專利名稱：人禽流感特異系列靶向藥物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人禽流感特異系列靶向藥物及其制備方法，尤其是提供了以人禽流感病毒中和性單鏈抗體或單鏈雙特異抗體為載體的系列靶向藥物及其制備方法，用于人禽流感的緊急預防與救治，屬于重要人畜共患病防治藥物制備技術領域。
背景技術：
據(jù)世界衛(wèi)生組織公布資料，截至2006年8月23日，全球已有241人確診感染了H5N1亞型HPAIV，造成141人死亡，病死率高達58.5％，如此高的病死率說明目前尚缺少有效的救治藥物，一旦這種病毒發(fā)生變異獲得了人間傳播的能力，就有可能引發(fā)一場流感的人間大流行。因此，必須加緊進行疫苗與藥物的研究與儲備，作好流感人間大流行的應對準備。
中和性抗流感病毒抗體具有中和病毒的作用，給感染初期人群和高危人群進行抗體注射可使機體快速獲得保護，從而可達到緊急預防與治療目的，但特異抗體只能中和體內(nèi)游離病毒，對于已進入細胞內(nèi)的病毒則無辦法，因為病毒的復制必須在活的宿主細胞內(nèi)進行，因此，如果能夠在中和游離病毒的基礎上再破壞已經(jīng)被禽流感病毒感染了的宿主細胞，則可控制流感病情的發(fā)展。
研究發(fā)現(xiàn)流感病毒感染會引起患者肺部組織內(nèi)細胞因子大量表達，造成嚴重的肺部炎癥，這些細胞因子包括IP-10、β-IFN、IL-6、IL-8、ICAM-1、HMGB1及MIF等。在致炎因子引發(fā)肺部炎癥的過程中，細胞間粘附分子-1(ICAM-1)起到了極為重要的介導作用，其介導的炎癥細胞與內(nèi)皮細胞間的粘附是許多炎癥性疾病的重要病理生理基礎。巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)是早期發(fā)現(xiàn)的一促炎癥細胞因子，其可直接或間接促進促炎癥分子的生成和表達，包括TNF、IL-1、IL-6、IL-8等；高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種強大的致炎細胞因子，研究表明其同樣可刺激TNF、IL-1、IL-6、IL-8的釋放，是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，與急性肺炎的發(fā)病機理關系密切。拮抗上述致炎細胞因子的作用，就會降低炎癥的發(fā)生和發(fā)展，達到救治的目的。當前研究已證明使用致炎因子單克隆抗體可降低炎癥反應。但抗致炎因子的單克隆抗體使用后在全身內(nèi)分布，無法在感染最嚴重的肺組織內(nèi)聚集，從而降低了其療效。
近十幾年來，國內(nèi)外學者紛紛將單克隆抗體、基因工程抗體、細胞因子等作為載體，與化學藥物、毒素、同位素及酶類等相連接，制成靶向制劑，將其帶至病灶部位，特異性的殺傷腫瘤細胞，這種治療稱為導向治療，有關的藥物稱為“生物導彈”或“免疫靶向藥物”。綠膿桿菌外毒素A(PE)對細胞具有殺傷作用，已廣泛用于腫瘤治療，但目前尚沒有以禽流感病毒中和性抗體為載體的靶向藥物研究報道。
流感病毒復制過程中核酸的復制和病毒結構蛋白的合成是基本同步的，其中病毒囊膜表面蛋白----血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)在翻譯合成后通過高爾基體到達宿主細胞表面并嵌于細胞膜上，在病毒在出芽時隨宿主細胞膜包裹在核衣殼上。以特異識別感染細胞膜表面上的HA/NA的單鏈抗體或單鏈雙特異抗體為靶向載體、以具有細胞殺傷作用的毒素或致炎因子的單鏈抗體為彈頭而研制的靶向藥物，可在病毒感染早期中和游離病毒、殺傷感染細胞、降低炎癥反應，從而達到緊急預防與治療的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種人禽流感特異系列靶向藥物，是以人禽流感病毒中和性單鏈抗體或單鏈雙特異抗體為載體的系列靶向藥物，可以中和游離病毒，并通過PE的細胞毒性作用殺傷病毒感染細胞。
本發(fā)明還公開了上述藥物的制備方法，并適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明所述的靶向藥物由兩個部分組成，其中，共同的部分是人禽流感病毒HA/NA的中和性單鏈抗體或者同時具有HA和NA中和活性的單鏈雙特異抗體，作為靶向載體，不同的部分是分別帶上各種致炎因子的單鏈抗體，將其作為彈頭。
所述的單鏈抗體選自綠膿桿菌外毒素PE40或MIF、HMGB1、ICAM-I等。
本發(fā)明的技術解決方案如下用單克隆抗體制備技術篩選抗人禽流感病毒HA和NA及致炎因子的雜交瘤細胞株；分別提取不同雜交瘤細胞RNA，用RT-PCR方法擴增出每種單抗的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因；通過重疊延伸拼接法(SOE-PCR)將HA或NA單抗的VH、VL基因以一段15個氨基酸的短肽相連，構建人禽流感病毒HA/NA的單鏈抗體(anti HA/NA ScFv)基因或HA、NA的單鏈雙特異抗體基因(anti HA-NA BsAb)，以相同的方法構建致炎因子的單鏈抗體(anti MIF ScFv、anti HMGB1 ScFv、anti ICAM-I ScFv)基因；將人禽流感病毒的單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因通過酶切、連接方法分別與致炎因子的單鏈抗體基因或綠膿桿菌外毒素PE40基因連接，構建原核表達載體，轉化Ecoli.BL21工程菌，經(jīng)發(fā)酵、提取及純化后獲得系列靶向拮抗劑。
具體制備方法包括以下步驟1.HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I等致炎因子抗體可變區(qū)基因的克隆①采用單克隆抗體制備技術制備HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I單抗；②以RT-PCR方法克隆HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I抗體可變區(qū)基因；2.單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因的構建①將HA或NA的抗體可變區(qū)基因通過SOE-PCR法構建成HA/NA單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因；②將MIF、HMGB1、ICAM-I的抗體可變區(qū)基因通過SOE-PCR法構建MIF、HMGB1、ICAM-I等致炎因子單鏈抗體基因；3.系列靶向藥物原核表達載體的構建與靶向藥物的制備①通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與MIF單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建MIF靶向拮抗劑原核表達載體；②通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與HMGB1單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建HMGB1靶向拮抗劑原核表達載體；③通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與ICAM-I單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建ICAM-I靶向拮抗劑原核表達載體；④通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與含有PE40的PET-28質粒相連，構建重組PE靶向藥物原核表達載體；⑤重組質粒轉化、表達，純化、復性，應用。
本發(fā)明的優(yōu)點在于以抗人禽流感病毒親和性單鏈抗體或單鏈雙特異抗體為載體，可特異引導毒素或致炎因子抗體到達靶器官或組織，高效發(fā)揮細胞殺傷作用與致炎因子拮抗作用。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領域普通技術人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的待批權利要求范圍之內(nèi)。
實施例1anti HA/NA ScFv-PE40抗體融合蛋白的制備1.禽流感病毒HA和NA抗體可變區(qū)基因的克隆①BALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA/NA抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA或NA呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA和NA單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA和NA抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)。
2.HA/NA單鏈抗體基因和HA-NA單鏈雙特異抗體基因的構建將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得HA或NA的單鏈抗體基因anti HA/NA ScFv，其中反向引物含有XhoI酶切位點，正向引物含有EcoR I位點。
3.anti HA/NA ScFv-PE40原核表達載體的構建用XhoI和EcoR I酶切anti HA/NA ScFv和裝有PE毒素基因的原核表達載體pET-28，用T4連接酶連接構建單鏈抗體原核表達載體。
4.anti HA/NA ScFv-PE40抗體融合蛋白的制備將構建的表達載體轉化Ecoli.JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得anti HA/NA ScFv-PE40抗體融合蛋白。
下面實驗進一步證明了anti HA/NA ScFv-PE40抗體融合蛋白在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射抗體融合蛋白，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有3只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為102.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表1)。
表1 anti HA/NA ScFv-PE40或anti HA-NA BsAb--PE40治療實驗結果

實施例2anti HA-NA BsAb--PE40抗體融合蛋白的制備1.禽流感病毒HA和NA抗體可變區(qū)基因的克隆
①BALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA呈特異陽性的雜交瘤細胞，分別提取RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA和NA單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF擴增HA和NA抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)2.HA-NA單鏈雙特異抗體基因的構建將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得HA和NA的單鏈雙特異抗體基因anti HA-NA BsAb，其中反向引物含有XhoI酶切位點，正向引物含有EcoR I位點。
3.anti HA-NA BsAb--PE40原核表達載體的構建用XhoI和EcoR I酶切anti HA-NA BsAb--PE40和裝有PE毒素基因的原核表達載體pET-28，用T4連接酶連接構建單鏈抗體原核表達載體。
4.anti HA-NA BsAb--PE40抗體融合蛋白的制備將構建的表達載體轉化Ecoli.JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化Ecoli.BL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得anti HA-NA ScFv-PE40抗體融合蛋白。
下面實驗進一步證明了anti HA-NA BsAb--PE40抗體融合蛋白在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射抗體融合蛋白，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有3只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為102.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表2)。
表2 anti HA/NA ScFv-PE40或anti HA-NA BsAb--PE40治療實驗結果

實施例3以人禽流感病毒HA/NA單鏈抗體為載體的MIF靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及MIF抗體可變區(qū)基因的克?、貰ALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA及MIF經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及MIF抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及MIF呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及MIF單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及MIF抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)2.單鏈抗體基因的構建①HA或NA單鏈抗體基因的構建挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
②MIF單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對MIF呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備分別通過酶切連接的方法將抗HA或NA單鏈抗體基因與MIF單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得MIF靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了MIF靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射MIF靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表3)。
表3 MIF靶向拮抗劑治療實驗結果

實施例4以人禽流感病毒HA-NA單鏈雙特異抗體為載體的MIF靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及MIF抗體可變區(qū)基因的克隆①BALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA及MIF經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及MIF抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及MIF呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及MIF單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及MIF抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)2.單鏈抗體基因的構建①HA-NA單鏈雙特異抗體基因的構建挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈雙特異抗體基因。
②MIF單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對MIF呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備將HA-NA單鏈雙特異抗體基因與MIF單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coli BL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得MIF靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了MIF靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射MIF靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表4)。
表4 MIF靶向拮抗劑治療實驗結果

實施例5以人禽流感病毒HA/NA單鏈/抗體為載體的HMGB1靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及HMGB1抗體可變區(qū)基因的克?、貰ALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA及HMGB1經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及HMGB1抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及HMGB1單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及HMGB1抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)。
2.單鏈抗體基因的構建①HA或NA單鏈抗體基因構建及克隆挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
②HMGB1單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備分別將HA或NA單鏈抗體基因與HMGB1單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得HMGB1靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了HMGB1靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射HMGB1靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表5)。
表5 HMGB1靶向拮抗劑治療實驗結果

實施例6以人禽流感病毒HA-NA單鏈雙特異抗體為載體的HMGB1靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及HMGB1抗體可變區(qū)基因的克?、貰ALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA及HMGB1經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及HMGB1抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及HMGB1單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及HMGB1抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)。
2.單鏈抗體基因的構建①HA-NA單鏈雙特異抗體基因的構建及克隆挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈雙特異抗體基因。
②HMGB1單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備將HA-NA單鏈雙特異抗體基因與HMGB1單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得抗HMGB1靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了HMGB1靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射HMGB1靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表6)。
表6 HMGB1靶向拮抗劑治療實驗結果

實施例7以人禽流感病毒HA/NA單鏈抗體為載體的ICAM-1靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及ICAM-1抗體可變區(qū)基因的克?、貰ALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選。
分別以制備的HA、NA及ICAM-1經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及ICAM-1抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及ICAM-1呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及ICAM-1單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及ICAM-1抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)。
2.單鏈抗體基因的構建①HA或NA單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
②HMGB1單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備分別將HA或NA單鏈抗體基因與ICAM-1單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得ICAM-1靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了ICAM-1靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射ICAM-1靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表7)。
表7 ICAM-1靶向拮抗劑治療實驗結果

實施例8以人禽流感病毒HA-NA單鏈雙特異抗體為載體的ICAM-1靶向拮抗劑的制備1.HA、NA及ICAM-1抗體可變區(qū)基因的克?、貰ALB/c小鼠的免疫與特異性單抗雜交瘤細胞株的篩選分別以制備的HA、NA及ICAM-1經(jīng)背部皮下免疫BALB/c小鼠，血凝抑制抗體效價大于27或ELISA結果呈陽性時無菌取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞進行融合，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，Western法檢測單抗特異性。
②HA、NA、及ICAM-1抗體可變區(qū)基因的克隆挑選對HA、NA及ICAM-1呈特異陽性的雜交瘤細胞，提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，分別以HA、NA及ICAM-1單抗的cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增HA、NA及ICAM-1抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)。
2.單鏈抗體基因的構建①HA-NA單鏈雙特異抗體基因的構建及克隆挑選對HA或NA抗原呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈雙特異抗體基因。
②HMGB1單鏈抗體基因的構建及克隆挑選對HMGB1呈特異陽性的雜交瘤細胞提取其RNA，以隨機六聚體引物完成RT反應，獲得cDNA，以cDNA為模板，以輕鏈可變區(qū)引物LB、LF和重鏈可變區(qū)引物HB、HF分別擴增抗體可變區(qū)輕鏈(VL)、重鏈(VH)基因(其中LF 5’端和HB 5’端含有連接肽序列)，將獲得的VL、VH基因等量混合作為模板，以單鏈抗體正向引物和反向引物對其進行SOE-PCR擴增，獲得單鏈抗體基因。
3.靶向拮抗劑的制備將HA-NA單鏈雙特異抗體基因與ICAM-1單鏈抗體基因重組，構建原核表達載體，將構建的重組質粒轉化E.coli JM109感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16h，用質粒(小量)抽提試劑盒提取質粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確后，轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于卡那抗性平板37℃過夜培養(yǎng)后，挑取孤立菌落接種于含有卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，將菌液按1％加入液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4h后，按1mM加入IPTG誘導6h。菌體發(fā)酵，發(fā)酵后用IEX和HIC層析方法純化蛋白，經(jīng)復性后即獲得ICAM-l靶向拮抗劑。
下面實驗進一步證明了ICAM-l靶向拮抗劑在防治禽流感上的積極效果方法將20只KM小鼠隨機分成兩組，每組10只，一組為病毒對照，一組為治療組。乙醚麻醉后以滴鼻方式攻擊禽流感病毒，每只小鼠3-5個LD50。治療組在攻毒48小時后靜脈注射ICAM-1靶向拮抗劑，30μg/只.d，病毒對照組靜脈注射注射用水，連續(xù)給藥8天。每日觀察小鼠發(fā)病死亡情況，在攻毒后第6天時每組各捕殺3只小鼠，取肺臟觀察病理變化情況，并測定肺臟病毒含量。攻毒后第21天時記錄小鼠死亡數(shù)量，統(tǒng)計發(fā)病率、病死率、病程等指標。
結果病毒對照組10只小鼠在攻毒第3天后全部發(fā)病，臨床上主要表現(xiàn)為體重下降、精神沉郁，在第6-7天時全部死亡，死亡小鼠肺臟呈出血、水腫及壞死灶，經(jīng)細胞病變法檢測肺臟病毒含量為106.5/0.1ml，而治療組10只發(fā)病鼠中只有4只死亡，剖檢后發(fā)現(xiàn)部分小鼠肺臟呈出血水腫癥狀，經(jīng)檢測肺臟病毒含量為103.5/0.1ml，并且病程較病毒對照組延長6天(見表8)。
表8 ICAM-1靶向拮抗劑治療實驗結果

權利要求
1.一種人禽流感特異系列靶向藥物，靶向藥物由兩個部分組成，其中，共同的部分是人禽流感病毒HA/NA的中和性單鏈抗體或者同時具有HA和NA中和活性的單鏈雙特異抗體，作為靶向載體，不同的部分是分別帶上各種致炎因子的單鏈抗體，將其作為彈頭；所述的單鏈抗體選自綠膿桿菌外毒素PE40或MIF、HMGB1、ICAM-I。
2.根據(jù)權利要求1所述的系列靶向藥物制備方法，其特征在于包括以下步驟1)HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I致炎因子抗體可變區(qū)基因的克?、俨捎脝慰寺】贵w制備技術制備HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I單抗；②以RT-PCR方法克隆HA、NA和MIF、HMGB1、ICAM-I抗體可變區(qū)基因；2)單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因的構建①將HA或NA的抗體可變區(qū)基因通過SOE-PCR法構建成HA/NA單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因；②將MIF、HMGB1、ICAM-I的抗體可變區(qū)基因通過SOE-PCR法構建MIF、HMGB1、ICAM-I致炎因子單鏈抗體基因；3)系列靶向藥物原核表達載體的構建與靶向藥物的制備①通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與MIF單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建MIF靶向拮抗劑原核表達載體；②通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與HMGB1單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建HMGB1靶向拮抗劑原核表達載體；③通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與ICAM-I單鏈抗體基因相連，裝入PET-28中，構建ICAM-I靶向拮抗劑原核表達載體；④通過酶切、連接的方法將HA/NA單鏈抗體基因或HA-NA單鏈雙特異抗體基因與含有PE40的PET-28質粒相連，構建重組PE靶向藥物原核表達載體；⑤重組質粒轉化、表達，純化、復性，應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及人禽流感特異系列靶向藥物及其制備方法，用單克隆抗體篩選抗人禽流感病毒及致炎因子的雜交瘤細胞株；分別提取不同雜交瘤細胞，用RT－PCR擴增出每種單抗的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因；通過SOE－PCR將單抗的VH、VL基因以一段15個氨基酸的短肽相連，構建人禽流感病毒HA/NA的單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因及致炎因子的單鏈抗體基因；將人禽流感病毒的單鏈抗體基因或單鏈雙特異抗體基因通過酶切、連接方法分別與致炎因子的單鏈抗體基因或綠膿桿菌外毒素PE40基因連接，構建原核表達載體，轉化Ecoli.BL21工程菌，經(jīng)發(fā)酵、提取及純化后獲得系列靶向拮抗劑，本藥物用于人禽流感的緊急預防與救治。
文檔編號A61P31/16GK1927396SQ200610017179
公開日2007年3月14日 申請日期2006年9月15日 優(yōu)先權日2006年9月15日
發(fā)明者夏咸柱, 朱平, 岳玉環(huán), 王承宇, 高玉偉, 侯曉強, 馮娜, 楊松濤, 黃耕, 王鐵成 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所