專利名稱：：凋亡基因Caspase-4為靶標的反義寡核苷酸及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物工程藥物領域，具體地說涉及一種靶向凋亡基因Ca印ase-4為靶標的反義寡核苷酸及其用途。
背景技術：
：機體的生理狀態(tài)是一種細胞內分子信號傳導通路組成的分子相互作用動力學網絡的平衡。輻射作為一種細胞的物理刺激信號，可以引起多種細胞的病理反應，導致細胞內多種信號傳導通路和網絡的異常并誘導細胞凋亡、進而引起多器官損傷，甚至功能衰竭和死亡。從這層意義上看放射病實際上是一種輻射引起的機體細胞凋亡等分子信號傳導通路組成的相互作用動力學網絡平衡的失調。大量研究己表明，輻射可以激活細胞信號傳導途徑和眾多基因的表達，誘導細胞DNA損傷、細胞周期改變和細胞凋亡。細胞凋亡、細胞周期改變和DNA的損傷修復與細胞放射敏感性之間具有明顯的相關性，于是，那些影響這些輻射反應的基因，理所當然會對細胞的放射敏感性產生不同程度的影響。大量研究表明它們不僅是腫瘤細胞輻射敏感性的生物標志，而且可以作為輻射防護和增敏藥物的潛在靶標。針對這些潛在靶標設計的藥物將成為新一代的輻射防護藥和增敏藥物。反義脫氧寡核苷酸(Antisenseoligodeoxynuclecotide,AS0DN)是一段與mRNA或DNA特異性結合并阻斷其基因表達的人工合成的DNA分子。與傳統藥物相比，反義藥物具有更高的特異性、更優(yōu)的療效和更低的毒性。因此，反義藥物越來越成為人們研究和開發(fā)的熱點。其中，反義藥物作為腫瘤輻射增敏劑已被大量研究。同樣如果反義序列靶向的是輻射敏感靶基因，反義寡核苷酸藥物便可以用于輻射防護。
發(fā)明內容半光氨酸蛋白酶基因家族在細胞的凋亡中具有非常重要的作用。本發(fā)明的目的是選擇凋亡相關基因Caspase-4為靶標，利用本實驗室設計發(fā)明的反義寡核苷酸設計軟件設計5條反義寡核苷酸序列(表l),對這些序列進行篩選獲得輻射防護藥物先導結構。寡核苷酸序列采用PE公司產391A型DNA合成儀合成并采用硫代修飾，經MicroPureII反向柱(SolidPhaseScience)純化后，以此產物作為輻射防護藥物。表l反義寡核苷酸序列及特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本發(fā)明的主要內容是選取了Caspase基因作為靶標進行輻射防護反義寡核苷酸的篩選和評價。Caspase-4是Caspase-1亞家族中的一員，該基因主要存在于細胞的內質網，當細胞受到損傷刺激時，該基因編碼的蛋白前體斷裂活化，活化的Caspase-4參與細胞凋亡的誘導。抑制Caspase-4的表達能抑制細胞的凋亡。在針對Caspase-4基因的5條反義寡核苷酸中，Cas4-3的體外保護細胞增殖作用最強。在0.2yM給藥濃度時，2Gy照射后細胞的存活率與單純照射組相比，細胞存活率增加了21.1%。集落形成實驗表明Cas4-3反義寡扼苷酸處理后的細胞輻射后集落形成能力與單純照射組相比也明顯增加，抑制細胞的凋亡。根據本發(fā)明，發(fā)明中所涉及的寡核苷酸或其修飾組成物具有輻射防護的作用，可用于腫瘤放射治療中的輻射防護。根據本發(fā)明，發(fā)明中針對Caspase-4基因輻射防護的優(yōu)選序列為A3。圖1為反義寡核苷酸(O.2uM)在細胞水平上的輻射防護作用；其中con為未照射細胞對照，IR為單獨照射組,IR+Lip為脂質體對照組，其余為不同反義序列轉染后照射組。圖2和3為不同濃度反義寡核苷酸轉染后對輻射后24h和48h細胞的輻射防護作用其中control為未照射對照組，IR為照射對照組，Scramble為隨機序列對照組，caspase4-3為反義組。圖4為0.4uM反義寡核苷酸在細胞水平上對靶基因mRNA表達的抑制作用；圖5為0.4uM反義寡核苷酸在細胞水平上對靶基因蛋白表達的抑制作用；圖6為0.4uM反義寡核苷酸增強細胞輻射后的集落形成能力；圖7為0.4uM反義寡核苷酸抑制輻射后細胞R0S的產生；圖8為反義寡核苷酸抑制輻射后細胞的凋亡。其中A:為未照射細胞對照；B:為單獨照射組，IR;C:為轉染隨機序列對照組；D:為轉染0.2uMcaspase4-3組；D:為轉染0.4uMcaspase4-3組。具體實施例方式實施例一體外輻射防護活性ASODN的篩選和評價1.材料和方法1.1反義寡核苷酸的設計本研究選取了Caspase4基因作為靶標進行輻射防護反義寡核苷酸的篩選和評價，基因序列由Genbank獲得。根據靶基因的mRNA序列，利用本實驗室開發(fā)的基于多預測結構的反義核酸設計軟件(軟件登記號2005SR12155)設計反義核酸序列(表1).1.2反義寡核苷酸的合成根據設計的反義寡核苷酸序列，合成5條(Cas4-1-Cas4-5)反義序列(具體序列見表l)。反義硫代寡聚核苷酸為無色粉末狀，合成后濃氨水55'C脫保護15小時，然后用反向柱(購自solidphasescience公司)層析純化。體外實驗用無雙抗的DMEM培養(yǎng)基配制，保存于-2CTC。1.3細胞培養(yǎng)、脂質體轉染及輻射防護活性測定人細胞株(A549)由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所保存。用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37'C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數生長期后，將細胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液100uL，含4乂103細胞。待40-60%的細胞融合后，吸去培養(yǎng)液，用無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基洗2次，在無血清狀態(tài)下，采用脂質體Lipofectin(GIBCO,lmg/ml)試劑并參照說明書操作進行硫代反義寡核苷酸的轉染。反義寡核苷酸轉染濃度為0.2MM，每個濃度重復3個孔，并設細胞和脂質體對照。轉染6小時后，換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細胞進行2Gy照射，照射后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時，每孔加20WMTS(CellTiter96Aqueousonesolutioncellproliferationassay,Promega)并繼續(xù)避光培養(yǎng)90min，在多標記酶聯免疫檢測儀(VICTORWallac1420MultilabelCounter,Wallac)上測定490nm處吸光值A,計算細胞存活率。1.4反義寡核苷酸在體外對靶基因mRNA表達的影響選取細胞水平輻射防護效果較好的A3硫代反義寡核苷酸，檢測其對靶mRNA表達的抑制作用。A549細胞培養(yǎng)條件同上。將細胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL,含1.5X10S細胞。待40_60%的細胞融合后，吸去培養(yǎng)液，進行硫代反義寡核苷酸的轉染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度分別為0.l幽、0.2幽、0.4MM，并設細胞對照和脂質體對照。轉染6h，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48h后，TRIZ0L法(Gibco)提細胞總RNA,紫外定量并將各組提取物調至相同濃度。采用Reversetranscriptionsystem(P，ega)進行反轉錄，及PCR擴增耙基因mRNA。以看家基因NADPH作為內標進行雙重PCR，設不加模板的空白對照。NADPH擴增片段317bp，靶基因Caspase4擴增片段為200bp。擴增產物用2%瓊脂糖膠(Sigma)電泳檢査。1.5反義寡核苷酸在體外對靶基因蛋白表達的影響細胞培養(yǎng)條件同上。將A549細胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含1.5X1()5細胞。硫代反義寡核苷酸的轉染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度為0.4MM，設細胞對照和脂質體對照。轉染6h后，換含10%胎牛血清的DMED培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，RIPA-PICT(Pharmacia)提細胞總蛋白，蛋白定量后將各提取物調至相同濃度。每孔5(Htg總蛋白，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，并進行Westernbloting觀察靶基因蛋白表達情況。2實驗結果2.1反義寡核苷酸作用靶位的篩選圖1結果表明，5條反義序列轉染細胞后經2Gy的照射，除cas-l和cas-5序列外，其余3條序列均能不同程度地提高細胞的存活率，其中0.2umol/LCas4-3反義轉染組與單獨照射組相比，細胞的存活率提高了21.1%,因此選擇Caas4-3進行進一步的分子水平分析。為了進一步證實Cas4-3的輻射防護作用，又進一步檢測了不同濃度反義藥物轉染細胞后的輻射防護作用。同時為了證明反義序列作用的特異性，同時還設計合成了一條隨機序列同時進行轉染，從圖2和圖3可以看出，不同濃度Cas4-3轉染細胞后，細胞經2Gy照射后24小時和48小時細胞的存活率均比單獨照射組提高，且有一定的劑量依賴關系，而轉染隨機序列(Scramble)組細胞的存活率則與單獨照射組相似。表明Cas4-3的作用是序列特異的。2.2反義寡核苷酸對靶基因轉錄及翻譯水平的影響反義藥物是通過抑制其靶基因的表達來實現藥效作用，同時觀察靶基因的表達情況也是評價和衡量反義藥物作用特異性的一個重要指標。由圖4可以看出，Cas4-3反義序列能抑制靶基因mRNA的表達且具有一定的量效關系，而隨機序列和脂質體對照則均不能抑制靶基因的表達。進一步檢測了反義寡核苷酸對靶基因蛋白表達的影響。由圖4可見，0.4umol/L濃度的Cas4-3可顯著抑制耙基因蛋白的表達，而隨機序列則無抑制作用。實施例二集落形成實驗評價ASODN的輻射防護活性1.材料和方法1.1A549細胞培養(yǎng)條件同上。待細胞長至對數生長期時，將細胞懸液接種在6孔培養(yǎng)板中，每孔接種培養(yǎng)液2mL，含2.0X10S細胞。待40-60%的細胞融合后，吸去培養(yǎng)液，進行硫代反義寡核苷酸的轉染(操作過程同上)。反義寡核苷酸的濃度為0.2幽，并設細胞對照和脂質體對照。轉染6h，換含l(^胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細胞進行2Gy、4Gy和6Gy的照射，照射完后，將細胞種植在直徑為30mm的平皿上，每個平皿含100個細胞，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，細胞進行固定和染色，計算每個平皿中含50個以上細胞的集落數。2實驗結果2.10.2umol/LCas4-3反義寡核苷酸轉染細胞后能提高輻射后細胞集落形成能力，其中2Gy照射后細胞集落形成率從67%提高到了89%，對4Gy和6Gy照射后細胞的集落形成能力也有不同程度的提高(圖5)。實施例三、氧自由基實驗評價ASODN的輻射防護作用1.材料和方法1.1A549培養(yǎng)在96孔板上，反義藥物的轉染條件和方法同前面。反義寡核苷酸的濃度為0.2MM,并設隨機序列對照。轉染6h,換含l(^胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細胞進行2Gy的照射，分別于照射后2，4，8和24小時檢測氧自由基(ROS)的產生。ROS的檢測采用DCFH-DA法進行測定，細胞吸去培養(yǎng)液，加入100ul含DCFH-DA溶液，置37度30min，細胞用PBS洗三次后，在488和525nm波長處進行測定。2實驗結果2.1從圖6可以看出，0.2umol/LCas4-3反義寡核苷酸轉染細胞后能抑制輻射后24h細胞產生ROS，而在輻射后2，4，8h對R0S的產生則沒有明顯的抑制作用。表明Cas4-3的輻射防護作用部分是通過抑制ROS的產生而起作用的。實施例四細胞凋亡實驗評價ASODN的輻射防護作用1.材料和方法1.1A549細胞的培養(yǎng)和反義藥物的轉染條件和方法同上。反義寡核苷酸的濃度為0.2剛，并設細胞對照和隨機序列對照。轉染6h，換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h后，細胞進行2Gy的照射，分別于照射后24h和48h檢測細胞的凋亡。細胞的凋亡用AnnexV凋亡檢測試劑盒進行檢測。2實驗結果2.1從圖7可以看出，0.2umol/L和0.4umol/L的Cas4-3反義寡核苷酸轉染細胞后能抑制輻射后引起的細胞凋亡，細胞的凋亡率由原來照射后的4.3%分別降低到2.9%和1.8%，而隨機序列則沒有相應的保護作用。核苷酸序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所<120>凋亡基因Caspase-4為靶標的反義寡核苷酸及其用途<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1CAGTTGCGGTTGTTGAATAT20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3TTCCTCTAGGTGGCAGCACC20權利要求1.一種與凋亡基因Caspase45’和3’基因互補的反義寡核苷酸，其特征為寡核苷酸序列選自下列之一1)CAGTTGCGGTTGTTGAATAT2)TCTCTTCAGCTCTTTCTTTA3)TTCCTCTAGGTGGCAGCACC。2.根據權利要求1所述寡核苷酸，其特征為組成寡核苷酸的磷酸二酯鍵部分的單鍵氧位置選自氧、甲基或硫。3.權利要求1或2所述任一寡核苷酸或其組合在制備輻射防護藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明涉及反義寡核苷酸的結構和用途，具體地說是根據凋亡相關基因(Caspase4)設計并制備的反義寡核苷酸。采用人細胞株(A549)，對所設計、制備的5條反義寡核苷酸進行篩選及評價。體外實驗可提高輻射后細胞的存活率，增加細胞輻射后的集落形成率，抑制輻射后細胞中ROS的產生和輻射誘導的細胞凋亡，并阻斷該基因表達。文檔編號A61K48/00GK101104632SQ20061009103公開日2008年1月16日申請日期2006年7月12日優(yōu)先權日2006年7月12日發(fā)明者伯曉晨,婁紹科,林汝仙,王升啟申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所