專利名稱：大戟科植物乳汁的極性溶劑提取物的活性級份的制作方法
大戟科植物乳汁的極性翻腿取物的活性級份發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明普遍涉及一種大戟科(Euphorbiaceae)植物乳汁的極性翻l」提取物 的活性級份，和它其中含有的一種或多種化合物，以^^述級份和/^^f述化合 物的用途，尤其在治療癌癥方面的用途。該發(fā)明也涉及一種包含所述活性級份 和M^述化合物的組儒，及其治療關(guān)于細(xì)胞增働血管生成的疾病的用途，尤 其是治療癌癥的用途。更具體地，本發(fā)明的活性級份來自綠玉樹(￡^/w^^fz'raa7///Ziw2ae^)植物乳汁的丁醇提取物。更具體地，本發(fā)明涉及3-(2,4，6-十二碳三烯酰基十二碳三烯?；?(dodecatrienoyl》-巨大戟二砲醇和3-(2,4,6，8-十四碳四烯酰S(tetodecatetranoyl)》巨大戟二萜醇在制備用于治療涉及細(xì)胞增殖的疾病或治療與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾 病的活性級份或藥物的用途。發(fā)明背景現(xiàn)在有越來越多的人投入了對癌癥，尤其是包括不良細(xì)胞增殖或血管生成 的疾病的特殊例子的研究及戰(zhàn)斗。已經(jīng)研究出許多替代療法，其中包括如本發(fā) 明的〗，植物藥的方法。綠玉樹(及#0^/""^07///丄.)是來自大戟科的植物，起源于東非和亞洲， 通常還被稱為aveloz或pencil tree, milkbush, esqueleto, graveto do cao, figueira do diabo, dedo do diabo, pau-pelado, S§b Sebasti§o tree, espinho畫de-cri就o, coroa-de~cristo, espinho國de-judeu, espinho italiano, pau國sobre國pau^ ^rvore de coral 。這 種植物的一部分，例如葉和外皮已被用于日常藥物中。但是，很多大戟科植物，尤其是綠玉樹(^p/K^/artraca//z'L)，流出的乳 汁是具有毒性、刺激性和腐蝕性的。它的乳汁可引起皮膚和粘膜的損害和TK腫， 刺激，眼睛流淚，眼瞼水腫，并且甚至是視覺困難。MA乳汁也可引起惡心， 嘔吐，腹灣，和大量時它甚至可以導(dǎo)致死亡。事實(shí)上，aveloz孚L汁富含祐類，包 括forbol和巨大戟二萜醇酯類。Forbol酯類具有纟頓l微性，己有報(bào)道稱其能艦月中瘤的出現(xiàn)(Kh叫A. Q.等人，五甲/2cvr/wo/: " iVew尸ewto^yc/z'c 7h'te^ e恥加w 五甲/^^^"^ 0 ///,尸/朋^^^& , 1989; 55: 290-291)。 一種特別的avelozforbol， 4-deoxyforbd酯，臨床上報(bào)道期每增大非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒(EBV)的傳染性， 導(dǎo)致免疫細(xì)胞DNA中斷，并通常引起免疫系統(tǒng)被抑制(MacNeil, A.等人， K/v加b" qf五/7血"-^r 丄Wc Qvc/e Ae q/"" f/ie P/爐五w/^cv^/a rtrao/取份 /C朋cw， 2003; 88(10); 1566-9)。除了這種化合物之外，還報(bào)道 了 aveloz提取物能繊斜寺定免疫細(xì)胞(T細(xì)胞)消滅EBV的能力。EBV是皰疹 病毒的一員，是最常見的人病毒之一。在感染初期，EBV將在細(xì)胞B中^:整 個生命周期的潛伏性感染。EBV感染可以引起單核細(xì)胞增多癥，并且一些EBV 感染者將發(fā)展成癌癥，例如伯基特淋巴瘤或nosefaringeous癌。簡而言之，所述 乳汁對人體來說是有害的，因此如大家看到和推薦的是應(yīng)該避免與它做任何的 接觸。因此，如下所述，本申請人克服了所有的技術(shù)偏見，證明所述乳汁提取物 的特定活性級份，以及它含有的一種或多種化合物具有有效的抗癌活性。發(fā)明內(nèi)容一方面，本發(fā)明的目的是提供一種大戟科植物乳汁極性自j提取物的活性 級傷、。它的制備方法是本發(fā)明的另一個方面。適當(dāng)?shù)臉O性翻提本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的具有高或中極性的翻U，尤其是 那些偶極矩為大約1.60至大約1.80并且介電常數(shù)為大約15至大約18的^U。 醇例如丁醇尤其合適。對本發(fā)明尤其有益的大戟科植物是大戟屬(五"/7/ orM0植物；更具體地， 用來獲得活性級份的孚L汁來自綠玉樹(^p/2wM ft'rao ///丄.)。如下面的實(shí)驗(yàn)所顯示的，所述活性級份具有抗癌活性，但這些實(shí)驗(yàn)并不對 本發(fā)明的范圍作出限制，本發(fā)明的范圍是由附屬的權(quán)利要求書來確定的。制備綠玉樹丁醇提取物的活性級份例如按重量l: l制備綠玉樹的乳汁，雌新鮮的乳汁和己烷的混合物。產(chǎn)生沉淀。傾析出的固體部分(或甚至與液體部分的混合物)與正丁醇混合，由 于高極性物質(zhì)與丁醇有較大親合力，而低極性物質(zhì)與己烷有較大親合九因此tt^充分?jǐn)嚢?，使組分得到有效提取。丁醇部分的分離(通過HPLC，液-、液色譜法，柱層析法或同等方法)將使其中存在的化合物主要根據(jù)尺寸而被分組洗脫出。在^ffl，SephadexG75的 柱層析法分離中，用己烷:乙酸乙酯(0%至100%)的混合物從乳汁提取物的丁 醇部分分離出8個級分。將根據(jù)M量進(jìn)行分離的這個分離步驟得到的級分進(jìn)行，薄層色譜法， 用按重量比為8:2的己烷乙酸乙酯的混合物進(jìn)行展開。得到的色譜圖如

圖1所 示?？梢钥吹角宄仫@示了級分7，并顯示確實(shí)存在具有高極性的以及與基質(zhì) 相溶且親合的成分。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的，由于分離方法本身的特性， 級分6和8也可含有少量級分7中存在的成分。如下所述，將所述級分7用來進(jìn)行驗(yàn)證其抗癌活性的實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例禾,磺酰羅丹明(Sulforhodamine)B測定法通過體外模M^評估AI中瘤細(xì)胞 株的抗增殖活性為了實(shí)施該試驗(yàn)，選擇癌細(xì)胞株MCF-7， NC1-ADR， OVCAR-03， PC03， 786-0和HT-29 ，在RPMI/SFB (RPM指的是PMI1640 -Roswell Paik Memorial Institute培養(yǎng)基，按照J(rèn) Swg (9wco/. 1969; 1(2); 15346中的；SBF指的是滅 活的牛胎JUlL清)中用5。/。SFB培養(yǎng);提及的細(xì)胞株由美國國家癌癥研究所NCI 提供(表2)。表2.用細(xì)胞板來評估抗增殖活性。細(xì)胞翻代碼培^M肺NCI460附著乳腺M(fèi)CF國7附著NCIADR*結(jié)腸HT29附著腎786-0附著卵巢OVCAR誦3附著前列腺PC誦3附著'細(xì)胞株對多種藥物顯示出抗藥性表型。將細(xì)胞置于具有5m]RPMI/SFB的25cm2燒瓶中，在37'C， 5%0)2和100 W鵬的大氣環(huán)境下進(jìn)行復(fù)制，直到形成的膜超伏約80%的融合。確定被測定物質(zhì)的抗增殖活性的測定法在96孔的板上根據(jù)對應(yīng)的培養(yǎng)密度(通過生長曲線預(yù)先確定)在 RPMI/SFB/慶大霉素中培養(yǎng)100^1細(xì)胞。在37。C和5 ^CQz和100%濕度的大氣環(huán)境下培養(yǎng)24小時后，在每100^ig/rnl ^f只中加入測定物質(zhì)(0.25至250ng/ml)。同時，固劍照板，測定加入測定物 質(zhì)時的吸光度(附圖中用零點(diǎn)上的實(shí)^^值To)。在i音養(yǎng)48小時后，固定其 他板，測定蛋白質(zhì)含量。 樣品稀釋為了制備母液，將樣品稀釋在二甲基亞砜(DMSO)鈉鹽中，使其濃度為 100 mg/ml。將這些溶液在RPMI/SFB/慶大霉素中稀釋400倍以加入到實(shí)驗(yàn)敬l:。 用磺酰羅丹明B (SRB)進(jìn)行比色測定根據(jù)Skehan等人A^w Co/o"'附欲/c C少totoo'c/(y A 輝，^4""a^7CW匿Dn/g /Ato/ C朋cer/mf 82: 1107-1112(1990)的方法進(jìn)行測定。在培養(yǎng)48小時后，在4。C時用50。/。濃度的50Ml三氯乙酸(TC)固定細(xì)胞。 為了完成細(xì)胞固定，盤子將在4"C時培養(yǎng)1小時。在用三氯乙酸固定后，用蒸餾水洗滌板四次，以除去TCA殘余吻、培養(yǎng)基、 牛胎兒血清和次級代謝產(chǎn)物，然后置于室溫下！S完^f燥。隨后在這些板上加入以0.4% (重a/體積)溶角ffi 1%乙酸的50^1的磺酰羅 丹明(SRB)并在4。C時培養(yǎng)30倂中，使板,。用1%的醋酸3^^套冼滌這些 板四次。除去洗滌溶液的殘余物，在室溫中干燥這些板。將結(jié)合在細(xì)胞蛋白上 的著色劑溶解在三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(由美國的Sigma Aldrich Fine Chemicals提供的Trizma base )中，使其濃度為lOnmM以及pH為10.5，超 聲5併中。用酶標(biāo)儀讀取560nm時的分光光度計(jì)的讀數(shù)的吸光度。 結(jié)果分析計(jì)算除去各自空白的平均吸光度，根據(jù)以下式子確定旨測定樣品的生長 抑制度(GI)。分析得到的結(jié)果，貝ij: -如果》C，，促進(jìn)了細(xì)胞生長；-如果T^To但〈C，表示具有細(xì)胞抑制活性(生長抑制)，使用的式子是 100x[(T-T0)/(C-T0)];-如果T<rQ，表示細(xì)胞殺滅活性(細(xì)胞死亡)，使用的式子是飾[(T-T0)/(C-T0)];其中T是處理過的細(xì)胞的平均吸光度，C是對照細(xì)胞的以及To是被加入時的對 照細(xì)胞的值。最后，還可從100%中減去獲得的結(jié)果，這樣就獲得生長抑制(GI)的百分?jǐn)?shù)o圖2和3中的曲線圖分別j該測定的活性級份以及阿霉素的濃傲活性曲 線，該曲線圖將化學(xué)治療的產(chǎn)物作為在不同濃度(250至0.25pg/ml)時的細(xì)胞 的附性對照，并將細(xì)胞生長的百分?jǐn)?shù)禾畔,的提取物的濃度作為橫縱坐標(biāo)。當(dāng)樣品在濃度依賴型中顯示出大于50%的生長抑制(在曲線圖中用通過點(diǎn) 50的線標(biāo))時，這些樣品將被認(rèn)為是有活性的并且還顯示出細(xì)鵬擇性(細(xì)胞株之間的不同活性或某一個細(xì)胞株的牛 活性)。ffii!S形非線性回歸方法計(jì)算IC50值(抑制50%生長的濃度)，將阿霉素 作為陽性對照，利用GraphPad Prism軟件(來自美國GraphPad軟件公司，San Diego CA)進(jìn)行分析。圖2 S51自身與附艦照的比較表明:大戟科植物乳汁的極性翻鵬取物， 在這里是正丁醇提取物，具有抗癌活性的功效。在本發(fā)明的另一個方面中， 一些^ 量為大約500至大約600的特殊的化 合物，也與所述活性級份的成分相同，明確地檢測到它們本身也具有抗癌活性。本發(fā)明還涉及所述化合物及其用途，^^[頓或與它們之間組合{頓或與 其他組合^ffi，用于治療與增生細(xì)胞相關(guān)的疾病，尤其是癌癥,以及它們用于制 備治療所述疾病的組合物和藥物的用途。以下是分子量為大約500至大約600的所述化合物中尤其有效的化合物以 及它們對應(yīng)的空間結(jié)構(gòu)?；衔飈: 3-(2,4,6沖二碳三烯酰基)-巨大戟二結(jié)醇(肝量524)H3C化合物2: 3-(2,4,6,8沖四碳四烯?；?gt;巨大戟二萜醇(舒量550)在本發(fā)明的另一個方面中，它包括一種藥物組合物，其含有藥用有效量的 大戟科植物，尤其是綠玉樹(五甲/^^ ^w"必丄.)乳汁的極性MU提取物 成分，尤其是正丁烷提取物，和可藥用的賦形劑。本發(fā)明的組合物可能含有大約0.001 %至大約95%的可如先前公開方法獲 得的大戟科乳汁提取物的活性級份。在本發(fā)明的另一個方面中，提出一種藥物組合物，其含有有效量的一種或 多種舒量為大約500至大約600的、可如公開方法獲得的大戟科乳汁提取物 活性級份中含有的化合物，和可藥用的賦形劑。在本發(fā)明的另一個方面中，它還包括一種藥物組合物，其含有有效量的一 種或多種如上所述的化合物1和2和可藥用的賦形劑。用于制備本發(fā)明組合物的可藥用的賦形劑可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 所有輔料，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二 鈣、硫酸鈣、甘露醇、山梨醇、乙醇、甘油、水和其他輔料。所述藥劑形式的配方的參考書是尸/7aw ac融'ca/ Sdewces,來自the U. S. publisher Mack Publishing 。一種或多種分子量為大約500至大約600的所述化合物，尤其是在本發(fā)明 的組合物中的一種或多種的化合物l和2的適當(dāng)用量是大約0.1mg至2000mg， 雌大約10mg至大約100mg，但不排除有其他的用量。本發(fā)明的組合物可以經(jīng)口服給藥(包括直接和/或控釋形式的)、不經(jīng)腸給藥 (肌肉、靜脈、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膜內(nèi)、皮下或皮下組織和真皮內(nèi))、通過粘膜 給藥(肺，舌下，鼻，結(jié)膜，飾，陰道)和局部給藥。本發(fā)明組合物合適的制劑形式是溶液、糖漿、酏劑、混懸液、乳劑、洗 齊IJ、軟膏、乳膏、糊劑、凝膠、氣霧劑、散劑、丸劑、片劑、錠劑、栓劑、卵 狀小體或滴眼劑，但并不限于此。除了大戟科乳汁極性翻鵬取物的活性級份和/或一種或多種其中含有的分 子量為大約500至大約600的化合物，和/或一種或多種如上所述的化，1和 2之外，本發(fā)明的組合物還可以含有其他有益于抵抗增殖細(xì)胞類型的有效成分， 而這些成分的抵抗是希望得到的。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道如何決定其他已知的有 效成分的添加。在另一個本發(fā)明的實(shí)施例中，提出了一種治療關(guān)于增殖細(xì)胞的疾病的方法， 尤其是癌癥，其中需要所述治療的患者,受有效量的(1) 大戟科植物乳汁的極性溶劑提取物的活性級份，和/或(2) 所述活性級份中的一種或多種^T量為大約500至大約600的化合物， 和/或(3) —種或多種如上所述的化合物1和2，或(4) 含有之前成分或其組合物的任意成分的組合物。在本發(fā)明的另一個方面中，提出了該大戟科植物乳汁的活性級份的用途， 尤其是用極性溶劑提取綠玉樹，極性溶劑尤其是丁醇，其特征在于是用于制備 治療關(guān)于增殖細(xì)胞，尤其是癌癥的疾病中的有效的組合物或藥物的用途。本發(fā) 明還包括在所述活性級份中含有的一種或多種分子量為大約500至大約600的化合物的用途，其特征在于是用于制備治療關(guān)于增殖細(xì)胞，尤其是癌癥的疾病 中的有效的組合物或藥物的用途。本發(fā)明還包括如上所述的一種或多種化合物1和2的用途，其特征在于是用于制備治療關(guān)于增殖細(xì)胞，尤其是癌癥的疾病中的有效的組合物或藥物的用途。本發(fā)明涉及任意動物的增殖的細(xì)胞，尤其是人類。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不脫離以下公開的權(quán)利要求書限定的范圍的情況 下，從在本文公開的教導(dǎo)和實(shí)施例中找到其他割介的方g實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 大戟科植物乳汁的極性溶劑提取物的活性級份，其特征在于所述級份包含在用層析柱分離得到的8個級分當(dāng)中較重的級分6、7和8。
2. 如權(quán)利要求l所述的級份，其特征在于所述級份只包含級份7。
3. 如權(quán)利要求i所述的級份，其特征在于所述乳汁im是新鮮的。
4. 如權(quán)利要求1所述的級份，其特征在于所述極性翻U的偶豐頗為大約 1.60至大約1.80，并且介電常數(shù)為大約15至大約18。
5. 如權(quán)利要求4所述的級份，其特征在于所述極性翻提醇。
6. 如權(quán)利要求4所述的級份，其特征在于所述翻'提正丁醇。
7. 如權(quán)利要求l所述的級份，其特征在于大戟科植物來自大戟屬。
8. 如權(quán)利要求7所述的級份，其特征在于該植物是綠玉樹。
9. 如^l利要求1至8任一項(xiàng)所述的級份，其特征在于所述級傷^含^ 量 為大約500至大約600的分子。
10. 如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的級份，其特征在于所述級傷^含化合 物3-(2，4,6沖二碳三烯?；?-巨大戟二砲醇和3-(2,4,6,8沖四碳四烯?；?-巨大戟 二砲醇中的一種或多種。
11. 權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的大戟科植物乳汁的極性翻腿取物的活 性級份在制備用于治療細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的組^tl或藥物中的用途。
12. 3-(2,4,6-十二碳三烯?；?-巨大戟二萜醇和3-(2,4,6,8-十四碳四烯?；?> 巨大戟二萜醇中的一種或多種在制備用于治療細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的組合物或藥 物中的用途。
13. —種組合物，所述組合物包含有J爐的權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的 活性級份或3-(2,4,6-十二碳三烯?；?-巨大戟二萜醇和3-(2,4,6,8-十四碳四烯酰 萄-巨大戟二萜醇中的一種或多種和可藥用的賦形劑。
14. 如禾又利要求13所述的組合物，其特征在于所述組合物包含大約0.001 %至大約95%的權(quán)利要求1至11任一項(xiàng)所述的活性級份。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于所述組合物包含大約0.1mg 至2000mg，，一步大約10mg至大約100mg的3-(2,4,6-十二碳三烯?；?gt;巨 大戟二砲醇和3-(2,4,6,8-十四碳四烯酰基)-巨大戟二結(jié)醇中的一種或多種。
16. 如權(quán)利要求13所述的組合物在制備用于治療細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的組合 物或藥物中的用途。
17. 如權(quán)利要求11或12所述的用途，其特征在于所述疾病是癌癥。
18. 如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于所述癌癥是肺癌、學(xué)L腺癌、結(jié) 腸癌、腎癌、卵巢癌或前列腺癌。
19. 一種治療細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的方法，其特征在于需要所述治療的患者 接受有效量的權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)個權(quán)利要求所述的活性級份和/或在權(quán)利要 求1至10任一項(xiàng)所述的活性級份中含有的一種或多種M量為大約500至大約 600的化合物和/或3-(2,4,6沖二碳三烯酰基)-巨大戟二萜醇和3-(2,4,6,8沖四碳四 烯?；?"巨大戟二萜醇中的一種或多種，或者包含有效量的如權(quán)利要求1至10 任一項(xiàng)所述的活性級份和/^權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的活性級份中含有的 一種或多種分子量為大約500至大約600的化合物和/或3-(2,4,6-十二碳三烯酰 基)-巨大戟二萜醇和3<2,4,6,8-十四碳四烯?；?-巨大戟二萜醇中的一種或多種 的組合物。
20. 如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于所述疾病是癌癥。
21. 如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于所述的癌癥劍市癌、乳腺癌、 結(jié)腸癌、腎癌、卵巢癌或前列腺癌。
22. —種制備大戟科植物乳汁的極性翻鵬取物的活性級份的方法，其特 征在于所述方法包括a) 將來自大戟科植物的乳汁與基本為非極性的輸嗨合；b) 在充分?jǐn)嚢柘?，向步驟a)的混合物中或混合步驟a)后傾析出的固相中加 A^本為極性的翻U，使翻U與混合物或固相充分接觸；c) 分離出極性相；d) 用層析纟樹極性相進(jìn)行分級；e) 分離出具有較高分子量的級分。
23. 如豐又利要求22所述的方法，其特征在于可使用以下一個或多個限制 -乳汁是新鮮的；-植物是大觀，尤其是綠玉樹； -基本為非極性的鋭l」是己烷；-該極性溶齊啲偶極矩為大約1.60至大約1.80，并且介電常數(shù)為大約15至頁大約18;-層析柱的固定相是Sephadex G75，以及用己烷乙酸乙酯的混合物進(jìn)療冼脫；-在八個成分中分級出極性相，這樣較高分子量的活性級份的分離將得到 級分6、 7和8 ， im僅是成分7 ，更tt^分子量為500至600的分子。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及大戟科植物乳汁的極性溶劑提取物的活性級份，和其中含有的一種或多種化合物，和所述級份和/或所述化合物的用途，尤其在治療癌癥方面的用途。本發(fā)明還涉及包含所述活性級份和/或所述化合物的組合物，和它們在治療與細(xì)胞增殖/血管生成相關(guān)疾病，尤其是癌癥中的應(yīng)用。
文檔編號A61K36/47GK101257912SQ200580050279
公開日2008年9月3日 申請日期2005年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月28日
發(fā)明者C·P·查弗斯, J·B·卡利克斯托, L·F·皮亞諾維斯基 申請人:阿馬佐尼亞菲托藥品有限公司