專利名稱：一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含銀杏內(nèi)酯的制劑，特別是銀杏內(nèi)酯注射液，同時(shí)還提供該注射液的制備工藝，屬于藥物組合物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
銀杏內(nèi)酯是從中草藥銀杏葉當(dāng)中提取獲得的有效物質(zhì)，銀杏內(nèi)酯是二萜烯類化合物，是包括1個(gè)四氫呋喃環(huán)、3個(gè)r-內(nèi)酯基和由2個(gè)戊碳環(huán)連結(jié)在1個(gè)碳原子上形成的螺[4，4]壬烷系統(tǒng)，共6個(gè)戊碳環(huán)與叔丁基相結(jié)合的獨(dú)特的C20籠蔽分子。其順式稠環(huán)F、A、D與C被塑造成半球形的空腔，這個(gè)空腔是足以容納1個(gè)陽(yáng)離子或陽(yáng)性極化的有機(jī)分子。
P.Braquet等(1988)報(bào)導(dǎo)已知的銀杏內(nèi)酯有5種，用A、B、C、M、J命名(Ginkgolides A、B、C、M、J)，銀杏內(nèi)酯的基本結(jié)構(gòu)是共同的，不同的銀杏內(nèi)酯之間的差別僅是羥基的數(shù)目與位置的不同。銀杏內(nèi)酯M與J，實(shí)際上是銀杏內(nèi)酯B的同分異構(gòu)物。銀杏內(nèi)酯A.B.C既存在于銀杏根皮內(nèi)，也存在于銀杏葉內(nèi)，銀杏內(nèi)酯M僅存在于根皮內(nèi)；銀杏內(nèi)酯J發(fā)現(xiàn)較晚，僅存在于銀杏葉內(nèi)。銀杏內(nèi)酯的化學(xué)性質(zhì)不活潑，是極為穩(wěn)定的(見鄭衛(wèi)平，樓鳳晶銀杏內(nèi)酯的研究概況。藥學(xué)進(jìn)展1999年23卷第2期，82-86頁(yè))。
對(duì)于銀杏內(nèi)酯的提取方法已經(jīng)有詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，李新崗等人介紹了銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室提取方法(參加李新崗等，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的實(shí)驗(yàn)室提取方法研究，中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志1998第1期)，中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1195665A介紹了銀杏內(nèi)酯的提取方法和含有銀杏內(nèi)酯的制劑，該方法是將銀杏葉用水煮沸提取，用吸附劑對(duì)提取濾液吸附，再用乙醇脫附，回收乙醇，將析出的結(jié)晶溶解，重結(jié)晶，干燥制得銀杏內(nèi)酯。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1313287A公開了一種銀杏內(nèi)酯的生產(chǎn)工藝。從銀杏內(nèi)酯的總提取物當(dāng)中分離銀杏內(nèi)酯單體的方法，也有很多相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，例如，游松等人介紹了銀杏內(nèi)酯中銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定方法(參見游松等，銀杏葉中銀杏內(nèi)酯的分離與結(jié)構(gòu)測(cè)定，中國(guó)藥物化學(xué)雜志1995年第4期)。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN1287121A公開了由銀杏葉或銀杏葉浸膏制備藥物銀杏內(nèi)酯A、B的方法。銀杏內(nèi)酯作為一個(gè)有效的活性物質(zhì)，可以將其制備成不同的臨床藥物劑型。劉潔等使用銀杏葉注射劑治療急性腦梗塞取得了一定療效[參見劉潔等，銀杏葉注射液對(duì)急性腦梗塞后肢體運(yùn)動(dòng)功能及TXB-2、6-Keto-PGF-(la)的影響]。關(guān)于銀杏內(nèi)酯的藥理作用，已經(jīng)有較為詳細(xì)的文獻(xiàn)報(bào)道(參見陳維軍等，銀杏內(nèi)酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理作用研究進(jìn)展，中國(guó)藥學(xué)雜志1998年第9期)。盡管現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中對(duì)于銀杏內(nèi)酯及其制劑的研究已經(jīng)有很多的報(bào)道，但是，對(duì)于銀杏內(nèi)酯的研究一直沒有停止，特別是對(duì)于銀杏內(nèi)酯單體的分離及其衍生物的研究，不斷有文獻(xiàn)報(bào)道。目前對(duì)于銀杏內(nèi)酯當(dāng)中有效單體的研究，已經(jīng)報(bào)道了銀杏內(nèi)酯A、B、C等結(jié)構(gòu)，將銀杏內(nèi)酯制備成注射劑，很重要一項(xiàng)技術(shù)問題是如何解決其難溶解性，到目前為止，銀杏內(nèi)酯注射劑制備過程當(dāng)中，對(duì)于助溶劑的選擇也非常重要，這直接影響到產(chǎn)品的穩(wěn)定性和臨床療效。
根據(jù)銀杏內(nèi)酯的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，一般很容易想到用酸或堿使開環(huán)，或者用有機(jī)溶劑溶解，但是它在一般的有機(jī)溶劑中溶解性也很差，如乙醇，聚乙二醇400，甘油，丙二醇中溶解度都很小。所以，目前銀杏內(nèi)酯制備注射劑的方法有通過使用堿溶液增加銀杏內(nèi)酯的溶解性而制得，例如CN200510040497.0，CN00115134.7，CN02134223.7。加入葡甲胺的情況下，對(duì)銀杏內(nèi)酯有很好的助溶作用例如CN02128962.X。對(duì)銀杏內(nèi)酯采用羥丙基-β-環(huán)糊精增溶制得的水溶液例如CN200510072466.3，CN200410013937.9，CN200410041120.2。另外，CN03100334.6公開針劑中含有5-99％銀杏葉提取物、1-95％泊洛沙姆188和pH值調(diào)節(jié)劑以及其它賦形劑。
這些方法中，加羥丙基-β-環(huán)糊精，泊洛沙姆，聚乙二醇等試劑，其作為注射液的安全性值得商榷。羥丙基-β-環(huán)糊精具有潛在的腎毒性，目前僅用抗真菌藥伏力康唑注射液中，在中國(guó)沒有作為合法的注射用附加劑。泊洛沙姆因?yàn)榘踩詥栴}在中國(guó)也沒有作為合法的注射用附加劑。聚乙二醇濃度較大時(shí)有溶血的危險(xiǎn)。所以基本無(wú)實(shí)用的可能。加堿或加葡甲胺都屬于讓內(nèi)酯開環(huán)成鹽，在中性或酸性條件下，很難形成有藥效形式的內(nèi)酯原形，甚至沒有白果內(nèi)酯。而白果內(nèi)酯是目前銀杏中最受關(guān)注的化學(xué)成分，動(dòng)物試驗(yàn)報(bào)導(dǎo)，白果內(nèi)酯具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，以及防止腦、脊髓神經(jīng)脫髓鞘作用，其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)保護(hù)作用比銀杏內(nèi)酯強(qiáng)。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯可防止腦細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激引起的功能改變，選種抗氧化應(yīng)激對(duì)改善老年記憶功能，防止老年性癡呆的發(fā)生和發(fā)展起到有益的作用，因此目前國(guó)際上對(duì)銀杏提取物的要求(德國(guó)衛(wèi)生部Commission E制訂的規(guī)格)是，白果內(nèi)酯含量應(yīng)為2.6-3.2％。
為了解決有效性問題。本發(fā)明公開了一種銀杏內(nèi)酯注射液的處方及配制方法，能使所投的銀杏內(nèi)酯原料與銀杏內(nèi)酯注射液，各組份和比例保持不變。由于銀杏內(nèi)酯A、B、C的基本結(jié)構(gòu)是共同的，不同的銀杏內(nèi)酯之間的差別僅是羥基的數(shù)目與位置的不同，但是其藥效(PAF受體拮抗劑)卻不盡相同；白果內(nèi)酯具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用。為了保持各組份和比例保持不變，本發(fā)明公開了一種用注射液的常用溶劑組成的混合溶劑。溶劑成本低廉，制作工藝簡(jiǎn)單易行，更重要的是解決了安全性和有效性問題。能使所投的銀杏內(nèi)酯原料與銀杏內(nèi)酯注射液，各組份和比例保持不變。并且與銀杏葉中的組份比例接近。而且意外地發(fā)現(xiàn)PH值及調(diào)節(jié)PH的物質(zhì)是關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
意外地發(fā)現(xiàn)用幾種注射液的常用溶劑組成的混合溶劑，能使銀杏內(nèi)酯溶解并能作成銀杏內(nèi)酯注射液。用檸檬酸調(diào)PH值到2.5~6.5。這種混合溶劑作成注射液中各成份及各成份的比例與所投的銀杏內(nèi)酯提取物是一致的。并且能在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。曾試驗(yàn)過不同的PH值及調(diào)節(jié)PH的物質(zhì)，包括鹽酸，磷酸，酒石酸，醋酸，硫酸，琥珀酸，蘋果酸等。久置都會(huì)引起PH值變化，最終各成份比例發(fā)生變化。
本發(fā)明的目的是提供一種含有銀杏內(nèi)酯的制劑，特別是銀杏內(nèi)酯注射液，同時(shí)還提供該注射液的制備工藝。
本發(fā)明所述的銀杏內(nèi)酯的制劑是以高純度的銀杏內(nèi)酯為有效成份制備而成，銀杏內(nèi)酯A，銀杏內(nèi)酯B，銀杏內(nèi)酯C，白果內(nèi)酯之和大于總提取物的80％以上(重量比)。
本發(fā)明的注射液的各組成部分的重量比為銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝(0.001％~0.15％)∶(1％~80％)∶(1％~80％)∶(15％~99％)上述組份的優(yōu)選重量比為銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝(0.05~0.15)∶(20~70)∶(10~40)∶(20~70)上述組份的優(yōu)選重量比為銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝(0.05~0.15)∶(30~50)∶(10~30)∶(30~50)其中還需加入適量的10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)PH值。
制劑處方處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 10g甘油 400ml乙醇 800ml
注射用水加至 2000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
制備本發(fā)明銀杏內(nèi)酯杏內(nèi)酯注射液所使用的銀杏內(nèi)酯原料，可以通過已知的提取方法提取，或者通過市售購(gòu)得，但是銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯的比例應(yīng)該與銀杏葉中的比例大體一致。
含量測(cè)定方法用HPLC-ELSD法測(cè)定銀杏葉中的4種萜類內(nèi)酯(見顏玉貞，謝培山.藥物分析雜志2001年21卷3期173-176頁(yè))從所投料的銀杏內(nèi)酯原料和所得成品的HPLC圖譜上可見銀杏內(nèi)酯A、B、C及白果內(nèi)酯各成份及各成份的比例沒有變化。(見附圖一，二)初步穩(wěn)定性試驗(yàn)仿市售包裝，于室內(nèi)常溫下放置(溫度8～32℃，相對(duì)濕度60％～90％)，樣品于當(dāng)月考察一次后，分別于1月、2月、3月、6月、12月、18月取樣按自擬的《銀杏內(nèi)酯注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(小針劑)(草案)》進(jìn)行考察(其中無(wú)菌、溶血、刺激性僅在0、3和18月進(jìn)行)。結(jié)果均符合規(guī)定，說明本發(fā)明的銀杏內(nèi)酯注射液基本穩(wěn)定。
銀杏內(nèi)酯注射液主要藥效學(xué)試驗(yàn)資料供試藥品銀杏內(nèi)酯注射液，，銀杏內(nèi)酯注射劑輔料溶液(簡(jiǎn)稱空白溶液)，燈盞花素注射液，規(guī)格5mg/2mL，系云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。
1抗血小板聚集性試驗(yàn)富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)和貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)的制備取健康家兔，體重2~3kg，雌雄均用。自清醒家兔頸動(dòng)脈取血收集于塑料離心管中，以3.8％枸櫞酸鈉抗凝(血與抗凝劑體積比9∶1)。室溫下900rpm離心10min，得PRP，吸出PRP于潔凈塑料管中；剩余血液再以3000rpm離心10min得PPP。PPP用于調(diào)零或調(diào)整PRP中的血小板數(shù)目，試驗(yàn)過程中血小板數(shù)控制在5×1011cell/L。
①銀杏內(nèi)酯注射液在體外對(duì)血小板聚集功能的影響將銀杏內(nèi)酯注射液用空白溶液、燈盞花素注射液用生理鹽水稀釋成不同濃度的藥液備用，分別取10μL藥液或空白溶液于PRP中，37℃溫育10min。按Born比濁法(Born GVR.Aggregation of blood platelets by adenosinediphosphate and its reversal.Nature，1962，194927-929)，即PPP調(diào)零及PRP調(diào)幅后，加入5μL的PAF(終濃度7.2nmol/L)，在血小板聚集儀上測(cè)定血小板聚集性并記錄5min內(nèi)最大血小板聚集率。血小板聚集抑制率按下式計(jì)算，用直線回歸法求出藥物的半數(shù)抑制濃度(50％inhibitoryconcentration，IC50).
血小板聚集抑制率(％)＝[1-(對(duì)照管聚集百分率/給藥管聚集百分率)]×100
結(jié)果顯示，銀杏內(nèi)酯注射液呈濃度依賴性明顯抑制PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，其IC50為9.4mg/L，燈盞花素注射液IC50為214.8mg/L(表1，2)。表明銀杏內(nèi)酯注射液抑制PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，顯著強(qiáng)于燈盞花素注射液。
表1.銀杏內(nèi)酯注射液在體外對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響

n＝5，x±s，**P＜0.01與空白溶液組比較(Student t-檢驗(yàn))表2.燈盞花素注射液在體外對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響

n＝5，x±s，**P＜0.01與空白溶液組比較.(Student t-檢驗(yàn))
2銀杏內(nèi)酯注射液在體內(nèi)對(duì)血小板聚集功能的影響健康家兔30只，體重2.0~2.5kg，雌雄均用，隨機(jī)分成5組，每組6只，即等體積空白溶液組、2.0、4.0、8.0mg/kg的銀杏內(nèi)酯注射液組和13.2mg/kg的燈盞花素注射液組。上述各組份均以5.0mL/kg體重經(jīng)耳緣靜脈注射給藥。給藥前取血一次，給藥后10、30、60、90和120min分別取血，同體外試驗(yàn)方法制備PRP和PPP，觀察藥物靜脈注射后對(duì)PAF誘導(dǎo)血小板聚集功能的影響。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射后，劑量為2.0mg/kg時(shí)對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集功能無(wú)明顯抑制作用，4.0mg/kg時(shí)，于注射后30和60min明顯抑制PAF引起的血小板聚集，8.0mg/kg時(shí)，于注射后10min起效，于60min達(dá)最大抑制作用，抗PAF作用持續(xù)至90min；13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)的燈盞花素注射液的作用特點(diǎn)與8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)的銀杏內(nèi)酯注射液相似。注射后60min，8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)銀杏內(nèi)酯注射液的抗PAF作用強(qiáng)度明顯高于13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)燈盞花素注射液組(表3)。
表3.銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板聚集功能的影響


n＝5，x±s，*P＜0.05，**P＜0.01，與等時(shí)間點(diǎn)的空白溶液組或0min比較，#P＜0.05與燈盞花素注射液比較(Student t-檢驗(yàn))。
3對(duì)電刺激大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響試驗(yàn)雄性SD大鼠50只，體重190~230g，隨機(jī)分成5組，每組10只，即空白溶液組(等體積)、2.0、4.0、8.0mg/kg的銀杏內(nèi)酯注射液組和13.2mg/kg的燈盞花素注射液組。上述各組份均以0.2mL/100g體重腹腔注射(ip)，1次/d，共2次，于末次給藥30min后，應(yīng)用Charlton等方法(CharltonPA，F(xiàn)aint RW，Bent F，Bryans J，Chicarelli-Robinson I，Mackie I，MachinS，Bevan P.Evaluation of a low molecular weight modulator of humanplasminogen activator inhibitor-1 activity.Thrombosis and Haemostasis，1996，75(5)808-15)并加以改良，即用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，分離左頸總動(dòng)脈，測(cè)定正常血流量；藥物再以0.2mL/100g體重經(jīng)股靜脈注射，10min后置兩根銀制電極于血管兩端，間距0.5cm，電極及血管下襯一絕緣薄膜，通以1.5mA直流電連續(xù)刺激7min，同時(shí)用5MHz點(diǎn)式超聲探頭，連續(xù)測(cè)量刺激部位遠(yuǎn)心端的血流量。從刺激開始至血流量為零的時(shí)間間隔，代表血管栓塞時(shí)間(occlusion time，OT)，此為血栓形成時(shí)間。若60min內(nèi)血管仍開放，則以60min作為記錄終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Student t-檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果顯示，銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射后，呈劑量相關(guān)性明顯延長(zhǎng)電刺激大鼠頸動(dòng)脈的血栓形成時(shí)間；13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)燈盞花素注射液組的血栓形成時(shí)間與8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)銀杏內(nèi)酯注射液組的相當(dāng)(表4)。
表4.銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射對(duì)電刺激雄性大鼠頸動(dòng)脈血栓形成的影響

n＝10，x±s，**P＜0.01與空白溶液組比較，#P＜0.01與燈盞花素注射液組比較(Student t-檢驗(yàn)).
4銀杏內(nèi)酯注射液的溶栓試驗(yàn)血栓模型的制備雄性SD大鼠50只，體重240~280kg，隨機(jī)分為5組，每組10只，即等體積的空白溶液組、13.2mg/kg燈盞花素注射液組、2.0、4.0和8.0mg/kg的銀杏內(nèi)酯注射液組。改良Charlton等方法，即用30mg/kg的戊巴比妥鈉ip麻醉大鼠，分離大鼠左頸總動(dòng)脈，置兩根銀制電極(間距0.8cm)，超聲探針置遠(yuǎn)心端。用電刺激器以2mA的直流連續(xù)刺激大鼠頸動(dòng)脈5min。用超聲波雙向血流儀連續(xù)探測(cè)頸動(dòng)脈血流量。以血流量降低為刺激前的50％作為血栓形成。
溶栓活性的測(cè)定以刺激結(jié)束后至血流量降低為刺激前的50％所需的時(shí)間定為血栓形成時(shí)間。形成血栓后20min，上述各組分均經(jīng)股靜脈一次性注射，觀察給藥后1h內(nèi)血管再通情況；該段時(shí)間內(nèi)，若血管沒有再通，則認(rèn)為再通失敗。若再通，則繼續(xù)觀察血管開放狀態(tài)1h。以≥50％或≤25％的刺激前血流量者判定為持續(xù)再通或繼后的再栓塞；再通后1h內(nèi)，每只動(dòng)物的頸動(dòng)脈血流量以刺激前血流量為基線可分為≥50％，＞25％至＜50％，和≤25％。頸動(dòng)脈血管開放程度分別為(1)持續(xù)栓塞(persistent occlusion，PO)無(wú)再通；(2)再通與再栓塞交錯(cuò)出現(xiàn)(cyclic reflow，CR)；(3)再通后持續(xù)開放(persistentpatency，PP)再通后無(wú)再栓塞。
結(jié)果表明，2.0mg/kg銀杏內(nèi)酯注射液組的栓塞血管與空白溶液組相似，均無(wú)一再通，4.0、8.0mg/kg銀杏內(nèi)酯注射液組及燈盞花素注射液組的血管再通率分別為30、60和60％；4.0mg/kg銀杏內(nèi)酯注射液組的血管再栓率為66.7％，8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)銀杏內(nèi)酯注射液組的再栓率與13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)燈盞花素注射液組相當(dāng)，均為50％(表5)。再通后1h內(nèi)，血管開放狀態(tài)表現(xiàn)為，空白溶液組均持續(xù)栓塞；13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)的燈盞花素注射液組的血管開放狀態(tài)分值與8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)的銀杏內(nèi)酯注射液組相當(dāng)(表6)。
表5.銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)動(dòng)脈血栓的溶栓作用


n＝10，x±s，*P＜0.05與空白溶液比較(X2test).
表6.一次性靜注銀杏內(nèi)酯注射液溶栓后1h動(dòng)脈開放狀態(tài)

n＝10雄性大鼠5銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)小鼠抗缺血、耐缺氧試驗(yàn)ICR小鼠50只，體重18～22g，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組10只，即等體積的空白溶液組、2.0、4.0、8.0mg/kg的銀杏內(nèi)酯注射液組和13.2mg/kg的燈盞花素注射液組。各組動(dòng)物按0.1mL/10g體重ip，1次/d，連續(xù)2d。于末次給藥后30min，再分別經(jīng)尾靜脈緩慢注射上述各組分，10min后將小鼠逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后張口喘氣停止時(shí)間作為抗腦缺血、耐缺氧指標(biāo)，數(shù)據(jù)以Student t-檢驗(yàn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
結(jié)果顯示，高、中劑量的銀杏內(nèi)酯注射液及燈盞花素注射液均明顯延長(zhǎng)正常小鼠斷頭張口喘氣時(shí)間，13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)的燈盞花素注射液組的喘氣時(shí)間與8.0mg/kg (臨床劑量的20倍)銀杏內(nèi)酯注射液組相當(dāng)(表7)。
表7.銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射對(duì)小鼠斷頭張口喘氣時(shí)間的影響


n＝10，x±s，*P＜0.05，**P＜0.01與空白溶液組比較，#P＜0.05與燈盞花素，注射液組比較(Student t-檢驗(yàn))。
6對(duì)沙土鼠腦缺血再灌注損傷改善試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒】瞪惩潦?0只，體重50～70g，雌雄兼用。2％戊巴比妥鈉(50mg·kg-1)ip麻醉動(dòng)物，頸部正中切口，分離頸總動(dòng)脈，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10min，松夾后直視血管再通(再灌注)，造成腦缺血再灌注損傷模型，假手術(shù)組行同樣操作，但不夾閉頸總動(dòng)脈?？p合皮膚切口，放回原條件繼續(xù)飼養(yǎng)5天(d)。手術(shù)過程中保持肛溫約37℃。
分組動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為假手術(shù)組、缺血模型組、銀杏內(nèi)酯注射液中、高劑量組和燈盞花素注射液陽(yáng)性對(duì)照組。造型前2天，分別ip溶媒(假手術(shù)組和缺血模型組)、銀杏內(nèi)酯注射液4.0、8.0mg/kg和燈盞花素注射液13.2mg/kg，每天1次，夾閉動(dòng)脈前5min股靜脈注射各受試樣品1次，再灌注期間ip 1次/d，共5次。
檢測(cè)指標(biāo)(1).記錄腦電圖(EEG)參照文獻(xiàn)(Sun F，Liu TP.Tetrandrine vsnicardipine in cerebral ischemia-reperfusion damages in gerbils.ActaPharmacol Sin.1995，16(2)145)用單個(gè)針形電極插入沙土鼠前腦皮下，參比電極置于枕部皮下，另一端接日本光電VC-11型記憶示波器，記錄缺血前、靜脈注射5min、缺血10min、再灌注10、30和60min的EEG，并將腦電信號(hào)輸入日本光電QC-111J型疊加直方分析儀，記錄其直方圖，以x軸的v數(shù)作為EEG電位幅度，以缺血前EEG為100％，按下式計(jì)算EEG電位幅度％。
EEG電位幅度(％)＝缺血或再灌注后幅度÷缺血前幅度×100(2).大腦皮層組織Ca2+、Na+、水含量測(cè)定腦缺血10min再灌注5d后，脫頸處死動(dòng)物，參照Young法(Young W，Rappaport H，Chalif DJ，F(xiàn)lammES.Regional brain sodium，potassium and water changes in the ratmiddle cerebral artery occlusion of ischemia.Stroke 1987；18751)取右側(cè)顳頂葉皮質(zhì)，用濾紙吸去血跡，置預(yù)先稱重的坩鍋中，精確稱取濕重，后置100℃烤箱烘烤5h致恒重，再稱取干重，按下式計(jì)算組織的含水量水含量(％)＝(濕重-干重)÷濕重×100之后經(jīng)消化、灰化、稀釋處理，用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定大腦皮層Ca2+、Na+含量(Bradbury，MWB，Kleeman，CR，Bagdoyan，H，Berberian A.The calcium and magnesium content of skeletal muscle，brain，andcerebrospinal fluid as determined by atomic absorption flamephotometry.J Lab Clin Med 1968；71884)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，缺血再灌注組動(dòng)物EEG電位幅度立即降低，持續(xù)低平，與假手術(shù)對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，再灌注后電位幅度恢復(fù)緩慢，60min時(shí)，僅恢復(fù)至缺血前的40.5％。給予銀杏內(nèi)酯注射液4.0、8.0mg/kg燈盞花素注射液13.2mg/kg后，均能促進(jìn)EEG電位幅度的恢復(fù)，再灌注60min時(shí)分別恢復(fù)至缺血前的49.5％，58.1％和70.8％，明顯高于缺血再灌注組，P＜0.05(表8)。
表8銀杏內(nèi)酯注射液注射給藥對(duì)沙土鼠腦缺血再灌損傷EEG的影響

x±s，n＝8.*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血再灌注組比較(Studentt-檢驗(yàn)).
缺血10min再灌注5d后，缺血再灌注組動(dòng)物大腦皮層水、鈉和鈣含量明顯高于假手術(shù)對(duì)照組(P＜0.01)。銀杏內(nèi)酯注射液8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)能減輕缺血再灌注損傷引起的腦水腫，與缺血再灌注組比較，差異有顯著性；對(duì)鈣鈉累積具有減少趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。燈盞花素注射液13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)對(duì)腦水腫影響不明顯，但能減輕鈣鈉累積(表9)。
表9銀杏內(nèi)酯注射給藥對(duì)沙土鼠腦缺血10min再灌5d大腦皮層H2O、Na+、Ca2+含量的影響


x±s，n＝8.*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血再灌注組比較(Studentt-檢驗(yàn)).
7對(duì)大鼠局灶性腦缺血改善試驗(yàn)雄性SD大鼠80只，體重310±17g，隨機(jī)分為6組，分別為假手術(shù)組、缺血模型組(均給予等體積溶媒)、銀杏內(nèi)酯注射液高劑量組(8.0mg/kg)、中劑量組(4.0mg/kg)、低劑量組(2.0mg/kg)和燈盞花素注射液陽(yáng)性對(duì)照組(13.2mg/kg)。于實(shí)驗(yàn)前2天每天ip.1次，第3天于缺血前5min給藥1次。參照文獻(xiàn)方法(徐叔云，卞如濂，陳修.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第三版，人民衛(wèi)生出版社，2002，pp.1066)，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型。用10％水合氯醛(300mg/kg)ip麻醉動(dòng)物，將硅化的0.28mm直徑尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈插入大腦前動(dòng)脈(以頸總動(dòng)脈分叉處為標(biāo)記，約為17mm)造成局灶性腦缺血模型。假手術(shù)組行同樣操作，但不閉塞大腦中動(dòng)脈。手術(shù)過程中保持肛溫約37℃。術(shù)后24h對(duì)動(dòng)物出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀進(jìn)行行為評(píng)分，標(biāo)準(zhǔn)如下0無(wú)異常1豎毛，輕度運(yùn)動(dòng)低下2行動(dòng)不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢(shì)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)3偏癱，不能站立或行走4痙攣，昏睡5死亡MCAO后24h，脫頸處死動(dòng)物，取出全腦，做冠狀切片，用1％TTC溶液37℃避光孵育25min，分離蒼白區(qū)(梗塞區(qū))和非蒼白區(qū)(正常區(qū))，稱重，按下式計(jì)算百分比梗塞百分比(％)＝梗塞區(qū)重量÷(梗塞區(qū)重量+正常區(qū)重量)×100結(jié)果表明，ip銀杏內(nèi)酯注射液4.0mg/kg(臨床劑量的10倍)和8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)和燈盞花素注射液13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)均能明顯縮小MCAO大鼠的梗塞范圍，試驗(yàn)各組的腦切片見圖1，與缺血模型組比較，差異有顯著性(P＜0.05，0.01)；銀杏內(nèi)酯注射液和燈盞花素注射液均能降低MCAO大鼠的腦卒中評(píng)分和動(dòng)物死亡率(表10)。
表10銀杏內(nèi)酯注射液注射給藥對(duì)大鼠MCAO 24h神經(jīng)缺陷評(píng)分和梗塞百分比

x±s.行為評(píng)分和梗塞百分比采用Student t-檢驗(yàn)*P＜0.05，**P＜0.01，與缺血模型組比較；死亡率采用X2-檢驗(yàn)*P＜0.05，與缺血模型組比較。
8增加小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，即空白溶液組、2.0、4.0、8.0mg/kg銀杏內(nèi)酯組和13.2mg/kg的燈盞花素注射液組。各組動(dòng)物均先以0.1mL/10g體重腹腔注射，1次/d，共2次，于末次給藥后30min，再繼以尾靜脈注射，10min后，0.5％伊文思藍(lán)以0.2mL/只尾靜脈注射并及時(shí)腹腔注射0.7％醋酸0.2mL/只，15min后處死動(dòng)物，腹腔注射生理鹽水5mL，輕揉后抽取腹腔液，離心，上清液于590nm處測(cè)定其OD值，數(shù)據(jù)行組間t檢驗(yàn).
結(jié)果表明，高、中劑量的銀杏內(nèi)酯注射液和燈盞花素注射液均能促進(jìn)H+刺激引起小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的增高(表11)。
表11.銀杏內(nèi)酯注射液靜脈注射對(duì)小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的影響

n＝10，x±s，*P＜0.05，**P＜0.01與空白溶液組比較，#P＜0.05與燈盞花素注射液組比較(Student t-檢驗(yàn)).
1.8對(duì)原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)取孕14-17d齡ICR胎鼠大腦皮層，D-Hanks液洗2次后，剪成糜狀，加入0.125％胰酶消化10min，用含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散，200目金屬網(wǎng)篩過濾，細(xì)胞濾液以800r.min-1離心5min，棄上清液，用DMEM培養(yǎng)液(含10％小牛血清，青霉素G 100U/mL，鏈霉素100U/mL)重新懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.5×106/mL，接種于多聚賴氨酸包被過的24孔和96孔板中，接種體積分別為400L和100L。于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液2次，3～5d后，加入阿糖胞苷10mol/L培養(yǎng)24h，以抑制非神經(jīng)細(xì)胞增殖。
谷氨酸對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞的損傷于培養(yǎng)第8天加入受試樣品(用DMSO助溶)或空白溶媒，24h后吸去培養(yǎng)液，用DMEM洗1次，加谷氨酸(終濃度500umol/L)處理1h，吸去含谷氨酸的培養(yǎng)液，用DMEM洗1次，再加入含小牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h。
MTT微量自動(dòng)比色法谷氨酸處理后24h，在96孔板中加入MTT(終濃度0.5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，再加入三聯(lián)液溶解藍(lán)紫色結(jié)晶(Formazan)，次日用EL340型酶標(biāo)儀測(cè)定570nm的吸收度，按公式計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)存活率(相對(duì)存活率％＝加樣孔OD值或Glu損傷孔OD值÷空白對(duì)照孔OD值×100)，結(jié)果進(jìn)行t-檢驗(yàn)。
LDH活性測(cè)定谷氨酸處理后24h，測(cè)定24孔板培養(yǎng)液中即細(xì)胞外液的LDH活性，之后將細(xì)胞凍存于-30℃冰箱，以破壞細(xì)胞，次日再次測(cè)定培養(yǎng)液中總的LDH活性，兩次差值的大小反應(yīng)細(xì)胞的損傷程度，差值越小損傷越重，說明LDH泄漏到細(xì)胞外液越多，結(jié)果進(jìn)行t-檢驗(yàn)。
在缺血性腦損傷的機(jī)制研究中，興奮性氨基酸在缺血性腦損傷病理過程中發(fā)揮著重要作用，研究表明谷氨酸與原代培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞接觸一定時(shí)間后將引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡，LDH泄漏到細(xì)胞外液中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明銀杏內(nèi)酯注射液和燈盞花素注射液均能減少谷氨酸引起的神經(jīng)細(xì)胞LDH的泄漏，兩者相比無(wú)顯著性差異，提示對(duì)谷氨酸所致細(xì)胞膜損傷有一定的保護(hù)作用；但對(duì)提高谷氨酸損傷后細(xì)胞的相對(duì)存活率影響不明顯(表12)。
表12.銀杏內(nèi)酯注射液對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)小鼠原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)原損傷的影響

x±s，P＞0.01與0濃度比較(Student t-檢驗(yàn))；P＞0.05與燈盞花素注射液比較(Student t-檢驗(yàn))。
綜上所述，銀杏內(nèi)酯注射液具有顯著改善腦組織的缺血和缺氧作用，銀杏內(nèi)酯注射液具有明顯的通脈、活血化瘀及促進(jìn)血瘀性物質(zhì)的吸收之功效。大部分藥效學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目中，銀杏內(nèi)酯注射液8.0mg/kg(臨床劑量的20倍)作用與燈盞花素注射液13.2mg/kg(臨床劑量的40倍)相當(dāng)，但前者選擇性強(qiáng)力拮抗PAF，抗腦水腫作用較強(qiáng)，后者減輕鈣、鈉累積作用較明顯。本試驗(yàn)為銀杏內(nèi)酯注射液作為防治中風(fēng)和外周血栓性疾病提供了較為可靠的依據(jù)。


圖1銀杏內(nèi)酯提取物的含量測(cè)定HPLC圖，其中峰1是銀杏內(nèi)酯C、峰2是白果內(nèi)酯、峰3是銀杏內(nèi)酯A、峰4是銀杏內(nèi)酯B。
圖2銀杏內(nèi)酯注射液的含量測(cè)定HPLC圖，其中峰1是銀杏內(nèi)酯C、峰2是白果內(nèi)酯、峰3是銀杏內(nèi)酯A、峰4是銀杏內(nèi)酯B。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 10g甘油 1000ml乙醇 2500ml注射用水加至 5000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.5，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于5ml玻瓶中，于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例二處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 10g甘油 400ml乙醇 800ml注射用水加至 2000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例三處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 15g甘油 50ml乙醇 100ml注射用水加至 1000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，每瓶1ml。于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例四處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 15g甘油 800ml乙醇 100ml注射用水加至 1000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，每瓶1ml。于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例五處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 15g甘油 50ml乙醇 900ml注射用水加至 1000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至5，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，每瓶1ml。于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例六處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 5g甘油 200ml乙醇 500ml注射用水加至 1000ml
制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于2ml玻瓶中，每瓶1ml。于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例七處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 10g甘油 1000ml乙醇 2500ml注射用水加至 10000ml制成 1000支制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.5，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于10ml玻瓶中，于100℃滅菌20分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
實(shí)施例七處方(以1000劑量單位計(jì))銀杏內(nèi)酯 10g
甘油 1000ml乙醇 2500ml注射用水加至 100000ml制成 1000瓶制備方法取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合耐醇微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封于100ml玻瓶中，于120℃滅菌30分鐘，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
權(quán)利要求
1.一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物含有以乙醇組成的混合溶劑，并且該藥物組合物的PH值為2.5-6.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物的混合溶劑含有乙醇、甘油、水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物的混合溶劑中銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝0.001％-0.15％∶1％-80％∶1％-80％∶15％-99％。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物的混合溶劑中銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝0.05％-0.15％∶20％-70％∶5％-40％∶20％-70％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物的混合溶劑中銀杏內(nèi)酯∶乙醇∶甘油∶水＝0.05％-0.15％∶30％-50％∶10％-30％∶30％-50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物的制備方法，其特征在于，調(diào)節(jié)該藥物組合物的PH值為3.5-5.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物的制備方法，其特征在于，該藥物組合物的PH值調(diào)節(jié)劑為枸櫞酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物的制備方法，其特征在于，取處方量約80％的注射用水，處方全量的甘油和乙醇，置配液缸中，加入處方量的銀杏內(nèi)酯，攪拌溶解后，加注射用水至全量，用10％檸檬酸溶液調(diào)節(jié)PH值，攪勻，半成品檢驗(yàn)合格后，用0.65μm和0.45μm復(fù)合微孔濾膜作濾材的微膜過濾系統(tǒng)過濾澄明，灌封，于100℃滅菌，冷卻，燈檢，貼標(biāo)，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，它的劑型是適合監(jiān)床應(yīng)用的注射劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，它的劑型也包括輸液、凍干粉針。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的一種銀杏內(nèi)酯的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物在防治中風(fēng)和外周血栓形成疾病上的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了用幾種注射液的常用溶劑乙醇、甘油和水組成混合溶劑，用檸檬酸調(diào)pH值到2.5~6.5，作成銀杏內(nèi)酯注射液。注射液中各成份及各成份的比例與所投的銀杏內(nèi)酯提取物是一致的。并且能在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，并且所作的注射液符合中國(guó)藥典的注射液的通則要求。
文檔編號(hào)A61K47/10GK1887282SQ20061010362
公開日2007年1月3日 申請(qǐng)日期2006年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月26日
發(fā)明者孫毅 申請(qǐng)人:孫毅