室溫下使該混合物在工作臺(tái)上靜置15分鐘，然后以1500rpm離心10分鐘。小心傾出上清(對(duì)上清進(jìn)行UV分析以確定結(jié)合到明鞏的A卩肽-OMPC偶聯(lián)物％)，并將沉淀重懸在無(wú)菌1X鹽水中。將混合物等分進(jìn)無(wú)菌3mL管式玻璃瓶，然后保存在2-8。C直至最后與ISCOMATRIX⑧配制。3.A卩肽-OMPC/明礬和ISCOMATRIX⑧疫苗的配制在最后與ISCOMATRIX⑧配制前，通過(guò)靜態(tài)光散射法確定A卩肽-OMPC/明礬在鹽水中的顆粒大小以證實(shí)結(jié)合并監(jiān)測(cè)顆粒穩(wěn)定性。在攪拌下，將無(wú)菌經(jīng)透析的IX鹽水中的ISCOMATRIX⑧加至無(wú)菌的150mMNaCl中的A卩肽-OMPC/明礬。給瓶加塞、加帽并壓皺，直至完全密封。在注射前將疫苗保存在2-8i:。注射前，每種疫苗渦動(dòng)3-5分鐘。B.在豚鼠中偶聯(lián)物疫苗的免疫原性從HarlanInc.,Indianapolis,IA得到6至10周齡的雌性豚鼠并才艮據(jù)常規(guī)指導(dǎo)銅養(yǎng)在Merck研究實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物房中。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都得到MerckResearchLaboratoriesInstitutionalAnimalCareandUseCommittee(IACUC)的批準(zhǔn)。將抗原制備在磷酸鹽緩沖鹽水中并配制在指定的佐劑中。在40pgISCOMATRIX⑧存在下通過(guò)肌內(nèi)注射400pl的偶聯(lián)物疫苗用顯示在圖2A中的A卩肽-KLH偶聯(lián)物(8pg肽含量或50昭的總偶聯(lián)物)免疫每組兩只動(dòng)物。以四周的間隔免疫三次。在首次免疫之前(pre-bleed)以及每次免疫三周之后收集血清才羊品并在抗體滴度測(cè)定前保存在4°C。采用AP40作為耙抗原按照以下方法通過(guò)ELISA測(cè)定抗體滴度。該基于ELISA的分析如下用每孔50)al在50mM碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為4iug/ml的AP包被96孔板，4。C過(guò)夜。將板用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌并用含有0.05%Tween-20的PBS中3%脫脂乳(乳-PBST)封閉。測(cè)試樣品在PBST中以4倍系列稀釋。將100pl稀釋的樣品加入每孔，并將板在24。C孵育兩小時(shí)，隨后用PBST洗滌6次。每孔加入50jal在乳-PBST中1:5000稀釋的HRP-偶聯(lián)第二抗體，并將板在24。C孵育l小時(shí)。將板洗滌三次，每孔加入100mM檸檬酸鈉(pH4.5)中的100|ul1mg/ml的鄰苯二胺二鹽酸鹽。在24。C孵育30分鐘后，通過(guò)每孔加入100|ul的INH2SO4終止反應(yīng)，并采用ELISA讀板儀在490nm處讀數(shù)?？贵w滴度被定義為給出OD490nm值高于均值加上偶聯(lián)物對(duì)照孔兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的最高稀釋度的倒數(shù)。顯示在圖3中的該分析結(jié)果證明在第一次注射后(PD1),—些肽區(qū)域引起顯箸的抗體滴度，如同18-mer對(duì)照。尤其是，對(duì)應(yīng)于Ap氨基酸1-8、2-9、3-10、17-24、21-28和33-40的Ap肽片段都產(chǎn)生超過(guò)1:800的滴度。在第二次注射后(PD2),15種8-mer偶聯(lián)物引起超過(guò)1:1000的抗體滴度。對(duì)給藥3次后(PD3)的分析進(jìn)一步證實(shí)AP肽的某些區(qū)域相對(duì)于其它區(qū)域免疫原性更強(qiáng)。11個(gè)區(qū)域表現(xiàn)出大于1:6000的滴度。這些區(qū)域包括對(duì)應(yīng)于Ap氨基酸1-8、3-10、7-14、11-18、13-20、15-22、19-26、21-28、23-30、27-34和29-36的區(qū)域。在這些區(qū)域中，五個(gè)區(qū)域是高免疫原性的(>1:10000)，包括區(qū)域1-8、15-22、21-28、23-30和29-36。該結(jié)果證實(shí)8-mer偶聯(lián)物能夠引起AP4o特異性抗體應(yīng)答。出人意料并且與以前的教導(dǎo)相反的是，并非AP的所有片段都有相等的免疫原性。實(shí)際上，這些數(shù)據(jù)表明某些8-mer為高免疫原性的，而其它的A卩區(qū)域(例如5-12、25-32、31-38和35-42)則是無(wú)免疫原性的(滴度<1:300)。C.偶聯(lián)物疫苗在恒河侯中的免疫原性在非人靈長(zhǎng)類(lèi)即恒河侯中進(jìn)行了研究，與在豚鼠中進(jìn)行的相似，以確定A卩肽-OMPC偶聯(lián)物和明鞏以及ISCOMATRIX⑧佐劑是否提供免疫應(yīng)答。才艮才居MerckResearchLaboratoriesandNewIberiaResearchCenter(TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的學(xué)會(huì)動(dòng)物關(guān)懷"i十戈寸々司養(yǎng)'f"亙;^可1^矣(iWac"c"。申請(qǐng)人采用偶聯(lián)至OMPC的Ap肽作為模型抗原，包括圖2B中顯示的8-mer:A(3(1-8)(SEQ.IDNO:67)、A卩(3-10)(SEQ.IDNO:69)、AJ3(7-14)(SEQIDNO:70)、A卩(17-24)(SEQIDNO.72)、A(3(21-28)(SEQIDNO:73)和A卩(33-40)(SEQIDNO.74);圖5中顯示的二價(jià)線性肽A，(3-10)(7-14)(構(gòu)建體No.1)、A卩(3-10)(21-28)(構(gòu)建體No.2)、A卩(1-8)(21-28)(構(gòu)建體No.5);以及顯示在圖6A中的多價(jià)分枝的MAP:A(3(3-10)(7-14)(構(gòu)建體No.8)、A卩(l-8)(21-28)(構(gòu)建體No.11)、A卩(3-10)(21-28)(構(gòu)建體No.12)。用配制在Merck明礬佐劑(MAA)中的5每種疫苗加上100叱的ISCOMATRIX⑧每4周免疫一次恒河侯(N二3)。在每次注射四周后收集血清樣品并通過(guò)ELISA確定A|3特異的抗體應(yīng)答。與來(lái)自豚鼠研究的結(jié)果一致，所有的偶聯(lián)物發(fā)現(xiàn)在猴中有免疫原性。Ap特異的抗體滴度在單次注射后就可檢測(cè)，在隨后的注射后進(jìn)一步增強(qiáng)。通常，對(duì)于所測(cè)試的偶聯(lián)物，在第二或第三次免疫之后達(dá)到峰值滴度，其中幾何平均滴度在25,000至500,000的范圍。這些結(jié)果證實(shí)本文描述的A卩偶聯(lián)物能夠引起AP特異的抗體應(yīng)答這一發(fā)現(xiàn)。D.佐劑對(duì)恒河侯中偶聯(lián)物疫苗免疫原性的影響另一項(xiàng)研究在非人靈長(zhǎng)類(lèi)即恒河侯中進(jìn)行，以確定A卩肽-OMPC偶聯(lián)物和基于皂戒的佐劑如ISCOMATRIX是否能提供改善的免疫應(yīng)答。申請(qǐng)人采用偶聯(lián)至OMPC的A(3(l-18)肽作為模型抗原。根據(jù)MerckResearchLaboratoriesandNewIberiaResearchCenter(TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的學(xué)會(huì)動(dòng)物關(guān)懷計(jì)劃飼養(yǎng)恒河侯向五組猴(每組三只)給予以下的AP(l-18)-OMPC偶聯(lián)物(1)明礬中的5iLig偶聯(lián)物(基于肽含量)，(2)明鞏中的5ng偶聯(lián)物+100叱ISCOMATRIX,(3)明礬中的5iug偶聯(lián)物+50mgISCOMATRIX,(4)明礬中的30嗎偶聯(lián)物，(2)明石凡中的30jug偶聯(lián)物+100)ugISCOMATRIX。通過(guò)在0、8和24周采用結(jié)核菌素注射器(Becton-Dlckmson,FranklinLakes,NJ)肌內(nèi)注射0.5ml的等份試樣進(jìn)行免疫。從0周起(pre-bleed)以四周的間隔收集血清樣品并通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)AP40的抗體滴度，如在以上實(shí)施例中所描述的那樣進(jìn)^^。該進(jìn)行中的研究的中間分析證明在PD1時(shí)，接受明礬中的5mcg偶聯(lián)物疫苗的猴沒(méi)有出現(xiàn)可檢測(cè)的滴度，而那些接受明礬中的30嗎偶聯(lián)物疫苗的猴出現(xiàn)低的AP4o特異性滴度。接受明礬加ISCOMATRIX⑧制劑的所有猴都出現(xiàn)了顯著的抗體滴度。在PD2時(shí)，在僅有明礬中的兩個(gè)劑量產(chǎn)生類(lèi)似的滴度水平，然而接受明礬加Iscomatrix⑧的組出現(xiàn)了相對(duì)于僅有明礬條件高10倍的抗體滴度。這項(xiàng)研究的結(jié)果證實(shí)該AP肽-OMPC偶聯(lián)物在非人靈長(zhǎng)類(lèi)中有免疫原性。該數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)這種偶聯(lián)物疫苗的有效性被基于皂戒的佐劑如ISCOMATRIX顯著增強(qiáng)。實(shí)施例4豚鼠多克隆血清的免疫反應(yīng)性為了證明以上用8-merKLH偶聯(lián)物免疫后的豚鼠產(chǎn)生的免疫血清(實(shí)施例3.B)與人AD有關(guān)，進(jìn)行了研究以評(píng)估用A卩(3-10)-KLH免疫原免疫的豚鼠的多克隆血清的免疫反應(yīng)性。在第二次注射該構(gòu)建體后四周，根據(jù)以下的方法從代表性豚鼠收集血液。在人AD腦切片(BioChainInstitute,Inc.,Hayward,CA)上評(píng)估多克隆血清的反應(yīng)性。通過(guò)以下方法制備人腦切片在6(TC孵育30分鐘，隨后在室溫下用二曱苯洗滌兩次，每次5分鐘。隨后將切片浸入100%EtOH中兩次，每次5分鐘，在每次之后在ddH20中浸泡5分鐘。將切片浸在99%曱酸中3分鐘，隨后是在ddH20中的短暫洗滌以及在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中浸泡5分鐘。隨后將切片與過(guò)氧化物酶阻斷劑一起孵育10分鐘，接著是5分鐘的PBS洗滌。通過(guò)暴露于10%山羊血清10分鐘來(lái)封閉切片并隨后用PBS洗滌5分鐘。然后將切片與稀釋的豚鼠血清在4°C孵育過(guò)夜或在室溫下孵育1小時(shí)。在5分鐘的PBS洗滌之后，將切片與稀釋的生物素化的山羊抗豚鼠IgG或生物素化的馬抗小鼠抗體(5mlPBS中一滴)一起孵育10分鐘。在PBS中洗滌切片5分鐘，隨后與ABC溶液(VectorstainABCkit;VectorLaboratories,Inc.)—起將育30分鐘。用PBS洗滌切片5分鐘。然后用DAB(DakoCytomation)對(duì)切片染色5分鐘并用ddH20洗滌。接著，將切片在蘇木精中復(fù)染30秒并在梯度EtOH和二曱苯(70%EtOH5分鐘，80%EtOH5分鐘，100%EtOH5分鐘以及二甲苯5分鐘)中脫水。然后對(duì)切片加上蓋玻片，通過(guò)光學(xué)顯微鏡評(píng)估。通過(guò)A(3(3-10)-KLH偶聯(lián)物產(chǎn)生的免疫應(yīng)答產(chǎn)生針對(duì)人AD腦組織的抗體應(yīng)答。如圖4所示，這個(gè)人腦切片具有廣泛的AJ3沉積，沉積方式為人AD通常所預(yù)期的。盡管免疫前豚鼠血清被證實(shí)在暴露于該組織時(shí)缺乏免疫反應(yīng)性，但在兩次注射A(3(3-10)-KLH構(gòu)建體后，觀察到來(lái)自同一只豚鼠的血清有陽(yáng)性免疫反應(yīng)性。這些數(shù)據(jù)證實(shí)，通過(guò)ELISA檢測(cè)的并顯示在圖3中的免疫原性含有針對(duì)該AD組織中存在的人A(3的顯著抗體應(yīng)答。因此，該結(jié)果將一些A(3片段的不同免疫原性的驚人發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展至進(jìn)一步證實(shí)該應(yīng)答是與治療應(yīng)用一致的方式被控制的。實(shí)施例5鑒別缺乏T細(xì)胞表位的免疫原性片段為了鑒定用于本發(fā)明的缺乏T細(xì)胞表位的免疫原性片段，以下的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISpot)測(cè)定可被用作評(píng)價(jià)T細(xì)胞對(duì)特定抗原的應(yīng)答。具有T細(xì)胞表位的免疫原片段通過(guò)在白色膜表面存在暗點(diǎn)來(lái)鑒別；每個(gè)點(diǎn)表明存在應(yīng)答抗原(即免疫原性片段)而分泌干擾素y(IFN-力的T細(xì)胞。疫苗和免疫學(xué)領(lǐng)域一支術(shù)人員熟悉這種測(cè)定法，參見(jiàn)，例如LarssonW"/.，AIDS3:767-777,1999,andMwau"a/.，AIDSResearchandHumanRetroviruses18:611-618,2002。最近的綜述可參考A.E.Kalyuzhny,MethodsMoBiol.302:15-31,2005。申請(qǐng)人使用來(lái)自恒河侯(NewIberiaResearchCenter,TheUniversityofLouisianaatLafayette,NewIberia,LA)的外周血單核細(xì)月包(PBMC)用于應(yīng)答肽A卩1-40(AmericanPeptideCo.,Sunnyvale,CA)(氨基酸序列NO:78)和A卩1-20(Synpep,Dublin,CA)(氨基酸序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF)(SEQIDNO:79)。純化的多克隆小鼠抗猴IFN-y(克隆MD-1,CatNo.CT525,U-CyTechbiosciences,Utrecht,TheNetherlands)被稀釋在含有1%青霉素和硫酸鏈霉素(GIBCO青霉素-鏈霉素，CatNo.15140-122,Invitrogen,Carlsbad,CA)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中，然后加至96孑LHTSIP無(wú)菌板(Cat.No.MSIPS4W10,Millipore,Billerica,MA),并在4°C終育超過(guò)12小時(shí)。洗板，并在37。C孵育至少2小時(shí)之前，加入RIO[RPMI培養(yǎng)基1640(GIBCOCat.No.11875-093)、10。/。胎牛血清(HyCloneSH30070.03,Logan,UT)、0.1%50mM2-巰基乙醇(GIBCC^Cat.No.21985-023)、1%1MHEPES緩沖液(GIBCO⑧15630-080)、1。/。200mM左旋谷氨酰胺(GIBCO⑧Cat.No.25030-081)、1%lOOmMMEM丙酮酸鈉溶液(GIBCO⑧Cat.No.11360-070)、1。/o青霉素-鏈霉素溶液(GIBCO⑧Cat.No.15140-122)]。離心PBMC,在R10中重懸。在Z2庫(kù)爾特計(jì)數(shù)儀(BeckmanCoulter，F(xiàn)ullerton,CA)上對(duì)PBMC計(jì)數(shù)。吸干的板的每孔接受0.4口)igofA卩1-40、A(31-20、PHA(植物凝集素,CatNo.L-8902,Sigma,St.Loms,MO,陽(yáng)性對(duì)照)或稀釋的DMSO(Sigma,陰性對(duì)照)；然后向每孔加入400000PBMC。將板在37。C下在濕潤(rùn)的C02培養(yǎng)箱中孵育18-24小時(shí)。將板在含有5%FBS和0.005%Tween的PBS中洗滌；將生物素偶聯(lián)的抗猴IFN-y多克隆抗體(U-CyTechbiosciences,Utrecht,TheNetherlands)稀釋在相同培養(yǎng)基中并添加至每板；然后將板在4。C孵育18-24小時(shí)。將抗生物素蛋白鏈霉素-AP(CatNo.l3043E，BDPharMmgen,FranklmLakes,NJ)稀釋在相同培養(yǎng)基中并添加至經(jīng)洗滌的澤反；將才反在室溫下避光孵育2小時(shí)。添加過(guò)濾的1-StepNBT/BCIP底物(P跳e,Rockford,IL,Cat.No.34042),并在室溫下再避光孵育10分鐘。洗滌后，在用CCD照相機(jī)成4象前使板干燥，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)對(duì)每孔內(nèi)的斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。申請(qǐng)人確認(rèn)每百萬(wàn)PBMC中的斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC/106PBMC)必須超過(guò)55并且必須超過(guò)4倍陰性對(duì)照才被定義為陽(yáng)性結(jié)果；沒(méi)有達(dá)到以上兩標(biāo)準(zhǔn)定義為陰性結(jié)果。用包含偶聯(lián)至OMPC的Ap(3-10)/(21-28)(構(gòu)建體No.12,圖6A)的MAP構(gòu)建體，或用兩種偶聯(lián)至OMPC的單體構(gòu)建體A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)接種獼猴。接種期間每月測(cè)定每只獼猴，持續(xù)三或四月；曾記錄到的針對(duì)A卩1-40或A卩1-20的最強(qiáng)信號(hào)僅為18SFC/l()6pBMC，顯著低于55SFC/106PBMC的標(biāo)準(zhǔn)。因此，全都產(chǎn)生陰性分值，為所述疫苗不引起T細(xì)胞應(yīng)答提供了可靠證據(jù)，因而不包括T細(xì)胞表位。實(shí)施例6升高血漿A卩用5嗎的連接至作為載體的OMPC并配制在MAA中的MAPA卩。-10)/("-M)偶聯(lián)物(構(gòu)建體No.l2,圖6A)或其單體成分偶聯(lián)物A卩(3-10)(SEQIDNO:69)和A卩(21-28)(SEQIDNO:73)加上100|igISCOMATRIX⑧免疫非人靈長(zhǎng)類(lèi)獼猴(N4)。該獼猴靈長(zhǎng)類(lèi)每四周接受接種，在每次注射后四周收集血液并進(jìn)行分析。確定了抗Ap犯滴度和總的A(3!4。水平。采用6E10/G210ELISA在這些經(jīng)免疫的動(dòng)物中確定血漿A(3"o水平。這種測(cè)定采用夾心ELISA測(cè)量Ah,,該ELISA包括N末端捕獲抗體6E10(A卩1-8)(SignetLaboratories,Dedham,MA)和偶聯(lián)至石成性磷酸酶的C匿末端A卩4。新表位抗體(G210)(TheGeneticsCompany,Inc.,Zunch，Switzerland)。將抗體6E10以5叱/ml的濃度包被各板。稀釋的血漿樣品(l:3)以50pl/孔使用，重復(fù)三次。A(3p4q標(biāo)準(zhǔn)品在6E10免疫耗盡(immuno-depleted)的獼猴血漿基質(zhì)中制備為400pM-3pM。該測(cè)定具有約5-20的信噪比。CDP-sta"咸性磷酸酶底物從AppliedBiosystems,FosterCity,CA獲得。預(yù)配制的封閉緩沖液SuperBlock⑧從PierceBiotechnology,Rockford,IL(Ca說(shuō)37515)獲得。采用擬合標(biāo)準(zhǔn)品的三級(jí)樣條函數(shù)，將各個(gè)樣品計(jì)數(shù)(重復(fù)進(jìn)行三次)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)際的分析物濃度。進(jìn)行QC樣品分析以評(píng)估板間信號(hào)變異性。如圖8A所示，這些分析的結(jié)果證實(shí)在用MAPA卩(3-10)/(21-28)構(gòu)建體(構(gòu)建體No.12,圖6A)免疫后在PD3時(shí)血漿A卩4o有大于3倍的升高。血漿AP4q的這種升高沒(méi)有在用單體AP偶聯(lián)物/OMPC疫苗構(gòu)建體免疫的動(dòng)物中觀察到。具體地，用A卩(3-10)(SEQIDNO:69)或A卩(21-28)(SEQIDNO:73)免疫對(duì)該量度不產(chǎn)生應(yīng)答或產(chǎn)生顯著較低的應(yīng)答。值得注意的是，這些差異獨(dú)立于顯示在圖8B中的滴度水平。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)一些構(gòu)建體相對(duì)于其它免疫原性構(gòu)建體在它們升高血漿AP水平的能力方面具有優(yōu)勢(shì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，免疫原性片段的這種選擇性，即升高血漿A(3水平的能力，在本發(fā)明之前并未被揭示并且不能從現(xiàn)有技術(shù)預(yù)測(cè)得來(lái)。因此，對(duì)缺乏T細(xì)胞表位并在免疫后升高血漿A(3的8-mer或MAP免疫原的鑒定提供了選擇用于疫苗構(gòu)建體的8-mer或MAP的方法。由于本發(fā)明，現(xiàn)有技術(shù)人員現(xiàn)在能夠定性(即免疫原性)和定量地(即多克隆抗體應(yīng)答的性質(zhì)-升高血漿A卩水平的能力)表征所述疫苗構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解的是，本發(fā)明不限于8氨基酸A卩片段，而是包括任何能夠在宿主生物體中產(chǎn)生與AP反應(yīng)的多克隆抗體應(yīng)答的抗原。權(quán)利要求1.一種藥物組合物，包含Aβ免疫原性片段，所述Aβ免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位，能以針對(duì)所述Aβ片段的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。2.權(quán)利要求1的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠升高血漿A卩水平。3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述免疫原性片段選自Ap的線性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一個(gè)間隔物的多價(jià)線性肽以及多價(jià)分枝的多抗原肽(MAP)。4.權(quán)利要求3的藥物組合物，還包含連接至所述組合物以形成偶聯(lián)物的載體分子，其中所述載體促進(jìn)包含針對(duì)所述AP片段的抗體的免疫應(yīng)答。5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其中所述載體分子選自血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子和腦膜炎奈瑟球菌(A^w^nawem"g"zA^)外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其中所述載體分子是OMPC。7.權(quán)利要求4的藥物組合物，還包含藥物可接受的佐劑。8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中所述藥物可接受的佐劑選自氬氧化鋁和基于皂甙的佐劑。9.權(quán)利要求9的藥物組合物，其中所述藥物可接受的佐劑為基于皂甙的佐劑。10.防止或治療患者腦中與Ap的淀粉樣蛋白沉積有關(guān)的疾病的方法，包括給予有效劑量的Ap免疫原性片段，所述Af3免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位，能以針對(duì)所述AP片段的抗體形式誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述免疫原性片段能夠升高血漿A卩水平。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述免疫原性片段選自A(3的線性8氨基酸肽(8-mer)、散布有至少一個(gè)間隔物的多價(jià)線性肽以及多價(jià)分枝的多抗原肽(MAP)。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述免疫原性肽被連接至載體分子以形成偶聯(lián)物并且其中所述載體促進(jìn)包含針對(duì)所述AP片段的抗體的免疫應(yīng)答。14.權(quán)利要求13的方法，其中所述載體分子選自血清白蛋白、鑰孔血藍(lán)蛋白、免疫球蛋白分子和腦膜炎奈瑟球菌外膜蛋白復(fù)合物(OMPC)。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述載體分子為OMPC。16.權(quán)利要求13的方法，其中所述偶聯(lián)物與藥物可接受的佐劑一起給藥。17.權(quán)利要求14的方法，其中所述藥物可接受的佐劑選自氫氧化鋁和基于皂甙的佐劑。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述藥物可接受的佐劑為基于皂戒的佐劑。全文摘要本發(fā)明提供了治療與患者腦中Aβ淀粉樣蛋白沉積有關(guān)的疾病如阿爾茨海默病的組合物和方法。這些方法需要給予Aβ的免疫原性片段，所述Aβ的免疫原性片段缺乏T細(xì)胞表位、能以針對(duì)Aβ的抗體形式誘導(dǎo)有益免疫應(yīng)答。另一方面，Aβ的免疫原性片段能夠升高血漿Aβ水平。該免疫原性片段包括Aβ的線性或多價(jià)肽。藥物組合物包含化學(xué)上連接至可與佐劑一起給藥的載體分子的免疫原性片段。文檔編號(hào)A61K39/00GK101171031SQ200680015389公開(kāi)日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年5月1日優(yōu)先權(quán)日2005年5月5日發(fā)明者G·金尼,J·G·喬斯,J·W·希弗,P·M·克勒,V·M·加斯基,梁小平申請(qǐng)人:默克公司