專利名稱：一類dna靶分子及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗腫瘤的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類DNA靶分子及其用途，具體地說，涉及一種8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物及其用途。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核酸(DNA)是生物的基本遺傳物質(zhì)，是遺傳信息的載體。許多分子能與DNA結(jié)合，破壞DNA的模板作用，影響基因調(diào)控和表達(dá)功能，從而誘發(fā)很多生物效應(yīng)。DNA與其它分子的相互作用是生物化學(xué)和分子生物學(xué)中的重要領(lǐng)域。研究小分子物質(zhì)與DNA的相互作用有助于人們對DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的了解，而且對進(jìn)一步指導(dǎo)人工核酸的合成以及DNA高級結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義。
在醫(yī)藥研究中，DNA與靶向藥物分子相互作用的研究不僅可以從分子水平闡明生命過程機(jī)理、疾病的致病機(jī)制，而且可以引導(dǎo)藥物的設(shè)計與合成、藥物體外篩選以及探討藥物的治病機(jī)理。另外，對雙鏈DNA(或單鏈DNA)具有選擇性結(jié)合或者具有序列特異性結(jié)合的靶向藥物分子可以作為DNA分子雜交與否或識別特定序列DNA指示劑，這是DNA生物傳感器研究的一個重要內(nèi)容。新穎的DNA靶向化合物的設(shè)計對于化學(xué)、生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)都具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價值。在醫(yī)學(xué)研究和新藥設(shè)計中，為了尋求符合要求的DNA靶向藥物分子，必須詳盡的了解DNA與靶向藥物分子間的相互作用。在生物體系中，靶向藥物分子與DNA的結(jié)合是復(fù)雜的，結(jié)合模式主要包括外部靜電結(jié)合、溝區(qū)結(jié)合和嵌插結(jié)合等。影響靶向藥物分子與DNA相互作用的因素很多，如靶向藥物分子的結(jié)構(gòu)(包括分子的形狀、大小、柔性)、靶向藥物分子間的相互作用、溶液的性質(zhì)以及溶液中其它分子與靶向藥物分子或DNA的相互作用等。
嵌插型DNA靶向分子在研究小分子與DNA的相互作用以及腫瘤治療中有著極其重要的用途。作為有效的DNA嵌入劑，它們一般都含有π電子缺乏的共軛的平面剛性結(jié)構(gòu)和堿性支鏈，其中平面芳香或芳香雜環(huán)體系易于嵌插到DNA堿基對中，而堿性支鏈則可通過靜電吸引與DNA結(jié)合，同時堿性支鏈對化合物的細(xì)胞毒性也起到非常重要作用。A.Ramos曾經(jīng)報導(dǎo)過一系列萘酰亞胺化合物的抗腫瘤能力，結(jié)果顯示當(dāng)支鏈中的氮原子被碳原子、硫原子和氧原子取代時將導(dǎo)致化合物活性的喪失(Curr.Med.Chem.-Anti Cancer Agents，2001，1237)。Stephanie Blanchard也評價了不同化合物對L1210小鼠白血病細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用(J.Med.Chem，2004，47978)，正如期望的那樣，比較那些沒有取代基的化合物，帶有N-二烷基側(cè)鏈的衍生物具有較低的IC50值。此外，還有一些其它的嵌入劑也獲得了同樣的結(jié)果，如蒽并吡唑、吡唑吖啶、蒽-4-甲酰胺、二羥蒽二酮以及它的氮雜類似物等(J.Med.Chem，2004，403749)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一在于，提供一種新型8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物；本發(fā)明目的之二在于，提供上述新型8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物的用途。
本發(fā)明是在ZL 02148400.7(發(fā)明人為錢旭紅和肖義等)所公開的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈及其衍生物的基礎(chǔ)上，在母體引入新的活性基團(tuán)，創(chuàng)制了本發(fā)明所涉及的DNA靶分子(新型8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物)，并經(jīng)實驗證實本發(fā)明所創(chuàng)制的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物能在0.01μM～10μM的濃度范圍內(nèi)，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡和顯著抑制動物體內(nèi)腫瘤生長，是一類活性很高的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物。
本發(fā)明所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物具有式(1)所示結(jié)構(gòu) 式(1)中，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；R3為CN或COOR4，其中R4為H，C1～C6的烷基或C1～C6的鹵代烷基； 式(2)中，R5為H或C1～C6的烷基；R6為含S的五元或六元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C6的烷基，R8，R9分別選自C1～C6的烷基中一種，n＝1～6。本發(fā)明一個優(yōu)選方案是當(dāng)R3為CN時，R1為H、含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)[式(2)中所包含取代基的含義與前文所述相同]，R2為H或含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基，且R1和R2不同時為H；更優(yōu)選的方案是當(dāng)R3為CN時，R1為H、含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基(如嗎啉基、硫嗎啉基或哌嗪基等)或由式(2)所示的基團(tuán)，式(2)中，R5為H或C1～C3的烷基；R6為含S的五元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C3的烷基，R8，R9分別選自C1～C3的烷基中一種，n＝1～4；R2為H或含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基(如嗎啉基、硫嗎啉基或哌嗪基等)，且R1和R2不同時為H。
本發(fā)明另一個優(yōu)選方案是當(dāng)R3為COOR4(其中R4為H，C1～C6的烷基或C1～C6的鹵代烷基)時，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；式(2)中，R5為H或C1～C6的烷基；R6為含S的五元或六元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C6的烷基，R8，R9分別選自C1～C6的烷基中一種，n＝1～6；更優(yōu)選的方案是當(dāng)R3為COOR4(其中R4為H，C1～C3的烷基或C1～C3的單鹵代烷基)時，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基(如嗎啉基、硫嗎啉基或哌嗪基等)或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；式(2)中，R5為H或C1～C3的烷基；R6為含S的五元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C3的烷基，R8，R9分別選自C1～C3的烷基中一種，n＝1～4。
制備本發(fā)明所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物的方法包括如下步驟以8-氧-8H-苊并[1，2b]吡咯-9-腈(其制備參見ZL 02148400.7)為起始原料，將其置于有機(jī)溶劑(如乙腈、四氫呋喃、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺或二甲基亞砜)中，與相應(yīng)的伯或仲胺(親核試劑)于20～100℃，反應(yīng)(芳香氫親核取代反應(yīng))0.5～24小時，蒸出溶劑后即得目標(biāo)物之一。
和先將8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈置于由濃硫酸和發(fā)煙硫酸組成酸中(溫度控制在0～5℃)，在15～25℃反應(yīng)10～20小時得8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸，然后與相應(yīng)的醇或鹵代烷進(jìn)行酯化反應(yīng)獲得相應(yīng)的酯(8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸酯)，最后將8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸酯與相應(yīng)的伯或仲胺按上述方法經(jīng)取代反應(yīng)后即得目標(biāo)物之二。


圖1～圖5為3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物7)與培氧細(xì)胞共孵育后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖。
其中橫坐標(biāo)為DNA濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)，化合物7與培氧細(xì)胞共孵育，其濃度分別為0、0.1、1、5、10μM。
具體實施例方式
確認(rèn)本發(fā)明所說8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物可作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物(包括體內(nèi)和體外)的實驗方法是，首先通過MTT等方法測定IC50。
如HeLa細(xì)胞體外抑制實驗使用MTT法。MTT比色試驗是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，目前已廣泛用于抗腫瘤藥物篩選，細(xì)胞毒性試驗等。具體步驟如下1)接種細(xì)胞將HeLa細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔103～104個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200μl。
2)培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中，37℃、5％CO2及飽和濕度下培育24小時后，加入化合物濃度從1μM到100μM，繼續(xù)培養(yǎng)72小時。
3)呈色每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl，孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。然后，每孔加入150μl DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。
4)比色選擇570nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。計算細(xì)胞存活率試驗組光吸收值/對照組光吸收值×100％，用細(xì)胞存活率對化合物劑量對數(shù)作圖求出IC50值(細(xì)胞增殖率降為50％時所需化合物濃度)。
P388細(xì)胞體外抑制實驗也使用MTT法，具體方法如下按不同腫瘤生長速率，將一定數(shù)量處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞90μl孔接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后加入藥液10μl/孔，對每個細(xì)胞株，每個濃度均為三個復(fù)孔。另設(shè)無細(xì)胞調(diào)零孔、如果藥物有顏色要做相應(yīng)藥物濃度無細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/lHCl)50μl/孔，于CO2培養(yǎng)箱中過夜。然后用酶標(biāo)儀測OD570值。按下列公式計算被測物對癌細(xì)胞生長的抑制率腫瘤抑制率＝(對照組OD值-治療組OD值)/對照組OD值×100％。
A549細(xì)胞體外抑制實驗使用磺酰羅丹明B(Sulforhodamine B，SRB)蛋白染色法法，具體方法如下根據(jù)細(xì)胞生長速率，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞以90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板，貼壁生長24小時再加藥10μl/孔。每個濃度設(shè)三復(fù)孔。并設(shè)相應(yīng)濃度的生理鹽水溶媒對照及無細(xì)胞調(diào)零孔。腫瘤細(xì)胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)72小時，然后傾去培養(yǎng)液，用10％冷TCA固定細(xì)胞，4℃放置1小時后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入由1％冰醋酸配制的SRB(Sigma)4mg/ml溶液100μl/孔，室溫中染色15分鐘，去上清液，用1％醋酸洗滌5次，空氣干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶標(biāo)儀520nm波長下測定A值。按下列公式計算被測物對癌細(xì)胞生長的抑制率腫瘤抑制率＝(A540對照孔-A540給藥孔)/A540對照孔×100％。
體內(nèi)抗腫瘤活性的實驗方法是首先培氧肝癌細(xì)胞系H22，按200μl/只接種于小鼠右腋皮下，制備成腫瘤動物模型。接種5天后，瘤塊形成，開始按照濃度梯度每日一次靜脈或局部注射化合物的30％DMSO溶液。實驗期間每周兩次測定腫瘤長徑(a)及與之相垂直的短徑(b)，按公式1/2ab2計算瘤塊體積，并觀測動物存活時間。結(jié)果表明，本發(fā)明中的化合物均有不同程度抑制腫瘤生長、延長腫瘤模型動物生存時間的作用。
本發(fā)明還通過流式細(xì)胞儀檢測了本發(fā)明所說8-氧-8H-苊并[1，2b]吡咯衍生物在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。在體外試驗中，選擇Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。按濃度梯度分別加入指定化合物，同時設(shè)細(xì)胞對照組和陽性藥物環(huán)磷酰胺對照組。CO2溫箱中孵育24小時后，70％冷乙醇固定；體內(nèi)試驗中，取經(jīng)過化合物處理的腫瘤模型動物的腫瘤組織，制備單細(xì)胞懸液，同時設(shè)定未經(jīng)處理的腫瘤模型動物為對照，70％冷乙醇固定。上機(jī)檢測前洗去固定液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測。計算機(jī)自動對各峰的位置、峰高度、細(xì)胞周期各時相百分比進(jìn)行分析。結(jié)果表明，效果最佳的化合物在0.01-10μM之間以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率在5.1-33.8％。
下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，其目的僅在于更好理解本發(fā)明的內(nèi)容而非限制本發(fā)明的保護(hù)范圍實施例18-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物1)在500mL單口燒瓶中，依次加入0.1mol苊醌，0.11mol丙二腈，150ml乙腈，加熱至回流，反應(yīng)4h，反應(yīng)混合物由淡黃色渾濁變?yōu)槌燃t透明。冷至室溫后，過濾，收集橙紅色濾餅，得1-二氰基亞甲基-2-氧-苊，粗產(chǎn)率96％。
在500mL單口燒瓶中，依次加入1-二氰基亞甲基-2-氧-苊粗品0.05mol，碳酸鉀1g，200ml乙腈，加熱至回流，反應(yīng)4h，大量土黃色固體析出。冷至室溫后，過濾，水洗，收集濾餅得化合物1，收率95％。
1H NMR(400M，DMSO)δ8.71-8.69(d，J＝8.0Hz，1H)，8.67-8.65(d，J＝7.6Hz，1H)，8.64-8.62(d，J＝8.0Hz，1H)，8.42-8.40(d，J＝7.6Hz，1H)，8.04-8.08(t，J＝8.0Hz，1H)，7.99-7.95(t，J＝7.8Hz，1H)；13C NMR(100M，DMSO)δ177.48，138.26，137.73，134.40，132.72，131.82，131.37，128.91，127.94，127.37，126.13，122.22，119.72，113.82，113.38；IR(KBr)cm-12231，1643，1577；ESI-MSM+Na+(253，m/z)。
實施例28-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸的合成(化合物2)在50mL單口燒瓶中，加入60mL濃硫酸或者25mL發(fā)煙硫酸，在0～5℃下，分批加入0.05mol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，加完后在室溫繼續(xù)反應(yīng)16小時。然后小心緩慢的將其滴入碎冰中，同時劇烈的攪拌，滴完后，靜置，小心的過濾，濾餅用大量水洗滌，直至濾液呈中性，濾餅干燥后得化合物2，收率95％，M.p.245℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ＝11.41(s，1H，OH*)，8.95(d，1H，J＝7.2Hz)，8.55(d，1H，J＝8.0Hz)，8.53(d，1H，J＝7.2Hz)，8.48(d，1H，J＝8.0Hz)，7.96(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝7.2Hz)，7.88(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝7.2Hz).
IR(KBr)cm-13208，1774，1700，1636，1583，1570.
MS(API-ES)m/z(M-H)-248.1。
實施例38-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯(化合物3)在100mL圓底燒瓶內(nèi)，依次加入0.01mol8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸，50mL乙腈為溶劑，大大過量的碘甲烷，氮氣保護(hù)下，加熱至35℃反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇80∶1)得化合物3，收率98％.M.p.202℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝9.12(d，1H，J＝7.2Hz)，8.75(d，1H，J＝7.6Hz)，8.31(d，1H，J＝8.0Hz)，8.25(d，1H，J＝8.0Hz)，7.87(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝7.2Hz)，7.77(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝7.6Hz)，3.20ppm(s，3H，CH*3).
IR(KBr)cm-13068，2933，1765，1712，1645，1586，1571.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C16H10NO3264.0661，實驗值264.0672.
實施例43-(N，N’-二乙氨基-乙胺基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物4)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和N， N’-二乙基乙二胺2mmol，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇10∶1)得化合物4。收率42％。m.p.＞300℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.97(d，1H，J＝7.6Hz)，8.61(d，1H，J＝7.6Hz)，7.98(d，1H，J＝9.2Hz)，7.91(dd，1H，J＝8.0，7.6Hz)，7.06(1H，d，J＝9.2Hz)，3.79(br s，2H，-NHCH2)，2.93(brs，2H，-NHCH2CH2)，2.38-2.41(m，4H，N(CH2CH3)2)，1.12-1.15ppm(m，6H，N(CH2CH3)2).
IR(KBr)cm-13313，2968，2213，1324，1574，1522.
HRMS(ESI)m/z(M-H)-計算C21H21N4O 343.1559，實驗值343.1557。
實施例53-(4-丁酸乙酯-丁胺基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物5)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和4-氨基丁酸乙酯2mmol，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)4小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇15∶1)得化合物5。收率45％。m.p.138.5-139.5℃1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.58(br s，1H，-NH)，8.90(d，1H，J＝8.0Hz)，8.55(d，1H，J＝8.0Hz)，7.93(d，1H，J＝9.2Hz)，7.87(dd，1H，J＝8.0，7.6Hz)，7.02(d，1H，J＝8.8Hz)，4.05(q，2H，OCH2CH3，J＝6.8Hz)，3.61(q，2H，NHCH2CH2，J＝7.2Hz)，2.52-2.50(m，2H，CH2COO)，1.99-1.96(m，2H，-NHCH2CH2)，1.68ppm(t，3H，OCH2CH3，J＝6.8Hz).
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)δ177.1，172.5，156.0，138.8，132.4，131.1，1129.6，128.0，127.0，125.8，122.1，116.1，114.3，111.4，108.1，63.0，45.2，30.7，30.6，17.0ppm；IR(KBr)cm-13326，2979，2218，1723，1627，1576，1531.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C21H18N3O3360.1348，實驗值360.1349。
實施例63-(噻吩基-2-基-甲氨基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物6)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和2-甲氨基噻吩2mmol，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇12∶1)得化合物6。收率38％.m.p.250℃。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)δ＝9.79(br s，1H，NH*)，8.94(d，1H，J＝8.0Hz)，8.67(d，1H，J＝8.8Hz)，8.10(d，1H，J＝7.6Hz)，7.86(dd，1H，J1＝7.6Hz，J2＝8.0Hz)，7.50(d，1H，J＝3.6Hz)，7.23(d，1H，J＝3.6Hz)，7.08(d，1H，J＝8.8Hz)，7.02(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝3.6Hz)，4.98(s，2H，CH*2).
IR(KBr)cm-13320，2920，2217，1628，1572，1492.
HRMS(ESI)m/z(M-H)-計算C20H10N3OS 340.0545，實驗值340.0546。
實施例73-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物7)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和2mmol硫嗎啉，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)8小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-丙酮60∶1)得化合物7。收率35％；m.p.232℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.61(d，2H，J＝8.0Hz)，8.12(d，1H，J＝8.8Hz)，7.94(dd，1H，J＝8.0，8.0Hz)，7.40(d，1H，J＝8.4Hz)，3.94(t，4H，J＝4.8Hz，N(CH2CH2)2S)，2.97ppm(t，4H，J＝4.8Hz，N(CH2CH2)2S).
IR(KBr)cm-12219，1624，1572，1499.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C19H14N3OS 332.0858，實驗值332.0861。
實施例83-(噻吩基-2-基-甲氨基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯(化合物8)在50mL圓底燒瓶內(nèi)，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸酯和2-甲胺基噻吩2.5mmol，20mL乙腈為溶劑，加熱至60℃反應(yīng)。TLC跟蹤，反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸去乙腈，經(jīng)兩次硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇12∶1)得化合物8。收率41％.M.p.240℃。
1H NMR(400MHz，d6-DMSO)8＝9.71(br s，1H，NH*)，8.87(d，1H，J＝8.0Hz)，8.77(d，1H，J＝8.8Hz)，8.60(d，1H，J＝7.6Hz)，7.86(dd，1H，J1＝7.6Hz，J2＝8.0Hz)，7.46(d，1H，J＝3.6Hz)，7.23(d，1H，J＝3.6Hz)，7.09(d，1H，J＝8.8Hz)，7.02(dd，1H，J1＝3.6Hz，J2＝3.6Hz)，4.98(s，2H，CH*2)，2.97ppm(s，3H，COOCH*3).
IR(KBr)cm-13298，2923，1748，1710，1693，1624，1563，1525.
HRMS(ESI)m/z(M+Na)+計算C21H14N2NaO3S 397.0623，實驗值397.0614。
實施例98-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸-2-溴乙基酯(化合物9)在100mL圓底燒瓶內(nèi)，依次加入0.01mol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸，50mL乙腈為溶劑，大大過量的1，2-二溴乙烷，氮氣保護(hù)下，加熱至35℃反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇70∶1)得化合物9。收率18％.m.p.205-206℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝9.10(d，1H，J＝7.6Hz)，8.74(d，1H，J＝7.6Hz)，8.31(d，1H，J＝7.6Hz)，8.26(d，1H，J＝8.0Hz)，7.86(dd，1H，J1＝7.6Hz，J2＝7.6Hz)，7.77(dd，1H，J1＝8.0Hz，J2＝7.6Hz)，4.13(t，2H，J＝6.4Hz，CH*2CH2Br)，3.66(t，2H，J＝6.4Hz，CH2CH*2Br).
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ＝178.7，168.7，166.3，142.9，137.2，136.5，134.2，132.7，132.3，131.6，129.3，128.1，127.5，125.3，121.3，39.5，28.3.
IR(KBr)cm-13063，2921，1769，1712，1647，1585，1572.
HRMS(ESI)m/z(M+Na)+計算C17H10BrNNaO3377.9742，實驗值377.9730。
實施例103-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸-2-溴乙基酯(化合物10)在50mL圓底燒瓶內(nèi)，加入0.01mol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸-2-溴乙基酯，50mL乙腈為溶劑，大大過量的硫嗎啉，氮氣保護(hù)下，加熱至60℃反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-甲醇70∶1)得化合物10。收率35％.m.p173℃。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ＝9.03(d，1H，J＝8.4Hz)，8.78(d，1H，J＝7.2Hz)，8.44(d，1H，J＝8.0Hz)，7.82(dd，1H，J1＝7.2Hz，J2＝8.4Hz)，7.20(d，1H，J＝8.0Hz)，4.11((t，2H，J＝6.4Hz，OCH*2)，3.64(t，2H，J＝6.4Hz，CH*2Br)，3.72(br s，4H，-N(CH*2CH2)2S)，3.00ppm(br s，4H，-N(CH2CH*2)2S).
IR(KBr)cm-12916，1753，1703，1628，1601，1570.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C21H18BrN2O3S 457.0222，實驗值457.0211。
實施例113，6-二嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物11)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和5mmol嗎啉，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)10小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-丙酮50∶1)得化合物11。收率45％；m.p.180℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.21(d，1H，J＝10Hz)，8.05(d，1H，J＝8.8Hz)，7.59(d，1H，J＝10Hz)，7.31(d，1H，J＝8.8Hz)，3.88(br s，4H，N(CH2CH2)2O)，3.82(br s，4H，-N(CH2CH2)2O)，3.54(br s，4H，N(CH2CH2)2O)，3.46ppm(br s，4H，N(CH2CH2)2O).
IR(KBr)cm-12219，1610，1546，1502.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C23H21N4O3401.1614，實驗值401.1606。
實施例126-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈(化合物12)在50mL單口燒瓶中，依次加入0.5mmol 8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈和5mmol嗎啉，20mL乙腈作溶劑，在室溫下攪拌反應(yīng)8小時。反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸去乙腈，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離(二氯甲烷-丙酮60∶1)得化合物12。收率12％；m.p.247℃。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.36(d，1H，J＝7.6Hz)，8.31(d，1H，J＝9.6Hz)，8.24(d，1H，J＝7.6Hz)，7.81(d，1H，J＝9.6Hz)，7.73(dd，1H，J＝7.6，7.6Hz)，3.81(br s，4H，-N(CH2CH2)2S)，2.88ppm(br s，4H，-N(CH2CH2)2S).
IR(KBr)cm-13431，2924，2852，2224，1618，1600.
HRMS(ESI)m/z(M+H)+計算C19H14N3OS 332.0858，實驗值332.0851。
實施例13體外抗腫瘤活性實驗。采用細(xì)胞培養(yǎng)法對本發(fā)明中的系列化合物進(jìn)行抗腫瘤活性實驗，通過MTT法測定IC50。選擇Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。按濃度梯度分別加入指定化合物的100％DMSO溶液，終濃度100，50，10，5，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同時設(shè)培養(yǎng)細(xì)胞腫瘤對照組和抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺陽性對照組。CO2溫箱中孵育24小時后，每孔加入MTT溶液20μl，用酶測定570nm下光密度(OD)值，根據(jù)光密度值計算各孔腫瘤細(xì)胞的存活率。實驗重復(fù)三次，取其平均值。用細(xì)胞存活率對化合物劑量對數(shù)作圖求出IC50值(細(xì)胞增殖率降為50％時所需化合物濃度)，結(jié)果見表1。
表1 不同化合物抗腫瘤活性

實施例14通過流式細(xì)胞儀檢測了本發(fā)明所指的化合物在體內(nèi)、體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。在體外試驗中，選擇Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋成密度約為5×105個/ml的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μl腫瘤細(xì)胞懸液。按濃度梯度分別加入指定化合物的100％DMSO溶液，終濃度100，50，10，5，0.5，0.1，0.05，0.01μM，同時設(shè)培養(yǎng)細(xì)胞腫瘤對照組和抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺陽性對照組。CO2溫箱中孵育24小時后，冷乙醇固定。上機(jī)檢測前洗去固定液，碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測。計算機(jī)自動對各峰的位置、峰高度、細(xì)胞周期各時相百分比進(jìn)行分析。結(jié)果表明，效果最佳的化合物在0.01-10μM之間以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率在5.1-33.8％(見圖1-圖5)。可見凋亡峰，凋亡率分別為3.2％、5.1％、7.9％、15.5％、33.8％。
實施例15體內(nèi)抗腫瘤活性測試。選擇化合物7進(jìn)行活體動物實驗。選擇飼養(yǎng)的中國昆明小鼠，隨即分組，每組10只。采用右下肢皮下荷瘤的方法，取傳代7天的含有H22細(xì)胞的小鼠癌性腹水，按1∶2稀釋，取0.2ml于右下肢皮下接種，荷瘤后4天，見荷瘤部位有一小指甲大小腫瘤開始給藥，連續(xù)給藥7天后取材，每組取4只，取血，肝，腎，其它動物觀察生存期。
取材后測得瘤重及瘤體積見表2。
表2 體內(nèi)抗腫瘤活性測試

權(quán)利要求
1.一種8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其具有式(1)所示結(jié)構(gòu) 式(1)中，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；R3為CN或COOR4，其中R4為H，C1～C6的烷基或C1～C6的鹵代烷基； 式(2)中，R5為H或C1～C6的烷基；R6為含S的五元或六元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C6的烷基，R8，R9分別選自C1～C6的烷基中一種，n＝1～6。
2.如權(quán)利要求1所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，其中當(dāng)R3為CN時，R1為H、含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，R2為H或含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基，且R1和R2不同時為H。
3.如權(quán)利要求2所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，其中R1為H、含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，R2為H或含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基，且R1和R2不同時為H；而式(2)中，R5為H或C1～C3的烷基，R6為含S的五元芳雜環(huán)基、 或 其中R7為H或C1～C3的烷基，R8，R9分別選自C1～C3的烷基中一種，n＝1～4。
4.如權(quán)利要求3所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，所說的衍生物是3-(N，N’-二乙氨基-乙胺基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，3-(4-丁酸乙酯-丁胺基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，3-(噻吩基-2-基-甲氨基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈，3，6-二嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈或6-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-腈。
5.如權(quán)利要求1所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，其中當(dāng)R3為COOR4時，其中R4為H，C1～C6的烷基或C1～C6的鹵代烷基，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的五元或六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；式(2)中，R5為H或C1～C6的烷基；R6為含S的五元或六元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C6的烷基，R8，R9分別選自C1～C6的烷基中一種，n＝1～6。
6.如權(quán)利要求5所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，其中R4為H，C1～C3的烷基或C1～C3的單鹵代烷基，R1，R2分別選自H，含1～3個N、S或/和O的六元雜環(huán)基或由式(2)所示的基團(tuán)，且R1和R2不同時為H；式(2)中，R5為H或C1～C3的烷基；R6為含S的五元芳雜環(huán)基， 或 其中R7為H或C1～C3的烷基，R8，R9分別選自C1～C3的烷基中一種，n＝1～4。
7.如權(quán)利要求6所說的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物，其特征在于，所說的衍生物是8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸，8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯，3-(噻吩基-2-基-甲氨基)-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸甲酯，8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸-2-溴乙基酯或3-硫嗎啉基-8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯-9-甲酸-2-溴乙基酯。
8.如權(quán)利要求1～7中任意一項所述的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑。
9.如權(quán)利要求1～7中任意一項所述的8-氧-8H-苊并[1，2-b]吡咯衍生物作為抗腫瘤化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種8－氧－8H－苊并[1，2－b]吡咯衍生物及其用途。所說的衍生物具有式(1)所示結(jié)構(gòu)。經(jīng)實驗證明本發(fā)明所創(chuàng)制的8－氧－8H－苊并[1，2－b]吡咯衍生物能在0.01μM～10μM的濃度范圍內(nèi)，以劑量依賴的方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞凋亡和顯著抑制動物體內(nèi)腫瘤生長，是一類活性很高的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑和抗腫瘤化合物。式(1)中，R
文檔編號A61K31/5377GK1931840SQ20061011713
公開日2007年3月21日 申請日期2006年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月13日
發(fā)明者錢旭紅, 張志超, 肖義, 劉鳳玉, 呂哲 申請人:華東理工大學(xué)