專利名稱：：包含纖連蛋白結(jié)合蛋白或纖連蛋白結(jié)合肽的疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可處于復(fù)合物、溶液或者懸液之中。另外，本發(fā)明還涉及其在制備抗包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的微生物的疫苗中的用途。本發(fā)明還涉及其部件中包括至少兩個區(qū)室的試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽，其包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且另一個區(qū)室包含使用說明和/或iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或iscom復(fù)合物和/或脂質(zhì)體。此外，本發(fā)明涉及動物疫苗接種的方法。
背景技術(shù)：
：SA是一種病原體，其幾乎在所有哺乳動物物中引起疾病。SA是在牛、綿羊和山羊物種中的重要病原體，其在遍及全世界的乳業(yè)養(yǎng)殖類包括牛、綿羊和山羊(家畜)在內(nèi)的飼養(yǎng)中引起疾患以及很大的經(jīng)濟(jì)損失。SA誘發(fā)的乳腺炎也許是獸醫(yī)領(lǐng)域中單個最重要的經(jīng)濟(jì)負(fù)面因素，這是由于其致病性造成的，包括嚴(yán)重的急性和疼痛炎癥、慢性和持久性病況以及難于高效治療，這主要基于因抗性導(dǎo)致淘汰而可能無用的抗生素。替代方案是接種疫苗，但是迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)高效的疫苗，疫苗接種可以構(gòu)成對抗由SA引發(fā)乳腺炎的基礎(chǔ)。有幾種病原性因子對于期望的抗SA感染保護(hù)性疫苗需要克服。例如，SA將抗原"隱藏"在對于感染和其存活所必需的細(xì)胞中。此外，SA具有操縱宿主免疫系統(tǒng)以輔助細(xì)菌生存的能力。這種復(fù)雜的情形是不能獲得抗乳腺炎的高效SA疫苗的一個原因。操縱并可以下調(diào)宿主免疫應(yīng)答的SA組分包括分泌產(chǎn)物比如a-和(5-毒素、殺白細(xì)胞素。同樣涉及細(xì)胞結(jié)合組分比如超抗原和蛋白質(zhì)A。細(xì)菌躲藏其感染的宿主免疫系統(tǒng)的必需結(jié)構(gòu)的實例是纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)或者外部纖維蛋白因子(Ebf)，其對于SA粘附至組織例如傷口是必需的。已經(jīng)從不同的革蘭氏陽性細(xì)菌中分離并表征了幾種識別粘性基質(zhì)分子的纖連蛋白結(jié)合性微生物表面組分。已經(jīng)克隆并測序了來自金黃色葡萄球菌(""/^/ococcws做m/s)(Signasetal.,"NucleosidesequenceofthegeneforafibronectinbindingproteinfromStaphylococcusaureus:Useofthispeptidesequenceinsynthesisofbiologicallyactivepeptides,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:699-703，1989)、釀膿鏈球菌(5^印tococcws/;"gertes1)(Talayetal""Fibronectin國bindingproteinofStreptococcuspyogenes:Sequenceofthebindingdomaininvolvedinadherenceofstreptococcitoepithelialcells,"Infect.Imm叫60:3837-3844，1992.;Hanskyetal.Infect.Immun.，60:5119-5125,1992)和停乳鏈球菌(5"加/^occms辦sgfl/flWae)(Lindgrenetal，"Twodifferentgenescodingforfibronectin-bindingproteinsfrom5^ep^cflcc"sdysgalactiae—thecompletenucleotidesequencesandcharacterizationofthebindingdomains,"Eur.J.Biochem,214:819-827，1993.)的編碼識別粘性基質(zhì)分子的纖連蛋白結(jié)合性微生物表面組分的基因。所推導(dǎo)的M^列顯示出它們具有非常相似結(jié)構(gòu)構(gòu)造的60-100kDa蛋白質(zhì)。N端信號序列的后面是一長段獨(dú)特序列，在某些情況中其被兩拷貝約30個JL&酸長的片段中斷。配體結(jié)合位點(diǎn)',位于富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的N端，據(jù)信其將所述蛋白質(zhì)錨定于細(xì)胞壁中。該結(jié)構(gòu)域后接著是作為細(xì)胞壁把向信號的序列LPXTGX(Schneewindetal"Science,268:103-106，1995.etal"1995)，一段代表跨膜單元的疏水殘基以及含有一簇正電荷殘基的短C端細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。無乳鏈球菌(iS^cptococcMS"^i/flf"Zfle)和乳房鏈球菌(iS^eptococcMS1w6m's1)以及凝固酶陰性葡萄球菌具有相似的纖連蛋白結(jié)合裝置并且對牛和綿羊物種中的乳腺炎特別相關(guān)。凝固酶陰性葡萄球菌也具有FnBp并引發(fā)乳腺炎。在這些識別粘性基質(zhì)分子的微生物表面組分上的主要纖連蛋白結(jié)合位點(diǎn)由重復(fù)3-4次的30-42個氨基酸長的基序所組成，并且多數(shù)重復(fù)單元含有共有序歹1(Lindgrenetal"1993loccit;McGavinetal""FibronectinreceptorsfromStreptococcusdysgalactiaeandStaphylococcusaureus:Involvementofconservedresiduesinligandbinding,"J.Biol.Chem.268:23946-23953，1993.)。該結(jié)構(gòu)域由重復(fù)3或4次的、37-40個氨基酸的單元所組成(USP6，685，943的圖1)。因此，基于粘附功能并且更作為細(xì)M逸作用靶標(biāo)來作為主要的抗SA保護(hù)機(jī)制，F(xiàn)nBp是配制抗包括SA在內(nèi)的幾種革蘭氏陽性細(xì)菌的保護(hù)性疫苗的重要粘附蛋白(抗原)。重要的是，F(xiàn)nBp存在于來自革蘭氏陽性細(xì)菌比如釀膿鏈球菌(5^印toccMS/^"ge"^)和/或停乳鏈球菌(flfj^a/flcftVie)和無乳鏈球菌(iS^e/7勿coccwsflgfl/acftW)和乳房鏈球菌(5^印to"cc"sw&n's)和凝固酶陰性葡萄球菌的許多分離林中。其中接近100%的SA分離林。疫苗不但用于保護(hù)牛以抵抗由SA感染引起的乳腺炎，而且用于包括A^內(nèi)的幾乎所有受由SA引發(fā)感染所影響的動物物種。根據(jù)幾種因素，包括地方株和臨床情況，疫苗抗原的組成可以在抗革蘭氏陽性細(xì)菌包括SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有變化。粘附至纖連蛋白介導(dǎo)感染過程中的重要和常見因素，并且這種蛋白質(zhì)存在于幾乎所有SA分離株中。阻斷粘附和中和是通過抗體由IgGl實現(xiàn)的作用，然而IgG2a對于作為抗SA的主要免疫保護(hù)性機(jī)制的吞噬作用是重要的。鑒于SA也是細(xì)胞內(nèi)寄生物的事實，免疫系統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)分支(CMI)是重要因素。已有充分的文獻(xiàn)記栽iscom系統(tǒng)強(qiáng)力增強(qiáng)CMI尤其是細(xì)胞毒性T細(xì)胞殺傷受感染細(xì)胞例如感染SA的細(xì)胞。因此，基于iscom技術(shù)的佐劑制劑具有誘發(fā)幾種免疫保護(hù)性機(jī)制的能力。包含F(xiàn)nBp的iscom已經(jīng)才艮道過(A7cAwso/！Nelsonetal,2000，Symposium,StresaItaly,Proceedings,426-4319)。FnBp被慘入iscom基i中從而與完整抗原一起形成iscom。然而Nelson的iscom制劑不具有足夠的免疫原性并且不能用于疫苗，這在一定程度上是由于該制劑只誘導(dǎo)很短持續(xù)期的免疫性?；趇scom基質(zhì)或脂質(zhì)體(matrixorliposome)作為佐劑的本發(fā)明提供好得多的免疫性(見本發(fā)明中實施例5的比較)。此外，根據(jù)本發(fā)明的疫苗制劑更好地適于大規(guī)模生產(chǎn)，因為本發(fā)明中應(yīng)用的iscom技術(shù)只需要向疫苗抗原懸液中加入iscom基質(zhì)?，F(xiàn)已證實iscom技術(shù)非常適于制備抗革蘭氏陽性細(xì)菌、包括金黃色葡萄球菌SA在內(nèi)以及尤其是抗牛物種中乳腺炎的疫苗組合物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可處于復(fù)合物、溶液或者懸液中。另外，本發(fā)明涉及其在制備抗包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的微生物的疫苗中的用途。本發(fā)明還涉及其部件中包括至少兩個區(qū)室的試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽，其包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且另一個區(qū)室包含使用說明和/或iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或iscom復(fù)合物和/或月旨質(zhì)體?！坟跋Σ罚景l(fā)明涉及個體疫苗接種的方法。通過以下的表和圖來闡明本發(fā)明。表l:l用纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自4矣選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表2:1用破傷風(fēng)類毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表3:1用白喉類毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。表3:1用白喉類毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周皮下免疫兩次。圖1:1用含于各種佐劑制劑中的FnBp第二次免疫Balb/C小鼠之后，對纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)的lgGl和IgG2亞類的血清抗體應(yīng)答。圖2:1用含于各種佐劑制劑中的TT第二次免疫Balb/C小鼠之后，在IgGl和lgG2亞類中所測量的對破傷風(fēng)類毒素(TT)的血清抗體應(yīng)答。圖3:1用含于各種佐劑制劑中的白喉類毒素(DT)第二次免疫Balb/C小鼠之后，對白喉類毒素(DT)的lgGl和IgG2亞類的血清抗體應(yīng)答。圖4:1至4:4在進(jìn)入噴乳期之前，用iscom基質(zhì)作為佐劑的FnBp初次免疫10只小母牛，分別經(jīng)陰道內(nèi)(ivag)途徑(4:1)(圖中顯示3只動物中的一只)；或者經(jīng)鼻內(nèi)(i.n.)實施初次免疫(4:2)(圖中顯示3只動物中的一只)，或者經(jīng)皮下(s.c.)施用(4:3)(圖中顯示4只動物中的1只)。3至4周后并且在哺乳期開始以后對所有組經(jīng)皮下實施第二次免疫。用ELISA通過測量如圖中所示的總Ig、IgGl、IgG2和IgA來分析血清和乳清中的抗體應(yīng)答。圖5:1以iscom基質(zhì)作為佐劑用FnBp間隔6周疫苗接種兩次的4-7月齡的5只小牛中對纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)的抗體應(yīng)答。記錄第一次免疫之后IgM和總IgG類型的免疫應(yīng)答。第二次免疫后，i己錄IgGl和IgG2亞類的抗體應(yīng)答。圖5:2在用各種制劑(見下)間隔6周疫苗接種兩次的4-7月齡小牛中對a(A)和(J(B)毒素的抗體應(yīng)答。通過毒素中和試驗測量抗體應(yīng)答。每組中的5只小牛按下述進(jìn)行免疫組A:以iscom基質(zhì)作為佐劑的FnBp組B:在第一次免疫時應(yīng)用FnBp加上金黃色葡萄球菌(SA)以及a和P毒素并用iscom基質(zhì)作為佐劑,其后只應(yīng)用FnBp組C:在兩次免疫中均應(yīng)用FnBp和SA再加上a和p毒素并用iscom基質(zhì)作為佐劑組D:在兩次免疫中均應(yīng)用SA以及a和p毒素并用iscom基質(zhì)作為佐劑組E:未免疫的對照圖6在用纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)并補(bǔ)充金黃色葡萄球菌(A)細(xì)胞或者a和(3毒素(B)疫苗接種的1-2歲齡小牛中的抗體應(yīng)答。試驗疫苗用iscom基質(zhì)佐劑。在IgM、總IgG、IgGl和IgG2類和亞類中測量抗體應(yīng)答。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一種纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可處于復(fù)合物、溶液或者懸液之中。所述組合物可用于制備抗革蘭氏陽性菌比如金黃色葡萄球菌(5"鄉(xiāng)^y/。coccMsflw"ws).酉良腺鏈球菌(iftr印toc0""s/7"^wes1)、停乳鏈球菌(5^e/toc0ccMS咖艱a/fl"iW),無乳鏈球菌(5^e/^coccwsagfl/a"/"e)和乳房鏈永菌(5^印^^ccwsw&A)以及凝固酶陰性葡萄球菌的疫苗?？梢詰?yīng)用全長的纖連蛋白結(jié)合蛋白以及截短的蛋白質(zhì)或者肽，只要其包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位。對于截短的蛋白質(zhì)，我們了解是已缺失一個或多個氨基酸的天然存在或合成產(chǎn)生的全長蛋白質(zhì)?？梢匀笔Х荈nBp結(jié)合區(qū)中的一個或多個氨基酸。也可以缺失來自FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氛基酸。不過，應(yīng)當(dāng)至少有一個FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位未受影響。優(yōu)選所述截短的蛋白質(zhì)或肽包含一或多個來自革蘭氏陽性細(xì)菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，尤其是來自金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌。纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以選自來自金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白A或B的D結(jié)構(gòu)域，比如DU和D1-D4結(jié)構(gòu)域；來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白A的A結(jié)構(gòu)域，比如AU和Al-A3結(jié)構(gòu)域；來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白B的B結(jié)構(gòu)域，比如B1-B3結(jié)構(gòu)域；以及來自釀膿鏈球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域，比如Pl-P4結(jié)構(gòu)域(見USP6,685,943的圖1)。金黃色葡萄球菌的FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域也描述于SignSsetal.:(1989)Nucleotidesequenceofthegenefibronectin隱bindingproteinfrom5"似/^盧"ccwsftwrn/s:Useofthispeptidesequenceinthesynthesisofbiologicallyactivepeptides.iVoc.7Vflf/y4cfl^/.5"c/.t/5^4，Vol:86pp.699-703。所述截短蛋白質(zhì)或肽可以在一個或多個FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如上述D、A、P結(jié)構(gòu)域的上游或者下游包含1-200、優(yōu)選1-100比如1-50、比如1-20個氨基酸。所述截短蛋白質(zhì)和肽可以是天然存在的氨基酸序列或者是合成產(chǎn)生的，或者通過雜交DNA技術(shù)產(chǎn)生。這些FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一種或多種或者包含一個或多個上述FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域的幾個重復(fù)單元可以根據(jù)本發(fā)明來產(chǎn)生和應(yīng)用。在USP6，685，943中描述了如何獲得天然存在的和合成產(chǎn)生的FnBp結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對Fn-結(jié)合結(jié)構(gòu)域或表位的鑒定在本領(lǐng)域中是普遍公知的。例如，可以使用Hopp的方法，如U.S.Pat.No.4,554,101中所教導(dǎo)的，其教導(dǎo)基于親水性來鑒定和制備氨基酸序列的表位。也能夠應(yīng)用在其它幾個文獻(xiàn)中描述的方法、以及基于其的軟件程序來鑒定表位核心序列(見，例如，JamesonandWolf,1988;Wolfetal"1988;U.S.Pat.No.4,554,101)。隨后可以通過應(yīng)用肽合成或者重組技術(shù)將這些"表位核心序列"的氨基酸序列很容易的摻入肽中。通常，所述結(jié)構(gòu)域或者表位的大小不是特別關(guān)鍵，只要它至少大到足以結(jié)合FnBp即可。根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容所預(yù)期的最小有用核心序列通常在約至少5個氨基酸長的水平，更優(yōu)選10或50個氨基酸長水平的序列?？梢詰?yīng)用一個或多個FnBp結(jié)構(gòu)域或表位。鑒定表位核心序列的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如，如U.S.Pat.No.4,554,101中所述，其教導(dǎo)基于親水性來鑒定和制備氨基酸序列的表位。此外，有許多計算機(jī)程序可用來預(yù)測蛋白質(zhì)的抗原性部分(見例如，JamesonandWolf，1988;Wolfetal.，1988)。計算機(jī)化的肽序列分才斤禾呈序(例如，DNAStar7軟件，DNAStar,Inc.，Madison,Wis.)也可用來設(shè)計根據(jù)本發(fā)明公開內(nèi)容的合成FnBp，以及源于FnBp的表位和表位類似物。就此來說，通過制備包括表位/免疫原性核心序列的合成肽可以實現(xiàn)特別的益處。這些表位核心序列可被鑒定為多肽的親水性和/或可移動區(qū)域或者包括T細(xì)胞基序的區(qū)域。為確認(rèn)蛋白質(zhì)或者肽或者與其生物功能等價物具有免疫交叉反應(yīng)性，本發(fā)明所公開肽的一種或多種表位也是直接的主題。應(yīng)用特異性分析法，例如單個建議表位序列的特異性分析，或者應(yīng)用更一般性篩選，例如對隨機(jī)產(chǎn)生合成肽或者蛋白質(zhì)片段庫的篩選，能夠很容易地對此進(jìn)行確定。所述篩選分析可用來鑒定等效抗原或者交叉反應(yīng)抗體。無論如何，原則是相同的，即，基于對抗體和抗原之間結(jié)合位點(diǎn)的竟?fàn)??？衫玫倪m當(dāng)?shù)木範(fàn)幮苑治霭ɑ诿庖呓M織化學(xué)分析、ELISA、RIA、Western或者斑點(diǎn)印跡等的方案。在任何竟?fàn)幮苑治鲋?，一種結(jié)合組分，通常是已知元件比如源于FnBp的肽、或者已知抗體，將會用檢測標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記，并且通常保留未標(biāo)記的待測組分將會被用來檢測它們降低結(jié)合于相應(yīng)反應(yīng)性抗體或抗原的標(biāo)簽的量的能力?？梢砸勒諏嵤├嵤├?之前的概述和實施例1中所述獲得可用于根據(jù)本發(fā)明用途中的肽。為了更好的純化所述截短的蛋白質(zhì)或肽，它們可以通過DNA工程和編碼對可用于分離的物質(zhì)具有親和性的氨基酸序列的插入序列來產(chǎn)生。例如可以分別引入6組氨酸；一個或多個正電氨基酸；和/或蛋白質(zhì)A的與螯合(Ni-或Co-)物質(zhì)結(jié)合的zz(z)區(qū)；離子交換物質(zhì)和免疫親和物質(zhì)。這些方法在本領(lǐng)域中是公知的。纖連蛋白結(jié)合蛋白、包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短纖連蛋白結(jié)合蛋白以及纖連蛋白結(jié)合肽可以從上述任何細(xì)菌的細(xì)菌細(xì)胞中分離。它們也可以從細(xì)菌的分泌產(chǎn)物中分離。此外，根據(jù)公知技術(shù)，所述抗原可以作為來自細(xì)菌細(xì)胞、真菌或者來自哺乳動物細(xì)胞的rDNA產(chǎn)物而產(chǎn)生。它們也可以在載體系統(tǒng)中產(chǎn)生；或者用所謂的DNA疫苗免疫之后或者作為本領(lǐng)域公知的所謂RNA疫苗進(jìn)行免疫之后在體內(nèi)產(chǎn)生。它們也可以作為融合蛋白并且是例如來自細(xì)菌細(xì)胞的rDNA產(chǎn)物而產(chǎn)生；作為融合蛋白并且是來自真菌細(xì)胞的rDNA產(chǎn)物而產(chǎn)生；作為融合蛋白并且是來自哺乳動物細(xì)胞的rDNA產(chǎn)物而產(chǎn)生；或者在來自細(xì)菌細(xì)胞的栽體系統(tǒng)中作為融合蛋白而產(chǎn)生；在來自真菌細(xì)胞的載體系統(tǒng)中作為融合蛋白而產(chǎn)生；在來自哺乳動物細(xì)胞的栽體系統(tǒng)中作為融合蛋白而產(chǎn)生。此外，所述融合產(chǎn)物可以是蛋白質(zhì)與來自革蘭氏陽性細(xì)菌諸如金黃色葡萄球菌，釀膿鏈球菌，停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌的碳水化合物莢膜抗原之間的偶聯(lián)體，或者所述融合蛋白質(zhì)產(chǎn)物可以是兩個蛋白質(zhì)之間的偶聯(lián)體，其中至少一個蛋白質(zhì)為來自任何上述微生物的細(xì)菌蛋白質(zhì)比如金黃色葡萄球菌蛋白質(zhì)。所述纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽可以整合入脂質(zhì)體中或者與iscom基質(zhì)或脂質(zhì)體(matrixorliposome)相混合或者結(jié)合于脂質(zhì)體或者iscom基質(zhì)。在本發(fā)明組合物中的iscom基質(zhì)復(fù)合物包含至少一種糖苷和至少一種脂質(zhì)。所述脂質(zhì)至少是固醇比如膽固醇并且還任選是磷脂酰膽堿。所述基質(zhì)對共施用的抗原性物質(zhì)具有免疫增強(qiáng)效應(yīng)，見EP0436620Bl并且可以根據(jù)本專利的描述來產(chǎn)生。所述組合物iscom、基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體也可以包含一種或多種其它免疫調(diào)節(jié)性(佐劑活性)物質(zhì)，而不必是皂苷，例如脂多糖(LPS)、脂質(zhì)A或脂質(zhì)A衍生物、CT或LT以及它們的亞片段或者其衍生物，例如，LTB、LTA、CTB、CTA或CTA1-DD。所述iscom基質(zhì)可以是一種或多種iscom基質(zhì)顆?；蛘咂?納米環(huán)的任何亞片段?？梢允褂眠@些iscom基質(zhì)、顆?；騺喥蔚娜魏位旌衔铩８鶕?jù)EP9600647-3(PCT/SE97/00289)所述，可以使用一種或多種抗原以及可以使用轉(zhuǎn)運(yùn)和過客抗原。所用脂質(zhì)尤其見本申請人的專利EPO109942Bl中尤其是第3頁以及專利EP0436620Bl中第7頁第7-24行描述的那些。尤其可使用固醇比如膽固醇和磷脂比如鱗脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿?？梢允褂媒Y(jié)合于細(xì)胞結(jié)合組分的含脂質(zhì)受體，比如包括作為神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的霍亂毒素受體在內(nèi)的糖脂，以及巖藻糖化的血型抗原。所述細(xì)胞結(jié)合組分隨后能夠作為粘液靶向分子發(fā)揮作用并且通過它們與包含它們的復(fù)合物簡單混合而結(jié)合于所述含脂質(zhì)的物質(zhì)。iscom復(fù)合物包含這些受體，受體描述于WO97/30728中。在EP0109924Bl中描述了可用的糖苷。優(yōu)選皂苷和三辟皂普(triterpensaponins)。它們可以是來自皂樹(5""/o履"'"Molina)的原始4C取物形式(Dalsgaard，K.(1974)，Arch.GesamteVirusforsch,44,243.)、或者其任何亞組分，如PCT/US/88101842toKensiletal.，Kensil,CA.etal.(1991)，J.Immunol,146,431,Kersten,GF.A.etal.(1990)."AspectsofIscoms.Analytical,PharmaceuticalandAdjuvantProperties;Thesis,UniversityofUtrecht、EP0362279B2和EP0555276Bl中所述。才艮據(jù)本發(fā)明的一個方面，所述iscom基質(zhì)復(fù)合物包含含皂苷混合物的QuilA粗制或原始提取物或其半純4匕形式比如QuillajaPowderExtract(Berghausen,USA)、QuillajaUltraPowderQPUF300、QuillajaUltraPowderQPUF1000或者Vax-Sap(所有三種都來自NaturalResponses,Chile)。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所述iscom基質(zhì)復(fù)合物包含至少一種純化的糖苷比如來自QuilA的皂苷組分。才艮據(jù)本發(fā)明的純化皂苷組分可以是WO96/11711描述的A、B和C組分，EP0436620描述的B3、B4和B4b組分，EP03632279B2描述的組分QA1畫22，Q-VAC(Nor-Feed,ASDenmark)，0"/〃"y"MolinaSpikoside(IsconovaAB,UppsalaSciencePark,75183，Uppsala,Sweden)。可以4吏用EP03632279B2的纟且分QA-l-2-3-4畫5畫6-7-8-9國10誦ll-12-13畫14-15-16-17-18-19-20-21和22,尤其可以使用QA國7、17-18和21。它們是根據(jù)EP03632279B2、尤其是在第6頁以及在第8和9頁的實施例1中所述而獲得。優(yōu)選使用亞組分A和C。在整個說明書和權(quán)利要求中，使用術(shù)語"一種來自皂樹(07/fl>Molina)的皂苷組分"作為對皂樹(0w///"_/Vi5"fl/w/i"nVi)的純化*或確定的皂苷組分或者基本純組分的通稱。重要的是，所述組分不含有很多對當(dāng)4吏用iscom混合物或主要包含一種組分的iscom基質(zhì)時所獲得良好結(jié)果有負(fù)面影響的任何其它組分。如果期望的話，所述皂苷制備物可以包括少量的其它化合物比如其它皂苷或其它佐劑物質(zhì)，所述少量例如最高40%重量，比如最高30%重量、最高25%重量、最高20%重量、最高15%重量、最高10%重量、最高7%重量、最高5%重量、最高2%重量、最高1%重量、最高0.5%重量、最高0.1%重量。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含至少兩種iscom復(fù)合物的混合物，其選自iscom基質(zhì)復(fù)合物，每種復(fù)合物主要包含一種不同的來自皂樹的皂苷組分，如WO2004/004762(PCT/SE03/01180)中所述。在優(yōu)選使用的基質(zhì)混合物中，皂樹組分和QuilC組分分別摻入不同的iscom復(fù)合物或基質(zhì)。如上所述，分別基于皂樹的組分A和C含量，可以使用不同iscom復(fù)合物的重量％的任何組合。所述混合物可以包含O.l比99.9%重量、5比95%重量、10比90%重量、15比85%重量、20比80%重量、25比75%重量、30比70%重量、35比65%重量、40比60%重量、45比55%重量、40比60%重量、50比50%重量、55比45%重量、60比40%重量、65比35%重量、70比30%重量、75比25%重量、80比20%重量、85比15%重量、90比10%重量、95比5%重量的包含皂樹之組分A(如本文定義)的iscom基質(zhì)復(fù)合物，并且在每一區(qū)間情況下其余是最高至100%的包含皂樹之組分C(如本文定義)的iscom基質(zhì)復(fù)合物，其中以所述iscom基質(zhì)復(fù)合物中皂樹之組分A和C總含量來計算。所述混合物可以包含從75%至99.5%重量的組分A和0.5%至25%重量的組分C。優(yōu)選地，所述混合物包含從卯％至99%重量的組分A和1%至10%重量的組分C。一種特別優(yōu)選的制備物包含約91%至98%重量的組分A和約2%至9%重量的組分C，尤其是約92%至96%重量的組分A和約4%至8。/。重量的組分C，其中以所述iscom基質(zhì)復(fù)合物中皂樹之組分A和C總含量來計算。任意組合使用上述所有區(qū)間。根據(jù)本發(fā)明可施用制劑的動物物種的實例是伴侶動物比如貓、狗、馬、鳥比如鷚鵠，重要經(jīng)濟(jì)物種比如家畜，例如牛類物種，豬、綿羊、山羊。優(yōu)選使用超過50%重量的組分C與任何其它組分相組合，并且尤其是與組分A相組合。因此可以使用從50.5至99.5%重量的C和0.5至49.5%重量的A。根振本發(fā)明的一個實施方案，所述iscom基質(zhì)復(fù)合物包含QuilA的組分A以及至少一種如WO2005/002620(PCT/SE2004/001038)中所述的其它佐劑。這種iscom復(fù)合物和Iscom基質(zhì)復(fù)合物可以包含占組分A和C總重50至99.9%的QuilA之片段A和0.1至50。/。的片段C和/或組分B和/或QuilA的其它組分或衍生物，其中可以將所述不同的糖苷成分整合入、偶聯(lián)在或混合于相同或不同的復(fù)合物或iscom基質(zhì)顆粒。也可以將包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽整合入、偶聯(lián)于或混合于脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體可以依照以下所述來制備Gregoriadis,G，McCormack,Obrenovic,M..Perrie,Y.andSaffie,R.InVaccineAdjuvants,PreparationMethodsandReseachProtocols.(2000)Ed.O'HaganD.,pp137-150.脂質(zhì)體可用作免疫佐劑和疫苗載體。它們也可以被整合入、偶聯(lián)于或者混合于和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可以處于復(fù)合物、溶液或懸液之中。優(yōu)選地，在此所述復(fù)合物不是iscom形式。可以考慮所述包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的纖連蛋白結(jié)合蛋白、截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和纖連蛋白結(jié)合肽作為抗原。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含至少一種另外的抗原。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述的至少一種另外的抗原是以革蘭氏陽性細(xì)菌全細(xì)胞形式的抗原。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述抗原是抗原性成分，比如來自細(xì)菌細(xì)胞或者分泌產(chǎn)物比如a和p溶血素，尤其是來自革蘭氏陽性微生物的那些。從中獲得這些全細(xì)胞和抗原性成分的革蘭氏陽性細(xì)菌可以是金黃色葡萄球菌、s良膿鏈球菌，停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌，和凝固酶陰性葡萄球菌。金黃色葡萄球菌細(xì)胞意思是指葡萄球菌屬的金黃色組。相應(yīng)的s良膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌、和凝固酶陰性葡萄球菌表示所述屬的各個組。這也將適用于從中獲得FnBp結(jié)合蛋白、肽或者結(jié)構(gòu)域的微生物。粘附素可以選自聚集因子(clumpingfactor,clf)、外部纖維蛋白結(jié)合蛋白(externalfibrinbindingprotein,efb)、針對纖維蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coagulase，coa)、結(jié)合于纖維蛋白原的纖維蛋白原結(jié)合蛋白A、附著于纖維蛋白原的纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)A和B、結(jié)合于膠原的膠原蛋白結(jié)合蛋白(cna)、結(jié)合于彈性蛋白的彈性蛋白結(jié)合蛋白(ebpS)、結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的MHC類似物蛋白(map或eap)、涉及細(xì)胞內(nèi)粘附和生物膜形成的多糖細(xì)胞內(nèi)粘附素(pia)、涉及可能逃過宿主防御的蛋白質(zhì)A(spa)、抗吞噬作用分子的莢膜多糖(例如l、5、8和13型)(cap)、或iTechoidacid。成孔因子(poreformingfactors)可以被外泌，并且可以選自a國溶血素、p-溶血素、y-溶血素、s-溶血素、涉及宿主細(xì)胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及組織侵入的彈性蛋白酶(sepA)、和涉及組織侵入的透明質(zhì)酸酶(hysA)。所有提及的組分可以是分離自細(xì)菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)或者碳水化合物、外泌產(chǎn)物、rDNA產(chǎn)物或者作為rDNA產(chǎn)物表達(dá)的融合產(chǎn)物、載體系統(tǒng)中的產(chǎn)物或融合蛋白，所謂的DNA或RNA疫苗，只要它們使用本發(fā)明的佐劑系統(tǒng)即可。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，所述抗原可以是下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原性成分，比如超抗原、莢膜抗原、內(nèi)毒素、外毒素和細(xì)胞外酶。這些外毒素和細(xì)胞外酶可以選自腸毒素A至E、H(sea-e,h)、毒素休克綜合征毒素-l(tst)(與超抗原一起逃避宿主防御的特性)、剝脫毒素AB(eta，efb,etb)(逃避宿主防御)、脂肪酶(geh)(逃避宿主防御)、Panton-Vallentine殺白細(xì)胞素(lukF，lukS)(裂解宿主吞噬細(xì)胞)、葡萄球菌激酶(sak)(逃避宿主防御)。上面提及的抗原性成分可以在來自世界不同地區(qū)的所述屬的組中在物種之間有所差異。上面有關(guān)截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽來源的信息也可適用于所述組合物可以包含的至少另外的抗原。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以包含藥用可接受載體、稀釋劑、賦形劑或者添加劑。所述藥物組合物可以是無菌注射水性或油性懸液的形式。該懸液可以根據(jù)公知技術(shù)應(yīng)用那些合適的分散劑或濕潤劑和助懸劑進(jìn)行配制，如上所述。所述無菌注射制備物也可以是在無毒胃腸外可接受稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或懸液，例如1,3-丁二醇的溶液。可應(yīng)用的可接受載體和溶劑中有水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌、不揮發(fā)性油通常用作溶劑或者懸浮介質(zhì)。為此目的，可以應(yīng)用任何品牌的不揮發(fā)性油，包括合成的單-或二甘油酯。此外，脂肪酸比如油酸也可用于所述注射制備物中。所述溶液或懸液也能夠包含至少一種以下佐劑無菌稀釋劑比如注射用水、鹽水、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其它合成溶劑，抗細(xì)菌劑比如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯，抗氧化劑比如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉，螯合劑比如乙二胺四乙酸，緩沖劑比如醋酸鹽、杼檬酸鹽或磷酸鹽，以及滲透壓調(diào)節(jié)劑比如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外制劑可以封裝于由玻璃或塑料制成的安瓿、可棄型注射器或多劑量容器。通式I的化合物可經(jīng)胃腸外施用。本文中使用的術(shù)語胃腸外的意思包括有關(guān)無針注射-射流注射的輸注技術(shù)的皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)注射。所述組合物可以是適于包含用于接種例如200只牛的幾百劑量的射流注射器用的疫苗組合物形式。根據(jù)本發(fā)明的組合物還可以包含影響乳房的抗原組合物比如凝固酶陰性葡萄球菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、大腸桿菌樣細(xì)菌包括克雷伯氏菌屬(f/WwV//"spp.)和大腸埃希氏菌(五."http://)。本發(fā)明也涉及所述組合物用于制備疫苗的用途。所述疫苗意圖用于任何哺乳動物比如人，動物比如牛、綿羊或山羊。本發(fā)明尤其涉及用于牛、綿羊和山羊動物抗乳腺炎的疫苗接種。本發(fā)明尤其涉及用于牛的包含來自金黃色葡萄球菌的抗原并混有iscom基質(zhì)的乳腺炎疫苗。所述基質(zhì)優(yōu)選產(chǎn)自粗制QuilA或者半純化的QuilA。?？梢栽诋a(chǎn)犢之前進(jìn)行一次疫苗接種并在產(chǎn)犢之前或之后(優(yōu)選之后)的一個月進(jìn)行加強(qiáng)接種。小母?？梢栽诋a(chǎn)犢之前施用兩次，優(yōu)選可能在產(chǎn)犢之后接著施用第三次。本發(fā)明的一個實施方案涉及根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其包含選自毒素和/或來自微生物的全細(xì)胞的至少另外一種抗原，所述微生物尤其是革蘭氏陽性細(xì)菌比如金黃色葡萄球菌、釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌，尤其是金黃色葡萄球菌。因此，所述組合物可以包含毒素或全細(xì)胞或兩者都包含。已證明的是，對于超過一歲齡的小母牛而言，當(dāng)所用的根據(jù)本發(fā)明的組合物添加來自革蘭氏陽性細(xì)菌尤其是來自上述任一種比如金黃色葡萄球菌的全細(xì)胞和/或毒素時獲得更佳的免疫效果。本發(fā)明還涉及部件的試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及另一個區(qū)室包含使用說明和/或至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體。上述革蘭氏陽性微生物種，比如來自葡萄球菌屬金黃色組的金黃色葡萄球菌，可以在世界不同區(qū)域之間有所差異。所述試劑盒的一個區(qū)室可以包含根據(jù)本發(fā)明的iscom基質(zhì)復(fù)合物或脂質(zhì)體。該區(qū)室可以包含一種或多種來自革蘭氏陽性微生物例如葡萄球菌屬金黃色組的抗原。另一區(qū)室可以包含來自可對某些區(qū)域有特異性的革蘭氏陽性微生物例如來自葡萄球菌屬金黃色組的抗原，例如這種特異性可以基于莢膜抗原。這兩類抗原可以整合入脂質(zhì)體，結(jié)合于脂質(zhì)體或iscom基質(zhì)復(fù)合物或者與iscom基質(zhì)復(fù)合物或脂質(zhì)體相混合。由于上述革蘭氏陽性微生物比如來自葡萄球菌屬金黃色組的金黃色葡萄球菌可以誘發(fā)下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原以及不下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原，所以能夠有益地將在不同制劑中的這些不同類型的抗原施用于動物體的不同部分，以增加免疫之后每種成分的效用。由此試劑盒可以包含至少一個包含至少一種下調(diào)免疫系統(tǒng)之抗原的區(qū)室和包含至少一種不下調(diào)免疫系統(tǒng)之抗原的另一區(qū)室。所述組合物和試劑盒也可以包含抗生素。當(dāng)動物具有上述微生物的亞臨床或臨床感染時，這可以是有用的。抗原性物質(zhì)的量可以根據(jù)所用物質(zhì)和微生物以及待處理個體而變化。對于小動物，低劑量是0.1jig至100ng;對于大動物，低劑量范圍是10jig至1000ng，尤其是10jig至300ng，所述這些不是限制性界限。對人而言，劑量范圍是ljtg至200ng，但這不是限制性界限。本發(fā)明也涉及用于哺乳動物比如人尤其是家畜的疫苗接種方法，其中向所述動物施用一種組合物，該組合物包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，其中它們包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體。保護(hù)性乳腺炎疫苗的免疫方案可以如下進(jìn)行對于將進(jìn)入哺乳期的小母牛實施兩次間隔5-8周的皮下免疫。在產(chǎn)犢前約10天完成最后免疫。之后推薦在預(yù)計產(chǎn)犢之前10-14天進(jìn)行每年一次的免疫。在母牛具有亞臨床或臨床SA乳腺炎的情況下，將推薦在干奶期中實施兩次間隔2-3周的疫苗接種并聯(lián)合用抗生素治療母牛，即免疫和抗生素聯(lián)合治療。所有關(guān)于所述纖連蛋白結(jié)合蛋白、包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽、脂質(zhì)、糖普以及除所述纖連蛋白結(jié)合蛋白或肽之外的其它添加抗原的信息進(jìn)行必要的變更后涉及本發(fā)明的所有實施方案。本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合某些公開實施方案進(jìn)行了描述，技術(shù)人員可以預(yù)見到?jīng)]有具體提及的但仍在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)的其它實施方案、變化或者組合。所有在本文中引用的參考在此以其整體通過參考并入本文中。本文中使用的表述"包含"應(yīng)被理解為包括但不限于所列的事項。本發(fā)明將通過以下非限制性實施例進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。實施例關(guān)于實施例的一般信息材料佐劑Al(OH)3-用于動物和人的傳統(tǒng)佐劑。其佐劑作用仍然沒有被完全了解。與沒有佐劑相比，抗體應(yīng)答被增強(qiáng)，但是該應(yīng)答強(qiáng)烈偏向于TH2。對細(xì)胞應(yīng)答沒有或者有很低的佐劑作用。AI(OH)3、Allhydrogel來自BrenntagAG^De證ark。Iscom基質(zhì)佐劑基質(zhì)-O-由含有全范圍不同皂樹皂苷分子的半純化皂樹皂苷(Quillajasaponin)制備。其佐劑作用強(qiáng)烈并且包括體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答?；|(zhì)-C由皂樹皂苷的一種純化組分(組分-C)制備。它具有強(qiáng)效的佐劑活性(Johansson,MandL6vgren-Bengtsson，KVaccine17,2894-2900)。其毒性比基質(zhì)-Q要低很多?；|(zhì)-OWT由皂樹皂苷的另一種純化組分(組分-A)制備。其佐劑作用被描述為低于基質(zhì)-C(PCT/SE2004/001038)，但似乎對細(xì)胞免疫應(yīng)答有很強(qiáng)作用?；|(zhì)-QWT顯示出在與佐劑活性相關(guān)的劑量中是基本無毒的并且在所有檢測過的動物中有非常好的耐受性。基質(zhì)-MIX—是基質(zhì)-OWT和基質(zhì)-C的混合物(由17%基質(zhì)《和83%基質(zhì)-QWT所組成)。相似的混合物顯示出對單一抗原發(fā)揮出高的令人驚奇的佐劑作用(WO2004/004762，PCT/SE2004/001038)。所有基質(zhì)佐劑制劑來自IsconovaAB,Uppsala，Sweden?？乖栺R林處理過的破傷風(fēng)類毒素(TT)得自TheStateSerumInstitute,Copenhagen,Denmark。TT是一種重要的免疫原性抗原。在實施例中應(yīng)用較高劑量(2.51f)和低劑量(0.5Lf)。對于該特定批次，1Lf的毒素相當(dāng)于x微克蛋白質(zhì)。重組白喉類毒素(DT)來自Sigma。在實施例中應(yīng)用l微克的劑量。纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)由CrosslinkLtdBudapestHungary制造，是FnBpAShort(396bp，與NC—002951.2的FnBpA具有100%—致性)和FnBpBShort(396bp,與NC002951.2的FnBpB具有95%—致性和來自BiostaproABUlltunaallen2B75651Uppsala,Sweden)的混合物并且是包括16kD纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA片段，其中所述纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括3個DD重復(fù)，其包括非免疫結(jié)果所必需的半胱氨酸N末端。l卯ng的該構(gòu)建體與1mgiscom基質(zhì)/劑量混合。ELISA小鼠血清通過常規(guī)間接ELISA在各個樣本中測量血清中的抗原特異性抗體。用溶于50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液的濃度為1fig/ml的單個抗原包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)并在+4n過^L在與樣品一起孵育之前，所述板在室溫(r.t.)下用添加2V。(w/v)脫脂奶粉的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸鹽緩沖液)(PBS-T/M)封閉1小時。板子依次與在PBS-T/M中連續(xù)稀釋的待檢血清以及偶聯(lián)HRP的兔抗小鼠IgG(Dakocytomation，Denmark)—起孵育。對于IgG亞類的測量，用偶聯(lián)HRP的山羊抗小鼠IgGlHRP(Serotec,Norway)或者用偶聯(lián)HRP的山羊抗小鼠IgG2aHRP(Serotec，Norway)與連續(xù)稀釋的待檢血清一起孵育。通過與底物緩沖液(K畫blue,SVANOVA,Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反應(yīng)顯4象，通itia入50nl的2MH2S04^10分鐘后終止該反應(yīng)，并且在450nm處讀取吸光度。用PBS-T進(jìn)行所有洗滌。在PBS-T/M中根據(jù)使用說明稀釋偶聯(lián)物。在滴定曲線線性部分通過內(nèi)插法計算效價并表示為產(chǎn)生1.0吸光度時血清稀釋度的倒數(shù)。牛血清和乳通過常規(guī)間接ELISA在個體血清(乳)樣品中測量血清和乳中的抗原特異性抗體。用溶于50mMpH9.6碳酸鹽緩沖液的濃度為1pg/ml的FnBp包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)并在+4"C過夜。在與樣品一起孵育之前，所i^L在室溫(r.t.)下用添加10。/。(w/v)馬血清的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸鹽緩沖液)(PBS-T/H)封閉2小時。板子依次與在PBS-T/H中連續(xù)稀釋的待檢血清(乳)以及偶聯(lián)HRP的綿羊抗牛IgG(Serotec，Norway)—起孵育。對于IgG亞類的測量，用偶聯(lián)HRP的綿羊抗牛IgGl(Serotec,Norway)或者用偶聯(lián)HRP的綿羊抗牛IgG2HRP(Serotec,Norway)、用偶聯(lián)HRP的綿羊抗牛IgA(Serotec，Norway)與連續(xù)稀釋的待檢血清一起孵育。通過與底物緩沖液(K-blue,SVANOVA，Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反應(yīng)顯像，通過加入50pi的2MH2S04在10分鐘后終止該^^應(yīng)并且在450nm處讀取吸光度。用PBS-T進(jìn)行所有洗滌。在PBS-T/H中根據(jù)使用說明稀釋偶聯(lián)物。在滴定曲線線性部分通過內(nèi)插法計算效價并表示為產(chǎn)生lo吸光度時血清稀釋度的倒數(shù)。抗葡萄球菌抗體使用商品ELISA(金黃色葡萄球菌抗體檢測試劑盒，WMRD，Pullman,WA,USA)測量血清和乳中的抗葡萄球菌抗體。實施例1纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的制備克隆纖連蛋白結(jié)合蛋白由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary實施項目由CrosslinkLtd.的FerencFel傷l(U撰寫才艮告由ISCONOVA,Uppsala,Sweden的Prof.BrorMorein定制內(nèi)容介紹piA.克隆在C末端具有6-His標(biāo)簽的全長形式plp3B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式介紹本項目的目的是克隆并表達(dá)來自金黃色葡萄球菌的FNBP基因a.)在C末端具有6-His標(biāo)簽的全長形式用于蛋白質(zhì)制備；b.)在C末端具有6-His尾的短形式用于連接佐劑；引起牛乳腺炎的菌林由ISCONOVALtd.，Uppsala,Sweden提供。然而，沒有獲得該菌林的序列信息。A.克隆在C末端具有6-His標(biāo)簽的全長形式在金黃色葡萄球菌中，兩種類型的基因編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)，即FNBPA和FNBPB基因。我們在NCBIDataBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中調(diào)查了有關(guān)FNBP的信息并找到8個金黃色葡萄球菌菌林的序列。在這8個菌林的FNBP基因中只有80%的一致性。為了確保能以全長(除了信號序列之外)擴(kuò)增我們菌株的FNBP基因，我們必須選擇既擴(kuò)增A又?jǐn)U增B的引物。制備來自金黃色葡萄球菌的靶DNA通過常規(guī)方法制備來自金黃色葡萄球菌的基因組DNA并用作PCR反應(yīng)中的模板。幸運(yùn)地是，A和B基因的長度有200bp差異。因此，在長電泳凝膠中分開這兩種PCR產(chǎn)物是可能的。分離A基因產(chǎn)物并用于l^的步驟中。1.50ml金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物(OD600=2)被離心并在2x25ml洗滌緩沖液(150mMNaCl,50mMTrisHC1[pH:7.5)中洗滌兩次。2.細(xì)胞被重懸于5ml裂解緩沖液A(10mMEDTA，50mMTrisHC1[pH:7.5，0.1mg/ml溶菌酶)并在室溫下保持15分鐘。3.加入5ml裂解緩沖液B(2%SDS,50mMTrisHC1[pH:7.4,0.025mg/ml蛋白酶K)。懸液在55匸下孵育過夜。4.用l體積苯酚提取懸液，接著用1體積氯仿+異戊醇進(jìn)行提取。5.用2.5體積乙醇沉淀DNA并用玻璃^i拌。用70o/。乙醇洗滌DNA并在Eppendorf管中干燥。6.DNA被重懸在250微升TE緩沖液中。在接下來的步驟中，我們用不同的限制性內(nèi)切酶消化這兩種PCR產(chǎn)物以選擇其中沒有切割位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物。它們能夠確保在末端克隆而不破壞插入片段。我們發(fā)現(xiàn)三種不切割FNBPA的限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII和Xhol。我們決定繼續(xù)用FNBPA，并用BamHI和HindIII進(jìn)行克隆，而用Xhol在C末端添加His標(biāo)簽。用于擴(kuò)增的引物在其5'末端具有上面的切割位點(diǎn)(粗體文本)CGGGATCCT.GCAGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGTKNBPaRGTAAGCTTATGCTTTGTGATTCTTTTTATTTCTGCGTAAFNBP基因的擴(kuò)增擴(kuò)增、克隆并通過測序確認(rèn)來自期望菌林的全長FNBPA基因。為了使隨后的純化更有效率，基因的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域(M)和跨細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域的重復(fù)和非重復(fù)部分(Wl和W2)#皮去除。有關(guān)所述結(jié)構(gòu)域的說明見文章SignSsetal.:(1989loc.cit.)Ncol和上面提及的Xhol限制性內(nèi)切酶適于本目的。在所設(shè)計的引物中FnBpNcoCGGGATCCATGGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGT(引物起點(diǎn)在以下參考序列中第2572388位〉ref]NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)FnBpD4GAGCTCGAGTGGCACGATTG(5AGGTGTTGTATCTTCT(引物起點(diǎn)在以下參考序列中第2569863位>ref|NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength-2809422)實施以下步驟1.100微升擴(kuò)增溶液含有10微升10xPCR緩沖液,每種引物(10pmol/jil母液)各IO微升，400孩馎爾dNTP和5UPfu酶。2.擴(kuò)增實施30個循環(huán)，每一循環(huán)包括變性(94"C45秒)、退火(65匸l分鐘)和聚合(72"C2分鐘)。3.在瓊脂糖凝膠中檢查PCR產(chǎn)物并用SingleSamplePCRCleanupMontagePCRFilterUnits(Millipore)進(jìn)行純化。PCR產(chǎn)物的克隆將FNBP基因克隆入pET21d載體。6-His標(biāo)簽的密碼子以及隨后的終止密碼子位于pET21d載體中Xhol切割位點(diǎn)之后。因而，所表達(dá)的蛋白質(zhì)在C末端將包含6-His標(biāo)簽。誘導(dǎo)后實施8小時的表達(dá)。表達(dá)后細(xì)胞用超聲進(jìn)行處理并離心。在SDS-PAGE上用考馬斯藍(lán)染色對產(chǎn)物進(jìn)行檢測，其中有或沒有Ni-NTA瓊脂柱上的制備物。與未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物相比，表達(dá)是明確的。實施以下步驟1.PCR產(chǎn)物被重懸在40jilNEB2緩沖液中并在37匸下用Ncol和Xhol限制性內(nèi)切酶消化2小時。2.用MontageGelExtractionKit(Millipore)從凝膠中純化消化后片段。3.在50nl反應(yīng)溶液中將純化的DNA克隆入pET21d載體中Ncol/Xhol位點(diǎn)。用11U連接酶將載體和插入物連接過夜。4.質(zhì)粒用2.5體積乙醇進(jìn)行沉淀，重懸，并根據(jù)供應(yīng)商使用說明經(jīng)電穿孑L(Bio-Rad)將其引入雄埃希氏菌BL21菌林。5.在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)克隆并通過Ncol/Xhol消化接著凝膠電泳來檢驗載體中FNBPA基因的插入。6.適宜的栽體再次轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌BL21菌林，在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行20個30ml平行培養(yǎng)。在OD600=1時用1mMIPTG誘導(dǎo)細(xì)胞。B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式用以下引物克隆所述短形式。Ncol限制酶和Xhol限制酶的切割位點(diǎn)用粗體字母表示。BGFCGGGATCCATGGAAGGTQGCCAAAATAGCGGTAACCAGT(引物起點(diǎn)在以下參考序列中第2570270位>reflNC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)BGRGAGCTCGAGAGGTGTTGTATCTTCTTCAATCGTTTGTTG(引物起點(diǎn)在以下參考序列中第2569875位>ref!NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL,completegenomeLength=2809422)用這些引物所制得的PCR產(chǎn)物被克隆入pET21d載體并在BL21(DE3)Star細(xì)胞中表達(dá)。6-His標(biāo)簽的密碼子和隨后的終止密碼子位于pET21d載體中Xhol切割位點(diǎn)之后。因而，所表達(dá)的蛋白質(zhì)在C末端將包含6-His標(biāo)簽。誘導(dǎo)后實施8小時的表達(dá)并且在Ni-NTA柱上純化表達(dá)產(chǎn)物以及在SDS-PAGE凝膠中顯像。與未經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)相比，表達(dá)是明確的。按下述制備較大量的所述蛋白質(zhì)。用FNBP(AB)BL21(DE3)Star菌株生產(chǎn)FNBP培養(yǎng)培養(yǎng)基4升LB+2g/L葡萄糖+100ng/mlAmp，在37匸直至OD1.5，降低溫度至30"C,在OD2-2.5時用1mMIPTG誘導(dǎo)5小時。下游通過離心沉淀培養(yǎng)物重懸于緩沖液中10mMTris，pH8，150mMNaCl通過離心沉淀，重懸于40ml25mMTrispH8超聲處理10次，每次30秒，每次之間暫停l分鐘。添加PMFS至5mM終濃度。以20000g沉淀25分鐘。保留上清液。重懸沉淀于40ml25mMTrispH8。如上進(jìn)行超聲處理。添加PMFS至5mM終濃度。將上清液與之前的上清液混合?？傮w積約卯ml。將上清液施加于用超聲緩沖液(25mMTrispH8)平衡的10mlNi-NTA瓊脂柱(具有5-10mg蛋白質(zhì)/ml凝膠的結(jié)合能力)。用l體積超聲緩沖液洗滌。用2體積25mMTrisHC1pH:6.8，250mlNaCl洗滌。用1體積25mMTrisHC1pH:8，8M尿素洗滌。用2體積超聲緩沖液洗滌。用200mM。米唑pH7進(jìn)4亍洗脫。添加TCA至10%終濃度，在4t:放置l小時。沉淀蛋白質(zhì)。添加0.2ml1MTrisHC1pH8并用TE緩沖液補(bǔ)充至1ml。在超聲器中以水浴溶解蛋白質(zhì)。(任選為了傳送，可以用硫酸銨來沉淀蛋白質(zhì)。)如下所述，由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary以相同的策略構(gòu)建相應(yīng)的FnBpA蛋白質(zhì)并交付一三個各含2mg蛋白質(zhì)的管。在Ni-NTA柱上純化蛋白質(zhì)。最后步驟是用硫酸銨沉淀并離心以產(chǎn)生沉淀。待作事項在弱緩沖液中進(jìn)行。優(yōu)選用帶水浴的超聲器，這促進(jìn)溶解并且沒有泡沫累積。在PD-10柱(Amersham)上去除鹽。——個含3.1mg蛋白質(zhì)的管。與其它3個管一樣，但是沒有離心。待作事項將管在4"C下放置1小時。以15,000g或更高離心20分鐘。移除上清液。實施如上W目同的步驟。所述蛋白質(zhì)是在末端具有His標(biāo)簽的FnBpA和FnBpB基因的混合物。分子量是16kDa。FnBpA1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDBCPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF50FnBpB1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF5051EEDTEKDKPKYE;gGGN工IDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^YQ10051EEDTEKDKPKYE^GGNIIDIDFDSVraiHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^VfQ100101FGGHNSVDFEEDTIiP^SGgNEGQQTIEEDTTPliEHHHHHH*142101FGGHNSVDFEEDTIjP^VSG^NEGQQTIEEDTTPIjEHHHHHH*142產(chǎn)物用于實施例6和7中所進(jìn)行的試驗,根據(jù)相同的策略由BiostaprosAB產(chǎn)生相應(yīng)的FnBpA蛋白質(zhì)。制備兩個分別在N和C末端有Cys的兩種構(gòu)建體。每種各50%的混合物用于實施例2-5。FNBPCys-NMACEGGQNSGNQSFEteDTEEDKPKYEQGGNWDIDFDSWQIHGQ服GNQSFEEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTOKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSG0NE6QQTIEEDTTPGFNBPCys^CEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSWHIHGFNKHrEnEEDTNKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSGQNEGQQTIEEDTTPCG實施例2介紹金黃色葡萄球菌(SA)對于大多數(shù)哺乳動物物種來說是引起創(chuàng)傷中、乳腺中急性和慢性感染或者引起人醫(yī)院感染的病原體，所述創(chuàng)傷包括由外科治療而引起的創(chuàng)傷。SA經(jīng)常對抗生素具有抗性，一種選擇是至少用于預(yù)防的疫苗，盡管已有許多嘗試用包括全細(xì)胞、毒素、多糖和粘附因子來配制疫苗，但是迄今為止還沒有有效的疫苗。為了成功制得抵抗有引起慢性感染傾向之病原體的疫苗制劑，當(dāng)應(yīng)用非復(fù)制性抗原時，佐劑系統(tǒng)的輔助是必要的。因此，作為疫苗抗原受關(guān)注并測試的SA的很多成分包括粘附因子、碳水化合物(多糖)和毒素都已失敗，這也許是由于缺少所涉及物種能夠接受的合適的佐劑。在此實施例中，我們選擇了粘附因子即纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)，其被認(rèn)為可以阻斷粘附但可能更重要的在于其是吞噬作用的靶標(biāo)，前提是如果誘導(dǎo)了促進(jìn)這種活性的FnBp的恰當(dāng)抗體(調(diào)理性抗體)。此外，基于iscom技術(shù)，已經(jīng)用多種佐劑制劑，包括對敏感性物種可接受的佐劑制劑，來補(bǔ)充FnBp。因此，不同的動物物種需要不同的佐劑制劑，包括不同的皂苦。例如牛類物種(bovinespecies)對QuilA或Q-WAC類型的半純化皂苷有非常良好的反應(yīng)，這對其它物種來說也許是有毒性的。其它動物物種例如貓或小鼠或人有不同程度的敏感性并且需要幾乎無毒的制劑例如QMIX(QV-MIX,瑞典專利申請0202110-3-QV-MIXPCT/SE03/001180)或者QWT制劑(QWT，瑞典專利申請0301998-1PCT/SE03/00586)，或者組分C-基質(zhì)制劑(ref)。后者被用于獸醫(yī)學(xué)中以;5LA臨床試驗中。其目種中IgG2a，而IgGl可能促進(jìn)抗-粘附和中和效應(yīng)。在本實施例中分析這些免疫學(xué)特性。應(yīng)注意的是，對于如果不是全部也是大部分哺乳動物物種來說，SA是重要的病原體，并且由乳腺炎疫苗產(chǎn)生的結(jié)果已經(jīng)對在包括人在內(nèi)的其它物種中SA引發(fā)疾病產(chǎn)生了影響。根據(jù)幾種因素，包括地方林和臨床情況，疫苗抗原的組成可以在抗SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有變化。粘附至纖連蛋白介導(dǎo)感染過程中的重要因素，并且這種蛋白質(zhì)存在于幾乎所有SA分離林中。粘附阻斷和中和作用是通過抗體由IgGl實現(xiàn)的作用，而lgG2a對于作為抗SA的主要免疫保護(hù)性機(jī)制的吞噬作用是重要的。所提及的亞類反映鼠免疫球蛋白系統(tǒng)，而例如IgG2a相當(dāng)于人的IgG3。通過反映Thl和Th2應(yīng)答的IgG免疫球蛋白類型之間的平衡來分析小鼠中對用QWT-基質(zhì)制劑作為佐劑的強(qiáng)候選疫苗FnBp的免疫應(yīng)答。試驗方案依照表l:l中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據(jù)早先有關(guān)免疫原性的試驗來確定抗原劑量。選擇不誘導(dǎo)高應(yīng)答的低劑量，以便于察看所添加佐劑的影響。用任一種所述FnBp佐劑制劑在小鼠尾根處經(jīng)皮下(s.c.)并間隔4周對所述小鼠進(jìn)行免疫。在第3周和第6周釆集用于血清檢測的血樣。所有動物接受1ngFnBp并且佐劑成分是組1無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質(zhì)誦Q6組4基質(zhì)-Q2ng。第6周時IgGl和lgG2亞類的抗原特異性抗體應(yīng)答被顯示在圖1:1中。通過ELISA測量抗體水平并表示為在y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖1:1)。結(jié)果第一次免疫后無佐劑的和以氫氧化鋁為佐劑的FnBp幾乎不誘導(dǎo)可檢測的血清抗體應(yīng)答。以任何iscom佐劑制劑為佐劑的各種FnBp制劑誘導(dǎo)針對FnBp的可檢測應(yīng)答。第二次免疫之后(圖1:1)IgGl應(yīng)答在用以iscom基質(zhì)為佐劑的FnBp免疫的小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予基質(zhì)-Q或者給予基質(zhì)MIX的小鼠組中很高，小鼠個體之間的效價分布沒有多少差距，然而在給予基質(zhì)C制劑中FnBp的小鼠組中4艮高。用氫氧化鋁佐劑的FnBp與用其它佐劑的FnBp制劑;J目比，IgGl血清抗體水平應(yīng)答明顯更低，4且在個體動物之間ELISA效價呈很大的離散分布。用無佐劑制劑免疫的小鼠具有低IgGl應(yīng)答。第二次免疫之后(圖1:1)IgG2a應(yīng)答在用以iscom基質(zhì)為佐劑的FnBp免疫的小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予基質(zhì)-Q或者基質(zhì)MIX的小鼠組中很高，小鼠個體之間的效價分布沒有多少差距，然而在給予基質(zhì)C制劑中FnBp的小鼠組中其分布卻很寬。用無佐劑FnBp或者用氫氧化鋁佐劑的FnBp免疫的小鼠應(yīng)答具有幾乎不可檢測的IgG2a血清抗體水平。討論很清楚的表明iscom制劑有能力調(diào)節(jié)包括TH1和TH2類型免疫應(yīng)答在內(nèi)的平衡的免疫應(yīng)答，這對于誘導(dǎo)抵抗持久性和慢性感染的保護(hù)作用是必須的。迄今為止在SA疫苗中所用的佐劑制劑還缺少這種能力。結(jié)論對SA和FnBp來說兩種感興趣的制劑是適于大型動物比如牛的基質(zhì)Q和幾乎沒有副作用并且例如適于貓和人的不同顆粒中的低毒基質(zhì)C和基質(zhì)A。這兩種制劑誘導(dǎo)高水平的和平衡的IgGl和IgG2反應(yīng)。實施例3介紹抗SA疫苗可以包括或者甚至需要各種疫苗成分，包括全細(xì)胞、毒素、多糖和粘附因子，其中每一種都有助于免疫保護(hù)作用。在本實施例中用如實施例2中的不同佐劑制劑檢驗破傷風(fēng)類毒素(TT)以研究它們對毒素的免疫增強(qiáng)作用。試驗方案依照表2:1中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據(jù)早先有關(guān)免疫原性的試驗但又不誘導(dǎo)非常高應(yīng)答來確定抗原劑量，以便于察看所添加佐劑的影響。用任一種所述TT佐劑制劑在小鼠尾根處經(jīng)皮下并間隔4周對所述小鼠進(jìn)行免疫。在第3周和第6周采集用于血清檢測的血樣。所有動物接受0.5Lf/劑量并且佐劑成分是組l無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質(zhì)-Q6ng;組4基質(zhì)-Q2jig。第6周時IgGl和IgG2亞類的抗原特異性抗體應(yīng)答被顯示在圖2:1中。通過ELISA測量抗體水平并表示為在Y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖2:1)。結(jié)果第一次免疫后無佐劑的和以氫氧化鋁為佐劑的TTi秀導(dǎo)可檢測的血清抗體應(yīng)答，正如用各種以任何iscom制劑為佐劑的TT制劑一樣。第二次免疫之后(圖2:1)IgGl應(yīng)答在包括無佐劑的TT在內(nèi)的所有小鼠組中是很高的(>101og4)。在給予以iscom基質(zhì)制劑為佐劑的TT的小鼠組中觀察到稍微更高的抗TT抗體水平并且在小鼠個體之間效價分布很少展開。第二次免疫之后(圖2:1)IgG2a應(yīng)答在用以iscom基質(zhì)為佐劑的TT免疫的小鼠組中是很高的(>101og5)。在給予以基質(zhì)Q或基質(zhì)MIX為佐劑的TT組中的小鼠所作應(yīng)答具有最高的IgG2a水平并且在小鼠個體之間效價分布很少展開。用無佐劑TT或以氫氧化鋁為佐劑的TT免疫的小鼠所作應(yīng)答沒有或者幾乎沒有可檢測的IgG2a血清抗體水平。討論TT對于Th2型應(yīng)答有很強(qiáng)的抗原性能力。氫氧化鋁也調(diào)節(jié)針對Th2型的免疫應(yīng)答。該實施例表明iscom制劑克^L了TT的強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用并且能夠誘導(dǎo)對于該毒素的平衡的Thl-Th2應(yīng)答。對于抗誘導(dǎo)慢性或持久性感染的病原體的疫苗來說重要的是，控制該病原體調(diào)節(jié)宿主中免疫應(yīng)答的內(nèi)在能力，這對于弱佐劑來說是不能實現(xiàn)的。結(jié)論該實施例表明iscom制劑有能力調(diào)節(jié)"強(qiáng)毒素抗原"免疫應(yīng)答為平衡的免疫應(yīng)答，這對于實現(xiàn)免疫保護(hù)可能是必需的。對于SA以及其它病原體來說，毒素是重要的致病性因素，因此可能需要獲得強(qiáng)效的疫苗。實施例4SA產(chǎn)生大量的毒素，其中一些具有強(qiáng)免疫原性，另一些具有相對弱的免疫原性。它們中任何一種都可能是獲得非常寬保護(hù)能力的疫苗所需要的疫苗抗原。相比較TT而言，白喉類毒素(DT)是相對弱的抗原。在該實施例中，用如實施例2和3所示的不同佐劑制劑來檢驗弱抗原以探究它們對DT型毒素的免疫增強(qiáng)作用。試驗方案依照表3:1中所示免疫18g雌性Balb/c小鼠。根據(jù)早先有關(guān)免疫原性的試驗但又不誘導(dǎo)非常高應(yīng)答的原則來確定抗原劑量，以便于察看所添加佐劑的影響。用任一種所述DT佐劑制劑在小鼠尾根處經(jīng)皮下(s.c.)并間隔4周對所述小鼠進(jìn)行免疫。在第3周和第6周采集用于血清檢測的血樣。所有動物接受1jigDT并且佐劑成分是組1無佐劑；組2Al(OH)3;組3基質(zhì)-Q6ng;組4基質(zhì)-Q2ng。第6周時IgGl和IgG2亞類的抗原特異性抗體應(yīng)答被顯示在圖3:1中。通過ELISA測量抗體水平并表示為在Y軸上讀出的稀釋曲線陡峭部分在OD450的稀釋度(101og)(圖3:1)。結(jié)果第一次免疫后只有用以基質(zhì)MIX制劑為佐劑的DT免疫的小鼠具有可檢測的血清抗體應(yīng)答。第二次免疫之后(圖3:1)IgGl應(yīng)答在用以氫氧化鋁以及基質(zhì)混合為佐劑的DT免疫的小鼠中最高(>101og3.5)。第二次免疫之后(圖3:1)IgG2a應(yīng)答在用以基質(zhì)MIX為佐劑的DT免疫的小鼠組中是很高的(約lOlog4)，其具有最高的抗體應(yīng)答水平，即比其它組中小鼠高出幾乎50倍或更高的效價，并且效價分布范圍較窄。用無佐劑DT或者用以氫氧化鋁為佐劑的DT免疫的小鼠沒有或幾乎沒有可檢測的IgG2a血清抗體應(yīng)答水平。討論DT是一種比TT(實施例3)弱的抗原，并且無佐劑DT甚至在兩次免疫之后沒有誘導(dǎo)可檢測的IgGl或IgG2，即既沒有Th2型應(yīng)答也沒有Thl型應(yīng)答。調(diào)節(jié)Th2型免疫應(yīng)答的氫氧化鋁使對DT的應(yīng)答增強(qiáng)到易于檢測到的IgGl水平。本實施例表明iscom制劑增強(qiáng)并且也調(diào)節(jié)針對DT的免疫應(yīng)答至Thl和Th2之間平衡的應(yīng)答。尤其是"低毒"基質(zhì)MIX對于刺激IgGl和IgG2都是高效的，即強(qiáng)效并平衡的免疫應(yīng)答。因此，iscom制劑能夠高效調(diào)節(jié)對強(qiáng)抗原以及弱抗原的免疫應(yīng)答。結(jié)論實施例2和3表明iscom制劑高效增強(qiáng)并調(diào)節(jié)毒素的免疫應(yīng)答，無論這些毒素是弱抗原還是強(qiáng)抗原，并且驅(qū)動例如偏向于Th2的毒素抗原趨于平衡的Thl-Th2應(yīng)答。這樣的能力在可由SA抗原制劑構(gòu)成的復(fù)雜抗原系統(tǒng)中是重要的。實施例5用以iscom基質(zhì)為佐劑的金黃色葡萄球菌粘附因子FnBp的免疫接種試驗進(jìn)行小規(guī)?，F(xiàn)場試驗在Kungs汪ngen(KJL)，一個屬于AgricultureUniversityUppsala的農(nóng)場中實施疫苗接種試驗，以在天然宿主即牛類物種中檢驗抗金黃色葡萄球菌(SA)的潛在疫苗。在奶牛中以及在相關(guān)物種綿羊和山羊中，當(dāng)它們被用來進(jìn)行乳品生產(chǎn)時，乳腺炎是嚴(yán)重問題。在乳品科學(xué)和生產(chǎn)中任何有經(jīng)驗的人員，包括乳場生產(chǎn)人員、負(fù)責(zé)動物健康的獸醫(yī)以及需要高質(zhì)量乳來生產(chǎn)不同乳制品的工廠，都充分認(rèn)識到乳腺炎問題。為了控制乳腺炎的情況，通過主要用抗生素處理來加強(qiáng)而改進(jìn)農(nóng)場管理是第一選擇。SA是引起相關(guān)乳房病患和經(jīng)濟(jì)問題最重要的病原體。尤其嚴(yán)重的問題是SA經(jīng)常具有抗生素抗性，并且由于沒有治療方法而必須剔除受影響動物?？股刂委熑橄傺椎奶娲桨甘敲庖哳A(yù)防劑即使用疫苗。盡管有許多的嘗試，但是市場上沒有高效乳腺炎疫苗。開發(fā)乳腺炎SA疫苗的嘗試仍是徒勞無功的并且在嘗試開發(fā)在不同情形中針對其它物種的SA疫苗中也是如此，例如抗狗療病或者抗人醫(yī)院感染。因此，高效的抗SA乳腺炎疫苗將從疾患中挽救受影響動物并且在經(jīng)濟(jì)上對于乳場、對于乳品工業(yè)以及對于它們的消費(fèi)者都具有極好的作用。選擇粘附因子，纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(FnBp)，是因為它存在于幾乎100%的SA分離林中。在早先的試驗(Nelsonetal.1991)中，F(xiàn)nBp被摻入iscom中。用這種SA乳腺炎試驗性疫苗獲得了有希望的結(jié)果。相反地，繼續(xù)試驗沒有獲得所期望的結(jié)果并且該計劃由此而被停止。失敗的原因是由于免疫性短暫并且也可能是由于在乳腺中的不充分免疫應(yīng)答。本疫苗接種試驗的目標(biāo)是研究進(jìn)一步開發(fā)用基于iscom技術(shù)的制劑為佐劑的FnBp疫苗的可能性。關(guān)注點(diǎn)是引起全身性和局部性免疫應(yīng)答的最佳施用模式，其中在血清中測量全身性應(yīng)答，在乳腺中測量局部性應(yīng)答。因此，為了獲得對于候選疫苗潛力的更好預(yù)測，對來自乳房的局部分泌物(乳清)也實施免疫學(xué)分析。對免疫應(yīng)答的評價包括血清和乳清中的抗體應(yīng)答，其包括IgGl、IgG2和IgA應(yīng)答，還調(diào)查抗體對SA細(xì)胞吞噬作用的增強(qiáng)。IgG2促進(jìn)吞噬作用，這是抗SA的最重要防御機(jī)制。局部產(chǎn)生的IgA抗體也是在粘膜表面中抵抗侵入者的重要防御因子。應(yīng)注意的是，先前的試驗沒有分析乳腺中的免疫應(yīng)答，很可能是因為之前的疫苗在乳清中沒有誘導(dǎo)明確可檢測的免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答將令人信服地支持該試驗。已經(jīng)認(rèn)識到大體積乳的稀釋作用會掩藏在乳腺中引起的免疫應(yīng)答。疫苗試驗方案以及材料和方法較大蛋白質(zhì)的16kD片段的纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(FnBp)片段包括負(fù)責(zé)粘附纖連蛋白的DD區(qū)。所述多肽在大腸埃希氏菌中表達(dá)并且從BiostaproAB獲得。它與早先的基于較短69-80kD蛋白質(zhì)的產(chǎn)物(Nelsonetal.1991)不同。此外，在早先的產(chǎn)物中，F(xiàn)nBp被摻入iscom基質(zhì)中從而形成iscom。在本試驗性疫苗中，所述疫苗的制備不涉及將FnBp包括在基質(zhì)中從而形成iscom的步驟。避免摻入過程的好處在于提供更簡單和更經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)系統(tǒng)。因此，本發(fā)明制劑在兩個方面不同于早先所檢驗的FnBpiscom4吳選疫苗。Iscom基質(zhì)由IsconovaAB提供。細(xì)菌學(xué)檢驗乳樣品的細(xì)菌學(xué)檢驗在7Vfl&》Am/FWcVmo^/"W似^(SVA)的乳腺炎實驗室中進(jìn)行。試驗方案抗原FnBp選擇在大腸埃希氏菌中生產(chǎn)的rDNA產(chǎn)物，這是根據(jù)早先的積極經(jīng)驗(Nelsonetal-)，但是構(gòu)建體更短。最好用確定抗原輔助免疫學(xué)評價。將進(jìn)入其第一哺乳期的10只小母牛用作試驗動物以盡可能避免早先SA感染的經(jīng)歷，這更可能在較高齡牛中發(fā)生，這會使對疫苗接種難以進(jìn)行免疫學(xué)評價。三種不同的施用模式被檢驗。因為乳房是一種具有很大粘膜區(qū)的器官，據(jù)此認(rèn)為粘膜免疫在乳腺中是重要的。與例如人和豬相比，在牛中沒有腸乳腺聯(lián)系(個人通信Holmberg)，即疫苗抗原的口服施用(即在消化道中)將在豬的乳腺中誘發(fā)免疫應(yīng)答但在牛中卻不會。在本試驗中使用兩種粘膜施用模式，即通過鼻內(nèi)(i.n.)或通過陰道內(nèi)(i.vag.)途徑施加初始劑量。這些初始免疫(priming)模式的作用與在上乳腺區(qū)域中經(jīng)皮下免疫的初始免疫進(jìn)行比較。3至4周后經(jīng)皮下途徑對所有動物施用第二劑量。使用這樣的免疫方式的目的在于探究是否在上呼吸道區(qū)或生殖道與乳腺之間存在聯(lián)系。對免疫保護(hù)重要的是，粘膜(局部)免疫應(yīng)答以及在乳腺中誘發(fā)正確類型的抗體類型。免疫方案包括在產(chǎn)犢前2-4周實施初始免疫。三只動物通過鼻內(nèi)(i.n.)施用、三只動物通過陰道內(nèi)(i.vag.)施用模式和四只動物在上乳腺區(qū)經(jīng)皮下途徑實施初始免疫。在乳腺定位的淋巴結(jié)引流處在上乳腺區(qū)(supramammalregion)中通過皮下模式在產(chǎn)犢后對所有動物實施第二次免疫。采樣.如圖(4:1至4:2)中所示，在第一次免疫時和隨后定期開始時釆集用于血清和免疫學(xué)分析的血液。對用于細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)分析的乳清的采集在分娩后開始，接下來如對血液所述。細(xì)菌學(xué)分析在SVA進(jìn)行并且僅有一次從經(jīng)鼻內(nèi)途徑初始免疫的一個動物的乳樣品中分離到SA。它恰好是在第二次免疫之前。免疫學(xué)分析包括測量ELISA中的抗體應(yīng)答(見上)。詳細(xì)的結(jié)果顯示在圖4:1至4:4中。吞噬作用分離和純化白細(xì)胞從牛血中分離和純化白細(xì)胞通過Ficoll離心方法進(jìn)行，參見以下描述Guidryetal1993JDairySci76:1285-1289和Leeetal2005CanJVetRes69:11-18。細(xì)胞被重懸在Hanks^i^溶液(HBSS)中，檢查其活力，并將其濃度調(diào)節(jié)至10xl(^細(xì)胞/ml。所選的金黃色葡萄球菌菌林首先培養(yǎng)在瓊脂平板上并且隨后在胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)(最少IOOml)中在37X:下培養(yǎng)18小時。通過在60t:水浴中孵育30分鐘殺死細(xì)菌。用鹽水洗滌3次后，細(xì)菌懸液在540nm處光密度為2.0時被調(diào)節(jié)至1:10的稀釋度。細(xì)菌的FITC標(biāo)記才艮據(jù)Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述進(jìn)行。FITC標(biāo)記的細(xì)菌在含0.15mM釣、1mM鎂和0.1%明膠的巴比妥緩沖鹽溶液(GVBS)中洗滌3次，在540nm處OD為1.350時按1:10稀釋度來確定其濃度并且最后在-80"C下以1ml等分將其保存在GVBS中直至應(yīng)用。吞謹(jǐn)作用;FITC標(biāo)記的細(xì)菌被融化并在2.4A超聲處理30秒，并且濃度被調(diào)節(jié)至1x109/ml。根據(jù)Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述，用在兩次免疫之前和之后收集的未經(jīng)稀釋或者在HBSS中1/4稀釋的50nl待;^r血清孵育細(xì)菌懸液和細(xì)胞。對照包括在HBSS中孵育的細(xì)菌懸液，以及沒有血清與的細(xì)胞懸液一起孵育的細(xì)菌懸液。在4予細(xì)振蕩下在37匸孵育30分鐘。通過加入含0.02%EDTA的冰冷鹽水來停止吞噬作用。在顯微鏡下檢查之前，用1。/。亞甲藍(lán)處理細(xì)胞以淬滅額外的細(xì)胞熒光。在熒光顯微鏡下對最少200個細(xì)胞實施檢測并且確定細(xì)胞與細(xì)菌的比例。結(jié)果經(jīng)陰道內(nèi)途徑(圖4:1)實施初始免疫的動物顯示出低的或者沒有血清抗體應(yīng)答。在乳清中，第一次免疫接種后記錄到抗FnBp抗體，以lgG2和IgA亞類為主。在加強(qiáng)免疫之前沒有收集乳樣品，因為在產(chǎn)犢之前沒有乳產(chǎn)生。在經(jīng)皮下強(qiáng)化免疫之后，在血清和乳中抗FnBp的抗體應(yīng)答持續(xù)期4艮短并且以IgG2和IgA為主。在來自經(jīng)鼻內(nèi)途徑實施初始免疫的動物的血清中檢測不到或幾乎檢測不到應(yīng)答(圖4:2)。在乳清中所記錄的抗FnBp的抗體主要為IgG2和IgA亞類。經(jīng)陰道內(nèi)模式給予初始免疫的所有動物都有應(yīng)答。在經(jīng)皮下加強(qiáng)免疫之后，在血清和乳清中動物之應(yīng)答具有明確的抗體升高。最高應(yīng)答是lgG2和IgA亞類?？贵w水平朝向試驗期結(jié)束時而下降。經(jīng)皮下模式施用進(jìn)行初始免疫和加強(qiáng)免疫的動物在血清和乳清中獲得了IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也很高的IgA(圖4:3)。加強(qiáng)免疫后血清和乳清中高水平的IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也高水平的IgA指示局部在乳房中和循環(huán)血液中保護(hù)性免疫的質(zhì)量。重要的是，血清抗體在整個試驗周期即7-10個月中持續(xù)。同樣，乳清抗體水平在試驗周期中持續(xù)即高達(dá)8個月，i^明本試驗性疫苗接種將覆蓋整個哺乳期，這對于保護(hù)性乳腺炎疫苗是重要的。對來自經(jīng)皮下途徑免疫兩次的組中牛的血清進(jìn)4亍吞喧作用測量。與細(xì)菌和在第一次免疫之前收集的血清一起孵育30分鐘后，有30%的PMN細(xì)胞顯示出吞噬作用。與細(xì)菌和第二次免疫后收集的血清一起孵育30分鐘后，有增加至51%的PMN細(xì)胞顯示出吞喧作用。有4。/。PMN細(xì)胞與細(xì)菌但無血清一起孵育時顯示出吞噬作用。不經(jīng)與細(xì)菌和第二次免疫后收集的血清一起孵育有2%的PMN細(xì)胞顯示出吞嗟作用。討論抗體應(yīng)答在其類型和亞型的分布對于獲得最佳的免疫保護(hù)作用是極其重要的。一般認(rèn)為IgG2抗體對于對抗SA感染具有最大的重要性，因為該亞型促進(jìn)對細(xì)菌的吞噬作用。所有形式的免疫接種既促進(jìn)乳清中也促進(jìn)血清中IgG2和IgA的FnBp特異性抗體。在來自經(jīng)陰道內(nèi)和鼻內(nèi)初始免疫動物的血清和乳清中具有相當(dāng)?shù)退降目贵w應(yīng)答。意料之外的是，通過應(yīng)用以iscom基質(zhì)為佐劑的FnBp進(jìn)行兩次皮下免疫，其在血清和乳腺分泌物中誘導(dǎo)了高抗體水平，其中包括IgGl、IgG2和IgA亞型。這些程度和性質(zhì)的免疫應(yīng)答還沒有在先前使用SA疫苗或任何其它疫苗的牛乳腺中被顯示出。同樣，在血清中這些Ig亞類也被記錄。與早先檢驗過的短持續(xù)期的試驗性疫苗(Nelsonetal.1991)相比，皮下施用模式誘導(dǎo)長期持續(xù)并且更優(yōu)的免疫應(yīng)答(圖4D)。特別受關(guān)注和有價值的是在乳腺中的強(qiáng)效免疫應(yīng)答，這在先前所檢驗的抗SA候選疫苗中沒有描述。來自功能性吞噬作用檢驗的結(jié)果突出表明誘發(fā)了重要的免疫保護(hù)特性。iscom基質(zhì)的強(qiáng)效免疫增強(qiáng)作用是沒有預(yù)料到的并且其通iti^免FnBp多肽與iscom基質(zhì)偶聯(lián)的步驟而有利于高效的疫苗生產(chǎn)。有兩種纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)FnBpA和FnBpB，它們具有相似的構(gòu)成。Nelsonetal所用的構(gòu)建體由60-65kD的蛋白質(zhì)組成，其與來自葡萄球菌蛋白A的兩個IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域相偶聯(lián)從而形成融合蛋白zzFnBpA以及zz-FnBpB,其中zz-FnBpB包含推測的T細(xì)胞表位，zzFnBpA與包含推測T細(xì)胞表位的另一部分相連而形成zz-FnBpA-T。這些多肽與iscom相偶聯(lián)(L6vgren，K.，Lindmark，J"Pipkorn，R.andMorein，B(1987)J.Immunol.Methods98.)。我們已經(jīng)使用了這些多肽并發(fā)現(xiàn)它們被片段化。對于Nelson構(gòu)建體限制性的一個原因，我們認(rèn)為是由于這種片段化的趨勢所引起的。本發(fā)明的16kDFnBp片段更加穩(wěn)定并且包^進(jìn)與纖連蛋白結(jié)合的重要的DD區(qū)重復(fù)片段。結(jié)論在兩次皮下免疫之后，補(bǔ)充iscom基質(zhì)制劑的截短型FnBp構(gòu)建體在乳腺和血清中誘導(dǎo)高水平的高質(zhì)量免疫應(yīng)答。所期望的疫苗在牛乳腺中誘導(dǎo)抗SA感染的免疫保護(hù)作用具有強(qiáng)的免疫學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。該技術(shù)能實現(xiàn)對于所期望疫苗重要的高效生產(chǎn)系統(tǒng)。實施例6全SA細(xì)胞以及a和|3溶血素對針對FnBp和毒素的免疫應(yīng)答的作用SA引起慢性和持續(xù)的感染，其通迚基于"掩蔽"感染和對從宿主免疫系統(tǒng)中存活所必要成分的能力而由病原體的固有特性所促進(jìn)。此外，引起持續(xù)和慢性感染的病原體具有指導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)從而允許其持續(xù)的能力。SA包含大量具有免疫調(diào)節(jié)特性的不同組分并且不合適的組合物可以引起針對包括在疫苗組合物內(nèi)的一種或所有抗原的低免疫應(yīng)答。如上所述，有許多可作為SA候選疫苗的組分。首先的策略是應(yīng)用分離自病原體的組分或由細(xì)胞(在此為大腸埃希氏菌)表達(dá)作為分離林疫苗抗原所產(chǎn)生的組分。第二種方法是應(yīng)用強(qiáng)效的佐劑，在本情況中為iscom基質(zhì)。疫苗組分的一個有希望類別是毒素。在來自乳腺炎的SA分離抹中非常頻繁地鑒定出a和p溶血素(對于p溶血素，在100%情況中)，這種事實^f吏得它們成為強(qiáng)有力的候選疫苗。這兩種毒素都是外泌產(chǎn)物并且能夠從SA生長的培養(yǎng)液中收集。在本試驗中，如材料和方法中的安排，SA細(xì)胞與含a和p溶血素的培養(yǎng)液在疫苗組合物中與FnBp混合以探究在該組合物中FnBp和所述毒素的免疫原性。材料和方法試驗方案。才艮據(jù)下面的免疫方案，對位于瑞典南部6vedsKloster的4-7個月大的25只小牛以4周間隔實施3次免疫。由RolandM6Uby教授領(lǐng)導(dǎo)的KarolinskaInstitutetMTC細(xì)菌學(xué)部生產(chǎn)并友好提供SA細(xì)*與含a和p溶血素的培養(yǎng)液。如下表所述，在頸側(cè)肩胛骨前部經(jīng)皮下用200fig的FnBp或者FnBp和108金黃色葡萄球菌細(xì)胞/劑量以及a和p溶血素各50照的混合物實施免疫。所有疫苗制劑用1mg/劑量的iscom基質(zhì)作為佐劑。劑量體積是2ml?？箘游锝M檢驗5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素E/PBSPBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黃色葡萄球菌細(xì)胞以及a和p溶血素，PBS:磷酸鹽緩沖液為了獲得有關(guān)免疫應(yīng)答達(dá)到最高限度的額外信息，以及有關(guān)反復(fù)免疫后可能的抑制的信息，實施了笫三次免疫。如上所述，通過ELISA對血清實施針對FnBp抗體應(yīng)答的評價。我們需要了解SA全細(xì)胞+毒素對FnBp是否具有支配作用即抑制抗FnBp的免疫應(yīng)答。在由RolandM611by教授領(lǐng)導(dǎo)的KarolinskaInstitutetMTC細(xì)菌學(xué)部實施針對a和p溶血素的中和試驗。結(jié)果在本實施例中，小牛的年齡小于l歲，并且它們對補(bǔ)充SA細(xì)胞以及a和p溶血素的FnBp不產(chǎn)生應(yīng)答或者產(chǎn)生的應(yīng)答只具有非常低的抗體效價。通過ELISA測量的關(guān)于組1的針對FnBp的免疫應(yīng)答顯示在圖5:1中。在第一次免疫后，僅在組l中只用FnBp以及用iscom基質(zhì)作為佐劑的FnBp免疫的動物產(chǎn)生IgM以及IgG抗體應(yīng)答。在第一次加強(qiáng)免疫后，在單獨(dú)用FnBp接種的動物中記錄到IgM、IgGl和IgG2應(yīng)^r有明顯的增加。在用包含F(xiàn)nBp和金黃色葡萄球菌細(xì)胞以及a和(5溶血素的組合物進(jìn)行初次免疫的動物中，沒有動物顯示出針對FnBp的免疫應(yīng)答(未顯示)。第三次免疫后進(jìn)行檢驗。針對a和p溶血素的免疫應(yīng)答在功能性即毒素中和試驗中進(jìn)行測量。該結(jié)果顯示在圖5:2中。第一次免疫后，在用包含SA細(xì)胞和毒素的疫苗組中即B、C和D組的動物中記錄到低IgG應(yīng)答。在第二次免疫時抗體水平下降。第二次免疫后，已接受兩劑量毒素的動物即組C和D中的動物產(chǎn)生具有高中和效價的應(yīng)答。討論本試驗表明金黃色葡萄球菌細(xì)胞與a和p溶血素的混合物抑制針對FnBp的免疫應(yīng)答。相比較而言，所有動物產(chǎn)生抗a和p溶血素的高中和抗體的應(yīng)答。不清楚的是，是否毒素或者培養(yǎng)液中其它產(chǎn)物或者全細(xì)胞或者兩者的組合引起這種下調(diào)。在本試驗中的動物年齡小于一歲。在后來的試驗中，所述動物超過一歲最大兩歲并且接受或者補(bǔ)充SA細(xì)胞或者補(bǔ)充a和(J溶血素的FnBP,這些動物產(chǎn)生針對FnBp的高水平抗體應(yīng)答(見實施例7)。在本試驗中注意到的抑制似乎是基于主動免疫應(yīng)答即具有記憶性，因為組B中的動物對第二次施用沒有作出應(yīng)答。相比較而言，a和p溶血素在所有試驗的疫苗抗原組合中誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，這提示毒素和FnBp的組合是相容的并且可行的疫苗組合物。全SA細(xì)胞在疫苗組合物中的可能應(yīng)用需要進(jìn)一步研究。實施例7的結(jié)果指出當(dāng)SA細(xì)胞或者a和p溶血素包含在所述疫苗制劑中時，年齡較大的小?；蚰概σ呙缈乖赡懿粚σ呙缈乖幸种品磻?yīng)。結(jié)論先前的試驗已經(jīng)顯示用iscom基質(zhì)為佐劑的FnBp在牛類物種中具有高度免疫原性，這在本實施例中被證實。在本實施例中，當(dāng)FnBp同時補(bǔ)充SA細(xì)胞以及a和p溶血素時，對FnBp的免疫應(yīng)答^皮下調(diào)。可以從實施例7中總結(jié)出，當(dāng)測量抗FnBp的抗體應(yīng)答時，聯(lián)合FnBp與a和p溶血素的疫苗組合物具有高免疫原性，并且FnBpSA細(xì)胞的聯(lián)合疫苗也是如此。可以想到，在用FnBp并補(bǔ)充SA細(xì)胞以及聯(lián)合a和p溶血素對較年輕動物進(jìn)行免疫觀察到有抑制，而對于超過一歲的牛則不產(chǎn)生抑制反應(yīng)。實施例7在實施例6中，我們已經(jīng)觀察到在試驗性疫苗中a和p溶血素與全SA細(xì)胞的混合物下調(diào)針對第三組分即FnBp的免疫應(yīng)答。因為a和(5溶血素以及全SA細(xì)胞都包括在內(nèi)，不清楚是毒素與細(xì)胞中的一種或另一種或者其組合負(fù)責(zé)這種抑制作用。在本實施例中，通過將FnBp與毒素或全SA細(xì)胞進(jìn)行組合，進(jìn)一步研究了各自的抑制、相容性或增強(qiáng)作用。為此目的，如材料和方法中所述來實施試驗。所有的試驗疫苗都用iscom基質(zhì)為佐劑。材料和方法試驗方案根據(jù)下面的免疫方案，對位于瑞典Uppsala東部MostaFarm的1-2歲齡的15只小牛以6周間隔實施2次免疫。由RolandM611by教授領(lǐng)導(dǎo)的KarolinskaInstitutetMTC細(xì)菌學(xué)部生產(chǎn)并友好提供SA細(xì)菌以及含a和p溶血素的培養(yǎng)液。如下表所述，在頸側(cè)肩胛骨前部經(jīng)皮下用200ng的FnBp或者FnBp與1()S金黃色葡萄球菌細(xì)胞/劑量的混合物或者FnBp與a和p溶血素各50jig的混合物實施免疫。所有的疫苗制劑用1mg/劑量的iscom基質(zhì)為佐劑。劑量體積是2ml。免疫方案抗動物組檢驗A/FnBpFnBp5FnBp和毒素B/SA+FnSA+Fn5FnBp和毒素C/Tox+FnTox+Fn5FnBp和毒素D/PBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黃色葡萄球菌，Tox:a和P溶血素，PBS:磷酸鹽緩沖溶液結(jié)果通過ELISA測量的針對FnBp的免疫應(yīng)答顯示在圖6:1中。在第一次免疫后三周，所有動物產(chǎn)生的應(yīng)答具有相當(dāng)高的抗FnBp抗體效價，其中包括所有檢驗的免疫球蛋白類型，即IgM、IgGl和IgG2。根據(jù)這種初級免疫應(yīng)答，所有積累的經(jīng)驗告訴我們，第二次免疫后將會產(chǎn)生IgG亞型應(yīng)答的顯著增加。第二次免疫的數(shù)據(jù)正在處理中。討論本試驗顯示金黃色葡萄球菌細(xì)胞以及a和p溶血素的混合物分離開地不抑制針對FnBp的免疫應(yīng)答。在實施例6中清楚的顯示毒素組分或者培養(yǎng)液中其它產(chǎn)物與全細(xì)胞聯(lián)合，下調(diào)所有檢驗的免疫球蛋白類型中的免疫應(yīng)答。在實施例6中所證明的抑制似乎是基于包括免疫記憶細(xì)胞的主動免疫應(yīng)答。在實施例6中也表明a和p溶血素在所有疫苗抗原組合中誘導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答，這提示毒素和FnBp的組合是相容的和可行的疫苗組合物。來自本實施例的結(jié)果表明，在疫苗組合物中使用全SA細(xì)胞是可能的，條件是在實施例6的某些組中檢驗的疫苗抗原組合物中引起抑制的因子被鑒定并從含全細(xì)胞的期望疫苗組合物中排除。應(yīng)當(dāng)注意，針對補(bǔ)充SA細(xì)胞以及a和p溶血素的FnBp的抗體應(yīng)答是低的，it^明針對FnBp的免疫應(yīng)答被抑制。應(yīng)該注意，實施例6中小牛的年齡小于一歲，而實施例7中的動物年齡較大即l-2歲。較年輕的動物可能還具有未發(fā)育完全的免疫系統(tǒng)或者不由FnBp抗體反映的母體抗體。在很多制劑中，以iscom基質(zhì)為佐劑的試驗疫苗已包括FnBp和毒素(見實施例3和4)。在小鼠模型中，引發(fā)了針對FnBp以及針對所包含毒素的非常強(qiáng)效的免疫應(yīng)答。因此，所積累的結(jié)果有力地表明，包含粘附因子和其它成分并以iscom制劑為佐劑的期望疫苗制劑可i秀導(dǎo)強(qiáng)免疫應(yīng)答。結(jié)論當(dāng)FnBp或者與毒素或者與全SA細(xì)菌細(xì)胞相混合時，在將i^V哺乳期年齡的動物中誘導(dǎo)抗FnBp的高抗體水平。因此，基于幾種抗原成分的SA疫苗是可行的。表l:l用纖連蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經(jīng)皮下克疫兩次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制劑由在分開顆粒中的0.6ng基質(zhì)-C+3.4jig基質(zhì)-A的混合物組成。表2:1用破傷風(fēng)類毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經(jīng)皮下免疫兩次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制劑由在分開顆粒中的0.6pg基質(zhì)-C+3.4照基質(zhì)-A的混合物組成。表3:1用白喉類毒素(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候選疫苗間隔4周經(jīng)皮下免疫兩次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制劑由在分開顆粒中的0.6pg基質(zhì)-C+3.4fig基質(zhì)-A的混合物組成。權(quán)利要求1.一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可處于復(fù)合物、溶液或者懸液之中。2.根據(jù)權(quán)利要求l的組合物，其中所述纖連蛋白結(jié)合蛋白、截短蛋白和/或肽包含一個或多個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其來自金黃色葡萄球菌(5yfl/;^v/0coccwsflM^ws)、酉良腺鏈球菌(iftfr/7tococc"s/7jogew^s")和停乳鏈球菌(5^CptoCOCCMSfl^S^fl/fl"/fl^)、無專L鏈球菌(iftf^p&COCCWSflg"/fl"/"e)和乳房鏈球菌(5^eptoo"wsw&n、)以及凝固酶陰性葡萄球菌。3.根據(jù)權(quán)利要求l-2中任一項的組合物，其中所述纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自來自金黃色葡萄球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白A或B的D結(jié)構(gòu)域、來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白A的A結(jié)構(gòu)域、來自停乳鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白B的B結(jié)構(gòu)域、和來自釀膿鏈球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白的P結(jié)構(gòu)域。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項的組合物，其中纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽被整合入脂質(zhì)體中或者與iscom基質(zhì)或脂質(zhì)體相混合或者偶聯(lián)于脂質(zhì)體或iscom基質(zhì)上。5.根據(jù)權(quán)利要求l-4中任一項的組合物，其還包含至少一種另外的抗原。6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中所述抗原是來自微生物的全細(xì)胞和/或抗原性成分的形式，所述微生物尤其是金黃色葡萄球菌、S良膿鏈球菌，停乳鏈球菌，無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌。7.根據(jù)權(quán)利要求5-6中任一項的組合物，其中所述抗原性成分選自不下調(diào)免疫系統(tǒng)的成分比如粘附素和成孔因子，以及下調(diào)免疫系統(tǒng)的成分比如超抗原、莢膜抗原、內(nèi)毒素、外毒素和細(xì)胞外酶。8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述粘附素選自聚集因子(clf)、外部纖維蛋白結(jié)合蛋白(efb)、針對纖維蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coa)、結(jié)合于纖維蛋白原的纖維蛋白原結(jié)合蛋白A、附著于纖維蛋白原的纖連蛋白結(jié)合蛋白(FnBp)A和B、結(jié)合于膠原蛋白的膠原蛋白結(jié)合蛋白(cna)、結(jié)合于彈性蛋白的彈性蛋白結(jié)合蛋白(ebpS)、結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的MHC類似物蛋白(map或eap)、涉及細(xì)胞內(nèi)粘附和生物膜形成的多糖細(xì)胞內(nèi)粘附素(pia)、涉及可能逃脫宿主防御的蛋白質(zhì)A(spa)、抗吞噬作用分子的莢膜多糖(1、5、8和13型)(cap)、或Techoidacid。9.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述成孔因子選自a-溶血素、p-溶血素、y-溶血素、5-溶血素、涉及宿主細(xì)胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及組織侵入的彈性蛋白酶(s印A)和涉及組織侵入的透明質(zhì)酸酶(hysA)o10.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中所述外毒素和細(xì)胞外酶選自腸毒素A國E、H(sea-e,h)、涉及靠超抗原和特性逃避宿主防御的毒素休克綜合征毒素-1(tst)、涉及逃避宿主防御的剝脫毒素AB(eta、efb、etb)、涉及逃避宿主防御的脂肪酶(geh)、涉及宿主吞噬細(xì)胞裂解、逃避宿主防御的Panton-Vallentine殺白細(xì)胞素(lukF、lukS)、涉及逃避宿主防御的葡萄球菌激酶(sak)。11.根據(jù)權(quán)利要求1-101中任一項的組合物，其中所述iscom基質(zhì)復(fù)合物包含一種或多種來自QuilA的糖苷片段。12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中至少兩種來自QuilA的糖苷片段是結(jié)合于不同iscom基質(zhì)顆粒中的復(fù)合物。13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項的組合物，其中所述iscom復(fù)合物包含QuilA的亞片段A和/或亞片段C。14.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項的組合物，其中所述iscom復(fù)合物包含粗制QuilA。15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項的組合物，其還包含至少一種影響乳房的抗原比如乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、克雷伯氏菌屬(/ir/AwW/flspp.)和大腸埃希氏菌(co/z)。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項的組合物，其還包含制藥可接受的栽體、稀釋劑、賦形劑或添加劑。17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項的組合物在制備抗包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的微生物比如金黃色葡萄球菌.釀膿鏈球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌以及凝固酶陰性葡萄球菌的疫苗中的用途，尤其是其用于哺乳動物比如人、牛、綿羊或山羊，并且優(yōu)選抗金黃色葡萄球菌。18.包括至少兩個區(qū)室的部件試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且另一個區(qū)室包含使用說明和/或至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體。19.根據(jù)權(quán)利要求18的部件試劑盒，其還包含至少一種下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原和/或至少一種不下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原、和/或來自微生物的全細(xì)胞，由此所述至少一種不下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原、和所述至少一種下調(diào)免疫系統(tǒng)的抗原和/或所述全細(xì)胞可以置于用于在不同位點(diǎn)施用的不同區(qū)室中。20.根據(jù)權(quán)利要求18的部件試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種來自地域性或局部性發(fā)生的金黃色葡萄球菌的抗原。21.根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項的部件試劑盒，其還包含抗生素。22.—種對個體接種疫苗的方法，其中向所述個體施用含有包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽、以及至少一種iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體的組合物。全文摘要本發(fā)明涉及一種組合物，其包含至少一種纖連蛋白結(jié)合蛋白、和/或至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或至少一種纖連蛋白結(jié)合肽，所有這些都包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；以及至少一種Iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或脂質(zhì)體和/或至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷，由此所述至少一種脂質(zhì)和至少一種皂苷可處于復(fù)合物、溶液或者懸液之中。另外，本發(fā)明也涉及其在制備抗包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的微生物的疫苗中的用途。本發(fā)明也涉及其部件中包括至少兩個區(qū)室的試劑盒，其中一個區(qū)室包含至少一種截短的纖連蛋白結(jié)合蛋白和/或纖連蛋白結(jié)合肽，其包含至少一個纖連蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且另一個區(qū)室包含使用說明和/或Iscom基質(zhì)復(fù)合物和/或iscom復(fù)合物和/或脂質(zhì)體。此外，本發(fā)明涉及用于個體疫苗接種的方法。文檔編號A61K39/39GK101107009SQ200680002650公開日2008年1月16日申請日期2006年1月20日優(yōu)先權(quán)日2005年1月20日發(fā)明者卡塔琳娜·龍隆德,卡林·勒夫格倫-本特松,卡洛斯·巴斯丘南,吉爾·?？怂固貍?布羅·莫雷因,比吉塔·弗羅姆格倫申請人:伊斯克諾瓦公司