專利名稱：一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
動物血，主要是豬、牛血是屠宰行業(yè)中副產(chǎn)物中利用最不理想的、量又非常大的部分，除了豬血有一部分可以用于食用外，其余絕大部分都不能進行有價值的深加工。國內(nèi)外研究人員一直都很重視動物血液的綜合利用，不過一直沒有重大進展。
生物小分子利用方面，人們主要把注意力放在氨基酸的提取中。以血蛋白為原料制備氨基酸，通常有兩種辦法酶解與酸解。1968年，Mullinger等人利用木瓜酶水解豬血，氨基酸得率不到10％，氨基酸濃度僅為1mg/ml。1994年，鄭遠旗等人采用了硫酸氨法提純氨基酸，使氨基酸收率達到了55.3％，但由于水解條件激烈，未知產(chǎn)物較多，一些氨基酸完全被破壞，產(chǎn)生黑色素，還有些氨基酸遭到部分破壞，因此無法進行實際應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，以解決目前對動物血利用率低，且用蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)品濃度小，成本高的問題。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是包括下列步驟一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5～1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過濾，取過濾液；二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2～0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20～30分鐘；然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1～0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39～45度，放置20～35小時，然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.5～5.5，將液體過濾，得到濾液。
本發(fā)明從動物血液中提純高濃度氨基酸及免疫活性肽工藝是一個利用豬牛血為原料，通過生物酶解，進而分離純化得到的高濃度氨基酸，高免疫活性多肽的生物化學法制備工藝，氨基酸濃度在不經(jīng)濃縮的條件下，是80～90mg/ml。該發(fā)明的主要特點是能將大型養(yǎng)殖場，屠宰場，肉類加工廠所產(chǎn)生的幾乎未被利用的下腳料——動物血有效地利用起來，通過一系列生物化學方法，將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦吒郊又档纳锂a(chǎn)品，即高濃度氨基酸及免疫活性肽。
本發(fā)明利用本工藝提純的氨基酸及免疫增強肽有著蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品濃度高，生產(chǎn)成本低廉等諸多優(yōu)勢，其中，血蛋白轉(zhuǎn)化率高于目前工藝水平的1倍以上，氨基酸濃度則超過目前工藝水平所能達到濃度的4倍，以成本來說，遠遠低于目前氨基酸生產(chǎn)的成本、且免疫活性好。產(chǎn)率血液的氨基酸轉(zhuǎn)化率是50％，即1Kg血液可以得到80g氨基酸，多肽可得到25g。
下面通過實驗例證明本發(fā)明的免疫活性。
體內(nèi)T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗簡介機體內(nèi)或機體外培養(yǎng)的淋巴細胞在受到抗原，促有絲分裂或非特異的刺激后，可導致細胞活化，產(chǎn)生細胞因子合成，細胞因子受體表達，細胞分化及細胞增殖的細胞行為的變化。細胞增殖反應雖不能反映細胞的全部功能，但亦可代表細胞活化的事實。而且細胞增殖反應的檢測手段，具有可靠性高，良好的重復性和簡便性等特點，故可通過細胞增殖反應的測定來判斷免疫細胞的功能一直得到廣泛的應用。當淋巴細胞在有絲分裂原或特意抗原的作用下，細胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成增加，同時細胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為原始母細胞，是淋巴細胞的一種“返幼”現(xiàn)象，而且用此試驗可測定淋巴細胞的應答功能，稱為淋巴細胞的轉(zhuǎn)化試驗，(Lyphocyte transformation test)簡稱淋轉(zhuǎn)試驗。
具體實驗步驟1)免疫小鼠將40只昆明小鼠按給藥方式和給藥劑量的不同，隨機分為40.0mg/Kg.d，20.0mg/Kg.d，10.0mg/Kg.d，5.0mg/Kg.d四種給藥劑量以及生理鹽水作為對照的給注射給藥組，同時將40.0mg/Kg.d，20.0mg/Kg.d，10.0mg/Kg.d，5.0mg/Kg.d四種給藥劑量以及生理鹽水作為對照的口服組作為口服給藥組，共10組，每組為4只小鼠。從第一天開始，按上述給藥劑量和給藥方式開始給藥，連續(xù)給藥10天。并在第一天和第八天，每只小鼠用0.5ml，5％的兔紅細胞進行免疫，最后一次給藥的24小時后，對小鼠取血然后處死。
2)動物取血并制成脾細胞懸液取脾細胞懸液0.1ml，對等量0.4ml臺酚蘭染液，混勻，吸取50μL，加入細胞計數(shù)載玻片內(nèi)，使懸液充滿計數(shù)室，按白細胞計數(shù)方法計數(shù)，計數(shù)后以培養(yǎng)液調(diào)節(jié)脾細胞懸液濃度，使各小鼠脾細胞懸液的濃度均為1×10,000,000cells/ml備用。
細胞濃度(細胞數(shù)/ml原液)＝(4大格細胞總數(shù)/4)×10,000稀釋倍數(shù)3)T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗取已配好的各實驗小鼠的脾細胞懸液(1×10,000,000cells/ml)，用常規(guī)方法培養(yǎng)后待顆粒完全溶解，吹散打勻，最后在酶標儀上讀出570nm下每孔OD結(jié)果。
結(jié)果判定＝ConA刺激孔吸光度均值/對照孔吸光度均值4)體內(nèi)T淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果注射對照組為1.091，給藥5mg/Kg，結(jié)果是1.538，高出對照50％以上。
口服對照組為1.281，給藥5mg/Kg，結(jié)果是1.741，高出對照36％以上。
具體實施例方式
實施例1一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過濾，取過濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20分鐘。然后降溫至25度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39度，放置20小時。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.5，將液體過濾，得到濾液。
實施例2一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.8L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過濾，取過濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.5倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.5，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)25分鐘。然后降溫至30度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.3倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在40度，放置25小時。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至4.5，將液體過濾，得到濾液。
實施例3一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過濾，取過濾液。
二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)30分鐘。然后降溫至45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在45度，放置35小時。然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至5.5，將液體過濾，得到濾液。
權(quán)利要求
1.一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，包括下列步驟一、粗酶液的制備取新鮮豬胰臟1Kg，然后將其手工去脂肪組織，再使用經(jīng)過消毒的刀具將其切碎，放置在干凈，干燥的容器內(nèi)，加入0.5～1L的蒸餾水，用膠體磨研磨后勻漿，再向勻漿內(nèi)加入少量NaOH，調(diào)節(jié)pH值至7.5，再將該勻漿置于室溫環(huán)境存放8小時，然后將勻漿用干凈的綢布積壓過濾，取過濾液；二、取新鮮的豬血1份，置于干燥的容器內(nèi)，加入0.2～0.8倍體積的蒸餾水，攪拌至均勻，再加入NaOH，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，保持沸騰狀態(tài)20～30分鐘，然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入步驟一所得到的0.1～0.5倍體積的粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，調(diào)節(jié)溫度在39～45度，放置20～35小時，然后取出，加熱煮沸10分鐘，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH值至3.5～5.5，將液體過濾，得到濾液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備高濃度氨基酸及免疫活性肽的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括粗酶液的制備取新鮮豬胰臟，加水，研磨，勻漿，調(diào)節(jié)pH值，過濾，取過濾液；取新鮮的豬血，加入水，調(diào)pH至7.9～8.2，將液體加熱至100度，然后降溫至25～45度，向液體內(nèi)加入粗酶液，混合均勻，再將其放入恒溫箱，再加入適量鹽酸，調(diào)節(jié)pH至3.5～5.5，將液體過濾，得到濾液。本發(fā)明利用本工藝提純的氨基酸及免疫增強肽有著蛋白酶解蛋白轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)品濃度高，生產(chǎn)成本低廉等諸多優(yōu)勢，且免疫活性好。
文檔編號A61K35/14GK1876821SQ20061001677
公開日2006年12月13日 申請日期2006年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月19日
發(fā)明者佟振宇 申請人:佟振宇