專利名稱：基因遞送用生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物及其制備方法。特別涉及生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的組合物和制備方法，所述共聚物包含低分子量的線性聚乙烯亞胺(LPEI)和生物可降解連接體，其中每個(gè)LPEI單元通過生物可降解連接體與臨近的單元共價(jià)連接。本發(fā)明還涉及熒光標(biāo)記的聚合物和制備方法，所述聚合物包含前述的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物和熒光標(biāo)記。本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物通過促進(jìn)DNA、RNA、寡核苷酸和其他陰離子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)或通過增強(qiáng)它們對(duì)生物表面的附著，可用于它們的遞送及其細(xì)胞定位。
背景技術(shù)：
基因治療的成功依賴于基因遞送系統(tǒng)將治療性基因有效并安全的遞送到靶標(biāo)組織的能力?？梢詫⒒蜻f送系統(tǒng)分為病毒和非病毒的(或基于質(zhì)粒DNA的)?？梢詫⑷缃衽R床使用的現(xiàn)有基因遞送技術(shù)認(rèn)為是第一類，這是因?yàn)樗鼈兙哂型ㄟ^其固有的化學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)性質(zhì)轉(zhuǎn)染或感染靶細(xì)胞的能力。但是，依靠這些獨(dú)有的性質(zhì)限制了它們的治療性應(yīng)用。例如，具有感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞能力的病毒已經(jīng)有效的用于具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的基因轉(zhuǎn)移。但是，當(dāng)用在臨床情形中時(shí)，已經(jīng)引起了嚴(yán)重的安全顧慮(例如宿主的強(qiáng)免疫應(yīng)答和潛在的誘變)。
基于“裸DNA”或配制的質(zhì)粒DNA的非病毒基因遞送系統(tǒng)比病毒載體更具有潛在的優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)槭褂玫谋憷砸约安徽T發(fā)特異性免疫應(yīng)答。已經(jīng)描述了一些合成基因遞送系統(tǒng)來克服裸DNA的限制，所述遞送系統(tǒng)包括陽離子脂類、肽和聚合物。除了前面的優(yōu)勢(shì)外，基于陽離子脂類系統(tǒng)的臨床實(shí)用性由于它們的低有效性、毒性和難控制性而受到限制。
另一方面，由于聚合物良好的分子柔性允許復(fù)雜的修飾和新元件的摻入，它們成為現(xiàn)有系統(tǒng)的可行性選擇對(duì)象。已經(jīng)廣泛研究了作為基因遞送候選物的陽離子聚合物，如聚(L-賴氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)和聚乙烯亞胺(PEI)，這是基于它們凝聚DNA并且提高DNA穩(wěn)定性和跨膜遞送的能力。陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率受到其分子量的影響。高分子量(＞20kD)的聚合物比低分子量的聚合物具有更好的轉(zhuǎn)染效率。諷刺的是，具有高分子量的那些聚合物也更具有細(xì)胞毒性。已經(jīng)進(jìn)行了一些嘗試來避免這一問題并且在不增加其細(xì)胞毒性的同時(shí)增強(qiáng)陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染活性。例如，Lim等人通過熔融縮合合成了生物可降解的聚合物，聚[α(4-氨基丁基)-L-乙醇酸](PAGA)，Pharm.Res.17811-816，2000。盡管PAGA已經(jīng)用在一些基因遞送研究中，但由于其轉(zhuǎn)染活性低以及在水溶液中的不穩(wěn)定性，其實(shí)際應(yīng)用是有限的，J Controlled Rel.8833-342，2003；Gene Ther.91075-1084，2002。羥脯氨酸酯(PHP酯)和網(wǎng)狀聚(氨基酯)也是其他可降解聚合物中的一些實(shí)例。通過熔融縮合或通過環(huán)己基碳二亞胺(二甲基-氨基)吡啶(DCC/DMAP)激活的縮聚作用，從Cbz-4-羥基-L-脯氨酸合成PHP酯，J.Am.Chem.Soc.1215633-5639，1999；Macromolecules 323658-3662，1999。使用在二(2-甲氧基-羰基乙基)[三-(羥甲基)甲基]胺的羥基和羧基基團(tuán)之間的大量縮聚，隨后通過與6-(Fmoc-氨基)己酸的縮合，合成成網(wǎng)狀聚(氨基酯)(Bioconjugate Chem.13952-957，2002)。已經(jīng)表明這些聚酯凝聚DNA并且在體外低細(xì)胞毒性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是它們?cè)谒芤褐械姆€(wěn)定性很差。
聚乙烯亞胺(PEI)將DNA有效凝聚成極窄分布的帶正電荷球形復(fù)合物，并且可以在體外和體內(nèi)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。由于PEI的轉(zhuǎn)染活性隨著聚合物/DNA比率增加而增加，因此PEI與其他陽離子聚合物類似。PEI優(yōu)于PLL的不同優(yōu)勢(shì)是其內(nèi)體裂解(endosomolytic)活性，這使得PEI能夠產(chǎn)生高的轉(zhuǎn)染效率。市售分支PEI由25％的伯胺、50％的仲胺和25％的叔胺組成。從pH7到pH5，PEI的總質(zhì)子化水平加倍，這意味著在內(nèi)體中PEI會(huì)被嚴(yán)重質(zhì)子化。PEI的質(zhì)子化引發(fā)了氯化物流過內(nèi)體膜，并且水流入以抵消內(nèi)體內(nèi)的高離子濃度，這最終導(dǎo)致滲透膨脹引起的內(nèi)體破壞以及內(nèi)部DNA的釋放。由于PEI本身的內(nèi)體裂解活性，其通常不需要添加內(nèi)體裂解劑用于轉(zhuǎn)染。由于這些優(yōu)勢(shì)，PEI越來越多的使用在聚合物發(fā)揮作用的方法中，以產(chǎn)生更安全和更有效的遞送系統(tǒng)。PEI的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染活性與聚合物的分子量線性相關(guān)。為了增加PEI轉(zhuǎn)染活性，同時(shí)不增加其細(xì)胞毒性，Ahn等人已經(jīng)通過將小分子量的分支PEI嵌段經(jīng)由酰胺鍵共價(jià)連接到PEG分子上來合成高分子量的多嵌段共聚物，J control Release 80273-282,2002；美國專利號(hào)6652886。這些多嵌段共聚物在水溶液中可溶性不佳并且在轉(zhuǎn)染活性上僅比單嵌段聚合物略好(最多好3倍)。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了線性聚(烷烯亞胺)(poly(alkylenimine))(LPAI)和親水性連接體的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述LPAI嵌段通過所述具有生物可降解酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或磷酸鍵的親水性連接體交聯(lián)在一起。優(yōu)選的，線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)選自以下之一聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、氨基糖苷-多胺、雙脫氧-二氨基-β-環(huán)糊精、精胺和亞精胺。更優(yōu)選的，線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)是線性聚(乙烯亞胺)(LPEI)。
可以將本發(fā)明交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物通過生物可降解的連接體任意連接到其他部分，例如熒光標(biāo)記、脂質(zhì)錨或其衍生物，即膽固醇、脂肪酸或其衍生物。優(yōu)選的，用于本發(fā)明的線性PEI分子量在1000到25000道爾頓的范圍內(nèi)。線性PEI嵌段優(yōu)選使用生物可降解的二硫二酸衍生的連接體(即二硫二丙酸衍生物)，經(jīng)由二酰胺鍵彼此連接。連接體與PEI的摩爾比優(yōu)選在1/1到5/1的范圍內(nèi)；脂質(zhì)錨與PEI的摩爾比優(yōu)選為0/1至3/1。本發(fā)明的聚合物作為聚銨鹽配制，優(yōu)選使用氯化物抗衡離子。由于PEI毒性隨著其分子量增加而增加，因此在本發(fā)明聚合物中使用較低分子量的PEI作為嵌段提供了改良的基因載體，其用作轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞和用于體內(nèi)基因治療應(yīng)用的常規(guī)試劑。
本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物可以自發(fā)形成分散的納米大小的具有核酸的顆粒，其與LipofectamineTM和簡單的聚乙烯亞胺相比，通常更能有效的促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中。摻入動(dòng)物細(xì)胞后，本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物易于代謝降解。此外，本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物可以形成膠束水溶液，其對(duì)于多種生物活性物質(zhì)如DNA的系統(tǒng)遞送特別有用。
本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)染制劑，其包含以適當(dāng)?shù)碾姾杀?脂聚物的正電荷/核酸的負(fù)電荷)與所選擇的核酸絡(luò)合的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，所述電荷比對(duì)于體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染都是最有效的。本發(fā)明還提供了由于其共價(jià)連接的熒光團(tuán)(例如若丹明)而可以用熒光顯微鏡觀察到的轉(zhuǎn)染試劑，因此提供了觀察細(xì)胞分布以及聚合物及其與陰離子劑的復(fù)合物運(yùn)輸?shù)墓ぞ摺?br> 本發(fā)明還提供了合成硫酸鹽形式的線性聚乙烯亞胺(PEI)的合成方法。本發(fā)明還提供了生物可降解的和水溶性的交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的制備方法，其在生理學(xué)條件下能夠凝聚核酸或其他陰離子生物活性劑，并且能夠形成穩(wěn)定的復(fù)合物。本發(fā)明還提供了攜帶有專門示蹤物(即熒光標(biāo)記或一些其他的功能性配體)的生物可降解及水溶性多嵌段共聚物的制備方法。此類聚合物在生理學(xué)條件下能夠凝聚核酸或其他陰離子生物活性劑，并且形成穩(wěn)定的復(fù)合物，對(duì)于用在分析和研究工作中有額外的優(yōu)勢(shì)。
附圖簡述

圖1舉例說明了本發(fā)明線性PEI(LPEI)的合成方案；圖2顯示了LPEI分析的1H NMR數(shù)據(jù)；圖3舉例說明了本發(fā)明LPEI的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的合成方案；圖4顯示了分析具有脂質(zhì)部分的LPEI 3.6K(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物的1H NMR數(shù)據(jù)；圖5顯示了具有多種N/P比的LPEI 3.6kD(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物和DNA的絡(luò)合物的顆粒大小；圖6顯示了具有以多種N/P比的LPEI 3.6Kd(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物和DNA的絡(luò)合物的zeta電位；圖7顯示了具有多種N/P比的LPEI 3.6kD(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物和DNA的絡(luò)合物的電泳遷移率；圖8顯示了使用生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物(BD3.6K)和LPEI 3.6kD(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物以及未交聯(lián)單PEI3.6kD嵌段聚合物的體外基因轉(zhuǎn)移；圖9顯示了使用線性PEI 3.6kD(BD3.6K-O)和25kD線性PEI的生物可降解交聯(lián)的陽離子多嵌段脂聚物的體外基因轉(zhuǎn)移；圖10顯示了在使用線性PEI 3.6kD(BD3.6K-O)和線性PEI 25kD的生物可降解交聯(lián)的陽離子多嵌段脂聚物的基因轉(zhuǎn)移后得到的細(xì)胞毒性；圖11顯示了在Cos-1細(xì)胞中使用線性PEI3.6kD(BD3.6K)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物和LPEI 3.6kD(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)脂聚物的基因轉(zhuǎn)移后的細(xì)胞生存力；圖12顯示了在4T1腫瘤中使用線性PEI 3.6kD(BD3.6K-O)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物的體外基因轉(zhuǎn)移；以及圖13顯示了線性PEI3.6kD(BD3.6K-O)的熒光標(biāo)記的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段脂聚物的用途，其用于聚合物/DNA復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)移和細(xì)胞定位。

發(fā)明內(nèi)容
在公開和描述遞送生物活性劑用的本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)當(dāng)理解由于構(gòu)造、處理步驟和原料可以有些不同，本發(fā)明不限于在本文公開的具體構(gòu)造、處理步驟和原料。還應(yīng)當(dāng)理解在本文中使用的術(shù)語僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，而不意圖限制，這是因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只受到所附權(quán)利要求及其等價(jià)物的限制。
還必須注意的是，，除非上下文另外明確說明，在本說明書和所附權(quán)利要求中單數(shù)形式“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)意義。因此，例如，包含“二硫鍵”的聚合物的指代包括兩個(gè)或更多個(gè)此類二硫鍵的指代，“配體”的指代包括一個(gè)或更多個(gè)此類配體的指代，并且“藥物”的指代包括兩種或更多種此類藥物的指代。
在描述和要求本發(fā)明的范圍時(shí)，將使用依照下面給出定義的以下術(shù)語。
“轉(zhuǎn)染”意指核酸從細(xì)胞外部環(huán)境到細(xì)胞，再到內(nèi)部細(xì)胞環(huán)境(特別是指胞質(zhì)和/或細(xì)胞核)的運(yùn)輸。不受任何具體理論的束縛，將理解核酸可以在被包囊后，或附著到一個(gè)或多個(gè)陽離子聚合物/核酸復(fù)合物上后，或與之被陽離子聚合物/核酸復(fù)合物帶走后，遞送到細(xì)胞中。具體的轉(zhuǎn)染列舉了將核酸遞送到細(xì)胞核。核酸包括DNA和RNA以及其合成的同類物。此類核酸包括錯(cuò)義、反義、無義；以及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的核苷酸；控制蛋白質(zhì)、肽和核酸產(chǎn)生的開關(guān)和速度的調(diào)節(jié)核苷酸。具體但不限于，它們可以是基因組DNA、cDNA、mRNA、tRNA、rRNA、雜交序列或合成或半合成序列，以及天然或人造來源的。另外，核酸可以在大小上不同，范圍從寡核苷酸到染色體。這些核酸可以是人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、病毒或合成來源的。它們可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)得到。
本文所用的術(shù)語“生物活性劑”或“藥物”或任何其他類似術(shù)語意指化學(xué)或生物學(xué)物質(zhì)或化合物，其適合于通過本領(lǐng)域在先已知的方法和/或本發(fā)明中教導(dǎo)的方法施用，其誘導(dǎo)所需生物學(xué)或藥理學(xué)效果，并且該效果可以包括但不限于(1)對(duì)生物具有預(yù)防作用并且防止不希望的生物學(xué)效果如預(yù)防感染，(2)改善由于疾病引起的病癥，如改善由于疾病引起的疼痛或炎癥，和/或(3)改善、減輕或完全消除生物的疾病。作用可以是局部的，例如提供局部麻醉作用，或可以是全身的。
本發(fā)明本身并不是關(guān)于新藥物或新類型的生物活性劑。更確切的，它是關(guān)于生物可降解陽離子共聚物組合物和使用此類組合物遞送基因或其他生物活性劑的方法，所述生物活性劑以本領(lǐng)域中的狀態(tài)存在或可以隨后構(gòu)建為活性劑，并且適合于通過本發(fā)明的遞送。此類物質(zhì)包括正常遞送到體內(nèi)的廣泛類別的化合物。通常，這包括但不限于核酸，如DNA、RNA和寡核苷酸，抗感染的如抗生素和抗病毒劑；鎮(zhèn)痛藥和鎮(zhèn)痛藥組合；減食欲藥；抗蠕蟲藥；抗關(guān)節(jié)炎藥；止喘劑；抗驚厥藥；抗抑郁藥；抗糖尿病劑；止瀉藥；抗組胺藥；抗炎劑；抗偏頭痛制劑；止惡心藥；抗腫瘤藥；抗帕金森病藥；止癢藥；抗精神病藥；退熱藥；鎮(zhèn)痙藥；抗膽堿能藥；擬交感神經(jīng)藥；黃嘌呤衍生物；心血管制劑，其包括鉀通道阻滯劑、鈣通道阻滯藥、β-受體阻滯劑、α-受體阻滯劑和抗心律失常藥；抗高血壓藥；利尿藥和抗利尿劑；血管舒張藥，其包括全身性的、冠狀的、外周的和大腦的；中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑；血管收縮藥；咳嗽和感冒制劑，其包括減充血?jiǎng)?；激素如雌二醇和其他類固醇，其包括皮質(zhì)類固醇；安眠藥；免疫抑制劑；肌松劑；抗副交感神經(jīng)藥；精神振奮藥；鎮(zhèn)靜劑和安定藥。通過本發(fā)明方法，所有形式(例如離子化，未離子化、游離堿、酸加成鹽等)的藥物可以被遞送，藥物可以是高分子量或低分子量的。待遞送的生物活性劑的屬或種類的唯一限制是常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易確定的功能性。
本文所用的術(shù)語“生物可降解的”或“生物降解”定義為通過溶解水解，或通過生物形成的實(shí)體(其可以是酶或生物的其他產(chǎn)物)的作用，將物質(zhì)轉(zhuǎn)變成較不復(fù)雜的中間體或終產(chǎn)物。
本文所用的“有效量”意指核酸或生物活性劑量在進(jìn)行任何藥物治療時(shí)足夠提供有適當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)/好處比的所需局部或全身性作用和功效。
本文所用的“肽”意指任何長度的肽并且包括蛋白質(zhì)。本文所用的術(shù)語“多肽”和“寡肽”沒有任何具體預(yù)期的大小限制，除非另外說明了具體大小?？梢允褂玫牡湫碗氖沁x自下列的那些催產(chǎn)素、血管升壓素、促腎上腺皮質(zhì)激素、表皮生長因子、促乳素、促黃體素釋放素或促性腺素釋放素、生長激素、生長激素釋放因子、胰島素、促生長素抑制素、胰高血糖素、干擾素、促胃液素、四肽胃泌素、五肽胃泌素、尿抑胃素、促胰液素、降鈣素、腦啡肽、內(nèi)啡肽、血管緊張素、腎素、緩激肽、桿菌肽、多黏菌素、黏菌素、短桿菌酪肽、短桿菌肽及其合成類似物、修飾以及藥物活性片段、單克隆抗體和可溶性疫苗?？梢允褂玫碾幕虻鞍踪|(zhì)藥物的唯一限制是功能性之一。
本文所用的糖類的衍生物包括例如，糖的酸形式，例如葡糖醛酸；糖的胺，例如半乳糖胺；糖的磷酸鹽，例如甘露糖-6-磷酸鹽等。
本文所用的“施用”和類似的術(shù)語意指將組合物遞送到待治療的個(gè)體，從而該組合物能夠全身循環(huán)，其中該組合物結(jié)合靶細(xì)胞，并且通過胞吞作用被攝取。因此，優(yōu)選將組合物全身施用到個(gè)體，一般通過皮下途徑、肌內(nèi)途徑、經(jīng)皮途徑、靜脈內(nèi)途徑或腹膜內(nèi)途徑。用于此類用途的可注射的藥物可以以常規(guī)形式制備，可以是液體溶液或懸液，或者是適合在注射前制備成溶液或懸液的固體形式，或作為乳劑?？捎糜谑┯玫倪m當(dāng)賦形劑包括例如，水、鹽水、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等；以及如果需要，可以使用小量的輔助物質(zhì)如潤濕劑或乳化劑、緩沖液等。
基因治療成功的基礎(chǔ)是開發(fā)在全身施用后安全有效的基因遞送載體。本發(fā)明提供了基于有效的非病毒聚合物的基因載體，用于遞送核酸至靶細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其包含低分子量的線性PEI嵌段和作為生物可降解連接體的二硫代羧酸部分，即二硫代二丙酸。本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物是通過經(jīng)由生物可降解的二硫鍵交聯(lián)的低分子量線性PEI單元合成的。這些生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物是水溶性的并且對(duì)于單嵌段聚合物轉(zhuǎn)染優(yōu)異(高于68-70倍的活性)。本發(fā)明的共聚物和現(xiàn)在可用的聚合物之間在轉(zhuǎn)染活性上這一巨大的不同可以是由于聚合物復(fù)合物、合成方案和生理化學(xué)性質(zhì)的不同。
例如，本發(fā)明的多嵌段共聚物是使用線性聚乙烯亞胺(LPEI)嵌段合成的，其與分支的聚乙烯亞胺相比表現(xiàn)出相當(dāng)不同的溶解性模式。由于線性PEI結(jié)構(gòu)不具有任何伯胺，與在先前報(bào)道中用到的那些鍵合/偶聯(lián)試劑相比，本發(fā)明中使用了不同的鍵合/偶聯(lián)試劑，Bioconjugate Chem.，2003，14，934；Bioconjugate chem.2001，12，989。另外，當(dāng)連接體與分支的PEI的分子量比≥1時(shí)，可以引起陽離子聚合物的多胺主鏈的顯著稀釋，并且是它們交聯(lián)產(chǎn)物轉(zhuǎn)染活性適度增加的原因。在本發(fā)明中，使用短連接體并且連接體對(duì)聚合物分子量的比＜0.2，這使得多胺聚合物主鏈的稀釋最小化。本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)之間的另一顯著不同是連接體和聚合物嵌段之間化學(xué)鍵的性質(zhì)。優(yōu)選的，本發(fā)明使用二硫鍵，其比酰胺鍵更容易生物降解。其他生物可降解鍵也可以用在本發(fā)明中，包括磷酸酯、腙、順式asotinyl、氨基甲酸乙酯和聚(乙烯)。由于任何連接體以分步模式反應(yīng)，因此其可以連接不同的嵌段或同一嵌段的不同區(qū)域(環(huán)形成)。由于多重成環(huán)，后者將促成具有溶解性差的較少交聯(lián)的物質(zhì)的形成。本發(fā)明的方法通過在LPEI嵌段中摻入部分和可逆的氮原子阻斷/保護(hù)來解決這一問題。此類LPEI起作用的過程也增加了聚合物的溶解性，促進(jìn)了LPEI嵌段的連接。此方法也可用于將附屬(pendant)輔助配體(例如脂類或熒光標(biāo)記)方便的摻入陽離子聚合物。最終，本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物是水溶性的并且表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染活性(比單嵌段聚合物轉(zhuǎn)染活性增強(qiáng)68-70倍)，而現(xiàn)有技術(shù)中的多嵌段共聚物水溶性差并且僅比單嵌段聚合物活性略好(3-4倍)。
通常，本發(fā)明的陽離子嵌段共聚物可以以下列化學(xué)式表示(CP)xLyYz其中CP代表包含至少一個(gè)仲胺基的陽離子聚合物，所述CP聚合物具有1000道爾頓至25000道爾頓之間的數(shù)均分子量；Y代表雙功能生物可降解連接體，其包含酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或磷酸鹽鍵；L代表配體；x是1至20之間的整數(shù)；y是1至100的整數(shù)；且z是0至40之間的整數(shù)。
更具體的，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案可以由下列化學(xué)式表示Ls[-CO(CH2)aSS(CH2)aCO-]p{[(CH2)nNH2+]q}r其中(CH2)n是共價(jià)連接到氮上并且形成線性聚烷烯亞胺主鏈的脂族碳鏈；L代表選自脂類、熒光標(biāo)記和靶向部分的配體；[-CO(CH2)aSS(CH2)aCO-]代表生物可降解的二硫代二酸連接體；其中整數(shù)a為1至15之間；n為2到15的整數(shù)；p是1到100的整數(shù)；q是20到500的整數(shù)；r是1到20的整數(shù)；并且s是1到40的整數(shù)。
如在圖1中舉例說明的，可以合成多種分子量的線性聚乙烯亞胺，其是在Tanaka方法基礎(chǔ)上略有改變的，Macromolecules，16849-853，1983。具體的，在多種量的起始物Me2SO4存在時(shí)，在140℃大量聚合純化的2-苯基-2-唑啉。將得到的聚(N-苯甲?；蚁﹣啺?s通過加熱到140-150℃，用60％的H2SO4水解。在移除副產(chǎn)品苯甲酸后，通過蒸汽蒸餾將LPEI(在圖2中說明了NMR)冷卻以硫酸鹽的形式(化學(xué)計(jì)量接近于硫酸鹽水合物，具有一個(gè)硫酸根(sulfate)并且每兩個(gè)氮有1分子水)高產(chǎn)量分離。在苛刻的水解條件中，主鏈完整性的保存是通過測量再次苯甲?；腖PEI游離堿的分子量來指示的(見下頁)。
LPEI的這些硫酸鹽在正常條件下具有低溶解性，但是在強(qiáng)酸(pH＜0)或含水弱堿(例如NaHCO3-聚銨聚合物主鏈的脫質(zhì)子化作用和LPEI硫酸鹽晶格的破壞)中是可溶的。LPEI硫酸鹽及其衍生物的這一低溶解性已經(jīng)被我們優(yōu)選的用在分離和純化LPEI及其衍生物中。另外，LPEI更可溶的鹽可以通過與相應(yīng)的鋇鹽交換來從硫酸鹽中制備。游離堿(作為可溶性不佳的水合物)通過用大量過量的NaOH處理硫酸鹽來制備。一系列具有從2kD到20kD的Mw的LPEI可以以這種方式制備。
LPEI的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物可以按照?qǐng)D3中舉例說明的來合成。由于它們作為水合物的低溶解性和作為無水游離堿的吸濕性，LPEI的化學(xué)修飾有一些不便。用于PEI交聯(lián)的任何雙功能連接體可以在屬于同一聚合物嵌段的兩個(gè)氮原子之間(即形成環(huán)，實(shí)際上沒有連接聚合物分子)或在來自不同聚合物嵌段的兩個(gè)氮原子之間(即真正連接聚合物嵌段)形成連接。由于很難化學(xué)計(jì)量區(qū)別這兩種連接模式，最容易的分析測試是通過光散射或溶液粘度測量來確定分子量并且確定得到的多嵌段產(chǎn)品的生物學(xué)活性，J.Mater.Chem.1995，5，405-411。在任何所給氮原子的附近，同一主鏈氮的[局部]濃度高并且不依賴于溶液濃度，而來自不同主鏈的氮的濃度低并且是濃度依賴性的。因此，在正常條件下，可以預(yù)期環(huán)形成是連接體優(yōu)選的反應(yīng)途徑。
為了使得此類環(huán)形成最小化，可以使用(至少一種)下列方法。第一個(gè)方法是通過在反應(yīng)混合物中增加聚合物分子的濃度。但是，聚合物溶解性使得此方法明顯受到限制。第二種方法是通過適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基可逆阻斷來增加在每個(gè)聚合物分子中可用的氮原子數(shù)量。這也增加了在有機(jī)溶劑中LPEI的溶解性。至少，當(dāng)每個(gè)分子只有一個(gè)可用的氮原子時(shí)，環(huán)形成是不可能的并且唯一可能的聚集體是二聚體。對(duì)于不徹底保護(hù)的聚合物，來自其他聚合物鏈的氮原子局部濃度與同一鏈的氮原子局部濃度同時(shí)減少，但是與之相當(dāng)?shù)?，相?duì)于環(huán)形成，產(chǎn)生了50％可能性的連接。
如果其附著隨著逐步發(fā)生是可見的，可以不僅到達(dá)已經(jīng)附著的聚合物分子的最近區(qū)域，而且可以到達(dá)溶液的更大容積中。如果聚合物濃度足夠高，從而另一聚合物分子進(jìn)入此體積中并且成為可用的(與已經(jīng)附著的聚合物分子的剩余物一起)，聚合物嵌段連接的可能性增加。此方法明顯的缺點(diǎn)是必需使用很長的連接體(其相應(yīng)的具有高分子量)，以及具有大量連接體的交聯(lián)產(chǎn)物的不可避免的稀釋。
基于這些考慮，更大PEI聚集體的使用是有問題的。因此，在本發(fā)明中選擇具有最低(低毒性)分子量的線性PEI作為PEI結(jié)構(gòu)單元，Macromolecules，1983，16卷，849；J.Polym.Sci.Polym.Lett.編著1978，16卷(1)，13。研究不同分子量的LPEI的基因轉(zhuǎn)染能力和毒性后，選擇具有MW為3.6K的LPEI作為合適的LPEI嵌段。將叔丁氧基羰基(Boc)基團(tuán)用作可移動(dòng)的保護(hù)基。之后將無水LPEI轉(zhuǎn)變成它們不徹底保護(hù)的形式。發(fā)現(xiàn)90％-95％Boc的摻入產(chǎn)生最優(yōu)的結(jié)果。得到的物質(zhì)具有更好的溶解性并且能在其剩余的游離NH基團(tuán)上進(jìn)行化學(xué)修飾。這些聚合物的NMR在圖4中說明。此方法對(duì)于連接一些更小的LPEI分子是優(yōu)選的，這是因?yàn)楫?dāng)使用未保護(hù)的LPEI時(shí)，環(huán)形成最小化是不可避免的。
使用生物可降解(例如二硫化物)連接體，使得連接與所使用的LPEI相關(guān)的毒性最小化的更小尺寸的LPEI有意義。Klibanov等人使用了概念上類似的方法-低分子量的疏水性改性分支的PEI的物理聚集，以及之前已經(jīng)連接的分支PEI，Proc.Nat.Acad.ScI.，2002，99卷(23)14640；美國專利6,652,886；Bioconjugate Chem.，2003，14,934；Bioconjugate chem.2001，12，989。但是，這些作者使用對(duì)BPEI的伯氨基基團(tuán)特異性的二硫化物連接試劑和通過凝膠滲透層析的非制備性費(fèi)力純化。本發(fā)明的方法不具有這些限制。發(fā)現(xiàn)在嵌段連接完成的同時(shí)很容易在單罐反應(yīng)中將附屬配體連接到聚乙烯亞胺嵌段上。本發(fā)明合成方案的另一優(yōu)勢(shì)是使用比其分支的異構(gòu)體更有活性的LPEI。
本發(fā)明的LPEI生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物和脂聚物具有靜電吸附到聚陰離子化合物如核酸上的胺基。本發(fā)明的陽離子共聚物凝聚DNA并且形成緊湊的結(jié)構(gòu)。另外，在遞送生物活性物質(zhì)后形成的單體降解產(chǎn)物的低毒性提供了具有降低的細(xì)胞毒性和增加的轉(zhuǎn)染效率的基因載體。
本發(fā)明的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物還可以和示蹤物(例如熒光標(biāo)記)或靶向配體直接綴合或經(jīng)由間隔分子綴合。優(yōu)選的，只有小部分的可用氨基基團(tuán)與配體偶聯(lián)。綴合到聚合物的靶標(biāo)配體將聚合物-核酸/藥物復(fù)合物定向結(jié)合到特異性靶細(xì)胞并且進(jìn)入此類細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血細(xì)胞等)。靶標(biāo)配體還可以是細(xì)胞內(nèi)靶向元件，使得能夠?qū)⒋龑?dǎo)的核酸/藥物轉(zhuǎn)移到一些希望的細(xì)胞區(qū)室中(線粒體、核等)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，配體可以是與氨基基團(tuán)偶聯(lián)的糖部分。此類糖部分優(yōu)選是單糖或寡糖，例如半乳糖、葡萄糖、巖藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纖維二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麥芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和葡糖酸。由于肝細(xì)胞上半乳糖受體的高親和性和親和力，乳糖的半乳糖單元為肝細(xì)胞提供了方便的靶向分子。
可以使用的靶向配體的其他類型包括肽(如抗體或抗體片段)、細(xì)胞受體、生長因子受體、細(xì)胞因子受體、葉酸、運(yùn)鐵蛋白、表皮生長因子(EGF)、胰島素、脫唾液酸血清類黏蛋白、甘露糖-6-磷酸(單核細(xì)胞)、甘露糖(巨噬細(xì)胞、一些B細(xì)胞)、LewisX和唾液LewisX(內(nèi)皮細(xì)胞)、N-乙?；樘前?T細(xì)胞)、半乳糖(結(jié)腸癌細(xì)包)和凝血調(diào)節(jié)蛋白(小鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞)、融合劑如多黏菌素B和血凝素HA2、抗溶酶體劑、核定位信號(hào)(NLS)如T-抗原等。
使用特性粘數(shù)測量的生物可降解交聯(lián)的脂聚物的分子量分析顯示了針對(duì)線性聚乙烯亞胺標(biāo)準(zhǔn)物的7.5kD的表觀分子量(表1)。特性粘數(shù)(和光散射)實(shí)際上測量了聚合物分子取決于分子的分子量和形狀的有效回轉(zhuǎn)半徑(Introduction to Physical Polymer Science，第3版，Leslie Howard SperlingWiley，2001，第96-102頁)。從線性校正曲線可見LPEI分子在pH2.5的水溶液中傾向于“桿型”。對(duì)于分支的PEI，其需要引入＞1的“形狀因數(shù)”，說明聚合物分子更緊湊的堆積到相同的回轉(zhuǎn)半徑中。因此，分支的PEI的實(shí)際分子量高于其表觀值，所述表觀值通過形狀因數(shù)值針對(duì)線性PEI標(biāo)準(zhǔn)物測量。這在下面通過2個(gè)單元的線性分子對(duì)比任意描繪的適當(dāng)分支的3單元分子(形狀因數(shù)可以是非常高的)來舉例說明。從生物可降解交聯(lián)聚合物轉(zhuǎn)染活性的數(shù)據(jù)(圖8)可見形狀因數(shù)相當(dāng)?shù)?1.5-2)，因此測量的寡聚體很有可能接近三聚體分子。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是提供了其中顆粒大小和電荷密度容易調(diào)控的基因載體。顆粒大小的調(diào)控對(duì)于基因遞送系統(tǒng)的優(yōu)化及其重要，因?yàn)轭w粒大小通?？刂企w內(nèi)轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞毒性和組織靶向。在本發(fā)明中，顯示顆粒大小大約為100nm直徑(圖5)，這是通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的有效顆粒大小。另外，帶正電荷的顆粒表面提供了結(jié)合到帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面的充足機(jī)會(huì)，其隨后通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在本發(fā)明中公開的基因載體具有在+10至+20mV范圍內(nèi)的zeta電位(圖6)。
本發(fā)明的陽離子多嵌段共聚物適于將大分子如DNA遞送到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。將大且?guī)ж?fù)電荷的DNA分子凝聚成小(＜200nm)且?guī)д姾傻募{米顆粒的能力被認(rèn)為是通過陽離子聚合物的基因轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵步驟。陽離子聚合物/DNA復(fù)合物的顆粒大小和zeta電位受到聚合物/DNA復(fù)合物中聚合物和DNA分子之間的氮對(duì)磷酸鹽(N/P)比率的影響。下列顯示的實(shí)驗(yàn)和結(jié)果證明生物可降解聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)與其作為安全有效的基因遞送系統(tǒng)的用途是一致的。
使用凝膠電泳和顆粒定型(particle sizing)來檢測本發(fā)明生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物將DNA分子凝聚成小顆粒的能力。在圖7中顯示了添加增加濃度的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物前后質(zhì)粒DNA的電泳遷移率。由于聚合物和DNA之間的比率增加，因此與聚合物的DNA復(fù)合度增強(qiáng)。在N/P比為5/1到10/1之間達(dá)到最優(yōu)凝聚。聚合物/DNA復(fù)合物的平均直徑低于200 nm，這是靶細(xì)胞胞吞攝取復(fù)合物的適當(dāng)大小分布。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中生物可降解多嵌段共聚物的DNA復(fù)合物有轉(zhuǎn)染活性。本發(fā)明生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物基因載體的轉(zhuǎn)染效率與基本結(jié)構(gòu)聚合物嵌段的轉(zhuǎn)染效率的比較在圖8中闡明。當(dāng)使用生物可降解聚合載體時(shí)，表現(xiàn)出大約70倍的增加。脂質(zhì)部分對(duì)生物可降解多嵌段共聚物的共價(jià)連接進(jìn)一步增強(qiáng)了基因轉(zhuǎn)染效率，比基本結(jié)構(gòu)聚合物嵌段總共增強(qiáng)了140倍(圖8)。在將基因轉(zhuǎn)移按照暴露于轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞總數(shù)百分?jǐn)?shù)來定量的不同類型測定中，生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物通常轉(zhuǎn)染75-90％的靶細(xì)胞。在多種N/P比率下對(duì)比生物可降解交聯(lián)多嵌段共聚物的轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞毒性與25kD線性PEI的轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞毒性。如在圖9中所示，生物可降解交聯(lián)共聚物在所有測試N/P比的轉(zhuǎn)染活性顯著高于25kD線性PEI的轉(zhuǎn)染活性。這些數(shù)據(jù)證明本發(fā)明中描述的交聯(lián)方案將小分子量線性PEI(3.6kD)的轉(zhuǎn)染活性顯著增強(qiáng)到用更高分子量線性PEI(25kD)所達(dá)到的水平。
當(dāng)確定基因載體的有效性時(shí)，細(xì)胞生存力或細(xì)胞毒性是重要的參數(shù)。如前所述，陽離子聚合物的高轉(zhuǎn)染效率通常與高細(xì)胞毒性相關(guān)。在25kDPEI的Cos-1細(xì)胞中檢測了生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的細(xì)胞毒性。如在圖10和圖11中所示，與用25kD線性PEI所觀察到的相比，Cos-1細(xì)胞與包含熒光素酶質(zhì)粒和本發(fā)明生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的轉(zhuǎn)染復(fù)合物一起孵育僅產(chǎn)生了很小的細(xì)胞毒性。這些數(shù)據(jù)證明使用本發(fā)明描述的方案，通過小的生物可降解鍵偶聯(lián)小分子量線性PEI在沒有顯著增加細(xì)胞毒性下增強(qiáng)了聚合物的轉(zhuǎn)染活性。
為了評(píng)估生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物在體內(nèi)工作的能力，引入鼠腫瘤模型。對(duì)于這些研究，將同源小鼠菌株植入鼠乳癌細(xì)胞。在生長一段時(shí)期后，對(duì)腫瘤注射與生物可降解聚合物載體復(fù)合的熒光素酶質(zhì)粒。處理24小時(shí)后，將腫瘤移除并且分析勻漿的蛋白質(zhì)表達(dá)(圖12)。兩種生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物(有或沒有脂質(zhì)部分)都能夠轉(zhuǎn)染腫瘤組織，這證明了這些聚合物對(duì)于人疾病基因治療的治療性潛力。
為了幫助轉(zhuǎn)染復(fù)合物在細(xì)胞中的定位，將熒光若丹明共價(jià)連接到生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物上。將熒光標(biāo)記的生物可降解多嵌段共聚物與β-半乳糖苷酶質(zhì)粒復(fù)合，并且加入到Cos-1細(xì)胞培養(yǎng)物中4小時(shí)。用標(biāo)記的聚合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光顯微術(shù)顯示Cos-1細(xì)胞攝取了將近100％(圖13，圖A)。在胎牛血清存在或不存在時(shí)，與未標(biāo)記的聚合物/DNA復(fù)合物相比，生物可降解多嵌段共聚物的熒光標(biāo)記不影響基因轉(zhuǎn)移(圖B)。當(dāng)熒光標(biāo)記的聚合物與熒光素酶質(zhì)粒一起使用時(shí)得到了類似的結(jié)果(圖C)。
下列實(shí)施例使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更清楚的理解如何實(shí)踐本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管本發(fā)明與其優(yōu)選的具體實(shí)施方案一起描述，下列所述實(shí)施方案意在說明而不是限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其他方面對(duì)于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
實(shí)施例1線性聚乙烯亞胺的合成此實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明硫酸鹽形式的線性聚乙烯亞胺聚合物嵌段的制備(圖1、2)。
這些物質(zhì)是通過略微改變的Tanaka方法制備的，Macromolecules，1983，16卷，849-853。
1.單體純化通常將市售2-苯基唑啉染色(黃綠到褐色)并且在真空(bp 110°/8mmHg)中蒸餾以得到無色物質(zhì)。向300g此類餾出液中加入大約45g磨碎的(粉末)KOH，并且將混合物放置在500mL燒瓶中。將該燒瓶連接至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，之后在大氣壓下50℃浴中旋轉(zhuǎn)4-5小時(shí)。發(fā)生微黃色著色。將混合物過濾通過燒結(jié)玻璃板漏斗；將固體塊用少量二氯甲烷洗滌，并且之后棄去。將濾液用水洗滌(2×100-150mL)，之后用Na2SO4干燥。向干燥的液體中加入1g苯甲酰氯并且將混合物蒸餾(首先在760mm移除第一二氯甲烷，之后移除具有強(qiáng)烈芐腈味道的混濁初餾物(bp＜100°/8)，并且之后在110°/8mmHg收集純化的苯基唑啉)。可以將其在氬氛下Na2SO4上儲(chǔ)存至少幾天?；厥章适谴蠹s90％。
2.聚合聚(N-苯甲酰乙烯亞胺)將特別制成的可密封的小瓶裝入100g(680mMol)純化的苯基唑啉和0.62g Me2SO4。將混合物旋轉(zhuǎn)以確?；旌?，并且將小瓶連接到真空/Ar歧管上并且放在冷卻浴中。一旦混合物固化，就將小瓶放在溫水浴中。允許混合物在真空下熔化并且脫氣，并且在真空下密封小瓶。之后將密封的小瓶放到熱浴中(140℃，但是，對(duì)于裝入更多催化劑，可以更激烈的進(jìn)行聚合，并且至少是在聚合開始時(shí)，更低的浴溫度(120℃)是可取的)。將小瓶在140℃維持48小時(shí)，在此期間混合物固化。之后將小瓶從熱浴中移出，冷卻并且打破。將易碎的聚合物掰碎成小片并且研磨成粉末。在下一步過程中似乎即使是8-10mm大小的大塊也在熱酸中緩慢水解并且通過攪拌分散，因此精細(xì)的研磨是不必要的?；厥盏?8-99g的MW為12K(通過GPC確定，針對(duì)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物)。以這種方式使用不同量的催化劑制備不同MW(8K到51K)的聚合物。
3.脫芐基作用線性聚乙烯亞胺硫酸鹽將1升圓底燒瓶中裝入大約50g聚(N-苯甲?；?乙烯亞胺)、水(180mL)和濃縮的H2SO4(300g)。將燒瓶裝上1個(gè)蛋形的磁性攪拌棒和(空氣)回流冷凝器。將該燒瓶放在140-145℃加熱浴中，加熱混合物并攪拌。最初，聚合物形成粘性物質(zhì)，其不久成為混濁分散體；(高能混合是必需的)。加熱和攪拌持續(xù)大約20小時(shí)。之后停止攪拌；熔化的苯甲酸形成(頂部)分離層。之后使用大移液管將熱的更低層轉(zhuǎn)移到另一燒瓶中；由于冷卻時(shí)其會(huì)固化，因此該轉(zhuǎn)移必需迅速進(jìn)行。將這一固化的更低層用水(大約400mL)稀釋，并且通過蒸汽蒸餾移除任何剩余的苯甲酸。作為增加的測試在蒸汽蒸餾結(jié)束前熱的可蒸餾液體(pot liquid)應(yīng)當(dāng)變成澄清的。此時(shí)固體的存在指示了不完全的脫芐基作用。冷卻時(shí)，可蒸餾的液體分離成聚乙烯亞胺硫酸鹽(水合物)的白色到灰白色晶體；其是通過過濾，在濾器上用水然后用丙酮洗滌，并且之后干燥來收集?；厥沾蠹s33g(97％)。
從MW為51K的苯甲?；?LPEI得到的物質(zhì)具有對(duì)應(yīng)于其所要求的結(jié)構(gòu)的NMR(D2SO4，Me3SiCD2CD2CO2Na作為標(biāo)準(zhǔn)物)δ3.62(s，CH2基團(tuán))；6.4-8.2(微量的苯甲?；鶊F(tuán))。元素分析(Galbraith Laboratories)為(-CH2NHCH2CH2NHCH2-x1H2SO4x1H2O)C 23.75％；N 13.87％，S15.85％所計(jì)算出的值是C 22.37％；N 12.54％，S 16.58％。此物質(zhì)的少量樣品被再次苯甲?；?不徹底的)并且MW為45 K，這表示在苛刻的水解條件下沒有顯著的主鏈降解發(fā)生。
實(shí)施例2生物可降解多嵌段陽離子聚合物的合成此實(shí)施例舉例說明了3.6kD線性PEI(BD3.6K)的生物可降解多嵌段共聚物的制備(圖3、4)。
1.線性聚乙烯亞胺游離堿將2L錐形瓶裝上磁性攪拌器并且裝入LPEI(Mw 3.6kD)硫酸鹽水合物(30g，大約0.15Mol SO42-)以及水(1L)。將NaOH(20g，0.5Mol)加入到攪拌的混合物中并且將多相混合物加熱到50-60℃并且攪拌3小時(shí)。將混合物冷卻；將沉淀的LPEI水合物過濾、用水洗滌并且干燥。
2.LPEI3600BOC95％將預(yù)先涂焦油的250mL燒瓶裝入LPEI游離堿水合物(7.1g)并且連接到真空管。將抽成真空的燒瓶在油浴中加熱到75℃。LPEI水合物伴隨著起泡緩慢轉(zhuǎn)變成無水LPEI熔化物。真空下加熱3小時(shí)后，冷卻褐色的LPEI熔化物，并且將燒瓶用氬吹洗。得到5.4g(125mMol的N)的無水LPEI。向裝有LPEI的燒瓶中加入120mL干燥氯仿和磁性攪拌棒。將混合物在氬中攪拌直到LPEI熔化物溶解，形成輕微混濁的溶液。經(jīng)過10分鐘向此攪拌的溶液中加入t-丁氧基羰基(BOC)酐(26g，119mMol，95％)。加入伴隨著溫和的放熱反應(yīng)和氣體逸出。將混合物攪拌3小時(shí)，過濾出少量懸浮的微粒，并且將混合物在真空中濃縮。回收17g，MW大約為11700(通過針對(duì)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物的GPC)。
3.LPEI-連接體共軛物將小瓶裝上磁性攪拌器并且裝入2.3g(197μMol)的LPEI3600BOC95％和5mL干燥的氯仿。加熱混合物并且攪拌分散，并且將0.5mL氯仿中的150mg(600μMol)二硫代二丙酰氯(從市售二硫代二丙酸和亞硫酰氯得到)經(jīng)過10分鐘緩慢加入到攪拌的混合物中。將攪拌的混合物在室溫下放置幾天直到強(qiáng)凝膠化。此時(shí)，加入10mL三氟乙酸并且將混合物攪拌30分鐘。將得到的多相混合物的更低(褐色)層移出，并且用40mL水稀釋。通過離心移除剩余的氯仿和少量微粒雜質(zhì)。向上清中加入10mL水中的Na2SO4(3g)水溶液，并且收集得到的連接的LPEI(BD3.6K)硫酸鹽沉淀物，用水然后用丙酮洗滌，并且干燥。產(chǎn)物是1.2g的灰白色物質(zhì)。
將50mL燒瓶裝入1.2g BD3.6K硫酸鹽(大約520mg硫酸鹽)和30mL水。加入BaCl2二水合物(1200mg，理論上90％)并且將多相混合物劇烈攪拌48小時(shí)。之后將硫酸鋇濾出，將含水濾液另外過濾通過0.2μm的注射器濾器，之后在真空下將含水濾液濃縮到大約6mL體積。在用200mL丙酮稀釋后，將沉淀的連接的LPEI氯化物過濾，用丙酮洗滌并且干燥。收集的量是大約0.9g。
可選的，凝膠化的BOC保護(hù)的物質(zhì)可以通過用過量HCL/二烷溶液處理來脫保護(hù)。脫保護(hù)的反應(yīng)混合物和固體剩余物的THF研制劑真空濃縮直接產(chǎn)生氫氯化物形式的靶標(biāo)物質(zhì)。
實(shí)施例3生物可降解多嵌段陽離子聚合物的脂質(zhì)共軛物的合成此實(shí)施例舉例說明了生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的脂質(zhì)共軛物的制備。3.6kD線性PEI(BD3.6K)的生物可降解多嵌段共聚物與脂質(zhì)油酰四甘醇羰基共軛以形成BD3.6K-油酰(BD3.6K-O)。
將小瓶裝上磁性攪拌器并且裝入2.3g(197μMol)的LPEI3600BOC95％和6mL干燥氯仿。將混合物加熱并且攪拌到分散，經(jīng)過10分鐘向攪拌的混合物中緩慢加入1.2mL氯仿中的150mg(600μMol)二硫代二丙酰氯(從市售的二硫代二丙酸和亞硫酰氯得到)和1.2mL氯仿中的110mg(大約200μMol)的油酰四甘醇羰基氯化物(從市售的聚乙二醇單油酰酯和光氣得到)。將經(jīng)攪拌的混合物在室溫下放置幾天直到強(qiáng)凝膠化。此時(shí)，加入10mL三氟乙酸并且將混合物攪拌30分鐘。將得到的多相混合物的更低(褐色)層移出并且用40mL水稀釋。通過離心移除剩余的氯仿和少量的微粒雜質(zhì)。向上清中加入10mL水中的Na2SO4(3g)水溶液，并且收集得到的連接的功能性LPEI(BD3.6K-O)硫酸鹽沉淀物，用水然后用丙酮洗滌，并且干燥。產(chǎn)物是1.35g的灰白色物質(zhì)。
將50mL燒瓶裝入1.3g(BD3.6K-O)硫酸鹽(大約550mg硫酸鹽)和30mL水。加入BaCl2二水合物(1.25g，理論上90％)并且將多相混合物劇烈攪拌48小時(shí)。之后將硫酸鋇濾出，將含水濾液另外過濾通過0.2μm的注射器濾器，之后在真空下將含水濾液濃縮到大約6mL體積。在用200mL丙酮稀釋后，將沉淀的(BD3.6K-O)氯化物過濾，用丙酮洗滌并且干燥。收集的量是0.9g。
可選的，凝膠化的BOC保護(hù)的物質(zhì)可以通過用過量HCL/二烷溶液處理來脫保護(hù)。脫保護(hù)的反應(yīng)混合物和固體剩余物的THF研制劑真空濃縮，直接產(chǎn)生氫氯化物形式的靶標(biāo)物質(zhì)。
實(shí)施例4共價(jià)連接到熒光標(biāo)記的脂質(zhì)生物可降解多嵌段陽離子聚合物的脂質(zhì)共軛物的合成此實(shí)施例舉例說明了生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的熒光標(biāo)記的脂質(zhì)共軛物的制備。用熒光標(biāo)記若丹明標(biāo)記實(shí)施例3(BD3.6K-O)的生物可降解多嵌段脂聚物。
將小瓶裝上磁性攪拌器并且裝入1.86g(156μMol)的LPEI3600BOC95％和5mL干燥氯仿。將混合物加熱并且攪拌至分散。經(jīng)過10分鐘向攪拌的混合物中緩慢加入熒光標(biāo)記麗絲胺磺酰氯(9mg，1mL CHCl3中的大約15μMol)和0.5mL CHCl3中的120mg(470μMol)二硫代二丙酰氯以及0.5mLCHCl3中的85mg(大約160μMol)的油酰四甘醇羰基氯化物。將攪拌的混合物進(jìn)一步在真空下濃縮到6mL體積，并且在50℃浴中放置幾天直至強(qiáng)凝膠化。48小時(shí)后，將混合物用100mL的石油醚稀釋并且將固體物質(zhì)通過過濾收集并且在濾器上用丙酮洗滌直到濾液幾乎是無色并且干燥的。向干燥物質(zhì)中加入5mL CHCl3和5mL三氟乙酸，并且將混合物攪拌90分鐘。將得到的多相混合物的更低(褐色)層移出并且用40mL水稀釋。通過離心移除剩余的氯仿和少量的微粒雜質(zhì)。向混合物中加入10mL水中的Na2SO4(3g)水溶液，并且收集得到的連接的功能性LPEI硫酸鹽沉淀物，用水然后用丙酮洗滌，并且干燥。在洗滌過程中移除了顯著量的未共軛的若丹明(紫色染料)，大概指示了磺酰氯水解。得到大約1.4g紫色物質(zhì)。
將50mL燒瓶中裝入1.4g標(biāo)記的LPEI共軛物(大約550mg硫酸鹽)和30mL水。加入BaCl2二水合物(1.4g，大約95％)并且劇烈攪拌多相混合物48小時(shí)。之后將硫酸鋇濾出，將含水濾液另外過濾通過0.2μm的注射器濾器，之后在真空中將含水濾液濃縮到大約5mL體積。在用200mL丙酮稀釋后，將沉淀的連接的功能性LPEI氯化物過濾，用丙酮洗滌并且干燥。收集的量大約為0.9g。
實(shí)施例5生物可降解多嵌段陽離子聚合物的分子量評(píng)估制備蒸餾水中的LPEI氫氯化物和生物可降解交聯(lián)多嵌段聚合物(精確測量的濃度是在5mg/ml的范圍內(nèi)、pH～2.5)的溶液。在浸漬槽(裝滿水的大燒杯，21℃)中放置Cannon-Fenske常規(guī)粘度計(jì)，并且測量通過粘度計(jì)毛細(xì)管的固定體積的這些溶液和溶劑(蒸餾水)的流動(dòng)時(shí)間。溶液流動(dòng)時(shí)間與溶劑流動(dòng)時(shí)間的無因次比率記錄為相對(duì)粘度。將相對(duì)粘度與溶液濃度的比(以g/dl測量)作為特性粘數(shù)(更嚴(yán)格的講，其應(yīng)當(dāng)在無限稀釋時(shí)作為極限值測量)。將此值(g/dl)針對(duì)LPEI聚合物的分子量來作圖，該分子量是前體聚(N-苯甲酰乙烯亞胺)對(duì)聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)物的GPC預(yù)先測量的。粘度測量和分子量分析的結(jié)果描述在表I中。
表I

實(shí)施例6質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化此實(shí)施例舉例說明了用來與本發(fā)明生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物復(fù)合的DNA的制備。將編碼熒光素酶蛋白質(zhì)的質(zhì)粒和編碼β-半乳糖甘酶(β-Gal)蛋白質(zhì)的質(zhì)粒在大腸桿菌(E.coli)菌株JM109中擴(kuò)增，之后根據(jù)制造商說明使用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi-prep或Giga-prep試劑盒(Chatsworth，CA)純化。純化后，使用260nm的吸光度分光光度確定DNA濃度。使用瓊脂糖凝膠電泳，隨后通過溴化乙錠染色，評(píng)估質(zhì)粒DNA的完整性。
實(shí)施例7DNA和生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的水溶性復(fù)合物的制備此實(shí)施例舉例說明了BD3.6K-O/DNA復(fù)合物的形成。將BD3.6K-O聚合物溶解在無菌水中以得到3mg/ml的最終濃度。將DNA溶解在無菌水中得到1mg/ml的最終濃度。為了制備聚合物/DNA復(fù)合物，將兩種成分分別用5％葡萄糖稀釋到150μl體積，之后將質(zhì)粒DNA溶液加入到聚合物溶液中。允許復(fù)合物形成在室溫進(jìn)行15分鐘。為了研究電荷比對(duì)基因轉(zhuǎn)移的影響，將BD3.6K-O/DNA復(fù)合物在不同的氮/磷酸鹽(N/P)比例1/1、5/1、10/1，和20/1制備。在復(fù)合物形成后，將復(fù)合物在比色杯中稀釋來測量復(fù)合物的顆粒大小(圖5)和ξ電位(圖6)。在25℃以657nm的波長和90°恒定角，用具有BI-Zeta選擇的90Plus/BI-MAS Particle size(BrookhavenInstruments Corp.，Holtsville，N.Y.)測量樣品的電泳遷移率。
實(shí)施例8凝膠阻滯測定BD3.6K-O聚合物凝聚質(zhì)粒DNA的能力在此實(shí)施例中評(píng)估(圖7)。簡言之，將BD3.6K-O以多種N/P比(1/1、5/1、10/、20/1)，在5％葡萄糖(w/v)存在時(shí)與質(zhì)粒DNA復(fù)合。將復(fù)合物在1％瓊脂糖凝膠上電泳。帶正電荷的BD3.6K-O聚合物與DNA糖主鏈上帶負(fù)電荷的磷酸根離子形成強(qiáng)的復(fù)合物。當(dāng)N/P比達(dá)到(10/1)時(shí)，沒有看見游離DNA。
實(shí)施例9體外基因轉(zhuǎn)移此實(shí)施例說明使用本發(fā)明生物可降解交聯(lián)多嵌段共聚物與DNA的復(fù)合物的體外基因轉(zhuǎn)移(圖8、9)。將包含熒光素酶質(zhì)粒、pCMV-Luc和BD3.6K-O或高分子量的LPEI(25kD)的轉(zhuǎn)染復(fù)合物以不同的聚合物/DNA(N/P)比例在Dulbecco’s改良的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中制備，并且測試細(xì)胞培養(yǎng)物中熒光素酶基因轉(zhuǎn)移。將Cos-1細(xì)胞(1.5×105)接種在12孔組織培養(yǎng)板中的10％FBS中至80％匯合。將包含1μg質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到存在或不存在10％胎牛血清的每孔中，在CO2培養(yǎng)箱中6小時(shí)。移除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞用1mL包含10％FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)40小時(shí)。將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液洗滌并且用TENT緩沖液(50mMTris-Cl[pH 8.0]、2mM EDTA、150mM NaCl、1％Triton X-100)裂解。使用Orion微量培養(yǎng)板發(fā)光計(jì)(Berthold Detection systems美國，Oak Ridge，TN)，測量細(xì)胞裂解物中的熒光素酶活性作為相對(duì)光單位(RLU)。以RLU/mg總蛋白質(zhì)報(bào)告熒光素酶的最終值。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce Chemical C，Rockford，IL)進(jìn)行總蛋白質(zhì)測定。
上述方法也用于β-半乳糖甘酶基因轉(zhuǎn)移。β-半乳糖甘酶基因轉(zhuǎn)移的水平是用獲自Gene Therapy Systems，Inc.(San Diego，CA)的X-Gal染色測定試劑盒來定量。
實(shí)施例10細(xì)胞毒性此實(shí)施例給出了使用不同氮與磷酸鹽比例的BD3.6K-O的DNA復(fù)合物進(jìn)行生物可降解交聯(lián)多嵌段共聚物的細(xì)胞毒性篩選中的步驟(圖10、11)。轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性是通過總蛋白質(zhì)測定和細(xì)胞增殖測定來評(píng)定的(Promega Corporation，2800 Woods Hollow Road，Madison，WI53711-5399)。蛋白質(zhì)測定在實(shí)施例8中描述。
Cos-1(非洲綠猴腎細(xì)胞)在補(bǔ)充了10％胎牛血清、1％青霉素、1％鏈霉素和谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中生長和維持。將細(xì)胞放置在37℃潤濕的5％CO2培養(yǎng)箱中。
將Cos-1細(xì)胞以1.5×103細(xì)胞/孔的密度置于96孔板中并且在37℃5％CO2中培養(yǎng)過夜。在達(dá)到70-80％匯合后，將0.1μgDNA以多種電荷比率加入到BD3.6K-O中。下一步，將BD3.6K-O/DNA復(fù)合物加入到分成兩組的孔中包含F(xiàn)BS的DMEM和沒有FBS的DMEM，兩組都具有每孔100μL的總體積。將無血清的孔溫育5-6小時(shí)，吸除培養(yǎng)基，并且之后加入沒有抗生素的正常生長培養(yǎng)基。將包含F(xiàn)BS的孔孵育24小時(shí)，并且加入等體積的包含培養(yǎng)基的血清(無抗生素)。轉(zhuǎn)染后兩組都孵育48小時(shí)之后，將培養(yǎng)基從所有孔中吸除，并且將100μL正常生長培養(yǎng)基(無抗生素)加入到所有孔中。隨后，將20μL室溫CellTiter 96AQueousOne SolutionReagent加入到每孔中并且將平板溫育4小時(shí)。在溫育期后，將平板在ELISA平板讀數(shù)器上在490nm分光光度讀數(shù)。使用下列等式計(jì)算細(xì)胞生存力相對(duì)百分比生存力(％)＝OD490(樣品)/OD490(對(duì)照)×100OD490(對(duì)照)代表了來自僅用生長培養(yǎng)基處理的孔的測量值，并且OD490(樣品)代表了來自用不同比率的BD3.6K-O/DNA處理的孔的測量值。
基于細(xì)胞毒性測定的蛋白質(zhì)中BD3.6K-O和25 KD LPEI的并行比較證明了BD3.6K-O較少的細(xì)胞毒性(圖10)。在細(xì)胞生存力測定中還檢測了BD3.6K及其脂質(zhì)衍生物BD3.6K-O的細(xì)胞毒性。如在圖11中所示的，將Cos-1細(xì)胞暴露于包含BD3.6K或BD3.6K-O的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，不影響細(xì)胞生存力。
如在圖11中所示的，將Cos-1細(xì)胞暴露于包含BD3.6K或BD3.6K-O的轉(zhuǎn)染復(fù)合物不影響細(xì)胞生存力。
實(shí)施例11體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移此實(shí)施例說明了使用質(zhì)粒遞送用生物可降解交聯(lián)多嵌段共聚物的體內(nèi)基因表達(dá)(圖12)。將編碼熒光素酶蛋白質(zhì)的質(zhì)粒腫瘤內(nèi)注射到小鼠中，劑量為30μl體積的0.2mg/ml以10∶1 N∶P比與聚合載體BD3.6K-O復(fù)合的總DNA。這給每個(gè)腫瘤6μgDNA劑量。在此實(shí)施例中，通過施用在細(xì)胞培養(yǎng)物中制備的PBS中的1×1064T1細(xì)胞(鼠乳癌)，將乳癌引入到7-8周齡的BALB/c小鼠的左右側(cè)脅中。10-11天后，按照公式計(jì)算體積＝4/3×3.14×(L/2×W/2×H/2)，其中L是腫瘤長度，W是腫瘤寬度并且H是高度，當(dāng)腫瘤大小達(dá)到大約70mm3時(shí)，將腫瘤注射質(zhì)粒/聚合物復(fù)合物。一天后，將腫瘤移出并且使用LN2冷凍。之后將腫瘤在裂解緩沖液中勻漿，并且根據(jù)制造商的說明使用Promega熒光素酶測定系統(tǒng)(Madison，WI)，使用Orion微量培養(yǎng)板發(fā)光計(jì)(Berthold Detection systems，Oak Ridge，TN)，分析熒光素酶活性。
實(shí)施例12
熒光標(biāo)記的聚合物體外轉(zhuǎn)染/分析此實(shí)施例說明了熒光標(biāo)記的生物可降解交聯(lián)多嵌段聚合物在轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞定位和體外基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用(圖13)。將Cos-1細(xì)胞以1.5×105/孔的細(xì)胞密度，接種到12孔組織培養(yǎng)板中包含10％FBS的DMEM中。在用BD3.6K-O/DNA轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞達(dá)到80％匯合。將載入的DNA總量維持在恒定的1μg/孔，并且轉(zhuǎn)染在存在或不存在10％FBS的血清中進(jìn)行。在復(fù)合物存在下將細(xì)胞孵育6小時(shí)，隨后用包含10％FBS的1 mLDMEM置換并且再孵育40小時(shí)。之后使用來自Gene Therapy Systems，Inc(San Diego，CA)的X-Gal染色測定試劑盒評(píng)估β-Gal的表達(dá)水平。
對(duì)于使用熒光顯微術(shù)的檢測，細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法與β-Gal分析相同，除了與BD3.6K-O/DNA孵育2小時(shí)后，將培養(yǎng)基移除并且將細(xì)胞用PBS洗滌并且隨后使用胰蛋白酶收獲。之后將細(xì)胞固定，放在載玻片上并且使用倒置熒光顯微鏡來檢測。用標(biāo)記的聚合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光顯微術(shù)顯示出Cos-1細(xì)胞將近100％的攝取(圖13，圖A)。存在或不存在胎牛血清時(shí)，與未標(biāo)記的聚合物/DNA復(fù)合物相比，生物可降解多嵌段共聚物的熒光標(biāo)記不影響基因轉(zhuǎn)移(圖B)。當(dāng)與熒光素酶質(zhì)粒一起使用熒光標(biāo)記的聚合物時(shí)，得到類似的結(jié)果(圖C)。
實(shí)施例13生物可降解多嵌段陽離子聚合物BD15K-12的合成此實(shí)施例舉例說明了生物可降解多嵌段陽離子聚合物BD15K-12的制備，其中單體聚乙烯亞胺是15kD線性PEI，其每個(gè)PEI單體具有12個(gè)二硫代二丙酸酯連接體。在前述實(shí)施例中，我們已經(jīng)使用3.6kD的LPEI單體用于交聯(lián)。
1.線性聚乙烯亞胺(MW15kD；游離堿)將2L錐形瓶裝上磁性攪拌器并且裝入LPEI(Mw 15000D)硫酸鹽水合物(30g，大約0.15Mol SO42-)和水(1L)。將NaOH(20g，0.5Mol)加入到攪拌的混合物中，并且將得到的多相混合物加熱到50-60℃并攪拌3小時(shí)。將混合物冷卻，將沉淀的LPEI水合物過濾、用水洗滌并且干燥。
2.LPEI15000BOC95％將預(yù)先涂焦油的250mL燒瓶裝入LPEI游離堿水合物(6g)并且連接到真空管。將抽成真空的燒瓶在油浴中加熱到80℃。LPEI水合物伴隨著起泡緩慢轉(zhuǎn)變成無水LPEI熔化物。在真空下加熱3小時(shí)后，將褐色的LPEI熔化物冷卻，并且將燒瓶用氬吹洗。得到4g(93mMol的N)的無水LPEI。向具有LPEI的燒瓶中加入80mL干燥氯仿和磁性攪拌棒。將混合物在氬中攪拌直到LPEI熔化物溶解，形成輕微混濁的溶液。經(jīng)過10分鐘向此攪拌的溶液中加入BOC酐(19.26g，88mMol，95％)。加入伴隨著溫和的放熱反應(yīng)和氣體逸出。將混合物再攪拌16小時(shí)，過濾出少量懸浮的微粒，并且在真空中濃縮。將剩余物與己烷研制，并且干燥?；厥?2.5g。
3.LPEI-連接體共軛物(PP15-12)將小瓶裝上磁性攪拌器并且裝入100mg(2μMol)的LPEI15000BOC95％和0.5mL干燥的氯仿。加熱混合物并且攪拌分散，并且將0.05mL氯仿中的6mg(24μMol，12倍摩爾過量)二硫代二丙酰氯(從市售二硫代二丙酸和亞硫酰氯得到)緩慢加入到攪拌的混合物中。將攪拌的混合物在室溫下放置幾天直到強(qiáng)凝膠化。此時(shí)，加入1mL三氟乙酸并且將混合物攪拌30分鐘。將多相混合物的更低(褐色)層分離，并且用2mL水稀釋。通過離心移除剩余的氯仿和少量微粒雜質(zhì)。向上清中加入2mL水中的Na2SO4(0.2g)水溶液，并且收集得到的連接的LPEI硫酸鹽沉淀物，用水然后用丙酮洗滌，并且干燥。得到80mg灰白色物質(zhì)。
將小瓶中裝入80mg連接的LPEI硫酸鹽(大約39mg硫酸鹽)和3mL水。加入BaCl2二水合物(80mg，理論上80％)并且將多相混合物劇烈攪拌48小時(shí)。之后將硫酸鋇濾出，將含水濾液另外過濾通過0.2μm的注射器濾器，之后真空濃縮到0.25mL體積。在用5mLTHF稀釋后，將連接的LPEI氯化物沉淀，收集并干燥。收集了60mg。
實(shí)施例14
生物可降解多嵌段陽離子聚合物BD15K-12-PEG的合成此實(shí)施例舉例說明了生物可降解多嵌段陽離子聚合物BD15K-12-PEG的制備，其中單體聚乙烯亞胺是15kD的線性PEI，其每個(gè)PEI 15kD單體具有12個(gè)二硫代二丙酸酯連接體和1個(gè)2kDmPEG。
將小瓶裝上磁性攪拌器并且裝入100mg(2μMol)的LPEI15000BOC95％和0.5mL干燥的氯仿。加熱混合物并且攪拌分散，并且將0.05mL氯仿中的6mg(24μMol，12倍摩爾過量)二硫代二丙酰氯(從市售二硫代二丙酸和亞硫酰氯得到)和4mg(2μMol)新鮮制備的MPEG2000氯甲酸酯(通過標(biāo)準(zhǔn)方法從市售的甲氧基聚乙二醇MW2000(MPEG2000OH)和光氣制備)緩慢加入到攪拌的混合物中。將經(jīng)攪拌的混合物在室溫下放置幾天直到強(qiáng)凝膠化。此時(shí)，加入1mL三氟乙酸并且將混合物攪拌30分鐘。將多相混合物的更低(褐色)層分離，并且用2mL水稀釋。通過離心移除剩余的氯仿和少量微粒雜質(zhì)。向上清中加入2mL水中的Na2SO4(0.2g)水溶液，并且收集得到的連接的LPEI硫酸鹽沉淀物，用水然后用丙酮洗滌，并且干燥。得到81mg灰白色物質(zhì)。
將小瓶中裝入81mg連接的LPEI硫酸鹽(大約39.5mg硫酸鹽)和3mL水。加入BaCl2二水合物(80mg，理論上80％)并且將多相混合物劇烈攪拌48小時(shí)。之后將硫酸鋇濾出，將含水濾液另外過濾通過0.2μm的注射器濾器，之后真空濃縮到0.25mL體積。在用5mLTHF稀釋后，將具有MPEG的連接的LPEI氯化物沉淀，之后收集和干燥。收集了60mg。
實(shí)施例15多嵌段共聚物BD15K-12和BD15K-12-PEG的全身性基因轉(zhuǎn)移此實(shí)施例證明了生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物BD15K-12和BD15K-12-PEG通過全身施用來增強(qiáng)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的能力。為了比較，市售的25kD分支的PEI，bPEI-25K包括在本研究中。在最初實(shí)驗(yàn)中，用與之前所述聚合物復(fù)合的編碼已經(jīng)熒光素酶基因的質(zhì)粒靜脈注射(iv)到小鼠尾部靜脈中。對(duì)于所有的實(shí)驗(yàn)組，使用30μg的DNA并且將其以11∶1的N∶P比與聚合物復(fù)合。注射的最終DNA濃度是0.1mg/ml，300μL。24小時(shí)后，處死動(dòng)物并且取得肺、肝和脾用于分析。將樣品在裂解緩沖液中勻漿并且確定熒光素酶活性。結(jié)果總結(jié)在圖14中，指示了兩種聚合物(具有或不具有PEG部分)都使得肺、脾和肝中得表達(dá)水平顯著高于使用市售25KBPEI聚合物時(shí)產(chǎn)生的表達(dá)水平。這些結(jié)果在肺和脾中是高度明顯的，而在肝中較不明顯。
實(shí)施例16通過腹膜內(nèi)施用具有BD3.6K-O和BD15K-12的IL-12基因表達(dá)質(zhì)粒復(fù)合物，治療腹膜彌漫性結(jié)腸直腸腫瘤此實(shí)施例證明了多嵌段共聚物用于治療癌癥的治療性應(yīng)用。聚合物用于遞送治療性基因的應(yīng)用使用彌漫性結(jié)腸直腸癌的鼠模型來評(píng)估。使用的治療性基因是鼠白細(xì)胞介素-12(IL-12)——已知具有強(qiáng)抗癌性質(zhì)的免疫調(diào)諧細(xì)胞因子。質(zhì)粒與兩個(gè)不同的聚合物復(fù)合N∶P比分別是11∶1和20∶1的BD LPEI-15K-12或BD3.6K-O。兩種聚合物的合成和基因遞送應(yīng)用已經(jīng)在先前實(shí)施例中討論。為了誘導(dǎo)腫瘤，用500μl體積PBS中的1.0×105CT-26細(xì)胞(鼠結(jié)腸癌)腹膜內(nèi)注射Balb/C小鼠(8周齡)。24小時(shí)后，開始質(zhì)粒/聚合物施用。治療方案是每周施用最終DNA濃度為0.5mg/ml的質(zhì)粒/聚合物復(fù)合物500μl，進(jìn)行5次治療。通過動(dòng)物生存確定功效。結(jié)果指示在圖15中。相對(duì)于未處理的對(duì)照，圖A，兩種聚合物遞送系統(tǒng)都趨向于增加生存。在此研究中，對(duì)于兩種聚合物都觀察到了中值生存時(shí)間的40-50％的增加(圖B)。
應(yīng)當(dāng)理解的是上述實(shí)施方案僅用來說明本發(fā)明原理的應(yīng)用?？梢圆幻撾x本發(fā)明的精神和范圍而衍生出許多改良和改變的實(shí)施方案，并且附屬的權(quán)利要求意在覆蓋此類改良和改編。因此，盡管本發(fā)明已經(jīng)在附圖中顯示并且在上面完整描述了目前與本發(fā)明最實(shí)際和優(yōu)選的實(shí)施方案相關(guān)的特性和細(xì)節(jié)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以不脫離如在權(quán)利要求中所說明的本發(fā)明的原理和概念而產(chǎn)生多種改變。
權(quán)利要求
1.線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)和親水性連接體的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述LPAI嵌段通過所述具有生物可降解鍵的親水性連接體交聯(lián)在一起，所述生物可降解鍵選自酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、磷酸鍵及其組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)選自聚乙烯亞胺、聚丙烯亞胺、氨基糖苷-多胺、雙脫氧-二氨基-β-環(huán)糊精、精胺、亞精胺及其組合中的一個(gè)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)是線性聚(乙烯亞胺)(LPEI)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述LPEI具有1000至25000道爾頓的平均分子量，所述親水性連接體具有100至500道爾頓的平均分子量，并且所述親水性連接體與LPEI的分子比率在1/1至5/1之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其進(jìn)一步包含附屬功能性部分，所述附屬功能性部分選自受體配體、膜滲透劑、內(nèi)體裂解劑、核定位序列、pH敏感的內(nèi)體裂解肽、顯色標(biāo)記和熒光標(biāo)記、脂肪酸、它們的衍生物及其組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述功能性部分選自油酸、棕櫚酸硬脂酸以及其組合中的一個(gè)，并且其中脂肪酰基鏈與LPEI的摩爾比是0/1至3/1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述熒光標(biāo)記選自若丹明及其衍生物、CyDye熒光染料、熒光黃及其衍生物、羧基熒光黃、渺標(biāo)記及其組合中的一個(gè)，其中LPEI和熒光標(biāo)記之間的摩爾比是0.001到0.100。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述親水性連接體是具有1(乙?；?至10(十一烷?；?個(gè)碳原子的二硫代二烷酰酸，或具有生物可降解二硫鍵的1，2-亞乙基二醇部分，或二硫代二(四乙二醇羰基)或其組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述生物可降解鍵是二硫鍵。
10.下式代表的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物(CP)xLyYz其中CP代表包含至少一個(gè)仲胺基團(tuán)的陽離子聚合物，所述CP聚合物具有1000道爾頓至25000道爾頓之間的數(shù)均分子量；Y代表雙功能生物可降解連接體，其包含酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或磷酸鍵；L代表配體；x是1至20之間的整數(shù)；y是1至100的整數(shù)；并且z是0至40之間的整數(shù)。
11.由下式代表的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物[-CO(CH2)aSS(CH2)aCO-]p{[(CH2)nNH2+]q}r其中(CH2)n是共價(jià)連接到線性聚乙烯亞胺主鏈中的氮上的脂族碳鏈；L代表選自脂類、熒光標(biāo)記和靶向部分的配體；[-CO(CH2)aSS(CH2)aCO-]代表生物可降解的二硫代二酸連接體；其中整數(shù)a在1至15之間；n是2到15的整數(shù)；p是1到100的整數(shù)；q是20到500的整數(shù)；r是1到20的整數(shù)；并且s是1到40的整數(shù)。
12.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的方法，其包括步驟1)制備線性聚(乙烯亞胺)(LPEI)嵌段，在所述LPEI嵌段通過具有生物可降解二硫鍵的親水性連接體交聯(lián)在一起之前，將其大于50％的氮原子可逆性保護(hù)；2)交聯(lián)所述保護(hù)的LPEI嵌段和所述親水性連接體；3)與親水性連接體交聯(lián)后移除所述LPEI嵌段的保護(hù)；以及4)通過沉淀所得的硫酸鹽形式可溶性不佳的交聯(lián)LPEI來分離和純化交聯(lián)的LPEI。
13.包含核酸，以及線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)和親水性連接體的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的轉(zhuǎn)染組合物，其中所述LPAI嵌段通過所述具有生物可降解酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵或磷酸鍵的親水性連接體交聯(lián)在一起。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)染組合物，其中所述核酸包含編碼遺傳標(biāo)記的DNA序列，所述遺傳標(biāo)記選自熒光素酶基因、β-半乳糖甘酶基因、潮霉素抗性、新霉素抗性、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶及其混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)染組合物，其中所述核酸包含編碼選自下列蛋白質(zhì)的DNA序列白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、胰高血糖素樣肽(GLP-1)、凝固因子、腫瘤抑制基因、胸腺嘧啶核苷激酶、p53、p16、轉(zhuǎn)錄因子及其組合。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述核酸包含編碼病毒抗原、細(xì)菌抗原或腫瘤抗原的DNA序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的組合物，其中所述核酸是選自siRNA、正義RNA、反義RNA和核酶的RNA。
18.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，其包括使細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求13的轉(zhuǎn)染組合物接觸，并且在允許組合物進(jìn)入細(xì)胞并且核酸在細(xì)胞中表達(dá)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
19.包含藥物劑，以及線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)和親水性連接體的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物的組合物，其中所述LPAI嵌段通過所述具有生物可降解的酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、磷酸鍵或其組合的親水性連接體交聯(lián)在一起。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述藥物劑是選自下列的多肽IL-2、IL-12、IFN、TNF、胰島素、GLP-1、艾桑丁、凝固因子、生長因子、細(xì)菌抗原、病毒抗原、腫瘤抗原、其他小肽及其組合。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述藥物劑是選自下列的抗癌劑阿霉素、博來霉素、順鉑、卡鉑、羥基紅比霉素、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、拓?fù)涮婵导捌淙魏谓M合。
22.向溫血?jiǎng)游锸┯盟幬锏姆椒?，其包括施用有效量的藥物，以及線性聚(烷烯亞胺)(LPAI)和親水性連接體的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物，其中所述LPAI嵌段通過所述具有生物可降解的酯鍵、酰胺鍵、二硫鍵、磷酸鍵或其組合的親水性連接體交聯(lián)在一起。
全文摘要
線性聚乙烯亞胺(LPEI)的生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物及其制備方法，其中LPEI嵌段通過具有生物可降解二硫鍵的親水性連接體連接在一起。該生物可降解交聯(lián)陽離子多嵌段共聚物還可以包含附屬功能性部分，其優(yōu)選是受體配體、膜滲透劑、內(nèi)體裂解劑、核定位序列、pH敏感的內(nèi)體裂解肽、顯色染料或熒光染料。
文檔編號(hào)A61K9/14GK101094652SQ200580045612
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者G·斯洛博德金, M·馬塔爾, J·法韋爾, K·安瓦爾 申請(qǐng)人:表達(dá)遺傳學(xué)公司