專利名稱：：用于進行抗葡萄球菌接種的免疫原性組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及葡萄球菌免疫原性組合物和疫苗，它們的制備以及這些組合物在醫(yī)學中的用途。更特別地，它涉及疫苗組合物，包含用于治療或預防葡萄球菌感染的抗原的組合。也提供了所述疫苗在醫(yī)學中的使用和它們的制備方法。背景近年來，隨著血管內(nèi)設備的使用增加，在社區(qū)獲得的和在醫(yī)院獲得的感染數(shù)量都已經(jīng)增加了。在醫(yī)院獲得的(醫(yī)源性)感染是發(fā)病和死亡的主要原因，更特別是在美國，它每年影響了超過200萬患者。根據(jù)各種研究，美國患者的大約6%在他們呆在醫(yī)院期間將獲得感染。估計1992年在美國的經(jīng)濟負擔超過45億美元(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev.6;428)。大多數(shù)頻發(fā)感染是尿道感染(UTI-感染的33%),接下來是肺炎(15.5%)，外科手術部位感染(14.8%)以及原發(fā)血流感染(13%)(Emori和Gaynes，1993，Clin.Microbiol.Rev,6;428)。金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性的葡萄球菌(大多數(shù)是表皮葡萄球菌)、腸球菌種、大腸桿菌以及綠膿桿菌是主要的醫(yī)源性病原體。盡管那些病原體差不多引起同樣數(shù)量的感染，但是它們可引起的失調(diào)的嚴重性再加上抗生素抗性的分離菌的頻率，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的這個排位進行平衡，它們成為了最重要的醫(yī)源性病原體。金黃色葡萄球菌是有著顯著發(fā)病率和死亡率的醫(yī)源性感染的最通常原因(Romero-Vivasetal1995，Infect.Dis.21;1417)。它是骨髓炎、心內(nèi)膜炎、膿毒性關節(jié)炎、肺炎、膿腫以及中毒性休克綜合征的一些病例的原因。表皮葡萄球菌是正常的皮膚共生生物，也是引起植入的醫(yī)療設備的感染以及在外科手術部位的感染的重要機會致病菌。被金黃色葡萄球菌感染的醫(yī)療設備包括心臟起搏器、腦脊液分流器、連續(xù)流動的腹膜透析導管、整形外科設備以及人工心臟瓣膜。用抗生素治療金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌感染，青霉素是首選藥物，而萬古霉素用于曱氧苯青霉素抗性的分離菌。自1980年代以來，對抗生素呈現(xiàn)廣鐠抗性的葡萄球菌菌抹的百分比已經(jīng)變得曰益普遍(Panliloetal1992，Infect.Control.Hosp.Epidemiol.13;582)，造成了對有效的抗菌治療的威脅。此外，近來出現(xiàn)的萬古霉素抗性的金黃色葡萄球菌已經(jīng)引起了恐懼，害怕曱氧苯青霉素抗性的金黃色葡萄球菌菌林將會產(chǎn)生并擴散，對此還沒有可用的有效治療。已經(jīng)研究了在被動免疫療法中使用抗葡萄球菌抗原的抗體這一備選方法。包括給予多克隆抗血清的療法正在研發(fā)之中(WO00/15238，WO00/12132)，以及用抗脂磷壁酸的單克隆抗體進行治療(WO98/57994)。備選方法將是使用主動疫苗接種來產(chǎn)生對葡萄球菌的免疫應答。已經(jīng)確定了用作疫苗組分而包含的幾種候選物。這些候選物包括纖連蛋白結合蛋白(US5840846)、MHCII類似物(US5648240)、纖維蛋白原結合蛋白(US6008341)、GehD(US2002/0169288)、膠原蛋白結合蛋白(US6288214)、SdrF、SdrG和SdrH(WO00/12689)、突變體SEA和SEB外毒素(WO00/02523)以及52kDa玻連蛋白結合蛋白(WO01/60852)。金黃色葡萄球菌基因組已經(jīng)被測序，并已經(jīng)確定了許多編碼序列(EP786519，WO02/094868)。對于表皮葡萄球菌同樣如此(WO01A34809)。作為該方法的改進，其他人已經(jīng)確定了被來自患有葡萄球菌感染的患者的超免疫血清所識別的蛋白質(WO01/98499，WO02/059148)。靶向金黃色葡萄球菌或靶向它所產(chǎn)生的外蛋白的疫苗的首次產(chǎn)生已經(jīng)獲得了有限成功(Lee1996TrendsMicrobiol.4;162)。仍然存在研發(fā)針對葡萄球菌感染的有效疫苗的需求。因此，本發(fā)明提供了包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自、溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP;組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和NiABC轉運蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。圖1-優(yōu)選蛋白質的多肽序列。表1提供了有關每個SEQID代表哪個蛋白質的信息。圖2-編碼優(yōu)選蛋白質的核苦酸序列。表1提供了有關每個SEQID編碼哪個蛋白質的信息。圖3-天然條件下a毒素的純化。圖A顯示了a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。第1道-分子量標志，笫2道-含有過量表達a毒素的可溶性級分，第3道-從Ni-NTA柱流過，第4道-用10%緩沖液B洗脫的級分，第5道-用20%緩沖液B洗脫的級分，第6道-用30。/。緩沖液B洗脫的級分，第7道-用50%緩沖液B洗脫的級分，第8道-用75。/。緩沖液B洗脫的級分，第9道和笫10道-用100%緩沖液B洗脫的級分，第11道"秀導前在T=0時的細菌，第12道-誘導后在T=4時的細菌，第13道-細胞溶胞產(chǎn)物，第14道國可溶性級分，第15道-不溶性級分。圖B顯示了10、5、2和1pi純化a毒素的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖4-變性條件下的SdrC的純化。圖A顯示了a毒素純化期間所制備樣品的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。泳道M-分子量標志，泳道Start-由含有過量表達SdrC的不溶性級分所形成的上清液，泳道FTl-從M-NTA柱流過，泳道C-用漂洗緩沖液C洗脫的級分，泳道D-用緩沖液D洗脫的級分，道E-用緩沖液E洗脫的級分。圖B顯示了1、2、5和10pl純化SdrC的考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE。圖5-在包被了純化蛋白質的平板中抗葡萄球菌蛋白質抗血清的ELISA結果。合并小鼠pre-使用提取自接種前小鼠的合并的血清的結果。合并小鼠PostIII-使用免疫后提取的合并的小鼠血清的結果。合并兔pre-使用提取自接種前兔的合并的血清的結果。合并兔PostIII-使用免疫后提取的合并的兔血清的結果。Blc-陰性對照。圖6-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質的小鼠抗血清的ELISA結果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細胞所包被的平板。用方塊符號標記的線顯示使用來自小鼠的抗血清的ELISA結果，該小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白質免疫三次。用菱形符號標記的線顯示免疫前小鼠血清的ELISA結果。圖7-在包被了殺死的葡萄球菌的平板上產(chǎn)生的抗葡萄球菌蛋白質的兔抗血清的ELISA結果。圖A使用由金黃色葡萄球菌血清型5殺死的完整細胞所包被的平板。圖B使用由金黃色葡萄球菌血清型8殺死的完整細胞所包被的平板。圖C使用由表皮葡萄球菌殺死的完整細胞所包被的平板。用方塊符號標記的線顯示使用來自兔的抗血清的ELISA結果，該小鼠用所標明的葡萄球菌蛋白質免疫三次。用菱形符號標記的線顯示免疫前兔血清的ELISA結果。詳細描述本發(fā)明公開了葡萄球菌抗原的特定組合，當其組合時，引起有效治療或預防葡萄球菌感染的免疫原性組合物的產(chǎn)生。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地摻入了參與不同葡萄球菌感染的抗原。所述免疫原性組合物以針對葡萄球菌功能的不同方面的免疫應答為目標，因此能夠誘導特別優(yōu)選的免疫應答。葡萄球菌感染的發(fā)展經(jīng)過幾個不同階段。例如，葡萄球菌的生存周期包括共棲增殖、通過接觸相鄰組織或血流而開始感染、在血液中的厭氧增殖、金黃色葡萄球菌毒力決定子與宿主防御機制之間的相互作用以及誘導并發(fā)癥包括心內(nèi)膜炎、轉移性膿腫形成和敗血病綜合征。細菌表面上的不同分子將參與感染周期的不同步驟。通過以針對參與葡萄球菌感染不同步驟的有效量的特定抗原的組合的免疫應答為目標，能夠產(chǎn)生功效增強的葡萄球菌免疫原性組合物或疫苗。特別地，來自不同類型的某些抗原的組合，其中一些參與對宿主細胞的粘附，其中一些參與鐵捕獲或其它轉運蛋白功能，其中一些是毒素或毒力調(diào)節(jié)劑和免疫優(yōu)勢抗原，能夠引起防止多階段感染的免疫應答?？梢酝ㄟ^如實施例中描述的動物模型分析法測定和/或j吏用如實施例中描述的調(diào)理吞噬作用分析法測定免疫應答的有效性。本發(fā)明的一個額外優(yōu)點是免疫原性組合物中來自不同蛋白家族的本發(fā)明的抗原組合將能夠產(chǎn)生抗更廣泛菌林的保護作用。本發(fā)明涉及包含多種蛋白的免疫原性組合物，所述蛋白選自至少兩類不同的蛋白，具有具有葡萄球菌的不同功能。這樣的蛋白質種類的例子是胞外結合蛋白質，轉運蛋白諸如Fe捕獲蛋白，毒素或毒力調(diào)節(jié)劑以及其它免疫優(yōu)勢蛋白質。本發(fā)明的疫苗組合能夠有效抗同源葡萄球菌菌抹(得到抗原的菌林)，并且優(yōu)選也抗異源葡萄球菌菌林。本發(fā)明的免疫原性組合物包含等于或多于2、3、4、5或6種的選自2或3個以下組的多種蛋白質組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP畫2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP;組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和NiABC轉運蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。例如，第一種蛋白質選自組a)、b)或c)，第二種蛋白質選自一個組，該組選自組a)、b)和c)，其不包括第二種蛋白質。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組a)的蛋白質以及選自組b)和/或組c)的額外蛋白質。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組b)的抗原以及選自組c)和/或組a)的額外蛋白質。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物含有至少一種選自組c)的抗原以及選自組a)和/或組b)的額外蛋白質。本發(fā)明的免疫原性組合物合適地含有來自金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌的蛋白。蛋白質本發(fā)明的免疫原性組合物包含分離的蛋白質，其包含與圖1的任意序列具有至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%或完全同一性的氨基酸序列。本文在明確提及蛋白質時，優(yōu)選指天然或重組的、全長蛋白質或者任選地已經(jīng)去除了任何信號序列的成熟蛋白質。蛋白質可直接從葡萄球菌菌林中分離或者通過重組DNA技術生產(chǎn)?？蓪⒌鞍踪|的免疫原性片段加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。這些片段是包含從蛋白質的氨基酸序列連續(xù)選取的至少10個氨基酸、優(yōu)選20個氨基酸、更優(yōu)選30個氨基酸、更優(yōu)選40個氨基酸或50個氨基酸、最優(yōu)選100個氨基酸的片段。此外，這樣的免疫原性片段是與針對葡萄球菌蛋白質而產(chǎn)生的抗體有免疫反應的，或者是與通過用葡萄球菌感染而產(chǎn)生的抗體有免疫反應的。免疫原性片段也包括以有效劑量給予時，(單獨或者作為結合到載體上的半抗原)，引起針對葡萄球菌感染的保護性免疫應答的片段，更優(yōu)選地是對金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌感染有保護性的。這樣的免疫原性片段可包括例如缺少N末端前導序列、和/或跨膜結構域和/或C末端錨定結構域的蛋白質。在優(yōu)選的方面，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性片段包含蛋白質基本上所有的胞外結構域，所述蛋白質在片段序列的整個長度上具有與選自圖1的序列至少85%同一性、優(yōu)選至少90%同一性、更優(yōu)選至少95%同一性、最優(yōu)選至少97-99%同一性。本發(fā)明的免疫原性組合物還可以含有葡萄球菌蛋白質的融合蛋白質或者葡萄球菌蛋白質的免疫原性片段。這樣的融合蛋白質可以重組制備，可包含至少2、3、4、5或6種葡萄球菌蛋白質的一個部分。作為選擇，融合蛋白質可包含至少2、3、4或5種葡萄球菌蛋白質的多個部分。這些融合蛋白質可以將不同的葡萄球菌蛋白質或其片段組合到同一蛋白質中。作為選擇，本發(fā)明也包括葡萄球菌蛋白質或其片段的單獨的融合蛋白質，作為與異源序列諸如T細胞表位或純化標志的提供者的融合蛋白質，例如P-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-轉移酶，綠色熒光蛋白(GFP)，表位標志諸如FLAG、myc標志、聚組氨酸，或者病毒表面蛋白質諸如流感病毒血凝素，或者細菌蛋白質諸如破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>胞外成分結合蛋白胞外成分結合蛋白是結合宿主胞外成分的蛋白質。該術語包括但不限于粘附素。胞外成分結合蛋白的例子包括層粘連蛋白受體(NaiduetalJ.Med.Microbiol.1992，36;177),SitC/MntC/唾液結合蛋白(US5801234，Wiltshire和FosterInfec.Immun.2001，69;5198),EbhA(WilliamsetalInfect.Immim.2002，70;6805)，EbhB，彈性蛋白結合蛋白(EbpS)(Parketal1999,J.Biol.Chem.274;2845)，EFB(FIB)(Wastfelt和Flock1995，J.Clin.Microbiol.33;2347)，SBI(ZhangetalFEMSImmun.Med.Microbiol.2000，28;211)，自溶素(Ruppeta12001，J.Infect.Dis.183;1038)，ClfA(US6008341,McDevittetalMol.Microbiol.1994，11;237)，SdrC，SdrG(McCreaetalMicrobiology2000,146;1535)，SdrH(McCreaetalMicrobiology2000，146;1535)，脂肪酶GehD(US2002/0169288)，SasA，F(xiàn)nbA(FlocketalMolMicrobiol.1994，12;599，US6054572)，F(xiàn)nbB(WO97/14799，Boothetal2001Infec.Immun.69;345)，膠原蛋白結合蛋白Cna(Visaietal2000，J.Biol.Chem.275;39837)，ClfB(WO99/27109)，F(xiàn)bpA(Phonimdaengetal1988J.GenMicrobiol.134;75)，Npase(Flock2001J.Bacteriol.183;3999)，IsaA/PisA(LonenzetalFEMSImmuno.Med.Microbiol.2000，29;145)，SsaA(LangetalFEMSImmunol.Med.Microbiol.2000，29;213)，EPB(Hussain和Hermann,丹麥14-17th關于葡萄球菌的研討會，2000)，SSP-1(Veenstraetal1996，J.Bacteriol.178;537)，SSP國2(Veenstraetal1996，J.Bacteriol.178;537)，17kDa肝素結合蛋白HBP(Fallgrenetal2001，J.Med.Microbiol.50;547)，玻連蛋白結合蛋白(Lietal2001，Curr.Microbiol.42;361)，纖維蛋白原結合蛋白，凝固酶，F(xiàn)ig(WO97/48727)以及MAP(US5648240)。SitC/MntC/唾液結合蛋白這是ABC轉運蛋白，它是肺炎葡萄球菌粘附素PsaA的同源物。它是高度免疫原性的32kDa脂蛋白，分布在整個細菌細胞壁(CockayneetalInfect.Immun.199866;3767)。它在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中表達為32kDa脂蛋白，40kDa同源物存在于人葡萄球菌中。在表皮葡萄球菌中，它是鐵調(diào)節(jié)操縱子的成分。它顯示了與包括副血鏈球菌的FimA在內(nèi)的粘附素有相當高的同源性，以及與具有證實的或推定的金屬離子轉運功能的ABC轉運蛋白家族的脂蛋白具有相當高的同源性。因此SitC被包括為胞外結合蛋白和金屬離子轉運蛋白。披露于US5，801，234的唾液結合蛋白也是SitC的形式，可被包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。ClfA和ClfB這兩種蛋白質都具有纖維蛋白原結合活性，在存在血漿時引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它們含有細胞壁相關蛋白質所共有的LPXTG基序。ClfA描述于US6008341,ClfB描述于WO99/27109。凝固酶(FbpA)這是一種纖維蛋白原結合蛋白質，在存在血漿時引起金黃色葡萄球菌形成聚集。它描述于涉及到凝固酶的參考文獻中Phonimdaengetal(J.Gen.Microbio.1988，134:75-83)，Phonimdaengetal.(MolMicrobiol1990;4:393-404)，Cheungetal.(InfectImmun1995j63:1914-1920)以及Shopsinetal.(J.CLin.Microbiol.2000;38:3453-3456)。肽(C末端27個氨基酸)的成熟蛋白質。、4凝固酶具有三個明顯的結構域。氨基酸59-297是巻曲螺旋區(qū)，氨基酸326-505是富含脯氨酸和甘氨酸的區(qū)域，從氨基酸506到645的C末端結構域具有P折疊構象。這些結構域的每一個都是本發(fā)明的優(yōu)選片段。SdrG-Fbe—EfB/FIGFbe是在表皮葡萄球菌的許多分離林中發(fā)現(xiàn)的纖維蛋白原結合蛋白，具有119kDa的推斷分子量(Nilssonetal1998.Infect.Immun.66;2666)。它的序列與金黃色葡萄球菌的聚集因子(ClfA)的序列相關?？笷be的抗體可阻斷表皮葡萄球菌結合到纖維蛋白原包被的平板和導管上(Pei和Flock2001,J.Infect.Dis.184;52)。該蛋白在WO00/12689中也描述為SdrG。SdrG在凝固酶陰性的葡萄球菌中被發(fā)現(xiàn)，是含有LPXTG序列的細胞壁相關蛋白質。SdrG含有信號肽(氨基酸1-51)，含有纖維蛋白原結合位點和膠原蛋白結合位點的區(qū)域(氨基酸51-825)，兩個CnaB結構域(氨基酸627-698和738-809)，SD重復區(qū)(氨基酸825-1000)以及錨定結構域(氨基酸1009-1056)。Fbe具有推定的信號序列，在氨基酸51和52之間帶有裂解位點。因此Fbe的優(yōu)選片段含有Fbe的成熟形式，從氨基酸52延續(xù)到C末端(氨基酸1092)。Fbe從氨基酸52到氨基酸825的結構域負責纖維蛋白原結合。因此Fbe的優(yōu)選片段包含或由氨酸52-825組成。Fbe的氨基酸373和516之間的區(qū)域顯示了Fbe和ClfA之間的最大保守性。因此優(yōu)選片段將含有Fbe的氨基酸373-516。Fbe的氨基酸825-1041含有高度重復區(qū)，由串聯(lián)重復的天冬氨酸和絲氨酸殘基組成。SdrG的優(yōu)選片段包括已經(jīng)去除了信號肽和/或SD重復序列以及錨定結構域的多肽。這些多肽包括或者由SEQIDNO:70的氨基酸50-825、氨基酸50-633、氨基酸50-597(WO03/76470的SEQIDNO2)、氨基酸273-597(WO03/76470的SEQIDNO4)、氨基酸273-577(WO03/76470的SEQIDNO6)、氨基酸1-549、氨基酸219-549、氨基酸225-549、氨基酸219-528、氨基酸225-528所組成的多肽。優(yōu)選地，將與SEQIDNO:70、20或21的序列具有至少80%、85%、卯％、92%、95%、97%、98%、99%或100%同源性的SdrG多肽加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的組合物任選包含上述SdrG多肽的片段。優(yōu)選片段已經(jīng)去除了信號肽和/或SD重復序列和/或錨定結構域。例如對應于SEQID76的氨基酸1-713、1-549、225-549、225-529、24-717、1-707、1-690、1-680、1-670、1-660、1-650、1-640、1-630、1-620、1-610、1-600、34-707、44-697、36-689的序列或者與SEQID70或20或21具有85%、90%、92%、95%、97%、98%、99%或100%同一性的序列。去除了信號肽的優(yōu)選片段在片段的N末端具有曱硫氨酸殘基以確保正確翻譯。更優(yōu)選的片段具有下面的序列MEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVIN麗QSINTDDNNQIIKKEET麗YDGIEKRSEDRTESTTNVDENEATFLQKTPQDNTHVSDFANSKIKESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEK廳(JDEKVTDQSITEGYDDSEGVIKAHDAENLIYDVTFEVDDKVKSGDTMTVDIDKNTVPSDLTDSFTIPKIKDNSGEIIATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIKAHLKLTSYIDKSKVP麗NTKLDVEYKTALSSVNKETNVNISGNGDEGSTIIDDSTIIKVYKVGDNQNLPDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLG麗GEFRTASYDNTIAFSTSSGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDKDGIQNTNDNEKPLSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGKYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLKHSGTNPALDSEGNSVWVTINGQDDMTIDSGFYQTPKYSLGNYVWYDTNKDGIQGDDEKGISGVKVTLKDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGDDDEQDADGEEVHVTITDHDDFSIDNGYYDDEEbhA和EbhBEbhA和EbhB是在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中都表達的蛋白質(ClarkeandFosterInfect.Immun.2002，70;6680，WilliamsetalInfect.Immun.2002，20;6805)，它Cl結合至'J纖連蛋白。由于纖連蛋白是胞外基質的重要成分，EbhA和EbhB在將葡萄球菌粘附到胞外基質方面具有重要功能。Ebh蛋白質較大，具有1.1兆道爾頓的分子量。由于生產(chǎn)和配制的容易性，使用Ebh蛋白質的片段而不是完整序列是有利的。蛋白質的中部區(qū)域含有不完全重復序列，其含有纖連蛋白結合位點。下述含有一個或多個重復結構域的片段是用來加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段。Ebh蛋白質含有127個氨基酸長度的不完全重復單元，其特征在于含有共有序列L.G.{10}A.{13}Q.{26}L..M..L.{33}A優(yōu)選地.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M"L.{33}A.{12}更優(yōu)選地.....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}LLN.AQKL..QI/V..A..V..V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/RN/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N/D.......其中"."代表任意氨基酸，".{10}"代表任意10個氨基酸，I/V表示氨基酸的備選。參考Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240中披露的序列以及表2，很容易推知Ebh蛋白質中的重復序列。包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段包括含有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、/\個、九個、十個或超過10個的127個氨基酸的重復單元的蛋白質。這樣的片段可以由l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO個或更多的127個氨基酸的重復區(qū)的重復序列所組成，或者可以由在片段的任一末端或兩個末端帶有額外氨基酸殘基的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多的重復序列所組成。另一種優(yōu)選的片段是跨越三個重復序列(氨基酸3202-3595)的大約44kDa的H2多肽，如ClarkeetalInfectionandImmunity70，6680-6687，2002中所描述的。這樣的片段將優(yōu)選能夠結合纖連蛋白和/或引起針對整個Ebh蛋白質有活性的抗體。Ebh蛋白質能夠結合纖連蛋白。這些多肽序列的優(yōu)選片段保持了結合到纖連蛋白的能力。可通過由Clarkeetal(InfectionandImmunity70;6680-66872002)所描述的ELISA來評估對纖連蛋白的結合。還有另一種優(yōu)選的片段是那些包含B細胞或T輔助細胞表位的片段，例如表3和4中描述的那些片段/肽。表2.Ebh全長序列中的重復序列。Ebh全長序列披露于Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240。下表顯示了127個氨基酸的重復序列在全長序列中開始和結束位置的氨基酸殘基。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表3.對127個氨基酸的重復序列所預測的B細胞表位全長序列披露于Kurodaetal(2001)Lancet357;1225-1240。選擇這些重復序列中序列的一個由全長序列的氨基酸3204-3331所編碼的重復序列來進行表位預測NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>"開始"和"結束"欄代表所預測的B細胞表位在127個氨基酸的重復序列中的位置"起始，，和"終止，，欄代表所預測的B細胞表位在Ebh全長序列中的位置表4預測的Ebh中的T輔助細胞表位全長序列披露于TrEMBL數(shù)據(jù)庫，序列索引Q8NWQ6。選擇這些重復序列中的一個由全長序列的氨基酸3204-3331所編碼的重復序列來進行表位預測NQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGV<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>-"重復序列中的位置"欄表示所預測的T細胞表位在重復序列中的位置-"序列中的位置"欄表示所預測的T細胞表位在Ebh全長序列中的位置肽；;此，這些片段可被用作生產(chǎn)本發(fā)明的全長多肽的中i;體。特別優(yōu)選的是其中幾個、5-10、1-5、1-3、1-2或1個氨基酸以任意組合被取代、缺失或添加的變體。彈性蛋白結合蛋白質(EbpS)EbpS是含有486個氨基酸的分子量83kDa的蛋白質。它與金黃色葡萄球菌的細胞質膜相關聯(lián)，具有三個將蛋白質保持在膜中的疏水區(qū)(Downeretal2002，J.Biol.Chem.277;243;Parketal1996，J.Biol.Chem.27"15803)。氨基酸1-205和343-486之間的兩個區(qū)域是在細胞質膜外表面上表面暴露的。EbpS的配體結合結構域位于N末端的殘基14-34之間(Parketal1999，丄Biol.Chem.274;2845)。加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段是含有彈性蛋白結合區(qū)域的表面暴露片段(氨基酸1-205)。一些優(yōu)選片段不含完整的暴露環(huán)，但是應當含有彈性蛋白結合區(qū)域(氨基酸14-34)。能夠使用的作為選擇的片段由形成第二表面暴露環(huán)的氨基酸組成(氨基酸343-486)。在一端或兩端含有少至1、2、5、10、20、50個氨基酸的作為選擇的片段也是可能的。層粘連蛋白受體金黃色葡萄球菌的層粘連蛋白受體在致病性方面起著重要作用。感染的典型特征就是允許廣泛的轉移性膿肺形成的血流侵襲。血流侵襲需要流過血管基底膜的能力。這是通過層粘連蛋白受體結合到層粘連蛋白而實現(xiàn)的(LopesetalScience1985，229;275)。層粘連蛋白是表面暴露的，存在于葡萄球菌的許多菌林包括金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中。SBISbi是除了蛋白A之外的第二IgG結合蛋白，它在大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林中表達(Zhangetal1998，Microbiology144;985)。Sbi序列的N末端具有典型的信號序列，在氨基酸29之后帶有裂解位點。因此加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的Sbi的優(yōu)選片段在氨基酸殘基30、31、32或33處開始，延續(xù)到Sbi的C末端，例如SEQIDNO:26。已經(jīng)將Sbi的IgG結合結構域確定為從氨基酸41-92向蛋白質N末端的區(qū)域。這個結構域與蛋白A的IgG結合結構域同源。Sbi的最小IgG結合結構域含有下面的序列QTTQ麗YVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK*國表示在IgG結合結構域之間相似的氨基酸包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的Sbi優(yōu)選片段含有IgG結合結構域。該片段含有IgG結合結構域的共有序列，如上面序列中所示的由*標明的。優(yōu)選地，片段含有或者由上面所示的全部序列組成。更優(yōu)選地，片段含有或者由Sbi的氨基酸30-92、33-92、30-94、33_94、30-146、33-146、30-150、33-150、30-160、33-160、33-170、33-180、33-190、33-200、33-205或33-210組成，例如SEQIDNO:26。優(yōu)選的片段可含有來自所指序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO個氨基酸的取代。優(yōu)選的片段可含有IgG結合結構域的多個重復序列(2、3、4、5、6、7、8、9或10個)。EFB-FIBFib是19kDa纖維蛋白原結合蛋白，它由金黃色葡萄球菌分泌到胞外基質中。所有測試的金黃色葡萄球菌分離林都產(chǎn)生它(WastfeltandFlock1995，J.Clin.Microbiol.33;2347)。金黃色葡萄球菌在存在纖維蛋白原時聚集并結合到纖維蛋白原包被的表面。該能力有助于導管和內(nèi)皮細胞的葡萄球菌菌落增殖。Fib在蛋白質的N末端含有信號序列，在大約氨基酸30處帶有推定的裂解位點。因此引入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選片段將含有成熟蛋白質的序列(從大約氨基酸30到蛋白質的C末端)。IsaA/PisAIsaA是29kDa蛋白質，也稱為PisA，已經(jīng)顯示出它是醫(yī)院患者敗血癥期間的免疫優(yōu)勢的葡萄球菌蛋白質(Lorenzetal2000,FEMSImmunol.Med.Microb.29;145)。IsaA序列的開頭29個氨基酸被認為是信號序列。因此包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中的IsaA優(yōu)選序列將含有從氨基酸殘基30起到編碼序列的末端。纖連蛋白結合蛋白纖連蛋白結合蛋白A(FnbA)描述于US5320951和Schenningsetal(1993，Mircob.Pathog.15;207)。纖連蛋白結合蛋白A含有參與結合纖連蛋白的幾個結構域(WO94/18327)。這些結構域被稱為Dl、D2、D3和D4。纖連蛋白結合蛋白A或B的優(yōu)選片段包含或由Dl、D2、D3、D4、Dl-D2、D2國D3、D3-D4、Dl-D3、D2-D4或Dl醒D4組成(如WO94/18327中的描述)。纖連蛋白結合蛋白含有36個氨基酸的信號序列。例如VK麗LRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA任選地，缺失該信號序列的成熟蛋白質包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。轉運蛋白革蘭氏陽性菌的細胞壁作為屏障來防止代謝物自由擴散到細菌中。一系列蛋白質協(xié)同形成了必需養(yǎng)分進入細菌的通道，因此對于細菌生存是必需的。術語轉運蛋白包括參與結合到代謝物諸如鐵的初始步驟的蛋白質以及參與將代謝物事實上轉運到細菌中的那些蛋白質。分子鐵對于細菌生長來說是必需的輔助因子。分泌結合游離鐵的鐵載體，然后被遞送鐵的細菌表面受體捕獲來轉運通過細胞質膜。鐵的探測對于確定人感染來說是關鍵的，以便針對該類蛋白質的免疫應答的產(chǎn)生能夠導致葡萄球菌生存力的喪失。轉運蛋白的例子包括免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白(Burnieetal2000Infect.Imun.68;3200)，IsdA(Mazmanianetal2002PNAS99;2293)，IsdB(Mazmanianetal2002PNAS99;2293)，Mg2+轉運蛋白，SitC(Wiltshire和Foster2001Infect.Immun.69;5198)以及NiABC轉運蛋白。免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白是有良好保守性的蛋白質，它可能能夠產(chǎn)生針對不同葡萄球菌菌林的交叉保護性的免疫應答(Meietall"7，Mol.Microbiol.26;399)。抗這種蛋白質的抗體已經(jīng)在患有敗血癥的患者中發(fā)現(xiàn)了(Burnieetal2000，Infect.Immun.68;3200)。免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白的優(yōu)選片段將包括肽DRHFLN、GNYD、RRYPF、KTTLLK、GVTTSLS、VDWLR、RGFL，更優(yōu)選KIKVYVGNYDFWYQS、TVIVVSHDRHFLYNNV和/或TETFLRGFLGRMLFS，因為這些序列含有被人免疫系統(tǒng)識別的表位。IsdA-IsdB金黃色葡萄球菌的isd基因(鐵調(diào)節(jié)的表面決定子)編碼負責血紅蛋白結合以及傳遞血紅素鐵到細胞質的蛋白質，它在這里作為必需養(yǎng)分。IsdA和IsdB位于葡萄球菌的細胞壁中。IsdA似乎被暴露在細菌表面上，因為它對蛋白酶K消化是敏感的。IsdB被部分消化，表明它部分暴露在細菌表面上(Mazmanianetal2003Science299;906)。IsdA和IsdB都是結合血紅素的29kDa蛋白質。它們的表達通過Fur阻抑物而被鐵的可獲得性所調(diào)節(jié)。它們的表達在鐵濃度將變低的宿主感染期間將變高。它們也4皮稱為FrpA和FrpB(Morrisseyetal2002，Infect.Immun.70;2399)。FrpA和FrpB是帶有高電荷的主要表面蛋白。已經(jīng)顯示它們提供了粘附到塑料的主要作用。在一種實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含IsdA和/或IsaB片段，其描述在WO01/98499或WO03/11899中。毒素和毒力調(diào)節(jié)劑這個蛋白質家族的成員包括毒素諸如a毒素、溶血素、腸毒素B和TSST-1以及調(diào)節(jié)毒素產(chǎn)生的蛋白質諸如RAP。oc毒素(Hla)ot毒素是由大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林產(chǎn)生的重要毒力決定子。它是具有溶血活性的孔形成毒素。已經(jīng)顯示抗oc毒素的抗體中和動物模型中ot毒素的有害和致命效應(Adlametal1977Infect.Immun.17;250)。人血小板、內(nèi)皮細胞和單核細胞對a毒素的效應是敏感的。a毒素的高毒性要求其在作為免疫原使用之前應當脫毒。這可以通過化學處理實現(xiàn)，例如通過用曱醛、戊二醛或其它交聯(lián)試劑處理或者通過將它化學綴合到如下所述的細菌多糖上。除去毒性的進一步的方式是引入除去毒性同時保持毒素的抗原性的點突變。在a毒素的氨基酸35處的點突變的引入導致毒性的去除同時保持免疫原性，所述突變是用亮氨酸殘基取代組氨酸殘基(Menzies和Kernodle1996;Infect.Immun.64;1839)。組氨酸35似乎對于孔形成所需的正確寡聚化來說是關鍵性的，這個殘基的突變導致毒性喪失。當加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中時，a毒素優(yōu)選通過His35突變而凈皮脫毒，最優(yōu)選通過用Leu或Arg取代His35。在作為選擇的實施方案中，a毒素通過綴合到免疫原性組合物的其它組分上而被脫毒，優(yōu)選莢膜多糖，最優(yōu)選綴合到金黃色葡萄球菌V型多糖和/或金黃色葡萄球菌VIII型多糖和/或PNAG上。RNAIII活化蛋白(RAP)RAP本身不是毒素。但是它是毒力因子表達的調(diào)節(jié)劑。RAP由葡萄球菌產(chǎn)生并分泌。它激活其它葡萄球菌的agr調(diào)節(jié)系統(tǒng)并激活毒力因子諸如溶血素、腸毒素B和TSST-1的表達和隨后的釋放。針對RAP產(chǎn)生的免疫應答將不會殺死細菌，但是將干擾它們的致病性。這具有這樣的優(yōu)點，即對于新的抗性菌林的形成提供更小的選擇壓力。它將具有第二個優(yōu)點，即產(chǎn)生的免疫應答在減少感染的發(fā)病方面將是有幫助的。將RAP與疫苗中的其它抗原結合是特別有利的，特別是在額外的抗原將提供能夠殺死細菌的免疫應答的情況。其它蛋白質累積-結合蛋白質(Aap)Aap是表皮葡萄球菌菌林累積在表面上所必需的140kDa蛋白質(HussainetalInfect.Immun.1997，65;519)。表達該蛋白質的菌林產(chǎn)生顯著更大量的生物膜，Aap似乎參與了生物膜的形成?？笰ap的抗體能夠抑制生物膜形成并抑制表皮葡萄球菌的累積。Aap的優(yōu)選片段是包含氨基酸550-1069或由氨基酸550-1069組成的保守結構域。葡萄球菌分泌的抗原SsaASsaA是在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌中都發(fā)現(xiàn)的30kDa強免疫原性蛋白質(Langetal2000FEMSImmunol.Med.Microbiol.29;213)。它在心內(nèi)膜炎期間的表達表明了特異性針對感染疾病發(fā)病的毒力作用。SsaA含有N末端前導序列和信號肽酶裂解位點。前導肽之后是從殘基30到殘基130的大約100個氨基酸的親水區(qū)。加入到本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選SsaA片段由成熟蛋白(氨基酸27到C末端或者氨基酸30到C末端)組成。另一種優(yōu)選的片段含有SsaA從氨基酸30到氨基酸130的疏水區(qū)。優(yōu)選組合本發(fā)明的免疫原性組合物中的優(yōu)選蛋白質組合包含層粘連蛋白受體和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SitC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含EbhA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含EbhB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含EbpS和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含EFB(FIB)和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SBI和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含自溶素和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含ClfA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、MABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SdrC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SdrG和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體和RAP。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SdrH和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含酯酶GehD和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SasA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、MABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含F(xiàn)nbA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含F(xiàn)nbB和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含Cna和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含ClfB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含F(xiàn)bpA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含Npase和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含IsaA/PisA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、MABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SsaA和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含EPB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SSP-l和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SSP-2和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含HPB和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含玻連蛋白結合蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含纖維蛋白原結合蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含凝固酶和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含F(xiàn)ig和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含MAP和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、CIfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含IsdA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含IsdB和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、西旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SitC和l、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、a毒素、a毒素H35L或H35R突變體、RAP、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含ct毒素和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含a毒素H35L或H35R突變體和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、MABC轉運蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含RAP和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、Aap和SsaA。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含Aap和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、RAP、a毒素和H35LORH35Rct毒素。本發(fā)明的免疫原性組合物中的另一種優(yōu)選的蛋白質組合包含SsaA和1、2、3、4或5種另外的抗原，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、CIfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP畫1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、RAP、ct毒素和H35LORH35Rcc毒素。發(fā)明人證明了某些抗原產(chǎn)生了抗原混合物范疇內(nèi)的特別有效的免疫應答。因此，本發(fā)明的一個實施方案是包含IsaA和葡萄球菌轉運蛋白或IsaA和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或包含Sbi和葡萄球菌轉運蛋白或Sbi和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或包含SdrC和葡萄球菌轉運蛋白或SdrC和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素，或IsaA和Sbi，或IsaA和SdrC，或IsaA和自溶素，或IsaA和Ebh，或Sbi和SdrC，或Sbi和自溶素，或Sbi和Ebh，或SdrC和自溶素，或SdrC和Ebh，或自溶素-葡糖酰胺酶和Ebh的免疫原性組合物。對于這些組合中的每一種，蛋白可以是全長或片段，其具有與圖1的序列具有至少85%、90%、95%、98%或100%同一性的序列。在上面的以及下面的組合中，特定蛋白質可以任選作為如上所述的片段或融合蛋白而存在于本發(fā)明的免疫原性組合物中。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物不包括WO02/094868中公開的蛋白序列。三種蛋白質的組合本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物包含oc-毒素、胞外成分結合蛋白(優(yōu)選粘附素)和轉運蛋白(優(yōu)選鐵結合蛋白)相組合的三種蛋白質成分。在這樣的組合中，oc毒素可以^:化學脫毒或通過引入點突變而遺傳學脫毒，優(yōu)選His35Leu點突變。A毒素作為游離蛋白質存在或者作為選擇而被綴合到免疫原性組合物的多糖或LTA成分上。優(yōu)選的組合包括免疫原性組合物，包含ct毒素、IsdA和胞外成分結合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含ot毒素、IsdB和胞外成分結合蛋白，其選自層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酉旨酶GehD、SasA、歸A、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含oc毒素、IsdA和粘附素，其選自層粘連蛋白受體、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、自溶素、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。免疫原性組合物，包含oc毒素、IsdB和粘附素，其選自層粘連蛋白受體、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、SSP-1、SSP-2、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP。包含a毒素、IsdA和層粘連蛋白受體的免疫原性組合物。包含oc毒素、IsdA和EbhA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EbhB的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EbpS的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和EFB(FIB)的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和SdrG的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和ClfA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和ClfB的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和FnbA的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和凝固酶的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和Fig的免疫原性組合物。包含ot毒素、IsdA和SdrH的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和SdrC的免疫原性組合物。包含a毒素、IsdA和MAP的免疫原性組合物。包含IsaA和Sbi的免疫原性組合物。包含IsaA和IsdB的免疫原性組合物。包含IsaA和IsdA的免疫原性組合物。包含IsaA和SdrC的免疫原性組合物。包含IsaA和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性組合物。包含Sbi和SdrC的免疫原性組合物。包含Sbi和Ebh或其如上所述的片段的免疫原性組合物。包含IsaA、Sbi或SdrC的免疫原性組合物。在不同克隆系中表達的抗原的選擇對與金黃色葡萄球菌種群結構相關的毒力因子的出現(xiàn)進行的分析表明，金黃色葡萄球菌的天然種群中存在可變的毒力基因。在金黃色葡萄球菌的臨床分離林中，至少五種克隆系顯示出是非常普遍的(Booth"a/.，2001InfectImimm.69(1):345-52)。A-溶血素(A/fl)、纖連蛋白結合蛋白A(/m/l4)和聚集因子A顯示出存在于大多數(shù)分離林中，無論品系身份如何，表明了些蛋白質在金黃色葡萄球菌的生存中的重要作用(Booth""/.，2001InfectImmun.69(1):345-52)。而且，才艮據(jù)Peacocketal.2002，/"6J、c//4、凝固酵、5/fl、附/7、/v/(Panton畫Valentine殺白細胞素)、/r/g(gamma-毒素)、a-毒素和/cfl似乎與潛在的克隆結構無關，表明了這些基因相當多的水平轉移。相反，其它毒力基因諸如纖連蛋白結合蛋白B(/h6B)、p-溶血素(Mft)、膠原蛋白結合蛋白(can)、TSST-1(加)和曱氧苯青霉素抗性基因(附ecj)與特定品系有力地相關聯(lián)(BoothC"/.，2001InfectImmun.69(1):345-52)。同樣地，PeacockWfl/.2002(InfectImmun.70(9):4987-96)顯示出腸毒素、"〃exfolatin(和)，(3-和S畫毒素、Mr基因U&D、s&E和66/7)、cwa、W/;S和^/fe在種群中的分布是與MLST-衍生的克隆復合物相當明顯地相關的。MLST數(shù)據(jù)沒有提供證據(jù)證明引起醫(yī)源性疾病的菌林代表了與引起社區(qū)獲得疾病的菌林或者從健康帶菌者回收的菌林所截然不同的亞群(FeilWfl/.，2003JBacteriol.185(11):3307-16)。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物對于來自不同克隆系的葡萄球菌是有效的。在一種實施方案中，這是通過包含1、2、3、4種的優(yōu)選至少1種在大多數(shù)葡萄球菌分離林中表達的蛋白質而實現(xiàn)的。這樣的蛋白質的例子包括a-溶血素(/t/fl)、纖連蛋白結合蛋白A(/wM)和聚集因子A(c(/^)、凝固酶、5/m、附op、/7v/(Panton-Valentine殺白細胞素)、A/g(gamma-毒素)和/cfl。我們也鑒定了免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、RAP、自溶素(Ruppetal2001，J.Infect.Dis.183;1038)、層粘連蛋白受體、SitC、IsaA/PisA、SPOIIIE()、SsaA、EbpS、SasF(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、EFB(FIB)、SBI、Clffi、IsdA、IsdB、FnbB、Npase、EBP、骨唾液酸結合蛋白II、IsaB/PisB(LorenzetalFEMSImmuno.Med.Microb.2000，29;145)、SasH(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、MRPI、SasD(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、SasH(Rocheetal2003，Microbiology149;643)、自溶素前體(AUR)/Seppl以及新的自溶素。在作為選擇的實施方案中，在不同的克隆菌林組中表達的2或多種蛋白質被包括在本發(fā)明的免疫原性組合物中。優(yōu)選地，抗原組合將使得能夠產(chǎn)生針對多種克隆菌林有效的免疫應答，最優(yōu)選針對所有克隆菌林。優(yōu)選組合包括FnbB和p-溶血素、FnbB和Cna、FnbB和TSST畫l、FnbB和mecA、FnbB和SdrD、FnbB和SdrF、FnbB和EbpS、FnbB和Efb、(3-溶血素和Cna、(5-溶血素和TSST-1、(3-溶血素和mecA、(3-溶血素和SdrD、(3-溶血素和SdrF、P-溶血素和EbpS、p-溶血素和Efb、Cna和TSST畫1、Cna和mecA、Cna和SdrD，Cna和SdrF、Cna和EbpS、Cna和Efb、TSST-1和mecA、TSST-1和SdrD、TSST誦1和SdrF、TSST-1和EbpS、TssT畫l和Efb、MecA和SdrD、MecA和SdrF、MecA和EbpS、MecA和Efb、SdrD和SdrF、SdrD和EbpS、SdeD和Efb、SdrF和EbpS、SdrF和Efb以及EbpS和Efb。上述優(yōu)選組合可以與上述額外成分相結合。選擇在不同生長階段表達的抗原葡萄球菌經(jīng)歷指數(shù)生長階段，在該階段表達特定組的蛋白。這包括很多胞外成分結合蛋白和轉運蛋白。在指數(shù)生長階段后，葡萄球菌回到指數(shù)后階段，在該階段中其生長較慢，并且調(diào)節(jié)蛋白表達。在指數(shù)生長階段表達的很多蛋白都受到下調(diào)，而其它蛋白，如酶和大多數(shù)毒素，包括OC毒素，都以更高水平表達。本發(fā)明的優(yōu)選免疫原性組合物包含在指數(shù)生長階段以更高水平表達的蛋白和在指數(shù)后階段以更高水平表達的蛋白。"更高水平"是指一個階段的表達水平相對于其它階段更高。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含ot毒素和胞外成分結合蛋白(優(yōu)選FnbA、FnbB、ClfA和ClfB)或轉運蛋白。更優(yōu)選地，其包含ot毒素或Cna或酯酶GehD和選自下組的蛋白層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、SasA、FnbA、FnbB、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC、NiABC轉運蛋白、Aap和SsaA。在上文描述的組合中，a毒素可以按照上文的描述遺傳學或化學脫毒，并且可能綴合或不綴合到下文描述的多糖上。多糖本發(fā)明的免疫原性組合物優(yōu)選進一步包含莢膜多糖，包括一種或多種PIA(也被稱為PNAG)和/或金黃色葡萄球菌的V型和/或VIII型莢膜多糖和/或表皮葡萄球菌I型和/或11型和/或III型莢膜多糖。PIA(PNAG)現(xiàn)在清楚的是，被確定為PS/A、PIA和SAA的各種形式的葡萄球菌表面多糖是同樣的化學實體-PNAG(Maira-LitranetalVaccine22;872-879(2004))。因此術語PIA或PNAG包括所有這些多糖或者衍生自它們的寡糖。PIA是多糖胞間粘附素，由被N-乙酰和O-琥珀酰成分取代的口-U口6)連接的葡糖胺的聚合物所組成。該多糖存在于金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者中，能夠從任一來源分離(Joyceetal2003,CarbohydrateResearch338;903;Maira-Litranetal2002，Infect.Imun.70;4433)。例如，PNAG可從金黃色葡萄球菌菌林MN8m分離(WO04/43407)。分離自表皮葡萄球菌的PIA是生物膜的組成成分。它負責介導細胞-細胞粘連，或許也起作用來防止生長的菌落免受宿主的免疫應答。該多糖在以前被稱為聚-N-琥珀酰-P-(.l口6)-葡糖胺(PNSG)，最近顯示它不具有預期結構，因為確定了N-琥珀?；遣徽_的(Maira畫Litranetal2002，Infect.Imun.70;4433)。因此，形式上稱為PNSG而現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)是PNAG的多糖也被術語PIA所包括。PIA(或PNAG)可以是不同大小的由多達30個重復單元(被N-乙酰和0-琥珀酰成分取代的口-(l口6)連接的葡糖胺聚合物)所組成的寡糖，從超過400kDa、至ij75和400kDa之間、至！』10和75kDa之l、司變化。任何大小的PIA多糖或寡糖都可用于本發(fā)明的免疫原性組合物中，然而超過40kDa的大小是優(yōu)選的。大小分級可通過現(xiàn)有技術中已知的任何方法來獲得，例如通過微流化、超聲照射或者通過化學裂解(WO03/53462，EP497524,EP497525)。PIA(PNAG)的優(yōu)選大小是40-400kDa、50-350kDa、40-300kDa、60-300kDa、50-250kDa和60-200kDa。PIA(PNAG)PIA可由于氨基被乙酸酯取代而具有不同程度的乙?；?。體外產(chǎn)生的PIA幾乎在氨基上被全部取代(95-100%)。作為選擇，可以使用脫乙?；腜IA(PNAG)，具有少于60%、優(yōu)選少于50%、40%、30%、20%、10%的乙?；?吏用脫乙?；疨IA(PNAG)是優(yōu)選的，因為PNAG的非乙?；砦辉诮閷д{(diào)理素殺死革蘭氏陽性菌時是有效的，優(yōu)選金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌。更優(yōu)選地，PIA(PNAG)具有40kDa和300kDa之間的大小并且是脫乙酰化的，以使得少于60%、50%、40%、30%或20%的氨基祐:乙?；Ｐg語使PNAG脫乙?；?dPNAG)是指少于60%、50%、40%、30%、20%或10%的氨基被乙?；腜NAG多糖或寡糖。在一種實施方案中，通過化學處理天然多糖來使PNAG脫乙?；孕纬蒬PNAG。例如，用堿性溶液處理天然PNAG，以4吏得pH上升到超過IO。例如用0.1-5M、0.2國4M、0.3-3M、0.5-2M、0.75-1.5M或lMNaOH、KOH或NH40H處理PNAG。處理進^f亍至少10或30分鐘，或者1、2、3、4、5、10、15或20小時，溫度在20-100、25-80、30-60或30國50或35-45。C?？砂凑誛O04/43405的描述來制備dPNAG。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的多糖優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質上，或者作為選擇不被綴合。來自金黃色葡萄球菌的5型和8型多糖在人體中引起感染的大多數(shù)金黃色葡萄球菌菌林含有5型或8型多糖。大約60%的人體菌林是8型的，大約30%是5型的。5型和8型莢膜多糖抗原的結構描述于MoreauetalCarbohydrateRes.201;285(1990)以及FournieretalInfect.Immun.45;87(1984)中。兩者都在它們的重復單元中具有FucNAcp以及具有ManNAcA,可用于引入巰基。所報道的結構為5型—4)-口隱D畫ManNAcA(30Ac)國(1—4)誦口畫L-FucNAc(1—3)國口-D-FucNAc-(1—8型—3)畫口-D陽ManNAcA(40Ac)一(1—3)-口-L畫FucNAc(1—3)畫口陽D—FucNAc隱(1—最近(JonesCarbohydrateResearch340，1097畫1106(2005))匪R譜將結構修正為5型—4)-□-D-ManNAcA國(l—4)-□-L-FucNAc(30Ac)-(l—3)-□-D-FucNAc-(1—8型—3)-□-D-ManNAcA(40Ac)-(l—3)-□一L-FucNAc(1—3)-□-D-FucNAc(1—可以使用本領域技術人員公知的方法從合適的金黃色葡萄球菌菌祙中提取多糖，例如按照US6294177中的描述。例如，ATCC12902是5型金黃色葡萄球菌菌林，ATCC12605是8型金黃色葡萄球菌菌林。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學處理進行大小分級。本發(fā)明也包括衍生自金黃色葡萄球菌5型和8型多糖的寡糖。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的5型和8型多糖優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質上，或者作為選擇不被綴合。作為選擇，本發(fā)明的免疫原性組合物含有5型或8型多糖。金黃色葡萄球菌336抗原在一種實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物包含US6294177中描述的金黃色葡萄球菌336抗原。336抗原包含P-連接的己糖胺，不含O-乙?；?，特異性結合到針對保藏為ATCC55804的金黃色葡萄球菌336型的抗體上。在一種實施方案中，336抗原是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學處理進行大小分級。本發(fā)明也包括衍生自336抗原的寡糖。包括在本發(fā)明免疫原性組合物中的336抗原優(yōu)選被如下所述綴合到載體蛋白質上，或者作為選擇不被綴合。來自表皮葡萄球菌的I、II和III型多糖表皮葡萄球菌菌抹ATCC-31432、SE-360和SE-10的特征分別在于三種不同的莢膜I、II和III型(IchimanandYoshida1981，J.Appl.Bacteriol.51;229)。提取自每種表皮葡萄球菌血清型的莢膜多糖構成I、II和III型多糖?？梢酝ㄟ^幾種方法提取多糖，包括描述于US4197290中的方法或者按照Ichimanetal1991，J.Appl.Bacteriol.71;176中所描述的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，免疫原性組合物包含來自表皮葡萄球菌的i和/或ii和/或ni型多糖或寡糖。多糖是天然大小，或者作為選擇可以通過例如微流化、超聲照射或者通過化學裂解進行大小分級。本發(fā)明也包括提取自表皮葡萄球菌菌林的寡糖。這些多糖不纟皮綴合，或者優(yōu)選地被如下所述進行綴合。多糖的綴合在與疫苗接種中使用多糖相關的問題中，其中之一是多糖本身為弱免疫原的這一事實。已經(jīng)設計來克服這一免疫原性缺乏的策略包括將多糖連接到較大的蛋白質載體上，其提供了旁觀者t細胞輔助。優(yōu)選的是，將本發(fā)明所利用的多糖連接到提供旁觀者T細胞輔助的蛋白質載體上?？梢耘c多糖免疫原綴合的這些載體的例子包括白喉和破傷風類毒素(分別是DT、DTCrml97和TT)、匙孔血藍蛋白(KLH)、和結核菌素的純化蛋白質衍生物(PPD)、綠膿桿菌外蛋白A(rEPA)、來自流感嗜血桿菌的蛋白D、肺炎球菌溶血素或者上述任何之一的片段。適合使用的片段包括含有T輔助表位的片段。特別地，蛋白D片段將優(yōu)選包含蛋白質的N末端1/3。蛋白D是來自流感嗜血桿菌的IgD結合蛋白質(EP0594610B1)，并且是潛在的免疫原。此外，葡萄球菌蛋白可以用作本發(fā)明的多糖綴合物中的載體蛋白。下文描述的葡萄球菌蛋白可以用作載體蛋白；例如層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrG、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Npase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig、MAP、免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和MABC轉運蛋白、a毒素(Hla)、a毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)或其片段。特別有利于使用在葡萄球菌疫苗中的新載體蛋白質是葡萄球菌a類毒素?？蓪⑻烊恍问骄Y合到多糖上，因為綴合步驟降低了毒性。優(yōu)選地將遺傳去毒的a毒素諸如His35Leu或His35Arg變體用作載體，因為殘留毒性更低。作為選擇，通過用交聯(lián)試劑、曱醛或戊二醛處理將oc毒素化學去毒。遺傳去毒的a毒素被任選化學去毒，優(yōu)選通過用交聯(lián)試劑、曱醛或戊二醛處理以進一步降低毒性。可通過任何已知方法將多糖連接到載體蛋白質上(例如通過Likhite的美國專利4，372，945，Armor的美國專利4，474，757以及Jenningsetal.的美國專利4,356,170)。優(yōu)選地，實施CDAP綴合化學(參見WO95/08348)。在CDAP中，氰化試劑l-氰基-二甲氨基吡啶四氟硼酸鹽(CDAP)被優(yōu)選用于多糖-蛋白質綴合物的合成。氰化反應可以在相對溫和的條件下進行，這避免了堿性敏感的多糖的水解。這種合成法使得能夠直接偶聯(lián)到載體蛋白質上?？蓪⒍嗵侨苡谒谢螓}溶液中?？蓪DAP溶解在乙腈中，立即加入到多糖溶液中。CDAP與多糖的羥基反應形成氰酸酯。反應步驟之后，加入載體蛋白質。賴氨酸的氨基與活化的多糖反應形成異脲共價連接。偶聯(lián)反應之后，然后加入大大過量的甘氨酸以淬滅殘留的活化官能團。然后將產(chǎn)物通過凝膠滲透柱以去除未反應的載體蛋白質和殘留試劑。綴合優(yōu)選包括在載體蛋白和多糖之間產(chǎn)生直接的鍵。任選地，可以將間隔基(如己二酸酐(ADH))導入載體和多糖之間。抗金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的保護作用在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，免疫原性組合物提供針對多于一種葡萄球菌菌林的有效免疫應答，優(yōu)選針對來自金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的菌株。更優(yōu)選地，產(chǎn)生針對金黃色葡萄球菌5型和8型血清型的保護性免疫應答。更優(yōu)選地，產(chǎn)生針對表皮葡萄球菌的多種菌林，例如血清型I、II和III中至少兩種血清型的菌林的保護性免疫應答。本發(fā)明免疫原性組合物的一種用途是通過在醫(yī)院治療之前接種疫苗來預防醫(yī)源性感染。在這個階段，很難精確預測患者將暴露于哪些葡萄球菌菌林。因此用能夠產(chǎn)生針對各種葡萄球菌菌林的有效免疫應答的疫苗進行接種是有利的。有效免疫應答被定義為在如實施例中描述的小鼠攻擊模型或調(diào)理呑噬作用分析中產(chǎn)生明顯保護。在例如實施例5的小鼠攻擊模型中的明顯保護被定義為與接種了載體的小鼠相比LD50至50%、100%或200%的增加。在例如實施例8的棉鼠攻擊模型中的明顯保護被定義為所觀察到的平均對數(shù)CFU/鼻至少10。/。、20%、50%、70%或卯％的降低。已知調(diào)理性抗體的存在是與保護性相關聯(lián)的，因此在例如實施例7的調(diào)理吞噬作用分析中細菌計數(shù)至少10%、20%、50%、70%或90%的減少表明了明顯的保護。包括免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、RNAIII活化蛋白、層粘連蛋白受體、SitC、IsaA/PisA、SsaA、EbhA/EbhB、EbpS和Aap在內(nèi)的幾種蛋白質在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之間是相當保守的，實施例8顯示IsaA、ClfA、IsdB、SdrG、HarA、FnbpA和Sbi能夠產(chǎn)生交叉反應性免疫應答(例如在至少一種金黃色葡萄球菌和至少一種表皮葡萄球菌菌林之間的交叉反應性)。PIA在金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌之間也是相當保守的，并且能夠誘導交叉免疫應答。因此在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物將包含兩種、三種或四種上述蛋白質，優(yōu)選進一步包含PIA(PNAG)。多核苷酸疫苗另一方面，本發(fā)明涉及圖2的多核苷酸在治療、預防或診斷葡萄球菌感染中的用途。所述多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含編碼在序列的全長上與圖1的氨基酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的多肽。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多肽，而具有至少98-99%同一性的多肽是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多肽是最高度優(yōu)選的。在本發(fā)明中有用的其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含在整個編碼區(qū)與編碼本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多核苷酸，而具有至少98-99%同一性的多核苷酸是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。其它多核苷酸包括分離的多核苷酸，其包含與圖1的序列具有至少70%同一性，優(yōu)選至少80%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，更優(yōu)選至少95%同一性的核苷酸序列。在此方面，高度優(yōu)選的是具有至少97%同一性的多核苦酸，而具有至少98-99°/。同一性的多核苷酸是更高度優(yōu)選的，具有至少99%同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的。所述多核苷酸可以插入合適的質?；蛑亟M微生物載體，并且用于免疫(參見例如Wolffet.al"Science247:1465-1468(1990);Corret.al.，J.Exp.Med.184:1555-1560(1996);Doeet.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93:8578-8583(1996))。本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明的前述蛋白的核酸和它們在醫(yī)學中的用途。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，并且可以是DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。其它的編碼或非編碼序列可能但不是必須存在于本發(fā)明的多核苷酸中。在其它相關實施方案中，本發(fā)明提供了與圖2中公開的序列具有顯著同一性的多核苷酸變體；采用此處描述的方法(如采用標準參數(shù)的BLAST分析)與本發(fā)明的多核苷酸序列相比具有至少75%序列同一性，優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%或更高序列同一性的多核苷酸。在相關實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸將包含編碼在圖1的序列的全長上與圖1的氨基酸序列具有至少90%，優(yōu)選95%和更高同一性的多肽的核苷酸序列；或與所述分離的多核苷酸互補的核苷酸序列。本發(fā)明也涉及與上述所有多核苷酸互補的多核苷酸的用途。本發(fā)明也提供了本發(fā)明的多核苷酸的片段的用途，當給予受試者時，所述片段與圖1的多核苷酸具有相同的免疫原性特征。本發(fā)明也提供了編碼此處定義的圖1的蛋白的免疫原性片段的多核苷酸的用途。也考慮具有圖2所示多核苷酸編碼的多肽序列的免疫原性活性水平的至少約50%,優(yōu)選至少約70%，更優(yōu)選至少約90%的免疫原性活性水平的片段的用途。用于本發(fā)明的多肽片段優(yōu)選包含至少約5、10、15、20、25、50或100或更多個連續(xù)氨基酸，包括此處所述多肽組分的所有中間長度，如上文列出的那些?？梢杂脴藴士寺『秃Y選技術，從來源于人腫瘤前或腫瘤組織(如肺)的細胞中的mRNA的cDNA文庫獲得用于本發(fā)明的多核苷酸(例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.，ColdSpringharborLaboratoryPress,ColdSpringharbor,N.Y.(1989))。本發(fā)明的多核苦酸也可以從天然來源如基因組DNA文庫獲得，或可以用公知和可商購的技術合成。存在一些本領域技術人員可獲得并且公知的方法來獲得全長cDNAs或延伸短cDNAs，例如基于cDNA末端快速擴增法(RACE)的那些方法(參見例如Frohmanetal.，PNASUSA85，8998-9002，1988)。最近對該:纟支術的改進，例如MarathonTM^支術(ClontechLaboratoriesInc.)，顯著簡化了對更長cDNAs的檢索。在Marathon技術中，從提取自選擇的組織的mRNA制備cDNAs,并且在每個末端連接上"銜接子"序列。然后，進行核酸擴增(PCR)，以便用基因特異性和銜接子特異性寡核苷酸引物的組合擴增cDNA的"丟失的"5，末端。然后，用"嵌套的"引物，即設計用于在擴增的產(chǎn)物內(nèi)退火的引物(典型是在銜接子序列中的更3，處退火的銜接子特異性引物和在已知基因序列的更5，處退火的基因特異性引物)重復PCR反應。然后可以通過DNA測序分析該反應的產(chǎn)物，通過將產(chǎn)物直接連接于存在的cDNA而構建全長cDNA，以得到完整序列，或用關于設計5，引物的新序列信息進行獨立的全長PCR。包含所述DNA的載體、用所述載體轉化的宿主和按照下文表達的它們的截短或雜合蛋白都形成本發(fā)明的部分。表達載體也可以是重組活微生物，如病毒或細菌。可以將感興趣的基因插入活重組病毒或細菌的基因組。用該活載體進行接種和體內(nèi)感染，將導致抗原的體內(nèi)表達和免疫應答的誘導。因此，在某些實施方案中，使用多種已知的基于病毒的系統(tǒng)的任何一種將編碼用于本發(fā)明的免疫原性多肽的多核苷酸導入到適合的哺乳動物宿主細胞中用于表達。在一個說明性的實施方式中，逆轉錄病毒提供了基因遞送系統(tǒng)的方便和有效的平臺。編碼用于本發(fā)明的多肽的選定核苷酸序列可以使用本領域已知的技術插入到載體中，并包裝到逆轉錄病毒顆粒中。然后能分離重組病毒并遞送給受試者。已經(jīng)描述了許多說明性的逆轉錄病毒系統(tǒng)(例如，美國專利No.5，219，740;MillerandRosman(1989)BioTechniques7:980-990;Miller,A.D.(1990)HumanGeneTherapy1:5-14;Scarpaetal.(1991)Virology180:849-852;Burnsetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037和Boris-LawrieandTemin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。此外，還已經(jīng)描述了許多說明性的基于腺病毒的系統(tǒng)。與整合到宿主基因組中的逆轉錄病毒不同，腺病毒存留在染色體外，因而使與插入資變有關的風險最小化(Haj-AhmadandGraham(1986)J.Virol.57:267-274;Bettetal.(1993)J.Virol.67:5911-5921;Mitterederetal.(1994)H腿anGeneTherapy5:717-729;Sethetal.(1994)J.Virol.68:933-940;Barretal.(1994)GeneTherapy1:51-58;Berkner，K.L.(1988)BioTechniques6:616-629;andRichetal.(1993)HumanGeneTherapy4:461-476)。也已經(jīng)開發(fā)出各種腺病毒相關病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于多核苷酸遞送。使用本領域公知的技術可以容易地構建AAV載體。參見，例如，美國專利No.5,173,414和5,139,941;國際公開No.WO92/01070和WO93/03769;Lebkowskietal.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996;Vincentetal.(1990)Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress);Carter,B.J.(1992)CurrentOpinioninBiotechnology3:533-539;Muzyczka,N.(1992)CurrentTopicsinMicrobiol,andImmunol.158:97-129;Kotin，R.M.(1994)HumanGeneTherapy5:793-801;ShellingandSmith(1994)GeneTherapy1:165-169;andZhouetal.(1994)J.Exp.Med.179:1867-1875。對于通過基因轉移遞送編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子有用的其他病毒載體包括那些來源于痘病毒家族的那些，例如牛痘病毒和禽痘病毒。舉例來說，表達感興趣的分子的牛痘病毒重組體可以如下構建。首先將編碼多肽的DNA插入到合適的載體中，使得它接近牛痘啟動子和側翼的牛痘DNA序列，例如編碼胸苦激酶(TK)的序列。然后這個載體被用于轉染同時感染了牛痘的細胞。同源重組用于將牛痘啟動子加編碼所述目標多肽的基因插入到病毒基因組中?？梢酝ㄟ^在存在5-溴脫氧尿核苷的情況下培養(yǎng)所述細胞，并選取對其有抗性的病毒斑塊，來選擇產(chǎn)生的TK.sup.(-)重組體?；谂６坏母腥?轉染系統(tǒng)可以被方便地用于提供在生物體的宿主細胞中在此描述的一種或多種多肽的可誘導的、瞬時的表達或共表達。在這個特定的系統(tǒng)中，細胞首先在體外用編碼噬菌體T7RNA聚合酶的牛痘病毒重組體感染。該聚合酶顯示了精確的特異性，僅轉錄帶有T7啟動子的模板。在感染之后，將細胞用由T7啟動子驅動的多核苷酸或目標多核苷酸轉染。在細胞質中表達的、來自牛痘病毒重組體的聚合酶將轉染的DNA轉錄成RNA，然后RNA通過宿主的翻譯機制被翻譯成多肽。該方法提供了高水平的、瞬時的、細胞質的大量RNA和它的翻譯產(chǎn)物的產(chǎn)生。參見，例如ElroySteinandMoss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(19卯)87:6743-6747;Fuerstetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:8122-8126。做為選擇，也可以l吏用鳥類痘病毒例如禽痘(fowlpox)和雀痘(canarypox)病毒來遞送目才示編碼序列。已知表達來自哺享t動物病原體的免疫原的重組禽痘病毒，當給非禽類物種施用時，給予了保護性免疫。在人類和和其他哺乳動物物種中施用Avipox載體是特別希望的，因為Avipox屬的成員僅在易感的禽類物種中生產(chǎn)性復制，因而在哺乳動物細胞中沒有傳染性。生產(chǎn)重組禽痘病毒的方法是本領域已知的，并應用了遺傳重組，在以上關于牛痘病毒的生產(chǎn)中描述了。參見，例如WO91/12882;WO89/03429;和WO92/03545。許多甲病毒屬載體的任何一種也可以被用于遞送本發(fā)明的多核苷酸組合物，例如那些在美國專利No.5，843,723;6，015，686;6,008,035和6,015,694中描述的。也可以使用某些基于委內(nèi)端拉馬腦炎(VEE)的載體，這些的il明性實例可以在美國專利No.5，505，947和5,643,576中找到。jt匕夕卜，也可以將分子綴合載體，如Michaeletal.J.Biol.Chem.(1993)268:6866-6869andWagneretal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099-6103中描述的腺病毒嵌合載體用于本發(fā)明的基因遞送。關于這些和其它公知的基于病毒的送遞系統(tǒng)的其它說明性的信息可以參見例如Fisher國Hochetal"P麼，胸/.JcflA5W.317-321，1989;Flexneretal"K5W.569:86-103，1989;Flexneretal"r"c">i":17-21，1990;U.S.PatentNos.4,603,112，4，769,330，and5,017,487;WO89/01973;U.S.PatentNo.4,777,127;GB2,200,651;EP0,345,242;WO91/02805;Berkner，所^:/m/《證6:616-627，1988;Rosenfeldetal"Sc&臟252:431-434，1991;Kollsetal.，/Vfl".5W.fAV/T97:215-219，1994;Kass-Eisleretal.，jP艦淑/.爿cflrf.CASL4卯11498-11502，1993;Guzmanetal.，C/，/函wM:2838-2848，1993;和Guzmanetal.，C/r.及w73:1202-1207，1993。上文描述的重組活微生物可以是有毒的或以各種方式減毒的，以獲得活疫苗。所述活疫苗也形成本發(fā)明的部分。在某些實施方案中，可以將多核苷酸整合到靶細胞的基因組中。該整合可以是通過同源重組發(fā)生在特異性的位置和方向(基因替代)和可以在隨機、非特異性的位置整合(基因增強)。在進一步的實施方案中，多核苷酸可以穩(wěn)定維持在細胞中，作為DNA的獨立的附加片段。所述多核苷酸片段或"附加體，，編碼足夠獨立于宿主細胞周期而維持和復制，或與宿主細胞周期同步維持和復制的序列。將表達構建體遞送到細胞和多核苷酸在細胞中維持的方式不依賴于采用的構建體的表達。在本發(fā)明的另一種實施方案中，作為"棵"DNA施用/遞送本發(fā)明的多核苦酸，例如在Ulmeretal"5We"ce259:1745-1749，1993中描述的和Cohen，Sc&wce259:1691-1692，1993綜述的。通過將DNA包被在生物可降解的珠中可以增加棵DNA的攝取，所述生物可降解的珠被有效地轉運到細胞中。在另一種實施方案中，可以用粒子轟擊方法遞送本發(fā)明的組合物，很多這樣的方法已經(jīng)描述過。在一個說明性的實例中，用例如PowderjectPharmaceuticalsPLC(Oxford，UK)和PowderjectVaccinesInc.(Madison,WI)制造的那些裝置可以實現(xiàn)氣體馬區(qū)動的粒子加速，這一點的一些實例在美國專利No.5，846，796;6,010,478;5,865,796;5,584,807;和EPPatentNo.0500799中描述了。這種方法提供了一種無針的遞送方法，其中微觀粒子，例如多核苷酸或多肽粒子的干粉制劑在手持裝置產(chǎn)生的氦氣噴射內(nèi)被加速到高速，推動所述粒子進入目標耙組織。在相關的實施方案中，對于氣體驅動的無針注射本發(fā)明的組合物有用的其他裝置和方法包括Bioject，Inc.(Portland,OR)提供的那些，其某些實例在美國專利No.4,790,824;5,064,413;5,312,335;5,383,851;5,399,163;5,520,639和5,993,412中描述。疫苗在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物與藥學可接受的賦形劑相混合，更優(yōu)選與佐劑混合以形成疫苗。本發(fā)明的疫苗優(yōu)選被佐劑化。合適的佐劑包括鋁鹽諸如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁，但是也可以是鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽或鋅鹽，或者可以是酰化酪氨酸或?；?、陽離子或陰離子衍生多糖或聚磷腈的不溶懸浮液。優(yōu)選所選擇的佐劑是TH1或TH2型應答的優(yōu)先誘導物。高水平的Thl型細胞因子傾向于幫助對特定抗原的細胞介導免疫應答的誘導，而高水平的Th2型細胞因子傾向于幫助對抗原的體液免疫應答的誘導。重要的是要記住，Thl和Th2型免疫應答的區(qū)別不是絕對的。實際上每個人都將維持被描述為Thl優(yōu)勢或Th2優(yōu)勢的免疫應答。然而，4艮據(jù)Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT細胞克隆中所描述的(Mosmann，T.R.和Coffman，R丄.(1989)TH1和TH2細胞淋巴因子分泌的不同模式導致不同的功能性質(TH1andTH2cells:differentpatternsoflymphokinesecretionleadtodifferentfunctionalproperties).AnnualReviewofImmunology,7，pl45-173)來考慮細胞因子家族經(jīng)常是方便的。傳統(tǒng)上，Thl型應答是與T-淋巴細胞所產(chǎn)生的INF-y和IL-2細胞因子相關聯(lián)的。經(jīng)常與Thl型免疫應答的誘導直接關聯(lián)的其它細胞因子不是T細胞產(chǎn)生的，諸如IL-12。相反，Th2型應答是與IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌相關聯(lián)的。促進Thl優(yōu)勢應答的合適佐劑體系包括單磷酰脂A或其衍生物，特別是3-脫氧-?；瘑瘟柞Ｖ珹(3D-MPL)(它的制備參見GB2220211A);單磷酰脂A的組合，優(yōu)選3-脫氧-酰化單磷酰脂A加上鋁鹽(例如磷酸鋁或氫氧化鋁)或水包油乳劑。在這樣的組合中，抗原和3D-MPL被包含在同一微粒結構中，以便能夠用于抗原性和免疫刺激性信號的更有效遞送。研究已經(jīng)表明3D-MPL能夠進一步增強明礬吸附抗原的免疫原性[ThoelenW"/.Vaccine(1998)16:708-14;EP689454-Bl]。增強體系涉及單磷酰脂A與皂苷衍生物的組合，特別是如WO94/00153中披露的QS21和3D-MPL的組合，或者更低反應原性的組合物，其中用膽固醇淬滅了QS21，如WO96/33739中所披露的。WO95/17210中描述了涉及水包油乳劑中的QS21、3D-MPL和生育酚的特別有效的佐劑制劑，這是優(yōu)選的制劑。優(yōu)選地，疫苗額外包含皂苷，更優(yōu)選QS21。制劑也可包含水包油乳劑和生育酚(WO95/17210)。本發(fā)明也提供了生產(chǎn)疫苗制劑的方法，包括將本發(fā)明的蛋白質與藥學可接受的賦形劑諸如3D-MPL混合在一起。含有未曱基化CpG的寡核*酸(WO96/02555)也是TH1應答的優(yōu)先誘導物，適合用于本發(fā)明中。本發(fā)明的優(yōu)選組合物是形成脂質體結構的那些。其中的固醇/免疫學活性的皂苷組分形成ISCOM結構的組合物也構成本發(fā)明的方面。QS21:固醇的比將典型地大約在1:100到1:1的重量比。優(yōu)選存在過量的固醇，QS21:固醇的比至少1:2w/w。對于人體給藥來說，典型地，QS21和固醇將以大約1fig到大約100iag的范圍存在于疫苗中，優(yōu)選每劑量大約10pg到大約50fig。脂質體優(yōu)選含有天然脂，例如卵磷脂，優(yōu)選在室溫不結晶的，例如卵黃卵磷脂、二油酰卵磷脂或二月桂基團卵磷脂。脂質體也可含有增加脂質體-QS21結構穩(wěn)定性的帶電荷的脂，因為脂質體是由飽和脂組成的。在這些情況下，帶電荷的脂的量優(yōu)選1-20%w/w，最優(yōu)選5-10%。固醇與磷脂的比為1-50%(mol/mo1),最優(yōu)選20-25%。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物含有MPL(3-脫?；鶈瘟柞Ｖ珹，也稱為3D-MPL)。由GB2220211(Ribi)可知，3D-MPL是3型脫氧酰化單磷酰脂A與4、5或6個酰化鏈的混合物，由RibiImmunochem，Montana生產(chǎn)。優(yōu)選形式披露在國際專利申請92/116556中。本發(fā)明合適的組合物是最初制備脂質體時沒有MPL、然后加入MPL的那些組合物，優(yōu)選100nm微粒。因此MPL不包含在嚢泡膜內(nèi)部(稱為MPL在外部)。MPL包含在嚢泡膜內(nèi)部的組合物(稱為MPL在內(nèi)部)也構成本發(fā)明的方面?？乖砂趪芭菽?nèi)部或者包含在嚢泡膜外部。優(yōu)選地，可溶性抗原在外部，疏水性或脂化抗原包含在膜的內(nèi)部或外部。本發(fā)明的疫苗制劑可用于防護或治療哺乳動物對感染的敏感性，其通過經(jīng)全身性或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑的注射；或者經(jīng)粘膜給予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。用于肺炎或中耳炎治療的疫苗鼻內(nèi)給藥是優(yōu)選的(因為能夠更有效地預防肺炎雙球菌的鼻咽遞送，從而減弱了在它的最早階段的感染)。盡管本發(fā)明的疫苗可作為單劑量給藥，但是其組分也可同時或不同時間一起共同給藥(例如肺炎球菌多糖可分開給藥，在疫苗的任何細菌蛋白質組分給藥的同時或1-2周后給藥，以便免疫應答的最佳彼此協(xié)調(diào))。對于共同給藥來說，可任選Thl佐劑存在于任意或所有的不同給藥中，然而優(yōu)選的是它與疫苗的細菌蛋白質組分結合存在。除了單一途徑給藥之外，也可使用2種不同的給藥途徑。例如，多糖可IM(或ID)給藥，細菌蛋白質可IN(或ID)給藥。此外，本發(fā)明的疫苗可以IM給藥用于致敏劑，IN給藥用于加強劑。每劑疫苗中的綴合抗原的量選擇為在典型疫苗中誘導免疫保護性應答而沒有明顯的不利副作用的量。這樣的量將根據(jù)采用的是哪種特定免疫原以及如何呈遞它而變化。通常，期望的是每劑將包含0.1-100pg多糖，優(yōu)選0.1-50fig的多糖綴合物，優(yōu)選0.1-10fig，更優(yōu)選1-10fig，其中1到5pg是更優(yōu)選的范圍。疫苗中的蛋白質抗原含量將典型地在1-100Mg的范圍，優(yōu)選5-50/ig的范圍，最典型地在5-25jig的范圍。在初次疫苗接種之后，受試者可接受一次或幾次適當間隔的加強免疫。疫苗制備一般地描述于VaccineDesign("亞基和佐劑方法，，("Thesubunitandadjuvantapproach")(edsPowellM.F.&NewmanM.J.)(1995)PlenumPressNewYork)中。在脂質體中的膠嚢化描述于Fullerton的美國專利4,235,877中。本發(fā)明的疫苗可保存在溶液中或者凍干。優(yōu)選地，在存在糖諸如蔗糖、海藻糖或乳糖的情況下凍干溶液。還進一步優(yōu)選的是，將它們凍干，在使用之前當場再生。凍干可形成更穩(wěn)定的組合物(疫苗)，可能在存在3D-MPL且缺少鋁基佐劑的情況下產(chǎn)生更高的抗體滴度?？贵w和纟皮動免疫本發(fā)明的另一方面是制備用于預防或治療葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用本發(fā)明的疫苗免疫受體并從受體分離免疫球蛋白的步驟。由該方法制備的免疫球蛋白是本發(fā)明進一步的方面。包含本發(fā)明的免疫球蛋白和藥學可接受載體的藥物組合物是本發(fā)明進一步的方面，其可用在治療或預防葡萄球菌疾病的藥物的生產(chǎn)中。本發(fā)明進一步的方面是用于治療或預防葡萄球菌感染的方法，包括給予患者有效量的本發(fā)明的藥物制劑的步驟。成水溶性組合物而制備的。將免疫刺激量的接種物給予哺乳動物，然后將接種過的哺乳動物維持足夠時間以便抗原性組合物誘導保護性抗體?？赏ㄟ^公知技術諸如親合層析在期望的程度上分離抗體(Harlow和LaneAntibodies;alaboratorymanual1988)?？贵w可包括來自各種常用動物的抗血清，例如山羊、靈長類、驢、豬、馬、豚鼠、大鼠或人。從動物取血，回收血清。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的免疫球蛋白可包括完整抗體、抗體片段或亞片段?？贵w可以是任何類型的完整免疫球蛋白，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有針對本發(fā)明的兩種或多種抗原的雙特異性的嵌合抗體或雜交抗體。它們也可以是片段，例如F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv等等，包括雜交片段。免疫球蛋白也包括天然的、合成的或遺傳工程化的蛋白質，它們象抗體一樣通過結合到特定抗原上形成復合物而起作用。本發(fā)明的疫苗可被給予受體，然后該受體作為免疫球蛋白源，是對來自特定疫苗的攻擊的應答而產(chǎn)生的。這樣，治療過的受試者將提供血漿，從該血漿中經(jīng)常規(guī)的血漿分級方法將獲得超免疫球蛋白。超免疫球蛋白將被給予另一受試者以便給予抗葡萄球菌感染的抗性或者治療葡萄球菌感染。本發(fā)明的超免疫球蛋白特別適用于治療或預防嬰兒、免疫受損個體中的葡萄球菌疾病，或者在需要治療時而沒有時間給該個體針對疫苗接種的應答產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的另外方面是藥物組合物，其包含兩種或多種針對本發(fā)明免疫原性組合物的至少兩種成分有反應的單克隆抗體(或其片段；優(yōu)選人抗體或人源化抗體)，可用于治療或預防革蘭氏陽性菌引起的感染，優(yōu)選葡萄球菌，更優(yōu)選金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。這樣的藥物組合物包含可以是任何類型的完整免疫球蛋白的單克隆抗體，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、具有針對本發(fā)明的兩種或多種抗原的特異性的嵌合抗體或雜交抗體。它們也可以是片段，例如F(ab，)2、Fab，、Fab、Fv等等，包括雜交片段。制備單克隆抗體的方法是現(xiàn)有技術中公知的，可包括脾細胞與骨髓瘤細胞的融合(Kohler和Milstein1975Nature256;495;Antibodies—alaboratorymanualHarlow和Lane1988)。作為選擇，單克隆Fv片段可通過篩選合適的噬菌體展示文庫而獲得(VaughanTJetal1998NatureBiotechnology16;535)。單克隆抗體可以通過已知方法人源4匕或部分人源化。方法本發(fā)明也包括制備本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗的方法。本發(fā)明的優(yōu)選方法是制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備本發(fā)明的免疫原性組合物的步驟以及加入藥學可接受賦形劑的步驟。治療方法本發(fā)明也包括治療或預防葡萄球菌感染的方法，特別是在醫(yī)院獲得的醫(yī)源性感染。的。這樣的患者將;先知道手i日期并能夠預先接種疫苗。由于不知道患者是否將暴露于金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染，因此優(yōu)選用如上所述的防護兩者的本發(fā)明的疫苗進行接種。優(yōu)選地，等待擇期手術的16歲以上成人用本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗進行治療。用本發(fā)明的疫苗接種醫(yī)護人員也是有利的。本發(fā)明的疫苗制劑可用于防護或治療哺乳動物對感染的敏感性，其通過經(jīng)全身性或粘膜途徑給予所述疫苗。這些給藥可包括經(jīng)肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或皮下途徑的注射；或者經(jīng)粘膜給予口腔/食道、呼吸道、泌尿生殖道。每劑疫苗中的綴合抗原的量選擇為在典型疫苗中誘導免疫保護性應答而沒有明顯的不利副作用的量。這樣的量將根據(jù)采用的是哪種特定免疫原以及如何呈遞它而變化。疫苗的蛋白質含量將典型地在1-lOO^ig的范圍，優(yōu)選5-50^g，最典型地在10-2^ig的范圍。通常，期望的是每劑將包含0.1-100jig所呈遞的多糖，優(yōu)選0.1-50^g，優(yōu)選0.1-10pg，更優(yōu)選1-10)ig，其中l(wèi)到5pg是最優(yōu)選的范圍。對于特定疫苗來說最佳的量可通過標準研究確定，包括在受試者中的合適免疫應答的觀察。在初次疫苗接種之后，受試者可接受一次或幾次適當間隔的加強免疫。盡管本發(fā)明的疫苗可通過任何途徑給藥，但是將所述疫苗給藥到皮膚中(ID)構成本發(fā)明的一種實施方案。人體皮膚包含外部"角質狀的，，角質層，稱為角質層，它覆蓋表皮。在該表皮之下是稱為真皮的層，它又覆蓋皮下組織。研究人員已經(jīng)證明，疫苗注射進皮膚中，特別是真皮中，刺激了免疫應答，這也可能與許多另外的優(yōu)點相關聯(lián)。用這里描述的疫苗進行的皮內(nèi)接種構成本發(fā)明的優(yōu)選特征。皮內(nèi)注射的常規(guī)技術"mantoux方法"包括如下步驟，清潔皮膚，然后用一只手伸展，用窄規(guī)針(26-31規(guī)格)朝向針上部的斜面以10-15。的角度插入。一旦針的斜面插入，就降低針管，進一步推進，同時提供低壓以在皮膚下抬高它。然后極慢地注射液體從而形成皮膚表面上的泡或隆起，接著慢慢抽出針。更為近來，已經(jīng)描述了特別地設計來將液體試劑給藥到皮膚中或穿過皮膚的設備，例如描述于WO99/34850和EP1092444中的設備，以及描述于例如WO01/13977中的快速注射設備；US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5，704，911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4，790，824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。皮內(nèi)給予疫苗制劑的作為選擇的方法可包括常規(guī)注射器和針，或者設計來沖擊遞送固體疫苗的設備(WO99/27961)，或者皮膚貼(WO97/48440;WO98/28037);或者施加到皮膚表面上(通過皮膚或經(jīng)皮的遞送WO98/20734;WO98/28037)。當將本發(fā)明的疫苗給藥到皮膚時，或者更特別地給藥到真皮中時，疫苗是較低的液體體積，特別是在大約0.05ml和0.2ml之間的體積。本發(fā)明的皮膚或經(jīng)皮疫苗中抗原的含量可以類似于肌肉內(nèi)疫苗中存在的常規(guī)劑量(見上文)。然而，皮膚或經(jīng)皮疫苗的特征是制劑可以是"低劑量"。因此"低劑量"疫苗中的蛋白質抗原優(yōu)選存在為僅僅0.1到10pg每劑，優(yōu)選0.1到5pg每劑；多糖(優(yōu)選綴合的)抗原可以在O.Ol-l)ig每劑的范圍內(nèi)存在，優(yōu)選0.01到0.5^g之間的多糖每劑。如這里使用的，術語"經(jīng)皮遞送"意指將疫苗遞送到皮膚中的真皮區(qū)域。然而，疫苗將不必全部位于真皮中。真皮是位于距離人體皮膚表面大約1.0和大約2.0mm之間的皮膚層，但是在個體之間以及身體不同部分中存在一定量的變化。通常，可預期的是通過到皮膚表面下1.5mm來到達真皮。真皮的表面是角質層和表皮，下面是皮下層。根據(jù)遞送模式，疫苗可能最終完全或主要位于真皮中，或者它可能最終分布在表皮和真皮中。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案是預防或治療葡萄球菌感染或疾病的方法，包括將本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗給予有此需要的患者的步服在優(yōu)選實施方案中，患者是等待擇期手術的。本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方案是本發(fā)明的免疫原性組合物在制備用于治療或預防葡萄球菌感染或疾病的疫苗中的用途，優(yōu)選手術后葡萄球菌感染。術語"葡萄球菌感染"包括由金黃色葡萄球菌和/或表皮葡萄球菌以及能夠引起哺乳動物中優(yōu)選人宿主中感染的其它葡萄球菌菌林所引起的感染。在每種情況下，發(fā)明人都認為這里的術語"包含，，、"包括可以任選用"由…組成"替換。入這里。為使本發(fā)明可被更好地理解，提供下面的實施例。這些實施例僅僅用于說明目的，不要以任何方式理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1表達重組蛋白質的質粒的構建A:克隆。設計在特異于葡萄球菌基因的寡核苷酸中的合適限制性位點允許將PCR產(chǎn)物定向克隆到E"http://表達質粒pET24d或pQE-30中，這樣蛋白質就能夠表達為在N-或C-末端含有(His)6親合層析標志的融合蛋白質。所使用的引物是oc毒素-5，-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3，和5，CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3"EbpS-5-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG畫3'和5,CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG-3"ClfA—5,國CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3"和5，CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC畫3"FnbpA—5，-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3"和5'CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3"Sbi—5,-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3"和5GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3"SdrC—5國CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3"和5CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC醒3"SdrG—5，畫CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3"和5，CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG國3"Ebh-5,-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3"和5AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG畫3,Aaa-5，-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC畫3'和5，GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3"IsaA—5，-CAAGC畫3，和5國AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3"HarA—5畫GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3'和5TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG國3"自溶素葡糖酰胺酶-5-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3，和5，-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3，自溶素酰胺酶-5，-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3，和5，GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3"IsdA—5，-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3"和5ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3"IsdB—5，畫TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG陽3'和5，GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3"MRPII-5，-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3"和5，AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3'首先按照廠商說明使用ToplO細菌細胞將PCR產(chǎn)物引入到pGEM-T克隆載體(Novagen)中。制備該中間構建體是為了幫助進一步克隆到表達載體中。通過限制酶分析選擇含有DNA插入片段的轉化體。消化之后，通過凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8%瓊脂糖)分析約20^1反應試樣。在凝膠電泳和溴化乙啶染色之后通過UV照射觀察DNA片段。將DNA分子大小標準(1Kb梯度，LifeTechnologies)與測試樣品平行電泳，用于估計DNA片段的大小。然后用如廠商(LifeTechnologies)所建議的合適限制酶將從每種克隆的選定轉化體純化的質粒順序消化完全。然后使用硅膠基自旋柱純化已消化的DNA片段，接著用pET24d或pQE-30質粒連接。使用pET24d質粒進行Ebh(H2片段)、AaA、IsdA、IsdB、HarA、Atl-酰胺酶、Atl-葡糖胺、MRP、IsaA的克隆，使用pQE-30質粒進行ClfA、SdrC、SdrE、FnbpA、SdrG/Fbe、a毒素和Sbi的克隆。B:表達載體的生產(chǎn)。為制備用于連接的表達質粒pET24d或pQE-30，用合適的限制酶同樣消化完全。使用大約為所制備載體5倍摩爾過量的消化片段來進行連接反應。使用本領域公知的方法，用T4DNA連接酶(約2.0單位/反應，LifeTechnologies)進行標準的約20pl的連接反應(約16。C，約16小時)。根據(jù)本領域公知方法使用連接試樣(約5pi)轉化M15(pREP4)或BT21::DE3電感受態(tài)細胞。在約1.0ml的LB肉湯培養(yǎng)基中于371C經(jīng)約2-3小時生長期后，將轉化細胞置于含有氨千青霉素(100pg/ml)和/或卡那霉素U0pg/ml)的LB瓊脂平板上。在選擇中包括抗生素。將平板在371C下培養(yǎng)約16小時。用無菌牙簽挑取單獨的ApR/KanR克隆，用于"補充"接種新鮮的LBApR/KanR平板以及約1.0mlLBAp/Kan肉湯培養(yǎng)基。補充平板和肉湯培養(yǎng)基兩者都在標準培養(yǎng)器(平板)或振蕩水浴中于371C下培養(yǎng)過夜。采用基于全細胞的PCR分析來證明轉化體含有DNA插入片段。這里，將約1.0ml過夜LBAp/Kan肉湯培養(yǎng)基轉移到1.5ml聚丙烯管中，在Beckmann微型離心機(約3分鐘，室溫，約12,000Xg)中經(jīng)離心收集細胞。將細胞沉淀懸浮在約200jU無菌水中，使用約10pl試樣進行約50^1終體積的含有正向和反向擴增引物的PCR反應。將最初的951C變性步驟增加到3分鐘以確保細菌細胞的熱破壞和質粒DNA的釋放。使用ABIModel9700熱循環(huán)儀和32循環(huán)的三步熱擴增程序即95。C、45秒；55-58°C、45秒，72°C、1分鐘來從裂解的轉化體樣品中擴增BASB203片段。在熱擴增之后，通過凝膠電泳(Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液中的0.8%瓊脂糖)分析約反應試樣。在凝膠電泳和溴化乙啶染色之后通過UV照射觀察DNA片段。將DNA分子大小標準(1Kb梯度，LifeTechnologies)與測試樣品平4亍電泳，用于估計PCR產(chǎn)物的大小。將產(chǎn)生預期大小的PCR產(chǎn)物的轉化體確定為含有蛋白質表達構建體的菌林。然后對含有表達質粒的菌林進行重組蛋白質可誘導表達的分析。C:PCR陽性轉化體的表達分析。將過夜的種子培養(yǎng)物試樣(約1.0ml)接種到含有約25mlLBAp/Kan肉湯的125ml錐形瓶中，在37"C振蕩(約250rpm)培養(yǎng)直到培養(yǎng)物濁度達到約0.5的O.D.600,即對數(shù)中期(通常大約1.5-2.0小時)。這時，將大約一半培養(yǎng)物(約12.5ml)轉移到第二個125ml瓶中，通過加入IPTG(制備在無菌水中的l.OM原液，Sigma)到1.0mM的終濃度來誘導重組蛋白質的表達。IPTG誘導的和沒有誘導的培養(yǎng)物在37。C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)另外的約4小時。在誘導期之后移出誘導的和沒有誘導的培養(yǎng)物的樣品(約1.0ml)，在微型離心機中于室溫離心約3分鐘來收集細胞。將單獨的細胞沉淀懸浮在約50pl無菌水中，然后與等體積的含有2-巰基乙醇的2XLaemelliSDS-PAGE樣品緩沖液混合，置于沸水浴中約3分鐘變性蛋白質。將等體積(約15^1)的未加工的IPTG誘導和沒有誘導的細胞裂解物加樣到雙份12%Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的Mini膠，Novex)上。將誘導的和沒有誘導的裂解物樣品與預先染色過的分子量標志(SeeBlue，Novex)—起在常規(guī)條件下使用標準SDS/Tris/甘氨酸跑膠緩沖液(BioRad)進行電泳。電泳之后，將一份膠用考馬斯亮藍R250(BioRad)染色，然后脫色以觀察新的IPTG可誘導的蛋白質。使用BioRadMini-ProteanII印跡設備和Towbin氏甲醇(20%)轉移緩沖液將第二份膠在PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)上于4TC電印跡約2小時。根據(jù)本領域公知的方法封閉膜并進行抗體溫育。首選使用單克隆抗-RGS(His)3抗體，然后使用綴合到HRP(QiaGen)的兔抗小鼠第二抗體來確證重組蛋白質的表達和識別。使用ABT不溶性底物或者使用帶有AmershamECL化學發(fā)光系統(tǒng)的Hyperfilm來實現(xiàn)抗-His抗體反應模式的觀察。實施例2:重組蛋白質的生產(chǎn)使用含有質粒(pQE30)的大腸桿菌M15(pREP4)或者含有質粒pET24d的BL21::DE3的編碼葡萄球菌蛋白質的重組表達菌林來生產(chǎn)用于重組蛋白質純化的細胞團。培養(yǎng)基用于重組蛋白質生產(chǎn)的發(fā)酵培養(yǎng)基由含有100網(wǎng)/mlAp和/或30pg/mlKm的2XYT肉湯(Difco)組成。以0.25ml/L(消泡劑204，Sigma)加入消泡劑到發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中。為誘導重組蛋白質的表達，加入IPTG(異丙基P-D-硫代半乳糖苷)到發(fā)酵罐中(1mM終濃度)。重組蛋白質的生產(chǎn)在天然條件下以1mM的終濃度加入IPTG，將培養(yǎng)物生長另外的4小時。然后將培養(yǎng)物在6,000rpm離心10分鐘，將沉淀重懸浮在包括蛋白酶抑制劑混合物的磷酸鹽緩沖液(50mMK2HP04，KH2P04pH7)中。使用1500巴的壓力將該樣品進行French壓力裂解(2次)。在15,000rpm離心30分鐘后，保留上清液用于進一步純化，加入NaCl到0.5M。然后將樣品加樣到50mMK2HP04，KH2P04pH7環(huán)境的Ni-NTA樹脂(XK16柱Pharmacia,Ni國NTA樹月旨Qiagen)。加樣之后，用緩沖液A(0.2MNaH2P04pH7，0.3MNaCl,10%甘油)漂洗柱。為洗脫結合的蛋白質，使用分步梯度，其中在緩沖液A中加入了不同比例的緩沖液B(0.2MNaH2P04pH7，0.3MNaCl，10。/"甘油和200mM味唑)。緩沖液B的比例由10%逐漸增加到100%。純化后，匯集含有蛋白質的洗脫組分，濃縮，對0.002MKH2P04/K2HP04pH7，0.15MNaCl透析。寸吏用該方法純化ClfA、SdrG、IsdA、IsaB、HarA、Atl-葡糖胺和a毒素。在變性條件下以1mM的終濃度加入IPTG，將培養(yǎng)物生長另外的4小時。然后將培養(yǎng)物在6,000rpm離心10分鐘，將沉淀重懸浮在包括蛋白酶抑制劑混合物的磷酸鹽緩沖液(50mMK2HPO4，KH2P04pH7)中。使用1500巴的壓力將該樣品進行French壓力裂解(2次)。在15,000rpm離心樣品30分鐘后，用包括1M尿素的磷酸鹽緩沖液漂洗沉淀。在15,000rpm離心30分鐘后，在8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris-HClpH8中重懸浮沉淀，在室溫保持過夜。將樣品在15000rpm離心20分鐘，收集上清液用于進一步純化。然后將樣品加樣到8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris-HClpH8環(huán)境的Ni-NTA樹脂(XK16柱Pharmacia,Ni-NTA樹月旨Qiagen)。在流過通道后，用緩沖液A(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0,5MNaCl、O.OIMTris、pH8.0)、緩沖液C(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH6.3)、緩沖液D(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH5.9)和緩沖液E(8M尿素、O.IMNaH2P04、0.5MNaCl、O.OIMTris、pH4.5)連續(xù)漂洗柱。在漂洗期間用緩沖液D和E從柱上洗脫重組蛋白質。變性的重組蛋白質可被溶于缺少尿素的溶液中。為此目的，將8M尿素中所含有的變性蛋白質對4M尿素、0.1MNa2P04、O.OIMTris-HCl、pH7.1，2M尿素、0.1MNaH2P04、O.OIMTris國HCl、pH7.1，0.5M精氨酸和0.002MKH2P04/K2HP04pH7.1，0.15MNaCl，0.5M精氨酸連續(xù)透4斤。該方法用于純化Ebh(H2片段)、AaA、SdrC、FnbpA、Sbi、Atl-酰胺酶和IsaA。通過SDS-PAGE分析純化的蛋白質。在天然條件(a毒素)下純化的一種蛋白質和在變性條件(SdrC)下純化的一種蛋白質的結果示于圖3和4中。實施例3多糖的制備如Joyceetal2003，CarbohydrateResearch338;903-922中所描述的制備PIA(PNAG)。如InfectionandImmunity(1990)58(7);2367中所描述的從金黃色葡萄球菌提取5型和8型多糖?；罨团悸?lián)化學將天然多糖溶于NaC12M中或水中。估計所有血清型的最佳多糖濃度，在2mg/ml和5mg/ml之間。從存在于乙腈中的100mg/ml原液中，將CDAP(CDAP/PS比0.75mg/mgPS)加入到多糖溶液中。1.5分鐘后，加入0.2M三乙胺以獲得特定的活化pH(pH8.5-10.0)。在該pH下的2分鐘期間于25匸進行多糖活化。將載體蛋白質加入到活化的多糖中，其量足以產(chǎn)生1/l的摩爾比，在特定pH下進行偶聯(lián)反應1小時。然后，用甘氨酸在25"C淬滅反應30分鐘，在41C過夜。使用以0.2MNaCl平衡過的Sephacryl500HR凝膠過濾柱經(jīng)凝膠過濾純化綴合物。確定洗脫組分的糖和蛋白質含量。匯集綴合物，在0.22pm滅菌膜上無菌過濾。確定綴合物制劑中的PS/蛋白質比。表征表征每種綴合物的蛋白質和多糖含量。經(jīng)間苯二酚測試測定多糖含量，經(jīng)Lowry測試測定蛋白質含量。通過濃度比確定最終PS/PD比(w/w)。殘留的DNAP含量(ng/pgPS):用CDAP活化多糖就在多糖中引入了氰酸酯基團并釋放DMAP(4-二曱氨基-嘧啶)。通過在GSK發(fā)展和驗證的特定分析法確定殘留的DMAP含量。游離多糖含量(％):置于4TC下或儲存于371C7天的綴合物的游離多糖含量是根據(jù)上清液確定的，所述上清液是與a-載體抗體和飽和硫酸氨溫育之后接著離心而獲得的。使用a-PS/oc-PSELISA來定量上清液中的游離多糖。綴合物的缺少也可通過a-載體/a-PSELISA來控制。實施例4制劑佐劑組合物來自上面實施例的蛋白質可以與葡萄球菌多糖組合單獨或一起配制，作為佐劑，制劑可包含3-脫氧-?；?單磷酰基酯A(3D-MPL)和氫氧化鋁的混合物，或者3-脫氧-?；?單褲?；(3D-MPL)和磷酸鋁的混合物，或者3D-MPL和/或QS21的混合物，任選在油/水乳劑中，任選與膽固醇或鋁鹽單獨配制，優(yōu)選磷酸鋁。3D-MPL:是革蘭氏陰性菌明尼蘇達沙門氏菌的脂多糖(LPS)的化學脫毒形式。在GSKBiologicals進4亍的實驗已經(jīng)顯示3D-MPL與各種載體的組合有力地增強了體液型和TH1型細胞免疫。QS21:是純化自QuillajaSaponariaMolina樹的樹皮粗提取物的一種皂苷，它具有強的佐劑活性它活化抗原特異性的淋巴細胞增殖以及對幾種抗原的CTL。含有3D-MPL和明鞏的有本發(fā)明抗原的疫苗可按照WO93/19780或92/16231中所描述的類似方式制備。在GSKBiologicals進行的實驗已經(jīng)證明了3D-MPL和QS21的組合在誘導體液型和TH1型細胞免疫應答方面的明顯協(xié)同效應。含有這樣抗原的疫苗描述于US5750110中。油/水乳劑由2種油(生育酚和角篁烯)和含有吐溫80作為乳化劑的PBS所組成。乳劑包含5。/。角鯊烯、5%生育酚、0.4%吐溫80，具有180nm的平均粒徑，被稱為SB62(見WO95/17210)。在GSKBiologicals進4亍的實驗已經(jīng)證明了該O/W乳劑添加MPL/QS21就進一步增加了它們的免疫刺激性。乳劑SB62(2倍濃度)的制備將吐溫80溶于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中產(chǎn)生2。/。PBS溶液。為提供IOOml兩倍濃度乳劑，將5g的DLa生育酚和5ml的角鯊烯進行渦旋以徹底混合。加入90ml的PBS/吐溫溶液，徹底混合。然后將所得溶液通過注射器，最后通過使用微流控機微流化。所得油滴具有大約180nm的大小。實施例5動物實驗。8到10周齡的雌性CD國1小鼠由CharlesRiverLaboratories,Kingston,Mass獲得。對于致死率研究來i兌，用CSA平板上培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌的連續(xù)稀釋物腹膜內(nèi)(i.P.)攻擊五組9到11個CD-l小鼠。接種物數(shù)量在約101()到108CFU/小鼠的范圍。按天評估死亡率3天。通過使用劑量-應答關系的概率單位模型估計50%致死劑量(LD5Q)。通過似然比檢驗測試普通LDs。的虛假設。通過用約2x106CFU/小鼠經(jīng)靜脈(i.v.)途徑或者用約2x107CFU/小鼠經(jīng)i.p.途徑攻擊8到20個小鼠的組來引起亞致死的菌血癥。接種后，在特定時間從尾部將分開的動物組放血，通過在帶有5%綿羊血(BectonDickinsonMicrobiologySystems)的胰蛋白酶水解的大豆瓊脂平板上重復進行定量平板計數(shù)兩次來評估菌血癥水平。用不配對的Stutent氏,發(fā)驗的Welch4務正來確定統(tǒng)計顯著性。實施例6確定不同哺乳動物中的抗體應答的一般方法通過ELISA測試血清的針對葡萄球菌多糖的IgG抗體。簡要地說，將來自ATCC(Rockville，Md，20852)的純化莢膜多糖以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的25^g/ml濃度包被在高結合性的微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4"C過夜。用10%胎牛血清(FCS)于371C封閉平板1小時。用20pg/ml細胞壁多糖(StatensSerumInstitute,Copenhagen)和10%FCS在室溫預孵育血清樣品30分鐘以中和針對該抗原的抗體。然后將樣品在微量平板上稀釋兩倍于PBS中的10%FCS中，在室溫攪拌平衡1小時。漂洗之后，用1:4000稀釋于PBS中的10%FCS中的過氧化物酶標記的抗人IgGFc單克隆抗體(HP6043-HRP，StratechScientificLtd)在室溫攪拌平衡微量平板1小時。使用1:5000的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過氧化物酶-綴合的AffiniPure山羊抗-大鼠IgG(H+L)(代碼112-035-003)進行ELISA來測定大鼠IgG。使用SoftMaxPro的邏輯對數(shù)比較對每種血清型的標準血清進行滴定曲線鑒定。用于包被ELISA平板的多糖濃度是10-20fig/ml。在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中使用4mgOPD(Sigma)加上14fil11202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50piHC1終止反應，在490nm相對于650nm讀取光密度。使用由SoftMaxPro軟件計算的4-參數(shù)的邏輯對數(shù)方程通過參照校準曲線模型的滴定點來確定IgG濃度。測定針對葡萄球菌多糖的鼠和大鼠IgG的ELISA是類似的，除了下面的例外。采用JacksonImmunoLaboratoriesInc.過氧4匕物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)和AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H+L)來檢測結合的IgG。HP6043-HRP與人和恒河猴純化IgG同樣地反應，所以將該試劑用于恒河猴抗血清。蛋白質ELISA是類似于多糖ELISA進行的，有下面的修改。將蛋白質以2.0pg/ml在PBS中包被過夜。將血清樣品稀釋在含有10%胎牛血清和O.l%聚乙烯醇的PBS中。使用針對人IgGFc的Sigma過氧化物酶綴合的山羊親合純化抗體(索引A-2290)檢測結合的人抗體。實施例7調(diào)理吞噬作用分析。按照Xuetal1992Infect.Immun.60;1358所述進行人多形核白細胞(PMN)對金黃色葡萄球菌的體外調(diào)理吞噬作用殺死。人PMN是通過在3%葡聚糖T-250中沉淀而從肝素化血液制備的。調(diào)理素反應混合物(lml)含有存在于補充了10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中的約106PMN，約108CFU的金黃色葡萄球菌，以及O.lml的測試血清或IgG制劑。將超免疫的兔血清用作陽性對照，將O.lml的未免疫的兔血清用作IgG樣品的完全來源。將反應混合物在37匸溫育，將細菌樣品在0、60和120分鐘時轉移到水中，隨后稀釋，涂布在胰蛋白酶水解的大豆瓊脂平板上，在37"€溫育，過夜溫育后用于細菌計數(shù)。實施例8葡萄球菌蛋白質在小鼠和兔中的免疫原性用純化的葡萄球菌蛋白質免疫動物以便產(chǎn)生超免疫血清。用Specol為佐劑的每種蛋白質10pg免疫小鼠三次(第0、14和28天)。用Specol為佐劑的每種蛋白質20pg免疫兔三次(第0、21和42天)。收集免疫血清，在抗-蛋白質和抗-已殺死的完整細胞的ELISA中進行評估。戎-f將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的1pg/ml的純化蛋白質包被在高結合性微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4TC過夜。用PBS-BSA1%在室溫攪拌封閉平板30分鐘。然后將測試樣品1/1000稀釋，在室溫攪拌溫育1小時。漂洗之后，使用在PBS-吐溫0.05%中1:5000稀釋的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過氧化物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引11-035_003)檢測結合的鼠或兔抗體。將檢測抗體在室溫攪拌溫育30分鐘。使用在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中的4mgOPD(Sigma)+5pi11202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50piHC1終止反應，在4卯nm相對于650nm讀取光密度。將PostIII的1/1000稀釋液的O.D.與用預先免疫的血清所獲得的O.D.相比較。用小鼠和兔血清產(chǎn)生的結果在圖5A中。觀察到了針對每種抗原的良好血清轉化。直接針對SBI的血清的評估減少了，這是由于該蛋白質的Ig結合活性。戎-已殺/ZW^T整糴。腔#￡X/5L4:將磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的20pg/ml的來自金黃色葡萄球菌5型和8型或者表皮葡萄球菌菌林Hay的已殺死的完整細胞(熱滅活或甲醛滅活)包被在高結合性微量滴定板(NuncMaxisorp)上于4°C蒸發(fā)過夜。用PBS-BSA1%在室溫攪拌封閉平板30分鐘。通過加入在PBS-吐溫0.05%中稀釋的10|Lig/ml的親合純化雞抗-蛋白質A(ICL索引CPA-MA-2)接著在室溫溫育1小時而中和蛋白質A。然后將測試樣品在微量平板上由1/10的起始稀釋成為稀釋兩倍于PBS-0.05%中，在室溫攪拌溫育1小時。漂洗之后，使用在PBS-吐溫O力5%中1:5000稀釋的JacksonImmunoLaboratoriesInc.過氧化物酶綴合的affiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)(索引115-035-003)或AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)(索引11-035-003)檢測結合的鼠或兔抗體。將檢測抗體溫育30分鐘。使用在每10ml的pH4.5的0.1M檸檬酸鹽緩沖液中的4mgOPD(Sigma)+5piH202在室溫于暗處顯影顏色15分鐘。用50filHC1終止反應，在490nm相對于650nm讀取光密度。應當注意的是，蛋白質在葡萄球菌中的表達水平將根據(jù)培養(yǎng)條件而變化。因此陰性結果可能反映了不正確的培養(yǎng)條件選擇而不是缺少免疫原性。使用小鼠血清的結果示于表5中，一些圖示于圖6中。用針對SdrC、FnbpA、Ebh、Sbi和IsaA的血清觀察到了金黃色葡萄球菌菌林5的微弱識別。只有用針對Sbi的血清才觀察到金黃色葡萄球菌菌林8的識別。用針對Atl酰胺酶、MRP、IsdA、IsaA、Ebh、Aaa和Sbi的血清7見察到了表皮葡萄球菌Hay的孩i弱識別。使用兔血清產(chǎn)生的結果選擇性示于圖7中，并總結在表6中。用IsaA和IsdB觀察到了三種菌林的非常良好的識別。用HarA觀察到了三種菌林的微弱識別，即使動物只接受一次注射而不是用于其它蛋白質的三次注射。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>表6蛋白質名稱對SA5的反應對SA8的反應對SEHay的反應IsaA+++++++++ClfA+++++Atl酰胺酶-+++IsdB+++++++++SdrG+++葡糖酰胺酶一--HarA(1次注射)+++IsdA一一-oc毒素——+SrdC——-Ebh-+一AaA一-—MRP一-++Sbi一+++一FnbpA++++實施例8葡萄球菌蛋白組合在鼻菌落增殖模型中的功效。用八種葡萄球菌抗原的組合接種十五組的三只棉鼠，作為對照的五只棉鼠不用抗原處理。這十六組如下組l-Atl-葡糖胺、AAA、a毒素、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi組2-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、IsdA、IsdB、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA組3-Atl-葡糖胺、Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、MRP、IsdB、AAA、"毒素組4-Atl-葡糖胺、HarA、IsdA、AAA、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi組5-HarA、MRP、AAA、a毒素、ClfA、SdrC、Ebh、FnbpA組6-IsdA、IsdB、AAA、a毒素、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA組7-Atl畫酰胺酶、IsdA、MRP、AAA、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA組8-對照組9-Atl-葡糖胺、IsdA、MRP、a毒素、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA組10-Atl岡葡糖胺、MRP、IsdB、AAA、ClfA、IsaA、SdrC、SdrG組ll-Atl-酰胺酶、MRP、IsdB、a毒素、ClfA、IsaA、Ebh、Sbi組12國Atl-葡糖胺、HarA、IsdB、a毒素、IsaA、SdrG、Ebh、FnbpA組13-Atl國酰胺酶、HarA、IsdB、AAA、IsaA、SdrC、Sbi、FnbpA組14-Atl-葡糖胺、Atl-跣胺酶、HarA、MRP、ClfA、SdrG、Sbi、FnbpA組15誦Atl-酰胺酶、HarA、IsdA、a毒素、ClfA、IsaA、SdfC、SdrG組16—HarA、IsdA、MRP、IsdB、SdrC、SdrG、Ebh、Sbi每種抗原混合物含有與佐劑相混合的3pg的每種抗原，所述佐劑由含有MPL和QS21的脂質體所制備。在實驗的第1、14和28天接種棉鼠三次。接種后兩周，使用如Kokai-Kunetal(2003)Antimicrob.Agents.Chemother.47;1589-1597中所描述的鼻菌落增殖分析法評估免疫功效。使用"DesignExpert6"軟件對數(shù)據(jù)進行經(jīng)典的多重線性回歸分析。將抗原存在編碼為1,抗原不存在為-1。使用模型的公式，確定哪些抗原是產(chǎn)生每個鼻菌落數(shù)量大量減少的關鍵抗原是可能的。結果鼻菌落增殖分析的結果示于表7中。對照組具有3.51335的平均對數(shù)CFU/鼻，在用葡萄球菌蛋白接種的所有棉鼠組中都能看到鼻菌落增殖的減少。組4、9和13顯示出鼻菌落增殖的最大減少，有超過2個對數(shù)CFU/鼻的減少。組12和16也得到了良好結果，顯示出大約2個對數(shù)CFU/鼻的減少。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>使用鼻菌落增殖數(shù)據(jù)的多重線性回歸分析來計算抗原混合物中特定抗原的貢獻。最終的模型含有七種最好的抗原。這些抗原的結果示于表8中。在蛋白質混合物中，HarA的包含就產(chǎn)生了鼻菌落增殖的最大減少，接著是IsaA、Sbi、SdrC、自溶素-葡糖胺、MRP和Ebh。表8模型中七種最好抗原的對數(shù)CFU/鼻和CFU/鼻比值的差異的影響以及相應的p-值。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>權利要求1.包含至少兩種不同的蛋白或其免疫原性片段的免疫原性組合物，所述蛋白或其免疫原性片段選自以下至少兩組蛋白或免疫原性片段組a)至少一種葡萄球菌胞外成分結合蛋白或其免疫原性片段，其選自SdrG、層粘連蛋白受體、SitC/MntC/唾液結合蛋白、EbhA、EbhB、彈性蛋白結合蛋白(EbpS)、EFB(FIB)、SBI、自溶素、ClfA、SdrC、SdrH、酯酶GehD、SasA、FnbA、FnbB、Cna、ClfB、FbpA、Nbase、IsaA/PisA、SsaA、EPB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻連蛋白結合蛋白、纖維蛋白原結合蛋白、凝固酶、Fig和MAP；組b)至少一種葡萄球菌轉運蛋白或其免疫原性片段，其選自免疫優(yōu)勢的ABC轉運蛋白、IsdA、IsdB、Mg2+轉運蛋白、SitC和NiABC轉運蛋白；組c)至少一種葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑、毒素或其免疫原性片段，其選自α毒素(Hla)、α毒素H35R突變體、RNAIII活化蛋白(RAP)。2.權利要求1的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白或免疫原性片段選自組a)。3.權利要求1或2的免疫原性組合物，其中至少一種蛋n或免疫原性片段選自組b).4.權利要求1-3的免疫原性組合物，其中至少一種蛋白:、免疫原性片段選自組c)。5.權利要求1-4的免疫原性組合物，，其中至少一種蛋白.i免疫原性片段選自組a)、組b)和組c),6.權利要求1-5的免疫原性組合物，包含至少一種來自會黃色葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段.7.權利要求1-6的免疫原性組合物，包含至少一種來自l皮葡萄球菌的蛋白或免疫原性片段。8.權利要求1-"的免疫原性組合物，進一步包含P1A多糖或寡糖"9.權利要求1-8的免疫原性組合物，進一步包含來自金裔色葡萄球菌的V型和/或VHI型莢膜多糖或寡糖.10.權利要求1-9的免疫原性組合物，進一步包含來自表史葡萄球菌的l型和/或II型和Z或lll型笑腹多糖或寡糖，11.權利要求的免疫原姓組合物，進一步包含來自專蘭氏陽性菌的脂礴壁酸，12.權利要求11的免疫原性組合物，其中脂辯壁酸提取自著萄球菌。13.權利要求8-12的免疫原性組合物，其中葡萄球菌莢脬多糖綴合到蛋白質栽體上。14.權利要求11-13的免疫原性組合物，其中脂褲壁酸綴合到蛋白質栽體上15.權利要求13-14的免疫原性組合物，其中蛋白栽體選纟破傷風類毒素、白喉類毒素、CRM197、流感嗜血桿菌蛋白D、肺jf球菌溶血素和a類毒素。16.權利要求1-15的免疫原性組合物，，其中產(chǎn)生了針對企黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌兩者的有效免疫應答.17.包含權利要求1-16的免疫原性組合物和藥學可接受賊形劑的疫苗》18.制備疫苗的方法，包括混合抗原以制備權利要求1-16O免疫原性組合物的步驟以及加入藥學可接受賦形刑的步驟，19.預防或治療葡萄球菌感染的方法，包括給予有此需要的患者權利要求n的疫苗的步驟.20.權利要求1-16的免疫原性組合物在制備用于治療或預防葡萄球菌感染的疫苗中的用途.21.制備用于預防或治療葡萄球菌感染的免疫球蛋白的方法，包括用權利要求17的疫苗免疫受體，并且從受體分離免疫球蛋巧的步驟。22.由權利要求21的方法制備的免疫球蛋白.23.包含權利要求22的免疫球蛋白和藥學可接受賦形劑的藥物組合物，24.治療或預防葡萄球菌感染的方法，包括給予患者有效l:的權利要求23的藥物制劑的步驟，25.權利要求23的藥物制刑在制備用于治療或預防葡萄球菌感染的藥物中的用途.全文摘要本發(fā)明涉及包含葡萄球菌抗原的混合物的免疫原性組合物，該混合物組合了具有不同功能的抗原，例如，包括葡萄球菌胞外成分結合蛋白和葡萄球菌轉運蛋白或葡萄球菌胞外成分結合蛋白和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素或葡萄球菌轉運蛋白和葡萄球菌毒力調(diào)節(jié)劑或毒素的組合。也描述了疫苗、治療方法、用途和制備葡萄球菌疫苗的方法。文檔編號A61K39/116GK101128215SQ200580039690公開日2008年2月20日申請日期2005年9月20日優(yōu)先權日2004年9月22日發(fā)明者C·A·尼特,C·卡斯塔多,J·普爾曼,N·P·F·勒克雷尼耶申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司