專利名稱：羥基馬桑毒素在制備癲癇動(dòng)物模型所用致癇藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及羥基馬桑毒素(tutin)的用途，特別是在制備實(shí)驗(yàn)性癲癇動(dòng)物模型所用致癇藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癲癇是發(fā)病原因復(fù)雜、表現(xiàn)形式多樣的腦疾病，全世界大約有超過(guò)5千萬(wàn)人患此疾病。利用不同的癲癇動(dòng)物模型對(duì)癲癇發(fā)生機(jī)制進(jìn)行研究、對(duì)治療癲癇病的藥物進(jìn)行篩選是進(jìn)一步闡明癲癇病因、治療人類癲癇的重要途徑之一。
癲癇動(dòng)物模型所用的致癇藥物通常為匹羅卡品(pilocarpine)、紅藻氨酸(kanic acid，KA)，雖然它們引起動(dòng)物癲癇狀態(tài)的表現(xiàn)大致相同，但各自的致癇原因、癲癇發(fā)生過(guò)程以及致癇機(jī)制卻不相同。匹羅卡品可致典型的癲癇狀態(tài)行為和腦電驚厥，興奮性氨基酸NMDA受體拮抗劑MK-801抑制匹羅卡品所致癲癇動(dòng)物發(fā)作性行為驚厥、腦電驚厥，表明興奮性氨基酸NMDA受體激活是該種癲癇模型形成的重要因素，此外，抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)受體功能異常是匹羅卡品導(dǎo)致動(dòng)物驚厥的另一原因(見(jiàn)OrmandyGC，Jope RS，Snead OC.Anticonvulsant actions of MK-801 on the lithium-pilocarpinemodel of status epilepticus in rats.Exp Neurol 1989；106172-180.)。紅藻氨酸(kanic acid，KA)所致的癲癇狀態(tài)是另一種癲癇模型，當(dāng)GABA-A受體拮抗劑、MK-801和腺苷受體擬似劑共同作用于紅藻氨酸所致的驚厥動(dòng)物時(shí)，可對(duì)紅藻氨酸引起的興奮毒性產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用(見(jiàn)MacGregor DG，Graham DI，Stone TW.The attenuation ofkainate-induced neurotoxicity by chlormethiazole and its enhancement by dizocilpine，muscimol，and adenosine receptor agonists.Exp Neurol 1997；148110-123.)。提示不同的遞質(zhì)受體系統(tǒng)參與了紅藻氨酸所致的驚厥。
上述實(shí)驗(yàn)表明，只有不斷開(kāi)發(fā)新的致癇藥物制備不同類型的癲癇動(dòng)物模型，才能滿足治療癲癇病的需要。
馬桑內(nèi)酯(coriaria lactone，CL)作為致癇劑也有所報(bào)道。馬桑內(nèi)酯是從中草藥馬桑寄生中提取的混合液，其組分主要有馬桑毒素、羥基馬桑毒素、馬桑亭及其它倍半萜內(nèi)酯，由于馬桑內(nèi)酯是一種混合物，發(fā)揮作用的有效組分不明，所以阻礙它成為一種公認(rèn)的致癇工具藥。
羥基馬桑毒素(tutin)是從馬桑內(nèi)酯混合液中分離純化獲得的一種純化學(xué)物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式如下 周華等對(duì)羥基馬桑毒素(tutin)的初步研究顯示，不同濃度(40μg/ml、30μg/ml和20μg/ml)的羥基馬桑毒素(tutin)灌流大鼠海馬腦片，均可顯著增高由順向刺激海馬Schaffer側(cè)支所誘發(fā)的CA1區(qū)錐體神經(jīng)元群體鋒電位(population spike，PS)的幅度(周華，鄭煜，唐玉紅；羥基馬桑毒素所致的大鼠海馬錐體細(xì)胞癇樣放電活動(dòng)；生理學(xué)報(bào)，June 25，2004；56(3)341-346)。該現(xiàn)象提示羥基馬桑毒素(tutin)可能具有致癇作用，但不能由此推論羥基馬桑毒素(tutin)在動(dòng)物整體情況下能引發(fā)癲癇樣行為和癲癇樣腦電，從而作為制備癲癇動(dòng)物模型的一種致癇藥物。因?yàn)椋趯?shí)驗(yàn)科學(xué)領(lǐng)域，人們一致認(rèn)為，不能簡(jiǎn)單地把離體實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果直接用來(lái)推測(cè)或解釋其在完整機(jī)體中的功能或所起的作用(姚泰，緒論，姚泰主編生理學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，2000，北京，1-6)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為制備癲癇動(dòng)物模型提供一種新的致癇藥物，促進(jìn)癲癇發(fā)生機(jī)制的研究和癲癇病治療藥物的篩選。
本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明用人工腦脊液(ACSF)將羥基馬桑毒素(tutin)配制成濃度為10.0～30.0μg/μl的注射液，以成年大鼠制備動(dòng)物模型，從大鼠側(cè)腦室給藥，給藥的劑量為5μl/只，給藥后全部大鼠產(chǎn)生了典型的癲癇狀態(tài)行為發(fā)作，腦電圖記錄到棘波、多棘波群、棘慢綜合波、成簇發(fā)放的多棘慢綜合波以及陣發(fā)性高波幅節(jié)律等癇樣腦電波。因此，羥基馬桑毒素(tutin)可作為一種新的致癇化學(xué)工具藥，用于制備實(shí)驗(yàn)性癲癇動(dòng)物模型。
癲癇行為觀察采用攝像機(jī)錄像記錄，并與Racine點(diǎn)燃模型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure.Electroencephalography and Clinical Neurophysiology 1972b；32281-294)和癲癇狀態(tài)(status epilepticus，SE)的發(fā)作類型(參照Brandt(Brandt C，Glien M，Potschka H，VolkHolger and Lscher W.Epileptogenesis and neuropathology after different types of statusepilepticus induced by prolonged electrical stimulation of the basolateral amygdale in rats.Epilepsy Res 2003；5583-103)〕進(jìn)行對(duì)照比較。
癇樣腦電活動(dòng)變化采用腦電圖(electroencephalogram，EEG)記錄電極、記錄裝置和生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄、顯示、貯存和分析，并與常見(jiàn)癇波的腦電圖(解學(xué)孔，癲癇的腦電圖表現(xiàn)，解學(xué)孔主編癲癇病學(xué)。人民衛(wèi)生出版社，1995，北京，350-385)進(jìn)行對(duì)照比較。
本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明為已知物質(zhì)羥基馬桑毒素發(fā)掘了新的用途，開(kāi)拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域。
2、本發(fā)明為制備癲癇動(dòng)物模型提供了一種新的致癇藥物，此種致癇藥物不僅致癇作用較強(qiáng)，而且動(dòng)物死亡率較低。
3、經(jīng)側(cè)腦室單次微量注射羥基馬桑毒素(tutin)液可制成一種新的大鼠急性癲癇狀態(tài)模型，有利于癲癇發(fā)生機(jī)制的研究和癲癇病治療藥物的篩選。
4、對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠注射羥基馬桑毒素液時(shí)采用側(cè)腦室局部給藥，不僅給藥量小，而且可避免血腦屏障對(duì)藥物進(jìn)入腦脊液的阻礙作用。


圖1是實(shí)驗(yàn)大鼠側(cè)腦室微量注射人工腦脊液(ACSF)前、后的腦電波圖，其中，A為注射人工腦脊液(ACSF)前的腦電波圖，B為注射人工腦脊液(ACSF)后的腦電波圖，他們均為正常腦電波，未見(jiàn)癇樣放電。
圖2是實(shí)驗(yàn)大鼠注射濃度為12.5μg/μl的羥基馬桑毒素液后5～10分鐘所出現(xiàn)的棘波放電腦電圖，其中，A為注射羥基馬桑毒素前的正常腦電波型圖，B1為常見(jiàn)的癲癇大鼠棘波放電的腦電波型圖(箭頭所指)，B2為連續(xù)、反復(fù)出現(xiàn)的單個(gè)棘波圖(線段所示)，B3為連續(xù)出現(xiàn)的多棘波群圖(箭頭所指)。
圖3是實(shí)驗(yàn)大鼠注射羥基馬桑毒素液后處于癲癇狀態(tài)I型發(fā)作階段的形態(tài)圖。
圖4是實(shí)驗(yàn)大鼠注射濃度為12.5μg/μl的羥基馬桑毒素液后10～20分鐘出現(xiàn)的肌陣攣性驚厥發(fā)作的腦電波變化圖，其中，A為頻率3～4Hz的連續(xù)性棘慢綜合波圖(線段所示)，B為彌漫性棘慢綜合波圖(箭頭所示)，C為較低幅度的多棘慢綜合波圖(線段所示)，D為較高幅度的多棘慢綜合波圖(線段所示)，E為多棘慢綜合波反復(fù)、成簇發(fā)放圖(箭頭所示)。
圖5是實(shí)驗(yàn)大鼠注射羥基馬桑毒素液后處于癲癇狀態(tài)II型發(fā)作階段的形態(tài)圖。
圖6是實(shí)驗(yàn)大鼠注射濃度為25.0μg/μl的羥基馬桑毒素液后15～30分鐘后出現(xiàn)的高幅陣發(fā)性癇性腦電波圖，其中，A為頻率8Hz(圖左側(cè))和頻率3Hz(圖右側(cè))的節(jié)律放電圖，B為A中圖右側(cè)腦電波被擴(kuò)展后所顯示的波形變化圖。
圖7是實(shí)驗(yàn)大鼠注射羥基馬桑毒素液后處于癲癇狀態(tài)III型發(fā)作階段的形態(tài)圖。
具體實(shí)施例方式
1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品羥基馬桑毒素(tutin)由原華西醫(yī)科大學(xué)藥廠生產(chǎn)，人工腦脊液(ACSF)組成(mmol)124NaCl，5KCl，1.25NaH2PO4，2MgSO4，2CaCl2，24NaHCO3，10Glucose。Sprague-Dawley(SD)大鼠15只，體重190～210g，雌雄不限，由四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分成對(duì)照組(5只)和實(shí)驗(yàn)組(10只)，實(shí)驗(yàn)組又分成兩個(gè)濃度組羥基馬桑毒素濃度25.0μg/μl組(n＝5)和羥基馬桑毒素濃度12.5μg/μl組(n＝5)。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)埋置在側(cè)腦室的給藥導(dǎo)管分別注射5μl不同濃度的羥基馬桑毒素液，羥基馬桑毒素液用羥基馬桑毒素和人工腦脊液(ACSF)配制而成；對(duì)照組側(cè)腦室注射同體積容量的人工腦脊液(ACSF)；羥基馬桑毒素液和人工腦脊液(ACSF)的pH值均為7.35～7.4。
1.2側(cè)腦室給藥導(dǎo)管和腦電圖(EEG)記錄電極的埋置SD大鼠經(jīng)3％戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定在立體定位儀上，常規(guī)消毒，暴露顱骨頂部，按鼠腦圖譜選定側(cè)腦室坐標(biāo)為前囟后1mm(P1.0)，中線旁開(kāi)1.8mm(RL1.8)，硬膜下3.5mm(H3.5)，埋置外徑為0.8mm的不銹鋼管作為側(cè)腦室給藥導(dǎo)管。腦電圖(electroencephalogram，EEG)記錄電極安放坐標(biāo)為前囟后5mm(P5.0)，中線左側(cè)旁開(kāi)3mm(LL3.0)和前囟后5mm(P5.0)，中線右側(cè)旁開(kāi)3mm(RL3.0)，鉆孔后，將兩根銅芯電極分別埋置到該兩點(diǎn)顱骨下硬膜外表面，互為記錄電極和參考電極，供記錄腦電圖(electroencephalogram，EEG)用。注射導(dǎo)管及腦電圖記錄電極全部用牙托粉和502膠水固定。手術(shù)完畢后，肌肉注射丁胺卡拉霉素，共三天。
上述手術(shù)后第三天，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。微量注射器(針頭直徑0.4mm)經(jīng)埋置在側(cè)腦室的給藥導(dǎo)管給實(shí)驗(yàn)組中兩個(gè)不同濃度組的動(dòng)物分別注射濃度為12.5μg/μl和濃度為25.0μg/μl的羥基馬桑毒素液5μl，2min推注完，留針2min，緩慢取出注射針；對(duì)照組動(dòng)物每只注射5μl人工腦脊液(ACSF)，時(shí)間過(guò)程同實(shí)驗(yàn)組。
1.3腦電圖描記由引導(dǎo)電極和參考電極引導(dǎo)的電信號(hào)先經(jīng)RM-6000多導(dǎo)生理記錄儀(Kohden，Japan)生物放大器放大后，輸入計(jì)算機(jī)，采用BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技股份公司)顯示、貯存、分析。動(dòng)物側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素液或人工腦脊液(ACSF)前，先記錄15min腦電波活動(dòng)，作為腦電圖記錄的基礎(chǔ)腦電。給藥后，連續(xù)描記腦電圖2h，記錄動(dòng)物癲癇發(fā)作的潛伏期和發(fā)作程度。以注射羥基馬桑毒素液到腦電圖首次出現(xiàn)特征性癲癇波形所需的時(shí)間為癲癇出現(xiàn)的潛伏期。
1.4癲癇行為觀察側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素液后，對(duì)大鼠的癲癇典型發(fā)作行為進(jìn)行錄象記錄，并與Racine點(diǎn)燃模型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和癲癇狀態(tài)(status epilepticus，SE)的發(fā)作類型進(jìn)行對(duì)照比較。
癲癇行為的嚴(yán)重程度按照Racine點(diǎn)燃模型的標(biāo)準(zhǔn)(Racine RJ.Modification ofseizure activity by electrical stimulation.II.Motor seizure.Electroencephalography andClinical Neurophysiology 1972b；32281-294)將動(dòng)物驚厥發(fā)作的行為表現(xiàn)分為5級(jí)。I級(jí)須動(dòng)，頭面部抽搐；II級(jí)節(jié)律性咀嚼及點(diǎn)頭；III級(jí)前肢或后肢抽搐；IV級(jí)四肢節(jié)律性抽搐；V級(jí)全身強(qiáng)直抽搐，伴有甩尾或翻滾、跌到。III級(jí)或III級(jí)以下者為輕型發(fā)作，IV～V級(jí)為重型發(fā)作。
癲癇狀態(tài)(status epilepticus，SE)的發(fā)作類型參照Brandt(Brandt C，Glien M，Potschka H，Volk Holger and Lscher W.Epileptogenesis and neuropathology after differenttypes of status epilepticus induced by prolonged electrical stimulation of the basolateralamygdale in rats.Epilepsy Res 2003；5583-103)分為三型，連續(xù)部分驚厥為I型SE，動(dòng)物主要表現(xiàn)為不動(dòng)或伴面部的自主活動(dòng)；連續(xù)部分驚厥與間歇性全身性發(fā)作為II型SE，動(dòng)物以部分驚厥表現(xiàn)為主，偶然出現(xiàn)軀干或四肢間歇性抽搐；全身性驚厥為III型SE，動(dòng)物全身及四肢肌肉強(qiáng)直陣攣，原地打轉(zhuǎn)、跳躍、奔跑、翻滾倒地。
1.5腦電波檢測(cè)側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素液后，同步記錄腦電圖變化，并與常見(jiàn)癇波的腦電圖進(jìn)行對(duì)照比較。
腦神經(jīng)元發(fā)作性的超同步化放電稱為癲癇性放電，這種放電表現(xiàn)在腦電圖中的腦電波形態(tài)稱為癲癇波形或癇波，常見(jiàn)的癇波有以下七種(解學(xué)孔，癲癇的腦電圖表現(xiàn)，解學(xué)孔主編癲癇病學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，1995，北京，350-385)。(1)散發(fā)性棘波棘波(spike)是癲癇性放電最具特征性的表現(xiàn)之一。其波幅多在100μV以上，周期在80ms以內(nèi)。棘波的出現(xiàn)表明腦部有刺激性病灶。(2)散發(fā)性尖波尖波(sharp)是常見(jiàn)的癲癇性放電特征波形之一。典型的尖波周期在80～200ms之間，波幅常在100～200μV之間，它可能是由較大的癲癇灶中多數(shù)神經(jīng)元棘波放電的不完全同步化形成的。(3)棘慢綜合波(spike and wave complex)或尖慢綜合波(sharp and wave complex)由棘波或尖波與周期為300～400ms的慢波結(jié)合在一起的癇波稱為棘慢波或尖慢綜合波，其頻率前者為2.5～3.5Hz，后者為1.5～2.5Hz。(4)多棘波群(multiple spikes)為2～6個(gè)棘波成簇地單獨(dú)出現(xiàn)，當(dāng)棘波連續(xù)出現(xiàn)時(shí)，多為大發(fā)作的表現(xiàn)。(5)多棘慢綜合波(multiplespikes and slow waves)由幾個(gè)棘波和一個(gè)慢波所組成，常為成串連續(xù)出現(xiàn)或不規(guī)則出現(xiàn)，棘波波幅高低不一，是肌陣攣性癲癇最具特征的波形之一。(6)發(fā)作性節(jié)律(slowwaves burst)在腦電圖近似基礎(chǔ)波的背景上出現(xiàn)陣發(fā)性高波幅節(jié)律，突然出現(xiàn)，突然消失。(7)高度節(jié)律紊亂(hypsarrhythmia)高波幅的棘波、尖波、多棘波或多棘-慢綜合波與慢波雜亂而不規(guī)則地結(jié)合呈現(xiàn)出的波形。
1.6資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理給藥前后的資料用配對(duì)t檢驗(yàn)處理；發(fā)生率和死亡率用卡方檢驗(yàn)；濃度組之間的數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析進(jìn)行。P＜0.05為差異有顯著性。
2.結(jié)果2.1側(cè)腦室注射人工腦脊液(ACSF)對(duì)大鼠腦電和行為的影響手術(shù)后第三天，大鼠頭部埋置的給藥導(dǎo)管和腦電圖(EEG)記錄電極無(wú)松動(dòng)，傷口無(wú)滲出物，動(dòng)物清醒，自由活動(dòng)。首先描記一段正常腦電圖，正常腦電圖主要表現(xiàn)為α波或β波，即基礎(chǔ)波，其腦電頻率在6～12Hz之間，平均8.25±1.49Hz，波幅在10±80μV之間，平均41.17±12.93μV(見(jiàn)圖1A)。對(duì)照組大鼠側(cè)腦室注射5μl人工腦脊液(ACSF)后，開(kāi)始在鼠籠內(nèi)較快地來(lái)回爬動(dòng)，約2～3min后，安靜、伏地，偶有爬動(dòng)，行為如常；腦電圖波形與注射前相似，腦電頻率6～12Hz，平均8.78±1.48Hz，波幅在10～90μV之間，平均51.99±20.42μV(見(jiàn)圖1B)。與注射前的基礎(chǔ)波相比，其頻率和波幅均無(wú)顯著性改變(P＞0.05，n＝5)，亦未見(jiàn)特征性的癲癇波。
2.2側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素(tutin)對(duì)大鼠腦電圖(EEG)的影響經(jīng)預(yù)先埋置的給藥導(dǎo)管給實(shí)驗(yàn)組10只大鼠(兩組羥基馬桑毒素液的濃度分別為25.0μg/μl和12.5μg/μl，每組5只)側(cè)腦室注射5μl羥基馬桑毒素液。兩組動(dòng)物注射羥基馬桑毒素液前，描記的腦電圖均正常，未見(jiàn)癇波(見(jiàn)圖2A)。在注射羥基馬桑毒素液后5～10分鐘，動(dòng)物腦電圖出現(xiàn)棘波，一種特征性癲癇腦電波(見(jiàn)圖2B1～B3)，其波寬常在40～80ms，波幅50～150μV大小不等，平均103.53±36.81μV。棘波發(fā)放的樣式既可是散在單個(gè)癇波(圖2B1)或反復(fù)連續(xù)發(fā)放(圖2B2)，亦可是由3～5個(gè)低幅棘波構(gòu)成的短段癇波(圖2B3)，呈陣發(fā)或連續(xù)發(fā)放。散在單個(gè)棘波發(fā)放(圖2B1)常出現(xiàn)在癲癇行為發(fā)作的潛伏期，棘波成段發(fā)放時(shí)(圖2B3)，動(dòng)物多伴有節(jié)律性咀嚼、眨眼、須動(dòng)等癇樣行為。
連續(xù)性棘慢綜合波(見(jiàn)圖4A)和彌漫性棘慢綜合波(見(jiàn)圖4B)常出現(xiàn)于失神發(fā)作型癲癇，其頻率為3～4Hz，平均幅度為293.53±41.62μV；另一種主要由數(shù)個(gè)棘波構(gòu)成的棘波群或多個(gè)棘波中夾有慢波的多棘慢綜合波，陣發(fā)性出現(xiàn)之初，表現(xiàn)為低幅(82.57±4.7μV)、高頻(9.12±1.09Hz)發(fā)放，每段波群持續(xù)時(shí)間平均為11.20±1.63s，發(fā)作間隔時(shí)間平均為50.93±7.72s，波群反復(fù)出現(xiàn)6次(見(jiàn)圖4C)。再次發(fā)作時(shí)，波幅增加為202.20±12.94μV，頻率為10.03±1.58Hz，每段波群持續(xù)時(shí)間平均減少為4.39±0.42s，發(fā)作間隔時(shí)間平均縮短到21.43±2.49s，波群反復(fù)出現(xiàn)8次(見(jiàn)圖4D)，成簇發(fā)放(見(jiàn)圖4E)，這種波型被認(rèn)為是肌陣攣性癲癇最具特征的波形之一。這種癲癇腦電波發(fā)放時(shí)，動(dòng)物除了有頭面部發(fā)作表現(xiàn)(如眨眼、須動(dòng)、耳抖、咀嚼等)外，常伴有肢體肌肉陣攣性收縮。
腦電記錄的陣發(fā)性高波幅節(jié)律有兩種，先是頻率為8Hz，幅度為555.54±98.23μV的放電波(見(jiàn)圖6A左段)，緊隨其后的是頻率為3Hz，幅度為667.74±127.24μV的慢波節(jié)律(圖6A右段，圖6B)，發(fā)作持續(xù)時(shí)間為60.02±10.34s，伴隨高幅陣發(fā)性腦電活動(dòng)，動(dòng)物行為表現(xiàn)出全身強(qiáng)直痙攣、跳躍、奔跑、旋轉(zhuǎn)、跌倒等重度發(fā)作的癥狀.
在2h腦電波記錄過(guò)程中，動(dòng)物的腦電圖在各段連續(xù)癇樣放電之間主要呈現(xiàn)出分散的棘波，尖波或棘慢波，少部分在發(fā)作間期為基礎(chǔ)腦電變化。
2.3側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素(tutin)對(duì)大鼠行為的影響側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素(tutin)液后，大鼠先后出現(xiàn)癲癇發(fā)作。兩組大鼠10只在給藥后全部出現(xiàn)部分性驚厥發(fā)作，動(dòng)物表現(xiàn)為凝視、不動(dòng)或頭面部發(fā)作癥狀，如須動(dòng)，咀嚼，眨眼、耳抖、點(diǎn)頭等，伴有呼吸加快，耳朵血管擴(kuò)張(I型SE，見(jiàn)圖3A、圖3B)。大多數(shù)動(dòng)物(9只)除了上述癥狀外，還出現(xiàn)短時(shí)間的前肢陣孿、直立、前肢抬起不斷撲動(dòng)或全身肌肉陣攣性收縮(II型SE，見(jiàn)圖5A、圖5B)。6只達(dá)到IV級(jí)及以上發(fā)作程度(III型SE，見(jiàn)圖7A、圖7B)，表現(xiàn)為四肢抽搐，全身肌肉陣攣性收縮，原地打轉(zhuǎn)，跳躍、奔跑、翻滾倒地、強(qiáng)直陣攣；其中一只在給藥后，經(jīng)歷短暫的I型發(fā)作后，表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的強(qiáng)直陣攣，翻滾倒地，張口呼吸，每次發(fā)作持續(xù)10s到5min不等，在給藥28min后死亡。
2.4不同濃度羥基馬桑毒素(tutin)液對(duì)癲癇發(fā)生率、潛伏期及發(fā)作程度的影響經(jīng)側(cè)腦室注射人工腦脊液(ACSF)的5只大鼠無(wú)任何癲癇行為，癲癇發(fā)生率為零，無(wú)死亡。側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素(tutin)液的10只大鼠(25.0μg/μl，n＝5；12.5μg/μl，n＝5)均出現(xiàn)了程度不同的癲癇發(fā)作。注射濃度25.0μg/μl羥基馬桑毒素(tutin)液的5只大鼠，給藥5.10±0.66min后，先出現(xiàn)短暫的部分性癲癇發(fā)作(I型和II型SE)，隨后，1只表現(xiàn)為II型SE發(fā)作，該型發(fā)生率20％，4只達(dá)到3型重度發(fā)作程度(III型SE)，該型SE發(fā)生率為80％，癲癇發(fā)生率為100％。重度發(fā)作的大鼠中，1只經(jīng)過(guò)反復(fù)的四肢抽搐，全身肌肉陣攣，翻滾倒地等驚厥發(fā)作，于給藥28min后死亡，死亡率20％。注射濃度12.5μg/μl羥基馬桑毒素(tutin)液的5只大鼠，給藥后8.05±2.79min，動(dòng)物出現(xiàn)部分性癲癇發(fā)作(I型SE)，發(fā)作潛伏期明顯長(zhǎng)于高濃度組(P＜0.05)，該型癲癇狀態(tài)發(fā)生率為20％，2只為II型SE發(fā)作，發(fā)生率為40％，2只達(dá)到III型SE發(fā)作，重型癲癇發(fā)生率為40％，該組癲癇發(fā)生率100％，無(wú)死亡。兩組癲癇發(fā)生率、各型比例及死亡率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，如表1所示。
表1.側(cè)腦室微量注射不同濃度羥基馬桑毒素(tutin)液的結(jié)果比較

*P＜0.05compared with 25μg/μl concentration group從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，在側(cè)腦室注射羥基馬桑毒素(tutin)液后，10只大鼠全部表現(xiàn)SE部分性驚厥發(fā)作，6只為SE全身性驚厥發(fā)作；腦電圖記錄到棘波、多棘波群、3Hz棘慢綜合波，9～10Hz成簇發(fā)放的多棘慢綜合波和陣發(fā)性高波幅節(jié)律等癇樣腦電波，同時(shí)動(dòng)物伴有頭面部肌肉抽搐，四肢陣攣，全身強(qiáng)直痙攣，旋轉(zhuǎn)，跌倒等不同程度發(fā)作的癥狀。實(shí)驗(yàn)大鼠產(chǎn)生的癲癇行為和癲癇腦電波充分證明了羥基馬桑毒素(tutin)是一種致癇藥物，經(jīng)側(cè)腦室單次微量注射羥基馬桑毒素(tutin)液可制成一種新的大鼠急性癲癇狀態(tài)模型。
權(quán)利要求
1.羥基馬桑毒素在制備癲癇動(dòng)物模型所用致癇藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于致癇藥物用羥基馬桑毒素和人工腦脊液配制，羥基馬桑毒素的濃度為10.0～30.0μg/μl。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于動(dòng)物癲癇模型為成年大鼠模型時(shí)，若從大鼠側(cè)腦室給藥，給藥的劑量為5μl/只。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了羥基馬桑毒素(tutin)在制備癲癇動(dòng)物模型所用致癇藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明用人工腦脊液(ACSF)將羥基馬桑毒素(tutin)配制成濃度為10.0～30.0μg/μl的注射液，以成年大鼠制備動(dòng)物模型，從大鼠側(cè)腦室給藥，給藥的劑量為5μl/只，給藥后全部大鼠產(chǎn)生了典型的癲癇狀態(tài)行為發(fā)作，腦電圖記錄到棘波、多棘波群、棘慢綜合波、成簇發(fā)放的多棘慢綜合波以及陣發(fā)性高波幅節(jié)律等癇樣腦電波。因此，羥基馬桑毒素(tutin)可作為一種新的致癇化學(xué)工具藥，用于制備實(shí)驗(yàn)性癲癇動(dòng)物模型。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1861196SQ20061002069
公開(kāi)日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2006年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月12日
發(fā)明者周華, 鄭煜, 唐玉紅 申請(qǐng)人:四川大學(xué)