專利名稱：中藥卷柏的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥卷柏的新用途，即卷柏在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
卷柏為蕨類植物門卷柏科卷柏屬植物，歷代名家對(duì)其均有論述和研究，認(rèn)為其性辛平，有破血散瘀，活血止血，主治腹痛、閉經(jīng)、癥瘕淋結(jié)，以及吐血、便血、尿血等癥的功能?，F(xiàn)代藥理及臨床研究表明卷柏具有防癌治癌、治療婦科病、抗炎抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血壓、降血糖、增強(qiáng)人體免疫功能等作用。在治療閉經(jīng)、崩漏、引產(chǎn)、輸卵管阻塞、祛瘀調(diào)經(jīng)、祛瘀止血方面也有作用，它在逐瘀縮宮下胎、清熱除濕解毒、胎死不下等臨床難癥中發(fā)揮了重要的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供卷柏在制備雌激素藥物的新用途。
本發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的卷柏在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
卷柏的總提取物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
卷柏中的水部位和正丁醇部位在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明人已通過實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明藥物在雌激素中的新用途一、采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)合報(bào)告基因技術(shù)，對(duì)五種中藥進(jìn)行植物雌激素活性的實(shí)驗(yàn)1、藥物選用中藥卷柏(Selaginella tamariscina)、松針(Pinus Massoniana Lamb)、石膽草(Corallodiscus flabellata)、貫眾(Dryopteris sublaeta Ching et Hsu)、益母草(Leonurusheterophyllus Sweet)。各藥材分別用10倍量水煮提兩次，過濾，合并濾液并減壓濃縮，真空干燥即為各藥材水提物。
各藥材水提物用雙蒸水溶解，其劑量見表1。陽性藥為尼爾雌醇片，上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，制成蒸餾水懸濁液，按1.7mg·kg-1·d-1給藥。
表1五種中藥的動(dòng)物給藥量

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株及質(zhì)粒昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9-12g，購(gòu)于河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。HEK293細(xì)胞株和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)對(duì)照質(zhì)粒pβgal-Control、重組報(bào)告基因載體pERE-TAL-luc由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈(zèng)。重組人ERα(humanERα，hERα)表達(dá)載體pCXN2-hERα和重組人ERβ(humanERβ，hERβ)表達(dá)載體pCXN2-hERβ由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系Satoshi Inoue博士惠贈(zèng)。
3、主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基、無酚紅RPMI1640培養(yǎng)基及脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 Reagent購(gòu)自Gibco Invitrogen公司；熒光素酶熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；鄰-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所葉棋濃博士惠贈(zèng)；17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)購(gòu)自Sigma公司作為報(bào)告基因檢測(cè)法中的陽性對(duì)照；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；無雌激素胎牛血清為HyClong公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
4、所用主要儀器電子讀數(shù)分析天平(日本Shimadzu公司制造)；普通手術(shù)器械；二氧化碳培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus)；臺(tái)式高速低溫冷凍離心機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；UV-7504PC型紫外-可見分光光度計(jì)(福州健洋科技儀器有限公司)；1250熒光檢測(cè)儀(芬蘭Wallac公司)。
5、實(shí)驗(yàn)方法小鼠子宮增重法將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組。給藥持續(xù)7天?？瞻讓?duì)照組每日蒸餾水0.3ml·10g-1灌胃；陽性對(duì)照組每日尼爾雌醇懸濁液0.3ml·10g-1灌胃；中藥各組每日0.3ml·10g-1灌胃。最后一次給藥后24h，脫頸處死小鼠，立即切取子宮稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮濕重·(體重)-1·100％)。結(jié)果與空白組相比，計(jì)算P值考察有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6、ERE調(diào)控的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前24h將HEK293細(xì)胞用含10％無雌激素的FBS、無慶大霉素和酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基接種于12孔板，細(xì)胞密度為8×104cells·ml-1·孔-1。每塊板均設(shè)置不同濃度的中藥孔、同時(shí)設(shè)置陽性藥對(duì)照孔、溶媒對(duì)照孔。轉(zhuǎn)染當(dāng)天用消毒PBS漂洗細(xì)胞一次，加入800μl含10％無雌激素的FBS、無慶大霉素和酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基，用pCXN2-hERα或pCXN2-hERβ、pERE-TAL-luc和pβgal-Control共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞株，6h后用E2(4×10-6mol·1-1)、中藥總提物(飽和溶液)干預(yù)，24h后，收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞裂解液，分別檢測(cè)熒光素酶和βgal的活性，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化熒光素酶活性，從而篩選出對(duì)ERα或ERβ有作用的中藥。
7、統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示，大劑量和小劑量卷柏組小鼠子宮系數(shù)與空白對(duì)照組相比均有特別顯著性差異(P＜0.01)。其余各組子宮系數(shù)與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2，圖1。
表2 卷柏、益母草、貫眾、石膽草、松針對(duì)性未成熟小鼠子宮濕重的影響

注與空白對(duì)照組比較，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較，▲表示P＜0.019、卷柏對(duì)報(bào)告基因載體pTAL-ERE-luc瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用結(jié)果顯示，不論由ERα或ERβ介導(dǎo)，E2孔標(biāo)準(zhǔn)化后的熒光素酶活性都高于溶劑對(duì)照孔(P＜0.01)，卷柏孔標(biāo)準(zhǔn)化后的熒光素酶活性也都高于溶劑對(duì)照孔(P＜0.01)，但仍低于E2孔(P＜0.01)。見表3，圖2。
表3 卷柏對(duì)報(bào)告基因載體pTAL-ERE-luc瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用(n＝10)

注與空白對(duì)照組比較，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較，▲表示P＜0.01二、采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明卷柏中所篩選出的水部位和正丁醇部位的雌激素作用選用從卷柏中篩選的乙醚部位、醋酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位，再采用小鼠子宮增重法實(shí)驗(yàn)。
結(jié)果顯示，大劑量和小劑量卷柏水部位組小鼠子宮系數(shù)與空白對(duì)照組相比均有特別顯著性差異(P＜0.01)，大劑量和小劑量卷柏正丁醇部位組小鼠子宮系數(shù)與空白對(duì)照組相比也均有顯著性差異(P＜0.05)，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對(duì)照組(P＜0.01)。其余各組與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4，圖3。
表4 卷柏不同部位對(duì)性未成熟小鼠子宮濕重的影響

注與空白對(duì)照組比較，☆表示P＜0.05；★表示P＜0.01；與陽性對(duì)照組比較，▲表示P＜0.01
三、結(jié)論1、子宮增重實(shí)驗(yàn)是是最早建立的檢測(cè)雌激素活性的經(jīng)典方法，在評(píng)價(jià)物質(zhì)的雌激素活性時(shí)，子宮實(shí)驗(yàn)考慮了物質(zhì)的吸收、代謝、與血漿蛋白結(jié)合以及藥代動(dòng)力學(xué)等多方面因素，直接反映受試藥物經(jīng)體內(nèi)代謝后的總體生物學(xué)效應(yīng)，通過上述實(shí)驗(yàn)，證明卷柏具有植物雌激素作用，從卷柏中篩選出的水部位和正丁醇部位為有效部位。
2、報(bào)告基因技術(shù)是根據(jù)體內(nèi)的雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑構(gòu)建的報(bào)告基因載體，細(xì)胞水平的藥物篩選模型除具備整體動(dòng)物所具有的活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能上的復(fù)雜性外，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)上比整體動(dòng)物更易于操作、易于推斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特異性強(qiáng)。在卷柏對(duì)報(bào)告基因載體pTAL-ERE-luc瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用實(shí)驗(yàn)研究中，能大致推斷出卷柏的活性成分與何種雌激素受體結(jié)合，并作用于雌激素應(yīng)答元件(ERE)來調(diào)控基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示卷柏與ERβ的親和力比與ERα的親和力大，說明卷柏激活基因轉(zhuǎn)錄主要是通過ERβ介導(dǎo)的；證明了卷柏的雌激素作用。
另外還對(duì)四組患有絕經(jīng)期綜合癥的病人進(jìn)行了臨床觀察每組患者30人；這30人均有潮熱、頭暈、耳鳴、夜里盜汗癥狀，其中還有16人同時(shí)還患有關(guān)節(jié)疼痛癥狀。
第一組患者服用卷柏總提取液；服用量和方法為取卷柏15重量份，加150重量份的水，煮沸20-30分鐘，過濾；在藥渣中再加入150重量份的水，煮沸15分鐘，過濾，合并濾液并在真空無菌的情況下保存，每次服合并濾液200毫升，早晚各一次。連續(xù)服用12周后有18人的潮熱癥狀和夜晚盜汗癥狀消失，耳鳴及頭暈癥狀減少，有8人關(guān)節(jié)疼痛現(xiàn)象減少。
第二組患者服用從卷柏中提取的水部位，每次服用量相當(dāng)于從10克新鮮卷柏中提取的量，每天早晚各服用一次，連續(xù)服用12周后有23人的潮熱癥狀和夜晚盜汗癥狀消失，耳鳴及頭暈癥狀減少，有12人關(guān)節(jié)疼痛現(xiàn)象減少。
第三組患者服用從卷柏中提取的正丁醇部位，每次服用量相當(dāng)于從10克新鮮卷柏中提取的量，每天早晚各服用一次，連續(xù)服用12周后有20人的潮熱癥狀和夜晚盜汗癥狀消失，耳鳴及頭暈癥狀減少，有11人關(guān)節(jié)疼痛現(xiàn)象減少。
第四組患者服用由卷柏15重量份、知母12重量份、茯苓30重量份、菊花10重量份、山藥30重量份、白芍12重量份、山萸肉30重量份、節(jié)菖蒲12重量份、合歡12重量份、炒棗仁12重量份、川斷15重量份，加入總藥重量6倍的水，煮沸30分鐘，過濾；藥渣中再加入總藥重量4倍的煮沸20分鐘，過濾，合并濾液，每次服上述合并濾液250毫升，每天早晚各服用一次，連續(xù)服用12周后有20人的潮熱癥狀和夜晚盜汗癥狀消失，耳鳴及頭暈癥狀減少，有13人關(guān)節(jié)疼痛現(xiàn)象減少。
從對(duì)上述患者的臨床觀察中，也證明了卷柏的雌激素作用。


圖1為卷柏、益母草、貫眾、石膽草、松針對(duì)性未成熟小鼠子宮濕重的影響的示圖；圖2為卷柏對(duì)報(bào)告基因載體pTAL-ERE-luc瞬時(shí)表達(dá)的誘導(dǎo)作用的示圖；圖3為卷柏不同部位對(duì)性未成熟小鼠子宮濕重的影響的示圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取卷柏15重量份，加150重量份的水，煮沸20-30分鐘，過濾；在藥渣中再加入150重量份的水，煮沸15分鐘，過濾，合并濾液為卷柏的總提取物，把其在真空無菌的情況下保存，每次服合并濾液200毫升。
實(shí)施例2稱取由卷柏15重量份、知母12重量份、茯苓30重量份、菊花10重量份、山藥30重量份、白芍12重量份、山萸肉30重量份、節(jié)菖蒲12重量份、合歡12重量份、炒棗仁12重量份、川斷15重量份，加入總藥重量6倍的水，煮沸30分鐘，過濾；藥渣中再加入總藥重量4倍量的水，煮沸20分鐘，過濾，合并濾液并將其在真空無菌的情況下保存，每次服合并濾液200毫升。
實(shí)施例3稱取卷柏50重量份，加入藥物重10倍量的水，煮沸30分鐘，過濾，藥渣中再加入藥材重8倍量的水，煮沸25分鐘，過濾，合并濾液，在溫度為10-30℃，壓力為0.5～0.7MPa的條件下濃縮，得濃縮液備用。
實(shí)施例4稱取新鮮卷柏20克，用65-70％的含水丙酮組織破碎提取后，置200克該含水丙酮液中浸泡三天，過濾，取濾液，在溫度為45℃，壓力為0.6MPa條件下濃縮至膏狀，在稠膏中加適量水，依次用乙醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水四個(gè)部位。
把正丁醇部位或水部位再進(jìn)行Diaion HP-20、ToyoPearl HW-40、MCI Gel CHP-20、Sephadex LH-20、Silica Gel等柱層析及制備薄層層析，可分離得單體化合物。
以上所得水部位或正丁醇部位可供制藥用或直接服用，每個(gè)部位分兩次服用。
本實(shí)施例中所得的水部位及正丁醇部位也可與其它藥物配伍使用，用于制作增加雌激素的藥物。
實(shí)施例5取卷柏100重量份粉碎，過120-140目篩，過篩后的粉末加入煉蜜80-90重量份，制成每粒3重量份的蜜丸，每次服用2-3粒，每日3次。
本實(shí)施例是卷柏直接用作雌激素藥物。
實(shí)施例6取卷柏35重量份，加入藥材重10倍量的水，煮沸30分鐘，過濾，藥渣內(nèi)再加入藥材重8倍量的水，煮沸25分鐘，過濾，合并濾液，在壓力為0.75～0.95MPa，溫度為35-60℃的條件下濃縮，得濃縮液備用；另取卷柏65重量份粉碎，過120-140目篩，過篩后的粉末與上述濃縮液泛制成丸，每次服用3-4重量份，每日2次。
權(quán)利要求
1.卷柏在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是卷柏的總提取物在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是卷柏中的水部位和正丁醇部位在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及卷柏的新用途，即卷柏在制備雌激素藥物中的應(yīng)用；同時(shí)還涉及卷柏的總提取液及其中的水部位和正丁醇部位在制備雌激素藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P5/00GK101028311SQ20061001749
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2006年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月3日
發(fā)明者鄭曉珂, 馮衛(wèi)生, 王繼峰, 牛建昭 申請(qǐng)人:河南中醫(yī)學(xué)院