專(zhuān)利名稱(chēng)：生物膜形成抑制劑和治療用器具的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物膜形成抑制劑和應(yīng)用該抑制劑的治療用器具。
背景技術(shù)：
已知進(jìn)行性胰腺癌·膽管癌是一種診斷和治療都非常困難的難治的癌癥。也就是說(shuō)，由于胰腺和膽管被包圍于胃·十二指腸·小腸·大腸·肝臟·膽囊·脾臟等其它臟器中，因此難以發(fā)現(xiàn)癌癥，而且，在早期階段并不出現(xiàn)癌癥的特征性癥狀。因此，是一種早期發(fā)現(xiàn)很難的癌癥，并且常常在被診斷時(shí)已經(jīng)太遲了。
另一方面，作為與這些癌癥比較相關(guān)的癥狀，有阻塞性黃疸(身體呈現(xiàn)黃色的癥狀)。這是由于，在從肝臟至十二指腸的胰腺頭部中的膽管(將由肝臟產(chǎn)生膽汁排出到消化管的管)由于癌癥而被阻塞，無(wú)法進(jìn)行膽汁的排泄而引起的。一般認(rèn)為，進(jìn)行性胰腺癌癥·膽管癌癥的治療的第一階段是改善這種阻塞性黃疸。
作為用于改善這種阻塞性黃疸的方法，可以使用膽管支架。這種膽管支架為筒狀的塑料或金屬(支架)，通過(guò)經(jīng)由十二指腸乳頭，利用內(nèi)視鏡將支架留置于膽管內(nèi)，可以擴(kuò)張膽管變細(xì)的部位使膽汁流過(guò)。
但是，由于該膽管支架的膽汁流出部露出在十二指腸內(nèi)，因此十二指腸液就會(huì)逆流到支架內(nèi)腔中。其結(jié)果是，包含于這十二指腸液中的各種腸內(nèi)細(xì)菌(大腸桿菌等)附著于支架內(nèi)腔的表面進(jìn)行增殖，通過(guò)一邊產(chǎn)活菌體外物質(zhì)(多糖)，一邊構(gòu)建復(fù)雜的立體結(jié)構(gòu)，形成所謂生物膜。一旦形成生物膜，其表面就會(huì)沉積膽結(jié)石(膽紅素鈣結(jié)石為主要成分，細(xì)菌產(chǎn)生的酶和伴隨炎癥的活性氧與其生成相關(guān))，導(dǎo)致內(nèi)腔的阻塞。
由于形成了這種生物膜，膽管支架內(nèi)腔在術(shù)后約3個(gè)月就阻塞了，就需要換新的膽管支架。但是，例如由于胰腺癌癥患者的平均預(yù)期壽命只有6個(gè)月左右，因此多次手術(shù)不僅使患者的QOL(Quallty of life)顯著降低，而且也增加了經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)。
而且，在生物體表面形成的生物膜存在引起慢性支氣管炎和慢性骨髓炎等感染癥的可能性。還有，一旦在人工基材表面、例如心臟的人工心瓣膜、人工關(guān)節(jié)、尿道導(dǎo)管等上形成生物膜，就會(huì)并發(fā)敗血癥，最壞的情況導(dǎo)致死亡。
現(xiàn)在，為了防止膽管支架內(nèi)形成生物膜，可以使用各種抗生素(局部給藥，血中給藥)(Is prophylactic ciprofloxacin effective indelaying biliary stent blockage？，Gastrointest Endosc 52175～182)。但是，由于長(zhǎng)期抗生素給藥，出現(xiàn)耐藥性菌的可能性高，給藥周期最長(zhǎng)為1周左右。由于一旦形成生物膜，對(duì)藥劑顯示出強(qiáng)耐藥性，因此目前沒(méi)有有效的藥劑。
而且，為了抑制細(xì)菌在支架表面上的附著，正在開(kāi)發(fā)以一般被認(rèn)為是動(dòng)物細(xì)胞的粘著少的高親水性表面的聚合物(商品名Hydromer)制成的涂布和以具有高疏水性表面的氟系聚合物(PFA；perfluoroalkoxy PTFE)制成的膽管支架。但是，這些材料無(wú)法抑制細(xì)菌的增殖。因此，如果附著了略微附著于表面的增殖能力高的細(xì)菌(大腸桿菌的加倍時(shí)間為30分鐘)，就無(wú)法預(yù)防其增殖，無(wú)法抑制生物膜的形成。
而且，為了抑制細(xì)菌的增殖，開(kāi)發(fā)了使用抗生素和銀離子的藥劑緩釋性聚合物，在實(shí)驗(yàn)水平上顯示出有效性。但是，對(duì)生物體的毒性和影響成為問(wèn)題，也就無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)人體的實(shí)用化。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題如上所述，以往，為了防止在膽管支架的內(nèi)面形成生物膜，施于抗生素以及進(jìn)行氟聚合物的涂布，但是無(wú)論是效果和安全方面方面都沒(méi)有實(shí)用性。
本發(fā)明是鑒于這種課題形成的，目的在于提供通過(guò)使包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌的死亡，抑制細(xì)菌的增殖可以有效且持久地抑制生物膜形成的膽管支架等治療用器具及適于在該治療用器具上形成涂布的支架形成抑制劑。
此外，本發(fā)明的其它目的在于提供對(duì)生物體既安全又有效的膽管支架等治療用器具及適于在該治療用器具上涂布的支架形成抑制劑。
用于解決課題的手段本發(fā)明是為了解決上述課題而形成的，如果根據(jù)這第1種觀點(diǎn)，可以提供一種生物膜形成抑制劑，其特征在于含有抑制生物膜形成有效量的兒茶素類(lèi)，和適于使前述兒茶素附著于留置在生物體內(nèi)的治療用器具的載體。
據(jù)報(bào)道兒茶素是綠茶味道(苦味)的主要成分“多酚”中的一種，具有抗菌作用(Yoda Y.et al.，J Infect Chemother.2004 10(1)55～58)，抗腫瘤作用(Tachibana H.et al.，A receptor for greentea polyphenol EGCG.Nat Struct Mol Biol.2004；11(4)380～381.Epub 2004)、活性氧消除作用·抗氧化作用(Kondo K.，et al.，Mechanistic studies of catechins as antioxidants againstradical oxidation.Arch Biochem Biophys 199936279～86)、抗う觸作用、除臭作用、膽固醇上升抑制作用、血糖值上升抑制作用、血壓上升抑制作用、抗過(guò)敏作用、血小板凝集抑制作用等。但是，在本發(fā)明以前對(duì)兒茶素類(lèi)對(duì)生物膜形成的效果并不了解。
本發(fā)明人，著眼于兒茶素類(lèi)具有由于損傷包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌的細(xì)胞膜而產(chǎn)生的殺菌作用，得到了兒茶素類(lèi)對(duì)生物膜形成抑制具有效果這樣的全新的見(jiàn)解，并基于這一點(diǎn)進(jìn)行了積極的研究，進(jìn)行了反復(fù)的實(shí)驗(yàn)，最終完成了本發(fā)明。也就是說(shuō)，如果使用本發(fā)明的生物膜形成抑制劑，可以使包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌死亡、抑制細(xì)菌的增殖，從而可以有效抑制在對(duì)象治療用器具上形成生物膜。
此外，由于可以在本發(fā)明的生物膜形成抑制劑中使用的兒茶素類(lèi)從十二指腸經(jīng)由小腸、大腸排泄到體外，因此我們認(rèn)為與在現(xiàn)有技術(shù)中使用的上述藥劑等相比，其通過(guò)長(zhǎng)期給藥對(duì)生物體產(chǎn)生的危險(xiǎn)性少。尤其是，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，與效果已經(jīng)被驗(yàn)證的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯相關(guān)的副作用還未有報(bào)道，在最近的研究中證明了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的高濃度長(zhǎng)期口服給藥對(duì)人體的安全性。因此，如果根據(jù)這種結(jié)構(gòu)，通過(guò)使附著于膽管支架等各種醫(yī)療制品等表面的細(xì)菌死亡，或抑制增殖完全抑制生物膜形成，可以獲得對(duì)生物體既安全又有效的治療用材料。
此外，如果根據(jù)本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施方式，為了有效抑制上述生物膜的形成，前述兒茶素類(lèi)，優(yōu)選在前述載體中含有每天0.22mg/cm2或其以上的量的兒茶素除法量。并且，通過(guò)改變載體中的兒茶素類(lèi)的含量，可以控制兒茶素類(lèi)的緩釋量，可以根據(jù)使用前述治療用材料的形態(tài)、應(yīng)用對(duì)象等各種因素，適當(dāng)選擇該除法量。
而且，如果根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，前述載體是親水性生物降解性聚合物。由于前述親水性生物降解性聚合物含水率高，加水迅速被分解，容易緩釋所含有的兒茶素類(lèi)。而且，由于前述親水性生物降解性聚合物為液狀，在紫外線照射下迅速固化，因此可以容易地在治療用基材表面上形成涂布。
此外，如果根據(jù)本發(fā)明的第2個(gè)主要觀點(diǎn)，提供一種治療用器具，其特征在于其為留置于生物體內(nèi)的治療用器具，在其表面涂布有抑制生物膜形成有效量的兒茶素類(lèi)。如果根據(jù)這種結(jié)構(gòu)，可以制造能夠通過(guò)使包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌的死亡、抑制細(xì)菌的增殖來(lái)有效抑制生物膜形成的治療用器具。
如果根據(jù)本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施方式，這樣獲得的前述治療用器具盡管不限于此，但如果為膽管支架，通過(guò)該支架可以改善和治療伴隨進(jìn)行性胰腺癌癥·膽管癌癥的阻塞性黃疸。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從下面記載的發(fā)明的實(shí)施方式中了解本發(fā)明的進(jìn)一步的特征及顯著的效果。


圖1表示兒茶素類(lèi)的結(jié)構(gòu)式的圖。
圖2表示表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)的結(jié)構(gòu)式的圖。
圖3表示EGCG的生物膜形成中抑制效果的圖。
圖4表示EGCG的生物膜形成中抑制效果的圖。
圖5本發(fā)明中使用的液狀生物降解性聚合物(TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP)的結(jié)構(gòu)式。
圖6表示本發(fā)明中使用的兒茶素緩釋性聚合物的兒茶素緩釋量(聚合物種類(lèi)圖6(a)、EGCG含有濃度圖6(b))的圖。
圖7表示靜態(tài)條件中EGCG非含有聚合物(TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP)對(duì)大腸桿菌附著的影響的圖。
圖8靜態(tài)條件中含有EGCG(0、5、10、20wt％(wt％重量濃度))液狀生物降解性聚合物(TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP)對(duì)大腸桿菌附著的影響的圖。
圖9表示顯示含有兒茶素的聚合物EGCG/(TMC/LL/PEG1k)表面上生物膜形成的樣子的共聚焦激光顯微鏡照片的圖。
圖10表示Modified Robbins device和實(shí)驗(yàn)步驟的圖。
圖11表示動(dòng)態(tài)條件中含有兒茶素的聚合物EGCG/(TMC/LL/PEG1k)對(duì)大腸桿菌附著的影響的圖。
圖12表示生物膜形成后，EGCG對(duì)生物膜內(nèi)的活菌的影響的圖。
圖13表示大腸桿菌對(duì)EGCG的(藥物)感受性的研究的圖。
具體實(shí)施例方式
如上所述，如果根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠通過(guò)使包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌的死亡、抑制細(xì)菌的增殖來(lái)有效抑制對(duì)象治療用器具中生物膜形成的生物膜形成抑制劑和應(yīng)用該抑制劑的治療用器具。
本發(fā)明的兒茶素類(lèi)雖不限于此，但包括圖1的結(jié)構(gòu)式(a)～(h)所示的例如兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯等，其中特別優(yōu)選抗菌作用最強(qiáng)，也就是說(shuō)對(duì)大腸桿菌的最小發(fā)育抑制濃度最低的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)。
使前述兒茶素類(lèi)存在于適合涂布于對(duì)象治療用器具的載體中。作為這種載體，可以用溶劑涂布，通過(guò)蒸發(fā)形成被膜，如果是在生物體內(nèi)不顯示毒性的生物降解性材料及非生物降解性材料，沒(méi)有特別的限定，但是優(yōu)選例如聚乳酸、形成親水性凝膠的聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸甲酯)和聚乙二醇共聚物、作為疏水性的聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚酰胺、醋酸纖維素等。這其中，由于親水性分解性聚合物含水率高，加水立即被分解，容易緩釋所含有的兒茶素類(lèi)，因此最為優(yōu)選。此外，前述親水性聚合物為液體，由于在紫外線照射下迅速固化，因此可以容易地在本發(fā)明中治療用基材的表面上形成涂布。
本發(fā)明的生物膜形成抑制劑的制造方法沒(méi)有特別的限定，可以是通過(guò)公知技術(shù)進(jìn)行獲得的方法。例如，如果按照本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施例，可以通過(guò)混合溶解于丙酮的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和液狀生物降解性聚合物來(lái)制備。
本發(fā)明的生物膜形成抑制劑的應(yīng)用方法如果是通過(guò)兒茶素類(lèi)應(yīng)用于生物膜形成抑制的用途，就沒(méi)有特別的限定。如果按照本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施例，可以將其應(yīng)用于用于改善伴隨進(jìn)行胰腺癌癥·膽管癌癥的阻塞性黃疸的膽管支架。也就是說(shuō)，在使用經(jīng)前述治療用材料中的1種的兒茶素緩釋性聚合物涂布的膽管支架時(shí)，由于使附著于膽管支架表面的細(xì)菌死亡，因此可以完全抑制生物膜形成，可以開(kāi)發(fā)出可長(zhǎng)期留置于生物體內(nèi)的膽管支架。然而，其應(yīng)用對(duì)象并不僅限于膽管支架，還可以在其它的各種治療用器具，例如尿道導(dǎo)管、外科手術(shù)用引流管、中心靜脈導(dǎo)管、疝手術(shù)用網(wǎng)等中使用。
而且，已知可以在本發(fā)明中使用的兒茶素類(lèi)中具有上述抗菌作用以外的各種作用。因此，前述治療用材料除了以生物膜的形成抑制的目的使用之外，還可以以例如接觸膽管支架外面的惡性腫瘤(胰腺癌癥、膽管癌癥等)的增殖抑制(通過(guò)兒茶素類(lèi)產(chǎn)生的抗腫瘤效果)、或膽管支架內(nèi)腔中的膽結(jié)石形成的抑制(兒茶素類(lèi)的活性氧消去作用)等目的來(lái)使用。
而且，本發(fā)明的治療用器具可以通過(guò)在上述對(duì)象器具上涂布本發(fā)明的生物膜形成抑制劑來(lái)獲得。這種治療用器具的制造方法沒(méi)有特定的限定，可以使用公知技術(shù)來(lái)制造。例如，在前述治療用器具為膽管支架時(shí)，將支架的基材-桶狀的塑料物質(zhì)(聚氨酯等)浸漬于液狀的含兒茶素類(lèi)的聚合物中，對(duì)表面涂布后，通過(guò)照射紫外線使之固化。然后，固化中(約5分鐘)，通過(guò)使基材以支架內(nèi)腔的軸為中心旋轉(zhuǎn)以使涂布的厚度不產(chǎn)生偏差，可以獲得在前述內(nèi)部涂布前述生物膜抑制劑的膽管支架。
并且，作為支架基材，除了上述的塑料制基材外，還有金屬制基材，該金屬制的支架基材中當(dāng)然優(yōu)選適用上述生物膜抑制劑的基材。但是，金屬支架是網(wǎng)狀的自我擴(kuò)張型支架，主要由于腫瘤的關(guān)系而導(dǎo)致阻塞，而不是主要由于生物膜而造成阻塞。因此，認(rèn)為本發(fā)明中這種含有兒茶素的聚合物作為主要內(nèi)腔的狹窄的塑料支架的涂布劑是有效的。
并且，根據(jù)以下說(shuō)明的實(shí)施例，清楚了在顯著抑制生物膜形成的聚合物中，兒茶素緩釋量最少的是生物降解性聚合物(TMC·PEG200)中含有20wt％表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)的聚合物。然后，根據(jù)該聚合物的初期24小時(shí)的兒茶素緩釋量為0.22mg/cm2，前述兒茶素類(lèi)，優(yōu)選在載體中含有每天0.22mg/cm2或其以上的量的兒茶素除法量。并且，如以下實(shí)施例說(shuō)明，通過(guò)改變載體及載體中的兒茶素類(lèi)的含量，可以控制兒茶素類(lèi)的緩釋量，可以根據(jù)使用前述治療用材料的形態(tài)、適用對(duì)象等各種因素，適當(dāng)選擇該除法量。
下面，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的效果進(jìn)行說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不限定于以下記載的實(shí)施例。
實(shí)施例1(實(shí)施例1)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在生物膜形成中抑制效果將直徑為8mm的圓盤(pán)狀的聚氨酯與混入了各種濃度(0-0.2mM)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)的大腸桿菌懸浮液(2×103CFU/ml)一起在培養(yǎng)皿中于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，取出聚氨酯，平穩(wěn)地用磷酸緩沖液清洗后，轉(zhuǎn)移到2ml磷酸緩沖液中，進(jìn)行超音波清洗，剝離附著的大腸桿菌。用平板計(jì)數(shù)法求出該液中的大腸桿菌活菌數(shù)。
如圖3、圖4所示，證明了表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在0.12mM(0.055mg/ml)以上的濃度顯著地抑制生物膜形成，并且在0.15mM(0.069mg/ml)以上的濃度完全地抑制生物膜形成。
(實(shí)施例2)兒茶素緩釋性聚合物的兒茶素緩釋量的測(cè)定混合3種液狀生物降解性聚合物(TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP示于圖5(a)～(c))和溶解于丙酮(Sigma-Aldrich)的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG、Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis，MO示于圖2)，使聚合物終濃度為20wt％(wt％重量濃度)。低壓槽中，使丙酮花費(fèi)24小時(shí)揮發(fā)后，將250mg聚合物涂布于玻璃瓶的底部(表面積1.1cm2)，用UV照射(SP-V，Ushio，Inc.，Yokohama，Japan)5分鐘使之固化。將1ml磷酸緩沖液(Nissui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)裝入玻璃瓶中密封，于37℃靜置，使EGCG緩釋。1、2、4天后取玻璃瓶中的溶液100μl，用Folin Ciocalteu法計(jì)算EGCG濃度。此外，對(duì)于TMC/LL/PEG1k，就EGCG濃度5、10wt％進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。
其結(jié)果以每聚合物表面積的EGCG緩釋重量(mg/cm2)示于圖6(a)、(b)中。根據(jù)圖6(a)，清楚了任意一種聚合物中EGCG的重量隨時(shí)間一起增加，EGCG在4天間緩釋。如果在聚合物間進(jìn)行比較，親水性(含水性)和生物降解性最高的LL/TMC/PEG1k的緩釋量最多、其次順序是TMC/PEG200、TMC/TMP。而且，如圖6(b)所示，對(duì)于改變了EGCG含量的TMC/LL/PEG1k，也確認(rèn)了EGCG含量越高，緩釋量越多。
(實(shí)施例3)由兒茶素緩釋性聚合物產(chǎn)生的對(duì)大腸桿菌生物膜的形成的抑制(靜態(tài)條件)
混合3種液狀生物降解性聚合物(TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP示于圖5(a)～(c))和溶解于丙酮的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)，使聚合物終濃度為0、5、10、20wt％(wt％重量濃度)。將該聚合物在聚氨酯表面上旋轉(zhuǎn)涂布，用UV照射5分鐘使之固化后，用帶式穿孔器穿孔，制成直徑8mm的圓盤(pán)狀的試樣。將大腸桿菌懸浮液(2×103CFU/ml)與該試樣一起于37℃在培養(yǎng)皿中靜置培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后，取出試樣，平穩(wěn)地用磷酸緩沖液清洗后，轉(zhuǎn)移到2ml磷酸緩沖液中，進(jìn)行超音波清洗，剝離附著的大腸桿菌。用平板計(jì)數(shù)法求出該液中的大腸桿菌活菌數(shù)。
其結(jié)果示于圖7及圖8。根據(jù)圖7，以單獨(dú)使用不含EGCG的聚合物，在TMC/LL/PEG1k、TMC/PEG200、TMC/TMP之間，對(duì)于大腸桿菌附著沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的差異。根據(jù)圖8，在含有10和20wt％的EGCG的TMC/LL/PEG1k和含有20wt％的EGCG的TMC/PEG200中，與不含EGCG的聚合物(0wt％)相比，顯著地抑制大腸桿菌附著。尤其是，含有20wt％EGCG的TMC/LL/PEG1k完全抑制了大腸桿菌附著。其與實(shí)施例2的兒茶素緩釋量成比例，這提示大腸桿菌的附著依賴(lài)于緩釋的兒茶素量被抑制。并且，大腸桿菌附著(％)按各個(gè)聚合物的EGCG含有濃度的0wt％的值作為100％進(jìn)行換算。
進(jìn)而，用共聚焦激光顯微鏡觀察兒茶素緩釋性聚合物EGCG/(TMC/LL/PEG1k)表面上生物膜形成。與上述相同，將經(jīng)含有0和20wt％的EGCG的TMC/LL/PEG1k涂布的圓盤(pán)狀的聚氨酯(直徑8mm)與要表達(dá)綠色螢光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的懸浮液(2×103CFU/ml)一起于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)。用磷酸緩沖液平穩(wěn)地清洗形成生物膜的聚合物表面后，用共聚焦激光顯微鏡(Radiance 2000；BioRed、Hercules，CA)觀察。如圖9所示，不含EGCG的(0wt％)TMC/LL/PEG1k中呈現(xiàn)綠色，大腸桿菌增殖，在聚合物表面上形成生物膜，與之相對(duì)，含20wt％EGCG的TMC/LL/PEG1k中完全沒(méi)有發(fā)現(xiàn)生物膜形成。根據(jù)圖像所見(jiàn)也證明了由兒茶素緩釋性聚合物產(chǎn)生的生物膜抑制效果。
(實(shí)施例4)由兒茶素緩釋性聚合物產(chǎn)生的對(duì)大腸桿菌生物膜形成的抑制(動(dòng)態(tài)條件)本實(shí)驗(yàn)示于圖10，使用Modified Robbins device(Tyler Co.，Edmonton，Canada)進(jìn)行。用硅類(lèi)的粘合劑將按與實(shí)施例3相同方式制成的直徑為8mm的試樣粘合到sample pot中。按1ml/min的速度，最初將大腸桿菌液(2×105CFU/ml)流入流路1小時(shí)，然后將經(jīng)滅菌的LB培養(yǎng)基流入流路23小時(shí)，按與實(shí)施例2同樣的方法定量附著的大腸桿菌。
其結(jié)果是，含有5和20wt.％的EGCG的TMC/LL/PEG1k中，與不含EGCG的聚合物(0wt.％)相比，顯著地抑制了大腸桿菌附著(圖11)。根據(jù)實(shí)施例2的靜態(tài)條件下，含有5wt.％EGCG的TMC/LL/PEG1k中沒(méi)有抑制附著，提示在動(dòng)態(tài)條件下，含有濃度更低的EGCG聚合物可以抑制生物膜形成。
(實(shí)施例5)生物膜形成后的EGCG對(duì)生物膜內(nèi)的活菌的影響將直徑為8mm的圓盤(pán)狀的聚氨酯與大腸桿菌懸浮液(2×103CFU/ml)一起放入培養(yǎng)皿中，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)，使在聚氨酯表面形成生物膜。在這種形成的生物膜表面上添加各種濃度(0-50mM)的表沒(méi)食子茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)溶液，再暴露24小時(shí)。取出聚氨酯，平穩(wěn)地用磷酸緩沖液清洗后，轉(zhuǎn)移到2ml磷酸緩沖液中，進(jìn)行超音波清洗，剝離附著的大腸桿菌。用平板計(jì)數(shù)法求出該液中的大腸桿菌活菌數(shù)。如圖12所示，證明表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在8mM(3.7mg/ml)以上的濃度，活菌數(shù)顯著減少，在50mM(23mg/ml)，生物膜內(nèi)大腸桿菌完全死亡。清楚了該濃度，與自培養(yǎng)初期起加入兒茶素的實(shí)施例1相比大大提高，曾一度形成的生物膜中的大腸桿菌對(duì)于兒茶素顯示出耐藥性。
(實(shí)施例6)大腸桿菌對(duì)EGCG的感受性的研究通過(guò)一般的感受性試驗(yàn)法(稀釋法)研究大腸桿菌對(duì)EGCG的感受性。將混合了經(jīng)階段稀釋的(0.16，0.31，0.63，1.25，2.5，5.0mM)表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)溶液的大腸桿菌懸浮液(1×107CFU/ml)裝入培養(yǎng)皿中，于37℃靜置培養(yǎng)24小時(shí)。取用肉眼沒(méi)有確認(rèn)菌的發(fā)育的最小的EGCG濃度作為最小發(fā)育抑制濃度(MIC)。如圖13所示，最小發(fā)育抑制濃度(MIC)為0.63mM(287μg/ml)。
并且，根據(jù)圖7及圖8的結(jié)果表明，在顯著地抑制生物膜形成的聚合物中，兒茶素緩釋量最少的是含有20wt％EGCG的TMC·PEG200。然后，根據(jù)該聚合物的初期24小時(shí)的兒茶素緩釋量為0.22mg/cm2，表明前述兒茶素類(lèi)優(yōu)選在載體中含有每天0.22mg/cm2或其以上的量的兒茶素除法量。
權(quán)利要求
1.生物膜形成抑制劑，其特征在于具有抑制生物膜形成有效量的兒茶素類(lèi)和適于使前述兒茶素附著在留置于生物體內(nèi)的治療用器具的載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1記載的生物膜形成抑制劑，其特征在于前述兒茶素類(lèi)為表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯。
3.根據(jù)權(quán)利要求1記載的生物膜形成抑制劑，其特征在于前述載體為親水性生物降解性聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1記載的生物膜形成抑制劑，其特征在于前述兒茶素類(lèi)在前述載體中含有每天0.22mg/cm2或其以上的量的兒茶素除法量。
5.治療用器具，其特征在于其為留置于生物體內(nèi)的治療用器具，在其表面涂布有抑制生物膜形成有效量的兒茶素類(lèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5記載的治療用器具，其特征在于該治療用器具為內(nèi)面涂布有兒茶素類(lèi)的膽管支架。
7.根據(jù)權(quán)利要求6記載的治療用器具，其特征在于前述治療用器具為非自我擴(kuò)張型的塑料支架。
8.根據(jù)權(quán)利要求5記載的治療用器具，其特征在于前述兒茶素類(lèi)是以在載體中含有每天0.22mg/cm2或其以上的量的兒茶素除法量的狀態(tài)被涂布的。
全文摘要
(課題)提供通過(guò)包括大腸桿菌在內(nèi)的所有細(xì)菌的死亡，抑制細(xì)菌的增殖可以有效且持久地抑制生物膜形成的膽管支架等治療用器具及適于在該治療用器具上形成涂布的支架形成抑制劑。(解決方法)提供一種生物膜形成抑制劑，其特征在于具有對(duì)生物膜形成抑制有效量的兒茶素類(lèi)和適于使前述兒茶素附著在留置于生物體內(nèi)的治療用器具的載體。
文檔編號(hào)A61L31/00GK101060867SQ20058003968
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月22日
發(fā)明者松田武久, 前山良 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人九州大學(xué)