專利名稱：兩親性殼聚糖衍生物的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于源于天然且可降解的殼聚糖兩親性殼聚糖衍生物的制備方法，以及以該衍生物制備成的水凝膠在內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)和體表創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
各種外科手術(shù)和機(jī)械性損傷造成內(nèi)臟組織損傷、創(chuàng)面出血和術(shù)后粘連一直是臨床急需解決的一個(gè)重大問題，目前研究或已經(jīng)上市的產(chǎn)品大部分針對(duì)體內(nèi)止血和防粘連方面，而具有內(nèi)臟組織修復(fù)或者兼具以上三種作用的研究尚未有報(bào)道。開發(fā)合適的創(chuàng)傷修復(fù)材料是解決該問題的一個(gè)重要途徑。
水凝膠是在水中溶脹并保持大量的水分而又不溶解的聚合物，高分子水凝膠是由高分子骨架、水、交聯(lián)劑組成的三維體系，具有大分子量的復(fù)雜空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有良好的吸水性，生物相容性好，所以在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用，而生物可降解的水凝膠材料則成為該研究的最新方向。
已有的水凝膠無法滿足內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)的要求，表現(xiàn)在以下方面創(chuàng)傷修復(fù)效果差、組織黏附性差、生物相容性不好、不能生物降解等多方面。而為了增強(qiáng)水凝膠的治療效果，生長(zhǎng)因子的應(yīng)用成為了一種可能。(陳佳，羅成群.中國燒傷創(chuàng)瘍雜志，2005，17(1)74-76)內(nèi)臟創(chuàng)面組織再生依賴于生長(zhǎng)因子，但外源性生長(zhǎng)因子半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝，在體表創(chuàng)傷使用時(shí)需反復(fù)大劑量使用，而且價(jià)格非常昂貴。特別是在內(nèi)臟手術(shù)時(shí)，只能在縫合前使用一次生長(zhǎng)因子，因此，需要開發(fā)如何使生長(zhǎng)因子持續(xù)高效發(fā)揮作用是解決其體內(nèi)應(yīng)用的關(guān)鍵問題。(付小兵，程飚，盛志勇.中國修復(fù)重建外科雜志，2004，18(6)508-512)殼聚糖及其衍生物由于其優(yōu)良的生物相容性和可降解性在生物醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，對(duì)于殼聚糖的結(jié)構(gòu)改性的研究很多，但主要涉及到親水性衍生物方面，例如N，O-羧甲基殼聚糖(CA Carolan，HS Blair.CarbohydratePolymer，1991，69195-196)、O-羧甲基殼聚糖(LingyunChen，Yumin Du.Biomaterials，2004，253725-3732)、N-磺酸化(K.R.Holme，A.S.Perlin.Carbohydr.Res.1997，302173-179)等等。兩親性殼聚糖衍生物有2-羥基-3-(對(duì)壬基苯氧基)丙基-羧甲基殼聚糖(隋衛(wèi)平，陳國華，高先池等.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(1)，133-135)等，大部分兩親性衍生物其氨基端接的基團(tuán)降解性差，有一定的微毒性，限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。
將水凝膠和生長(zhǎng)因子復(fù)合后用于治療體表創(chuàng)傷已經(jīng)有報(bào)道，如表皮生長(zhǎng)因子(Park JS，Yoon JI，Li H，et al.ArchPharm Res.2003 Aug；26(8)659-65.)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(付小兵，郭振榮，盛志勇，沈祖堯等.中華醫(yī)學(xué)雜志，2002，0335-52)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(Dunaiski Vera，Marshall Nick，Belford David A.Regulatory Peptides，2000，941-3)，但在內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)方面的應(yīng)用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是用可生物降解的天然來源的殼聚糖為原料，進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾，使其形成具有兩親性的聚合物分子，即一端含親水基，另一端含親脂基并且仍可以在體內(nèi)生物降解的聚合物，以適用于創(chuàng)傷修復(fù)，尤其作為生物相容性良好、無毒性的內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)材料。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還包括研究的兩親性殼聚糖衍生物，制備成水凝膠，具有良好的組織黏附性和適宜的機(jī)械強(qiáng)度，用于創(chuàng)傷修復(fù)不僅可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合，還可以止血和防止術(shù)后粘連。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題還包括研究的兩親性殼聚糖衍生物，制備成水凝膠可以和創(chuàng)傷修復(fù)相關(guān)的生長(zhǎng)因子復(fù)合，用于更好地治療創(chuàng)面。
為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)解決方案為1、下述通式表示的N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖 其中R＝-(CH)n，n＝8、10、12、14、16、18上述N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖，其特征在于n＝8、10、12、14、16、18，優(yōu)選n＝8和10；脫乙酰度為80-100％，優(yōu)選93-98％；N-?；〈葹?0-50％，優(yōu)選30-35％；6-O-羧丙基取代度為80-100％，優(yōu)選95-100％。
前述N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖的制備方法，其特征在于用以下方法制備1)將純化的殼聚糖用KOH堿化12小時(shí)，在異丙醇介質(zhì)中，攪拌下加入溴丁酸的異丙醇溶液，反應(yīng)溫度控制在40-50℃，反應(yīng)5-20小時(shí)，生成6-O-羧丙基殼聚糖。
2)將6-O-羧丙基殼聚糖溶于異丙醇中成粘稠液體，在攪拌下緩慢加入長(zhǎng)鏈脂肪酰氯，反應(yīng)溫度控制在50-60℃，反應(yīng)5-20小時(shí)，生成N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖。
所述的制備方法，其較好的技術(shù)特征在于
1)溴丁醇物質(zhì)的量是殼聚糖的三倍，生成的6-O-羧丙基殼聚糖，用稀鹽酸中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60-70℃下真空干燥。
2)長(zhǎng)鏈脂肪酰氯的碳鏈長(zhǎng)為偶數(shù)，取值在10-20之間(包含10和20)，包括癸酰氯、十二酰氯、十四酰氯、十六酰氯、十八酰氯，物質(zhì)的量是殼聚糖的0.3-0.6倍。
3)生成的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖，用KOH中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60-70℃下真空干燥。
前述方法制備的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖，其特征在于N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖可進(jìn)一步加工成為高度純化、無菌無熱原的材料，其純化方法如下所述1)將N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖加入到一定量含0.01N HCl+20mM NaCl的溶液中混勻，加入一定量氯仿和異丙醇，劇烈攪拌30分鐘，用布絲漏斗過濾。此過程重復(fù)三遍。然后，將CM-CH溶于水/異丙醇溶液中，緩緩加入0.5NNaOH+20mM NaCl，調(diào)節(jié)到PH為8。
2)在上述溶液加入溶液三倍體積的無水乙醇沉淀，靜置過夜，用布絲漏斗過濾雜質(zhì)，沉淀用無水乙醇脫水三次，60-70℃真空干燥，收集產(chǎn)品。
上述方法制備的CM-CH純度高，雜質(zhì)少，經(jīng)檢驗(yàn)內(nèi)毒素含量不超過0.06U/ml，完全符合體內(nèi)植入材料的要求。
前述的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠制備方法，其特征在于制備過程中加入或不加入生物可降解的交聯(lián)劑，交聯(lián)劑可以是乙二醇縮水甘油醚、丙三醇縮水甘油醚、丁二醇縮水甘油醚、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷中的一種或幾種，交聯(lián)劑物質(zhì)的量和N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖單體的比例為1/400-1/100。
前述方法制備成的交聯(lián)或未經(jīng)過交聯(lián)N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠，具有良好的組織粘附性和一定的機(jī)械強(qiáng)度，用于創(chuàng)面修復(fù)時(shí)無需縫合，不會(huì)脫位，并可以承受一定的張力，其中交聯(lián)的水凝膠拉伸強(qiáng)度為0.5Mpa-1.2Mpa。
前述方法制備成的交聯(lián)或未經(jīng)過交聯(lián)N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠，同時(shí)具有良好的生物相容性和生物降解性，在體內(nèi)可以水解成長(zhǎng)鏈脂肪酸，為人體自有的物質(zhì)，可以被機(jī)體吸收利用。主鏈降解后形成的6-O-羧丙基-2-氨基葡萄糖可以安全排出體外。
前述方法制備的交聯(lián)或未經(jīng)過交聯(lián)N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠并且具有明顯的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生物活性，并具有明顯的止血作用和預(yù)防術(shù)后粘連的發(fā)生的作用。
在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使大鼠肝臟切割模型愈合速度加快4-6天，止血速度在5分鐘之內(nèi)，在盲腸粘連模型中減少50％粘連的發(fā)生。
前述的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖作為創(chuàng)傷修復(fù)水凝膠的應(yīng)用，其特征在于將該N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖制備成水凝膠，應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)可以復(fù)合細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)。
前述的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖復(fù)合生長(zhǎng)因子后的水凝膠作為創(chuàng)傷修復(fù)的應(yīng)用，其特征在于可以用于體表創(chuàng)面敷料，治療難愈性創(chuàng)面，包括三度燒傷、燙傷和嚴(yán)重機(jī)械性損傷；也可以用于內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)，包括各種內(nèi)臟手術(shù)創(chuàng)傷、其他原因?qū)е碌膬?nèi)臟損傷等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一6-O-羧丙基殼聚糖的制備殼聚糖用KOH堿化12小時(shí)，在異丙醇介質(zhì)中，攪拌下加入的溴丁酸的異丙醇溶液，溴丁酸物質(zhì)的量為殼聚糖物質(zhì)的量三倍，反應(yīng)溫度控制在40-50℃，反應(yīng)8小時(shí)，生成6-O-羧丙基殼聚糖，用稀鹽酸中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60-70℃下真空干燥。元素分析測(cè)得O-羧丙基取代度為85％。
實(shí)施例二N-壬?；?6-O-羧丙基殼聚糖的制備將6-O-羧丙基殼聚糖溶于異丙醇中成粘稠液體，在攪拌下緩慢加入癸酰氯，反應(yīng)溫度控制在50℃，反應(yīng)10小時(shí)，生成N-壬?；?6-O-羧丙基殼聚糖，用KOH中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60℃下真空干燥。元素分析測(cè)得N-壬?；〈葹?1.2％。
實(shí)施例三N-十一酰基-6-O-羧丙基殼聚糖的制備將6-O-羧丙基殼聚糖溶于異丙醇中成粘稠液體，在攪拌下緩慢加入癸酰氯，反應(yīng)溫度控制在50℃，反應(yīng)10小時(shí)，生成N-壬?；?6-O-羧丙基殼聚糖，用KOH中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60℃下真空干燥。測(cè)得N-十一?；〈葹?5％。
實(shí)施例四N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖的純化將N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖加入到三倍體積含0.01N HCl+20mM NaCl溶液混勻，加入一定量氯仿和異丙醇，劇烈攪拌30分鐘，用布絲漏斗過濾。此過程重復(fù)三遍。然后，將CM-CH溶于水/異丙醇溶液中，緩緩加入含0.5NNaOH+20mM NaCl的溶液，調(diào)節(jié)到PH為8。加入溶液三倍體積的無水乙醇沉淀，靜置過夜，用布絲漏斗過濾雜質(zhì)，沉淀用無水乙醇脫水三次，60-70℃真空干燥，收集產(chǎn)品。
上述方法制備的CM-CH純度高，雜質(zhì)少，無菌，經(jīng)檢驗(yàn)內(nèi)毒素含量不超過0.06U/ml，完全符合體內(nèi)植入材料的要求。
實(shí)施例五未交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠的制備及性質(zhì)將純化的N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖溶于水中成3％溶液，加入1％的甘油，充分溶解后澆鑄于已調(diào)節(jié)水平的玻璃板上，50℃真空干燥，切割成一定大小，測(cè)定水凝膠膜的性質(zhì)。結(jié)果為含水率45％；凝膠分?jǐn)?shù)65％；拉伸強(qiáng)度0.5Mpa；斷裂伸長(zhǎng)率340％。該水凝膠膜片與組織粘附性強(qiáng)，但因?yàn)闆]有經(jīng)過交聯(lián)而緩慢溶解，存留時(shí)間短，適合體外創(chuàng)面的應(yīng)用。
實(shí)施例六交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠的制備及性質(zhì)將純化的N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖溶于水中成3％溶液，加入1％的甘油，加入N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖單體物質(zhì)的量0.5％的丙三醇縮水甘油醚，充分溶解、攪拌均勻后澆鑄于已調(diào)節(jié)水平的玻璃板上，50℃真空干燥，切割成一定大小，測(cè)定水凝膠膜的性質(zhì)。結(jié)果為含水率55％；凝膠分?jǐn)?shù)53％；拉伸強(qiáng)度1.8Mpa；斷裂伸長(zhǎng)率320％，平衡溶脹比(平衡吸水率)386％。該水凝膠膜片與組織粘附性強(qiáng)，在動(dòng)物腹腔內(nèi)存留時(shí)間可達(dá)到十天左右，適合內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)的應(yīng)用。
實(shí)施例七N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖復(fù)合生長(zhǎng)因子水凝膠的制備將純化的N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖溶于水中成3％溶液，加入1％的甘油，加入一定量包含EGF、FGF和IGF的納米微囊，加入N-十一酰基-6-O-羧丙基殼聚糖單體物質(zhì)的量0.5％的丙三醇縮水甘油醚，充分溶解、攪拌均勻后澆鑄于已平衡的玻璃板，25℃真空干燥，切割成一定大小，測(cè)定水凝膠膜中細(xì)胞因子的活性。結(jié)果表明生長(zhǎng)因子有良好的緩釋作用，在動(dòng)物體內(nèi)保持活性時(shí)間最長(zhǎng)為十天。
實(shí)施例七交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠，對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟創(chuàng)傷的促進(jìn)愈合和止血效果新西蘭大白兔40只，雄性，體重約2500～3000g，備皮、麻醉后，無菌下開腹，暴露肝臟，并在肝表面切除1.5cm×1.5cm大小的肝組織，造成切取面積的出血?jiǎng)?chuàng)面，一組放置2cm×2cm交聯(lián)N-十一酰基-6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠膜，敷壓傷口，待與創(chuàng)面完全粘合后松開，另一組為膠原海綿止血材料，計(jì)算止血時(shí)間?？p合，處理創(chuàng)面，分別在一周和兩周后開腹觀察其創(chuàng)面愈合情況，組織切片進(jìn)一步觀察。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠膜的止血性能與膠原海綿相當(dāng)，約為5分鐘，而促愈合的性能則優(yōu)于膠原海綿，平均愈合時(shí)間為5.3天，而膠原海面組為9.2天。
實(shí)施例八交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠，對(duì)動(dòng)物內(nèi)臟創(chuàng)傷的促進(jìn)愈合和防粘連效果新西蘭大白兔40只，雌性，體重約2000～2500g，備皮、麻醉后，無菌下開腹，找出子宮，在子宮頸處用紗布擦去2cm×2cm漿膜，直至滲血。在盲腸表面用干紗布連續(xù)擦磨，直至漿膜外層被擦掉，一組放置2.5cm×2.5cm交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠膜，敷壓傷口，待與創(chuàng)面完全粘合后松開?？p合，清理創(chuàng)面，分別在一周和兩周后開腹觀察其創(chuàng)面愈合和粘連情況，組織切片進(jìn)一步觀察。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠有顯著的促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果(P＜0.05)，交聯(lián)N-十一?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠全部為0級(jí)，而對(duì)照組主要屬于III級(jí)和IV級(jí)，該水凝膠具有良好的防粘連效果。
權(quán)利要求
1.下述通式表示的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖 其中R＝-(CH)n，n＝8、10、12、14、16、18。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述2-N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖，其特征在于n＝8、10、12、14、16、18，優(yōu)選n＝8和10；脫乙酰度為80-100％；N-?；〈葹?0-50％；6-O-羧丙基取代度為80-100％。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖的制備方法，其特征在于用以下過程制備1)將純化的殼聚糖用KOH堿化后，在異丙醇介質(zhì)中，攪拌下加入溴丁酸的異丙醇溶液，反應(yīng)5-20小時(shí)，生成6-O-羧丙基殼聚糖。2)將6-O-羧丙基殼聚糖溶于異丙醇中成粘稠液體，在攪拌下緩慢加入長(zhǎng)鏈脂肪酰氯，生成N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于1)生成的6-O-羧丙基殼聚糖，用稀鹽酸中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60-70℃下真空干燥。2)長(zhǎng)鏈脂肪酰氯的碳鏈長(zhǎng)為偶數(shù)，取值在10-20之間(包含10和20)，包括癸酰氯、十二酰氯、十四酰氯、十六酰氯、十八酰氯。3)生成的N-酰基化-6-O-羧丙基殼聚糖，用KOH中和，用丙酮或乙醇沉淀產(chǎn)物，過濾，洗滌，脫水，60-70℃下真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求書3所述N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖的制備方法，其特征在于N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖可進(jìn)一步加工成為高度純化、無菌無熱原的材料，以該材料制備成的水凝膠具有良好的組織粘附性和一定的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)具有良好的生物相容性和生物降解性，并且具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生物活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求書5所述N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖水凝膠制備方法，其特征在于制備過程中加入或不加入生物可降解的交聯(lián)劑，交聯(lián)劑可以是乙二醇鎖水甘油醚、丙三醇縮水甘油醚、丁二醇縮水甘油醚、戊二醛、環(huán)氧氯丙烷中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖作為創(chuàng)傷修復(fù)水凝膠的應(yīng)用，其特征在于將該N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖制備成水凝膠，應(yīng)用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合時(shí)可以復(fù)合細(xì)胞生長(zhǎng)因子，包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)。
8.根據(jù)權(quán)利要求書5所述的N-?；?6-O-羧丙基殼聚糖作為創(chuàng)傷修復(fù)水凝膠的應(yīng)用，其特征在于可以用于體表創(chuàng)面敷料，治療難愈性創(chuàng)面，也可以用于內(nèi)臟創(chuàng)傷修復(fù)，具有明顯的促愈合作用和止血作用，可以明顯的預(yù)防術(shù)后粘連的發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的、兩親性殼聚糖衍生物的制備和應(yīng)用，屬于殼聚糖衍生物制備和應(yīng)用技術(shù)。所述的兩親性殼聚糖衍生物是以殼聚糖為原材料，堿化后在異丙醇介質(zhì)中與4－溴丁酸反應(yīng)制得6－O－羧丙基殼聚糖，經(jīng)純化后與長(zhǎng)鏈脂肪酰氯(碳鏈長(zhǎng)為偶數(shù)，取值在10－20之間，如癸酰氯或十二酰氯或十四酰氯或十六酰氯或十八酰氯)反應(yīng)生成N－酰基化－6－O－羧丙基殼聚糖。以該材料制備成的水凝膠具有良好的生物相容性和生物降解性，用于創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)具有良好的組織粘附性和適宜的機(jī)械強(qiáng)度，不僅能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，同時(shí)可以起到止血和預(yù)防術(shù)后粘連的作用。其中R＝－(CH)n，n＝8、10、12、14、16、18。
文檔編號(hào)A61K31/716GK101074271SQ20061001006
公開日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2006年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日
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