專利名稱：作為疫苗的重組分枝桿菌和生物活性劑的組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包括至少兩種成分的組合，這樣的組合作為藥物組合物的應(yīng)用，其用于制備藥物的應(yīng)用，使用這樣的組合治療患者的方法以及制備這樣的組合的方法。
現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)強(qiáng)烈地集中在免疫原性化合物或調(diào)節(jié)患者免疫系統(tǒng)的化合物用于治療這樣的患者的應(yīng)用。其中，代表性的疾病為腫瘤和傳染病。
在兩種情形中，將抗原性化合物，即將適于激發(fā)免疫應(yīng)答或加強(qiáng)免疫應(yīng)答的化合物施用到患者機(jī)體中。然而，在許多情形中，各自的化合物的應(yīng)用是有限的，其需要免疫系統(tǒng)的增強(qiáng)，以便達(dá)到臨床上相應(yīng)水平的效率和功效。這樣的增強(qiáng)可以通過(guò)重復(fù)施用單獨(dú)的藥劑或者通過(guò)使用佐劑而進(jìn)行。
現(xiàn)有技術(shù)提供了一些佐劑，諸如礦物油、滅活的分枝桿菌(mycobacteria)、鋁化合物等。
然而，本領(lǐng)域已知的佐劑并沒(méi)有總是以足以滿足醫(yī)學(xué)需要的方式表現(xiàn)，特別是與新的治療方案聯(lián)系時(shí)，諸如應(yīng)用如在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US94/01631中描述的細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞。
因此，本發(fā)明潛在的問(wèn)題是提供組合物，更具體地是藥物組合物，其包括至少第一成分和第二成分，其中第一成分是佐劑，以及第二成分是生物活性劑。
在第一方面，這一問(wèn)題通過(guò)包括第一成分和第二成分的組合而得以解決，其中所述第一成分是細(xì)菌細(xì)胞，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽(phagolysosomal escape peptide)或多肽的重組核酸分子；其中所述第二成分是生物活性劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是脲酶缺陷型的。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是分枝桿菌(Mycobacterium)細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)菌細(xì)胞的至少一種細(xì)胞脲酶亞基編碼核酸被滅活。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少細(xì)菌脲酶C亞基-編碼序列被滅活。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是利斯特氏菌(Listeria)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域由選自包括下列各項(xiàng)的組的核酸分子編碼a)包括SEQ.ID.NO.1中所示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列；b)編碼同來(lái)自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和c)在嚴(yán)緊條件下與a)或b)的序列雜交的核苷酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞包括至少一種編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的肽或多肽的重組核酸分子。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述肽或多肽選自自身抗原、腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲(chóng)抗原、細(xì)菌抗原以及其免疫原性片段。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述肽或多肽是融合多肽片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合多肽包括a)來(lái)自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫反應(yīng)，和b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多肽是權(quán)利要求9定義的多肽或其片段。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所定義的吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是真核細(xì)胞，并且更優(yōu)選地是表達(dá)細(xì)胞因子的遺傳操作的真核細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞因子選自包括白介素-2、白介素-4、白介素-12以及干擾素-γ的組。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種或多種細(xì)胞因子。
在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IL-2和干擾素-γ。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞相對(duì)于施用或者要施用所述細(xì)胞和/或組合物的受試者是自體同源的。
在一個(gè)優(yōu)選的備選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞相對(duì)于施用或者要施用所述細(xì)胞和/或組合物的受試者是同種異基因性的。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞選自包括非專職抗原呈遞細(xì)胞、專職抗原呈遞細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的組。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述腫瘤細(xì)胞是免疫原性腫瘤的細(xì)胞，并且其中所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選地選自包括黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、乳腺瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞、前列腺腫瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、頭頸鱗狀腫瘤(head and neck squamous tumor)的組。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是同種異基因型細(xì)胞，并且是與I類HLA匹配的。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表達(dá)另一種免疫分子，所述免疫分子選自包括細(xì)胞因子、黏著分子、共刺激性因子、腫瘤相關(guān)的抗原、腫瘤特異性抗原和寄生蟲(chóng)抗原的組。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述寄生蟲(chóng)抗原是瘧原蟲(chóng)(Plasmodium)優(yōu)選地是惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)的gp190/MSP1蛋白，或者是其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是瘧原蟲(chóng)，優(yōu)選地是惡性瘧原蟲(chóng)的gp190/MSP1蛋白，或者是其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是人巨細(xì)胞病毒。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是病毒顆?；蚱淙后w(multitude)，其優(yōu)選地在人巨細(xì)胞病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后釋放，其中所述顆粒(a)被脂膜包圍，病毒糖蛋白內(nèi)含在脂膜中，和(b)不含有病毒DNA，也不含殼體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒包含一種融合蛋白，所述融合蛋白包括T細(xì)胞抗原pp65(UL83)的一個(gè)或多個(gè)片段以及一種或多種非pp65蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原pp65融合到人巨細(xì)胞病毒糖蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段上，因而所述糖蛋白選自包括HCMV糖蛋白gH、HCMV蛋白IE1(ppUL123)和HCMV糖蛋白gB的組。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞抗原融合到蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段上，所述蛋白為除了HCMV以外的人病原體片段。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述病原體選自包括HIV-1、HBV、HCV和流感的組。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒包含至少兩種糖蛋白的片段，所述糖蛋白是來(lái)自不同HCMV毒株的特別的糖蛋白的變體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩種特別的HCMV糖蛋白變體中的一種是HCMV Towne毒株的變體，另一種是HCMV Ad169毒株的變體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，優(yōu)選地是包皮成纖維細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒是密體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是密體，優(yōu)選地是HCMV的密體，或者本文所定義的密體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是分枝桿菌(Mycobacterium)的抗原，優(yōu)選的是分枝桿菌亞種(Mycobacterium ssp.)的抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分枝桿菌選自包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、M.canettii、非洲分枝桿菌(M.africanum)和副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)的組。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原是抗原85。
在第二方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)包括按照本發(fā)明第一方面的組合和任選的藥用載體的組合物，優(yōu)選地藥物組合物而得以解決。
在第三方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)使用按照本發(fā)明第一方面的組合、或按照本發(fā)明第二方面的組合、或者這樣的組合的每種成分用來(lái)制備藥物的應(yīng)用而得以解決。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物用于預(yù)防和/或治療選自包括癌癥和傳染病的組的疾病。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解，單獨(dú)的或者組合的本發(fā)明的組合物及其成分還可以優(yōu)選地用于預(yù)防疾病。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這是基于這樣的事實(shí)，即，按照本發(fā)明的組合的第一成分適于引發(fā)免疫應(yīng)答，并且更具體地是特異性免疫應(yīng)答，在疾病表現(xiàn)之前，并且更具體地在疾病的臨床或醫(yī)學(xué)相關(guān)表現(xiàn)之前，其允許使單獨(dú)的人或動(dòng)物機(jī)體與所述疾病抗?fàn)帯?br> 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是免疫原性腫瘤，并且其中所述腫瘤優(yōu)選地選自包括前列腺癌、黑素瘤、腎癌、乳腺癌、腦癌、非小肺癌(non-small lung cancer)、結(jié)腸癌和頭頸鱗狀腫瘤的組。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，所述傳染病是瘧疾。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是瘧原蟲(chóng)gp190/MSP1蛋白或其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，所述傳染病是HCMV感染，優(yōu)選地是人HCMV感染。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是本文公開(kāi)的密體。
在一個(gè)備選實(shí)施方案中，所述傳染病是結(jié)核病。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是分枝桿菌抗原，優(yōu)選地是分枝桿菌亞種的抗原。更優(yōu)選地，所述分枝桿菌選自包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、M.canettii、非洲分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的組。甚至更優(yōu)選地，所述抗原是抗原85。
在第四方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)應(yīng)用按照本發(fā)明第一方面的組合或者這樣的組合的每一成分用來(lái)制備疫苗的應(yīng)用而得以解決。
在第五方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)用于治療患有疾病或者需要這樣的治療的患者的方法而得以解決，所述方法包括施用按照本發(fā)明第一方面的組合、或者按照本發(fā)明第二方面的藥物組合。
在第六方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)用于制備藥物組合優(yōu)選地是按照本發(fā)明第二方面的藥物組合物的方法而得以解決，所述方法包括步驟-提供細(xì)菌細(xì)胞作為第一成分，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；
-提供生物活性劑作為第二成分；和-將所述第一成分和第二成分配制成藥物組合物。
在第七方面，本發(fā)明潛在的問(wèn)題通過(guò)用于制備藥物組合優(yōu)選地是按照本發(fā)明第二方面的藥物組合物的方法而得以解決，所述方法包括步驟-提供細(xì)菌細(xì)胞作為第一成分，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；-提供生物活性劑作為第二成分；和-獨(dú)立地配制第一成分和第二成分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將配制的第一成分和配制的第二成分包裝在一個(gè)包裝中。
備選地，配制的第一成分和配制的第二成分包裝在獨(dú)立的包裝中。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述包裝是單一劑型或者包括多種單一劑型。
本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以是革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性的表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的細(xì)菌細(xì)胞是一種特別有用的佐劑，其可以與生物活性劑組合應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明人已經(jīng)意識(shí)到，當(dāng)使用生物活性劑，以及更具體地使用其它免疫引發(fā)性生物活性劑時(shí)，牛分枝桿菌，優(yōu)選地是牛分枝桿菌卡介苗(BCG)，并且更優(yōu)選地是諸如編碼BCG或表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的的分枝桿菌，是引發(fā)免疫應(yīng)答或者加強(qiáng)具體調(diào)控的免疫應(yīng)答的適宜方式。一種引發(fā)特別優(yōu)選類型的免疫應(yīng)答的生物活性劑是表達(dá)至少一種細(xì)胞因子或寄生蟲(chóng)抗原、或者腫瘤或寄生蟲(chóng)抗原或病毒抗原的細(xì)胞。
不希望受到任何理論的束縛，本發(fā)明人的看法是，一旦這樣的吞噬溶酶體逃逸肽可以獲得，這樣的吞噬溶酶體逃逸肽或多肽使得來(lái)源于細(xì)菌細(xì)胞或者生物活性劑的并且適于引發(fā)免疫應(yīng)答的任何抗原更加有效。換句話說(shuō)，通過(guò)允許在將細(xì)菌細(xì)胞誘陷到吞噬溶酶體中時(shí)而產(chǎn)生的抗原從吞噬溶酶體逃離，并且因此被呈遞到免疫系統(tǒng)，增加了BCG特異性抗原的可及性，并且因此產(chǎn)生有效與本發(fā)明聯(lián)系應(yīng)用的優(yōu)良佐劑。
這種進(jìn)入I類MHC呈遞途徑的肽的遞送可以加強(qiáng)已經(jīng)存在的BCG-特異性免疫應(yīng)答及其佐劑活性。
BCG的佐劑作用，并且更具體地是BCG或任何微生物優(yōu)選任何分枝桿菌微生物(其編碼或者表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽或多肽)的佐劑作用，是本發(fā)明人的另一個(gè)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)引起這樣的佐劑作用的微生物與另一種或第二種生物活性劑組合或共同施用時(shí)，其可以優(yōu)選地得到應(yīng)用。與刺激TH2免疫應(yīng)答的其它佐劑不同，前文描述的佐劑，即，微生物，可以用來(lái)引發(fā)TH1免疫應(yīng)答。由于它誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，所以，目前，這樣的TH1免疫應(yīng)答是有效的。因此，在另一方面，本發(fā)明涉及編碼和/或表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽的微生物的應(yīng)用，其中作為佐劑的所述微生物優(yōu)選地是BCG，并且更優(yōu)選地是本文所述的BCG，并且最優(yōu)選地是ure C-缺陷型BCG。
甚至更令人驚訝地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，編碼和/或表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽的微生物，優(yōu)選地BCG或其衍生物，并且更優(yōu)選地是本文在其各種實(shí)施方案中所述的BCG，包括但不限于rBCG:Hly，以及最優(yōu)選地是ure C-缺陷型BCG諸如BCG:rBCGΔureC:Hly及其衍生物，優(yōu)于沒(méi)有吞噬溶酶體逃逸肽的BCG，在這種程度上它們能夠誘導(dǎo)對(duì)個(gè)體微生物諸如分枝桿菌特異的顯著的CD8應(yīng)答，并且另外，還誘導(dǎo)對(duì)本文公開(kāi)的和/或定義的的生物活性劑代表或給出的抗原特異的顯著的CD8應(yīng)答。換句話說(shuō)，在這一實(shí)施方案中，用作或者叫作本文的第一成分的微生物，即，其包括吞噬溶酶體逃逸肽，并且更優(yōu)選地還是ureC陰性的，不限于引發(fā)微生物-特異的CD8免疫應(yīng)答，這與本領(lǐng)域的技術(shù)人員預(yù)測(cè)的相反。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的吞噬溶酶體逃逸肽或多肽是L.monocytogenes的吞噬溶酶體逃逸多肽，李斯特菌溶胞素(Hly)。李斯特菌溶胞素是孔-形成的巰基活化的溶細(xì)胞素，并且負(fù)責(zé)將L.monocytogenes微生物從吞噬溶酶體空泡釋放到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中。這種逃逸作用可以轉(zhuǎn)移到各種細(xì)菌細(xì)胞，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、減毒的沙門(mén)氏菌亞種(Salmonella ssp.)菌株以及分枝桿菌，如在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP2004/004345中所述。此外，國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/101496公開(kāi)了分泌生物活性李斯特菌溶胞素融合蛋白的重組牛分枝桿菌。因此，形成按照本發(fā)明的組合物的第一成分的細(xì)菌細(xì)胞表現(xiàn)出孔形成機(jī)制，用于在內(nèi)體膜上穿孔引起優(yōu)異的免疫保護(hù)性。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，存在一些吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，其中優(yōu)選例如在US 5,733,151中所述的利斯特氏菌屬吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。更優(yōu)選地，所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域來(lái)源于生物體L.monocytogenes，最優(yōu)選地，所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域由選自下列各項(xiàng)的核酸分子編碼a)包括SEQ.ID.NO.1中所示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列，b)編碼與來(lái)自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列，和c)在嚴(yán)緊條件下與a)或b)的序列雜交的核苷酸序列。其中，可以用于這樣的目的的其它吞噬溶酶體逃逸多肽為產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)的溶血素(產(chǎn)氣莢膜梭菌素)(O′Brien DK，等.Infect Immun.2004 Sep；72(9)5204-15)；弧菌(Vibrio)的溶血素，更特別地是創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)的溶血素(Lee SE等.，Biochem BiophysRes Commun.2004 Nov 5；324(1)86-91)；B組鏈球菌(streptococcus)的溶血素/溶細(xì)胞素(Liu GY等.，Proc Natl Acad Sci USA.2004 Oct 5；101(40)14491-14496.Epub 2004 Sep 20)；桿菌的溶血素BL，更特別地是蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的溶血素(Moravek M等.，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.2004 Sep1；238(1)107-13)；博德特氏菌屬(Bordetella)的溶血素，更特別地是百日咳博德特氏菌(Bordetella pertusis)的溶血素(Bassinet L等.，Infect Immun.2004 Sep；72(9)5530-3)；大腸桿菌(Escherichia coli)的溶血素(Wyborn NR等.，Microbiology.2004 May；150(Pt 5)1495-505)和志賀氏菌屬的溶血素(Sharma K等.，Microbios.2001；106(413)31-8)。
除了SEQ ID No.1所述的核苷酸序列外，本發(fā)明還包括與其雜交的核酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雜交”如Sambrook等.(Molecular Cloning.A laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，1.101-1.104)定義的那樣應(yīng)用。按照本發(fā)明，如果在用1 X SSC和0.1％SDS在55℃，優(yōu)選地在62℃和更優(yōu)選地在68℃洗滌1小時(shí)后，仍舊可以觀察到陽(yáng)性雜交信號(hào)，那么就使用術(shù)語(yǔ)“雜交”。在這樣的洗滌條件下，與按照SEQ ID No.1的核苷酸序列雜交的序列是本發(fā)明優(yōu)選的吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域編碼核苷酸序列。
如上文所述的編碼吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列可以直接獲得于李斯特氏菌(Listeria)生物體或者任何重組資源，如含有相應(yīng)的上文所述的利斯特氏菌核酸分子或其變體的重組大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞。
應(yīng)該意識(shí)到，對(duì)于按照本發(fā)明的組合物，包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽的重組核酸分子的這樣的細(xì)菌細(xì)胞，并且更特別地是作為包括Hly的分枝桿菌細(xì)胞的這樣的細(xì)菌細(xì)胞是特別優(yōu)選的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞還是脲酶缺陷型的，更具體地是ureC缺陷型。這樣的生物體還叫作BCG:rBCGΔureC:Hly或BKG。
盡管其功效還是可疑的，但是，分枝桿菌，并且更具體地是牛分枝桿菌卡介苗(BCG)已經(jīng)廣泛地用作預(yù)防結(jié)核病的可行性疫苗。然而，存在這樣的統(tǒng)一意見(jiàn)，即，BCG可以保護(hù)以免受或者至少改善兒童全身性結(jié)核病的嚴(yán)重形式。
然而，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了新型的BCG。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與生物活性劑一起施用時(shí)，這些新型的BCG作為佐劑特別有效，并且因此可以用作按照本發(fā)明的組合的第一成分。
用作按照本發(fā)明的組合的第一成分的細(xì)菌細(xì)胞優(yōu)選地是脲酶缺陷型的。由于脲酶缺陷，分枝桿菌細(xì)胞將不能在需要這樣的酶活性的環(huán)境中諸如在吞噬溶酶體中存活，所以，這一特點(diǎn)導(dǎo)致增強(qiáng)的安全性。
脲酶缺陷性可以通過(guò)將編碼脲酶亞基的一個(gè)或一些細(xì)胞核酸分子部分或者完全滅活而實(shí)現(xiàn)，特別是部分或者完全滅活編碼脲酶亞基A的ureA，編碼脲酶亞基B的ureB和/或編碼脲酶亞基C的ureC。分枝桿菌特別是牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中的ureA、ureB和ureC序列以及其所編碼的蛋白由Reyrat等.(1995)和Clemens等.(1995)所述，其通過(guò)參考結(jié)合于此。
優(yōu)選地，脲酶缺陷型細(xì)菌菌株通過(guò)在脲酶亞基-編碼核酸序列和/或表達(dá)控制序列中刪除和/或插入一個(gè)或一些核苷酸而獲得。刪除和/或插入可以通過(guò)同源重組、轉(zhuǎn)座子插入或者其它適當(dāng)方法而產(chǎn)生。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，ureC序列被滅活，例如，通過(guò)構(gòu)建含有被選擇標(biāo)記基因中斷的ureC基因的自殺性載體，用所述載體轉(zhuǎn)染靶點(diǎn)細(xì)胞，并且篩選具有脲酶陰性表型的選擇標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行，如Reyrat等.(同前所述)所述的那樣。
按照本發(fā)明，可以將各種分枝桿菌物種用作形成按照本發(fā)明的組合物的第一成分的細(xì)菌細(xì)胞，即，牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、田鼠分枝桿菌(M.microti)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、M.canettii、瘰疬分枝桿菌(M.marinum)或偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)?？梢詰?yīng)用展現(xiàn)出一種或兩種前面提及的特征(即編碼或表達(dá)吞噬溶酶體逃逸肽或多肽，并且是脲酶-陰性的，更優(yōu)選地是ureC-陰性的)的其它微生物，優(yōu)選地是胞內(nèi)微生物，這也在本發(fā)明之內(nèi)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，相應(yīng)細(xì)菌細(xì)胞被減毒。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是減毒的，但是仍然是活的，并且更加特別適用于引發(fā)TH1反應(yīng)。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述相應(yīng)的細(xì)菌細(xì)胞是活的細(xì)菌細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞還包括至少一種編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的肽或多肽的重組核酸分子。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)“在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答”意指，當(dāng)將這樣的肽或多肽或其部分暴露于哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)時(shí)，可以產(chǎn)生為B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫應(yīng)答。然而，備選地，所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，更優(yōu)選地是1類MHC-限制的CD8 T細(xì)胞應(yīng)答。
更優(yōu)選地，這樣的肽或多肽選自包括自體抗原、腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲(chóng)抗原、細(xì)菌抗原及其免疫原性片段的組。優(yōu)選地，免疫原性片段是仍然能夠引發(fā)免疫應(yīng)答的這樣的抗原的片段。一種特別優(yōu)選的抗原是瘧原蟲(chóng)的gp190/MSP1蛋白，如本文更詳細(xì)地所述的那樣。另一種特別優(yōu)選的病毒抗原是本文更詳細(xì)所述的HCMV的密體。另一種抗原是適于引發(fā)針對(duì)結(jié)核的免疫應(yīng)答，并且更特別地是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、M.canettii、非洲分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答的抗原。一種特別優(yōu)選的抗原是抗原85。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的抗原是第二成分。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，當(dāng)涉及本文的抗原時(shí)，這一術(shù)語(yǔ)還包括其片段或突變形式。只要它這樣的突變形式或片段表現(xiàn)出全長(zhǎng)或野生型抗原的至少一種特征，那么，它的片段和突變形式就被視作相應(yīng)的抗原。優(yōu)選地，這樣的特征是它引發(fā)免疫應(yīng)答的能力，更優(yōu)選地是當(dāng)與本文所述的第一成分或佐劑組合在一起應(yīng)用時(shí)引發(fā)免疫應(yīng)答的能力。在一個(gè)甚至是更優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的免疫應(yīng)答是特異的CD8免疫應(yīng)答。這還分別適用于多肽和蛋白。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)該意識(shí)到，考慮到遺傳密碼的簡(jiǎn)并性或者考慮到使得所述序列適應(yīng)各自宿主或生產(chǎn)生物體的密碼子應(yīng)用的需要，當(dāng)分別提及核酸和編碼多肽或蛋白的核酸時(shí)，術(shù)語(yǔ)還包括編碼多肽或蛋白的那些核酸，其任選地是本文優(yōu)選定義的其片段或突變形式。
術(shù)語(yǔ)多肽、蛋白或抗原來(lái)源于生物體優(yōu)選地意指，相應(yīng)的多肽、蛋白或抗原的氨基酸序列是相應(yīng)生物體的多肽、蛋白或抗原，其中所述序列以及因此還有其相應(yīng)的編碼核酸可以是其片段或突變形式。
還應(yīng)該意識(shí)到，所述能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的肽或多肽可以是所述組合物的第二成分。所述肽或多肽是融合多肽的片段也是在本發(fā)明內(nèi)。優(yōu)選地，這樣的融合多肽包括能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的肽或多肽，或者其仍然具有這樣的特性的結(jié)構(gòu)域，并且所述融合多肽還包括吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選地與本發(fā)明第一成分的實(shí)施方案聯(lián)系的上文所述的吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。如果這樣的肽是細(xì)菌抗原，那么，能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的多肽的結(jié)構(gòu)域可以是來(lái)源于微生物，優(yōu)選地來(lái)源于分枝桿菌屬，并且更優(yōu)選地來(lái)源于結(jié)核分枝桿菌或牛分枝桿菌。這一結(jié)構(gòu)域具有至少6個(gè)優(yōu)選地至少8個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。所述免疫原性結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地是天然分枝桿菌多肽的片段。然而，來(lái)源于天然免疫原性結(jié)構(gòu)域的通過(guò)取代、刪除和/或添加一個(gè)或一些氨基酸而修飾的免疫源性結(jié)構(gòu)域也是在本發(fā)明范圍內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)構(gòu)域是瘧原蟲(chóng)gp190/MSP1蛋白的結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白由重組核酸分子，即，按照SEQ ID No.1的核酸分子編碼。這一核酸分子包括信號(hào)肽編碼序列，(核苷酸1-120)，編碼免疫原性結(jié)構(gòu)域的序列(核苷酸112-153)，肽接頭編碼序列(核苷酸154-210)，編碼吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域的序列(核苷酸211-1722)，另一個(gè)肽接頭編碼序列(核苷酸1723-1800)以及編碼隨機(jī)肽的序列(核苷酸1801-1870)。對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在SEQ ID No.2中顯示。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，更特別地當(dāng)所述第一成分是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly時(shí)，所述第二成分是生物活性劑，并且更具體地是一種遺傳操作的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述遺傳操作的細(xì)胞是真核細(xì)胞。更優(yōu)選地，這樣的遺傳操作的細(xì)胞表達(dá)至少一種細(xì)胞因子。當(dāng)用于本文時(shí)，細(xì)胞因子是一種影響其它細(xì)胞的行為和特征的分泌蛋白。優(yōu)選的細(xì)胞因子是白介素、趨化因子、淋巴因子、單核因子和生長(zhǎng)因子。特別優(yōu)選的細(xì)胞因子是白介素和干擾素，其中優(yōu)選的白介素是白介素-2、白介素-4、白介素-12，優(yōu)選白介素-2，并且干擾素優(yōu)選干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ，更優(yōu)選地是干擾素-γ。
當(dāng)優(yōu)選地用于本文時(shí)，遺傳操作的細(xì)胞是通過(guò)插入外源遺傳物質(zhì)對(duì)細(xì)胞中存在的遺傳組成進(jìn)行修飾的細(xì)胞。這樣的遺傳組成的修飾包括引入細(xì)胞中不存在的遺傳物質(zhì)，以便成為真正的外來(lái)核酸，或者激活一部分內(nèi)源遺傳物質(zhì)，因而這樣的內(nèi)源遺傳物質(zhì)不存在或者是有活性的，而沒(méi)有所述外源遺傳物質(zhì)存在，因而外源遺傳物質(zhì)不必是一種遺傳物質(zhì)，但是可以是這個(gè)范圍內(nèi)的任何活性物質(zhì)。實(shí)現(xiàn)這樣的修飾的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。例如，可以通過(guò)磷酸鈣沉淀技術(shù)、病毒載體技術(shù)、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、病毒載體系統(tǒng)諸如腺伴隨病毒系統(tǒng)、顯微注射或生物射彈方法，而將外源DNA物質(zhì)引入到細(xì)胞中。這樣的遺傳操作的結(jié)果是所述遺傳操作的細(xì)胞將能夠表達(dá)以前不表達(dá)的某些基因產(chǎn)物。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，白介素，更具體地是白介素-2，和干擾素-γ，與作為按照本發(fā)明的組合物的第一成分而描述的細(xì)菌細(xì)胞組合共同表達(dá)，提供一種非常有效的方法來(lái)增加生物體的免疫應(yīng)答，更具體地是TH1應(yīng)答。具體的細(xì)胞可以選自多種細(xì)胞，諸如非專職抗原呈遞細(xì)胞、專職抗原呈遞細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞。在這些細(xì)胞類型中，特別優(yōu)選腫瘤細(xì)胞。當(dāng)施用這樣的腫瘤細(xì)胞時(shí)，已經(jīng)引入這樣的腫瘤細(xì)胞的癌癥患者體會(huì)到對(duì)腫瘤接種方法的功效的增加的作用。優(yōu)選地，用于這樣的接種方法的細(xì)胞取自與要用按照本發(fā)明的組合物治療的腫瘤相同的或相似的腫瘤實(shí)體。因此，其中使用國(guó)際專利申請(qǐng)WO 94/18995中所述的遺傳操作的細(xì)胞的有益作用，還通過(guò)將所述細(xì)菌細(xì)胞用作形成按照本發(fā)明的組合的第一成分而增強(qiáng)。
下述屬于本發(fā)明，即，所述專職抗原呈遞細(xì)胞是一種樹(shù)突細(xì)胞，然后其被用作本文所定義的生物活性劑，或者是所述生物活性劑的另一種成分，因而優(yōu)選地在這樣的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是遺傳操作的細(xì)胞，更優(yōu)選地是本文所述的細(xì)胞因子表達(dá)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞甚至更優(yōu)選地同時(shí)表達(dá)兩種細(xì)胞因子，并且最優(yōu)選地是白介素-2和干擾素-γ。所述樹(shù)突細(xì)胞優(yōu)選地負(fù)荷腫瘤抗原，其中所述腫瘤是使用所述樹(shù)突細(xì)胞治療的一種腫瘤，優(yōu)選地與本文所述的佐劑組合和/或以佐劑和生物活性劑諸如例如所述細(xì)胞因子共表達(dá)細(xì)胞的組合進(jìn)行治療。所述樹(shù)突細(xì)胞的負(fù)荷是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且例如，在Vari和Hart((2004)，Cytotherapy6(2)111-121.)中得到描述。將這樣的樹(shù)突細(xì)胞，單獨(dú)地或與本文所述的任何佐劑特別是BCG和BKG組合，或者與本文所述的第一和第二成分的任何組合，優(yōu)選地用于治療本文所述任何疾病。優(yōu)選地這樣的疾病是本文所述的任一種腫瘤疾病。
可以使用這種方法闡釋的優(yōu)選的腫瘤和癌癥分別是具體的免疫原性腫瘤或癌癥，其中諸如黑素瘤、腎癌、乳腺瘤、腦瘤、前列腺腫瘤、非小肺癌、結(jié)腸癌以及頭頸鱗狀腫瘤。
細(xì)胞因子的表達(dá)，并且更具體的是白介素-2和干擾素-γ的共表達(dá)允許通過(guò)所述遺傳操作的細(xì)胞呈遞的腫瘤抗原的增加的功效?？鼓[瘤反應(yīng)的提高由向相同方向運(yùn)作的兩種不同機(jī)制引起。在傳入(afferent)方面，IFNγ分泌增加MHC和黏著分子在細(xì)胞表面的表達(dá)，這導(dǎo)致MHC I分子對(duì)針對(duì)CD8+T-細(xì)胞的腫瘤特異性抗原的更好的呈遞，并且因此導(dǎo)致T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的更好的識(shí)別。在傳出(efferent)方面，在緊密接近腫瘤細(xì)胞處的IL-2分泌增加CD8+T-細(xì)胞的活性。在這種情況下，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選地所述表達(dá)至少一種細(xì)胞因子的遺傳操作的細(xì)胞至少在某種程度上是涉及使用其用于治療的腫瘤實(shí)體。當(dāng)然，應(yīng)該理解，在這種情況下可以應(yīng)用其它細(xì)胞系，其中更優(yōu)選地，除了如本文所述那樣進(jìn)行遺傳操作外，所述細(xì)胞還表達(dá)要被這樣治療的腫瘤實(shí)體的某些抗原特征。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，原則上所述遺傳操作的細(xì)胞可以是自體同源的細(xì)胞。這意味著細(xì)胞取自要使用按照本發(fā)明的組合進(jìn)行治療的患者，因而所采集的細(xì)胞通常取自要被治療的腫瘤，并且對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行操作以成為本文所定義的遺傳操作的細(xì)胞。隨后，將這種細(xì)胞作為按照本發(fā)明的組合的部分再次施用給患者。
為了增加所述遺傳操作的細(xì)胞的功效，這些細(xì)胞還表達(dá)另一種免疫分子。當(dāng)用于本文時(shí)，免疫分子包括適于影響免疫系統(tǒng)的任何分子。其中，免疫分子包括細(xì)胞因子、黏著分子、共刺激性因子、腫瘤相關(guān)抗原、腫瘤特異性抗原和寄生蟲(chóng)抗原。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述遺傳操作的細(xì)胞是同種異基因的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，同種異基因細(xì)胞是源于相同物種然而并不是源于恰好同一個(gè)體的細(xì)胞。同種異基因細(xì)胞是來(lái)源于相同物種但是抗原性截然不同的細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述同種異基因細(xì)胞與要治療的腫瘤的各自細(xì)胞群相匹配。更優(yōu)選地，所述匹配涉及到將一些或全部人淋巴細(xì)胞抗原(HLA)種類與要使用按照本發(fā)明的組合治療的患者相關(guān)聯(lián)。然而，可以應(yīng)用不同程度的匹配。更具體地，所述匹配應(yīng)該是I類HLA匹配。I類HLA包括亞類A、B和C。如果在用作按照本發(fā)明的組合物的第二成分的細(xì)胞和組成要使用所述組合物治療的患者的腫瘤的細(xì)胞之間存在匹配，那么將給出I類HLA匹配。
應(yīng)該意識(shí)到，所述匹配以及需要的這樣的匹配的程度是在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。一種可能的實(shí)驗(yàn)方法是用不同程度的匹配接種不同組的動(dòng)物/患者，并且然后用腫瘤刺激以檢驗(yàn)效果。備選地，檢測(cè)可以直接對(duì)腫瘤患者進(jìn)行。
一種特別優(yōu)選的細(xì)胞系是LNCaP，其同時(shí)表達(dá)白介素-2和干擾素-γ，并且其被用作與按照本發(fā)明的組合聯(lián)系的第二成分，更具體地，用于治療前列腺癌，其中所述第一成分是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是寄生蟲(chóng)抗原，更具體地是瘧原蟲(chóng)的gp190/MSP1蛋白。優(yōu)選地，所述相應(yīng)抗原來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)。優(yōu)選地，所述相應(yīng)抗原來(lái)源于瘧原蟲(chóng)MSP-1蛋白的氨基酸序列，優(yōu)選地來(lái)源于惡性瘧原蟲(chóng)MSP-1蛋白的氨基酸序列。當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)寄生蟲(chóng)抗原意指全長(zhǎng)抗原以及其片段，只要它們適于引發(fā)免疫應(yīng)答，更優(yōu)選地是TH1應(yīng)答或TH1介導(dǎo)的應(yīng)答，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物中引發(fā)，甚至更優(yōu)選地與按照本發(fā)明的組合物相聯(lián)系，其中所述第一成分更優(yōu)選地分別是rBCG:Hly和rBCGΔureC:Hly。
這一實(shí)施方案在治療瘧疾中特別有用。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，這樣的寄生蟲(chóng)抗原可以由作為按照本發(fā)明的組合的第一成分的細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)，或者由作為按照本發(fā)明的組合物的第二成分的真核細(xì)胞表達(dá)。然而，也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，所述寄生蟲(chóng)抗原由這樣的細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)，即，其包括由本發(fā)明的許多實(shí)施方案詳細(xì)說(shuō)明的至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子。
應(yīng)該意識(shí)到，gp190/MSP由一些天然存在的結(jié)構(gòu)域組成，并且意識(shí)到，單獨(dú)的或組合的這樣的結(jié)構(gòu)域可以是本文優(yōu)選應(yīng)用的寄生蟲(chóng)抗原。gp190/MSP1暫時(shí)被視作針對(duì)瘧疾的疫苗的潛在候選。然而，它的制備被視作是極端費(fèi)力的，不允許這一抗原的大規(guī)模生產(chǎn)。考慮到這一點(diǎn)，潛在瘧疾疫苗還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)可用。然而，基于國(guó)際專利申請(qǐng)WO 98/14583的技術(shù)教導(dǎo)，現(xiàn)在這種瘧原蟲(chóng)抗原可以實(shí)現(xiàn)大量的可用。應(yīng)該意識(shí)到，這樣的寄生蟲(chóng)抗原不限于gp190/MSP1抗原，還包括在除惡性瘧原蟲(chóng)之外的其它瘧原蟲(chóng)物種如間日瘧原蟲(chóng)(P.vivax)中發(fā)現(xiàn)的其同源染色體。所述國(guó)際專利申請(qǐng)的技術(shù)教導(dǎo)通過(guò)參考結(jié)合于此，并且允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員制備這種抗原需要的任意量，以便將其作為第二成分結(jié)合到按照本發(fā)明的組合物中。例如，DNA疫苗在Grode L，Mollenkopf HJ，Mattow J，Stein M，MannP，Knapp B，Ulmer J，Kaufmann SH.Application of mycobacterial proteomicsto vaccine designimproved protection by Mycobacterium bovis BCGprime-Rv3407 DNA boost vaccination against tuberculosis.Infect Immun.2004 Nov；72(11)6471-9中得到描述。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是少量或一組病毒抗體或者病毒顆粒的群體，其優(yōu)選地在人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后釋放，其中所述顆粒(a)被脂膜包圍，病毒糖蛋白內(nèi)含在脂膜中，并且(b)不含有病毒DNA，也不含殼體，或者是密體，優(yōu)選地是人巨細(xì)胞病毒的密體。這樣的顆粒將在本文中更詳細(xì)地描述，其優(yōu)選地用于預(yù)防和/或治療人巨細(xì)胞病毒的感染，所述人巨細(xì)胞病毒為β-皰疹病毒?？梢允褂冒凑毡景l(fā)明這一方面的組合進(jìn)行治療的一組特別相關(guān)的受試者是不得不進(jìn)行骨髓移植的患者。
在免疫活性個(gè)體中，HCMV感染通常是不被注意的，其具有至多是輕微的和非特異性的癥狀。相反，在某些危險(xiǎn)組中，例如，在免疫抑制性患者如AIDS患者或移植受體，以及在產(chǎn)前感染后，HCMV感染具有嚴(yán)重的表現(xiàn)，因此，這組成了可以使用佐劑和所述相應(yīng)顆粒組合進(jìn)行治療的另一組患者。
按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP 00/01794的技術(shù)教導(dǎo)，已經(jīng)證明，所謂的HCMV密體有效地誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且最后誘導(dǎo)針對(duì)HCMV感染的免疫保護(hù)。在這種情況下，所述密體提供中和抗體的長(zhǎng)期持續(xù)誘導(dǎo)，所述中和抗體以菌株重疊方式保護(hù)免受HCMV感染。這通過(guò)有效誘導(dǎo)針對(duì)HCMV的所謂的“輔助細(xì)胞反應(yīng)”(CD4-陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞)而提供，以輔助抗體-分泌性B-淋巴細(xì)胞的成熟。另外，所述密體適于誘導(dǎo)針對(duì)HCMV的細(xì)胞毒性T細(xì)胞的形成，其中這種類型的淋巴細(xì)胞對(duì)于終止HCMV感染是至關(guān)重要的，其發(fā)生并且限制所述病毒在機(jī)體內(nèi)的擴(kuò)散。最后，這樣的密體適合將疫苗的副作用減至最小。
密體由HCMV感染而誘導(dǎo)，并且釋放到被感染的初級(jí)人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中。它們是在電子顯微鏡下可見(jiàn)的結(jié)構(gòu)，并且其大于90％的蛋白質(zhì)體由pp65組成。它們與現(xiàn)有的病毒顆粒相當(dāng)，即，所述病毒顆粒具有通過(guò)病毒糖蛋白修飾的細(xì)胞脂膜，并且從細(xì)胞釋放出來(lái)。所述病毒糖蛋白在這一包膜中很可能是天然構(gòu)象。由于密體不含病毒DNA也不含病毒殼體，所以它們是非感染性的。它們可以通過(guò)已確定的方法從細(xì)胞培養(yǎng)物的上層清液濃縮。使用這樣的密體，特別是與本文所述的佐劑組合使用，可以實(shí)現(xiàn)預(yù)防性以及治療性疫苗應(yīng)用。
密體由脂膜圍繞，其使得可能將所述顆粒融合到特定的哺乳動(dòng)物細(xì)胞上，以便它們的內(nèi)容物進(jìn)入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。所述顆粒的膜含有代表病毒-中和抗體的主要抗原的病毒糖蛋白。此外，所述顆粒特征在于，它們不含病毒DNA也不含殼體。另外，它們含有病毒T-細(xì)胞抗原pp65(ppUL83)，其刺激T-輔助細(xì)胞的形成，并且是誘導(dǎo)針對(duì)HCMV的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的主要抗原。
這些特性，特別是能夠誘導(dǎo)中和抗體和充分的細(xì)胞應(yīng)答的抗原的組合，使得所述顆粒適于用作針對(duì)HCMV的疫苗。
此外，不考慮施用的途徑，密體誘導(dǎo)Th1類型的T-輔助細(xì)胞應(yīng)答，這使得它們有資格用作針對(duì)HCMV的疫苗。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了含有融合蛋白的密體或相應(yīng)顆粒，其中所述融合蛋白一方面包括病毒T-細(xì)胞抗原pp65(ppUL83)或蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段，另一方面包括一種或多種其它蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。
由于這種融合蛋白在所述顆粒中大量存在，所以，這使得可以將所述顆粒的抗原性最優(yōu)化。另外，已知細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的抗原在一個(gè)分子中的表達(dá)可以顯著地增加抗原性。Pp65和其它蛋白的多個(gè)片段可以直接融合在一起，但是，例如，還可能在各個(gè)片段之間存在4個(gè)接頭序列，所述接頭序列并不是所包含的蛋白之一的天然成分。由于為了影響所述抗原的特性而有意克隆或者結(jié)合，所以可以出現(xiàn)這種類型的序列。然而，所述融合蛋白優(yōu)選地不含不是融合部分之一的成分的外源序列。在這樣的實(shí)施方案中，所述融合蛋白由pp65的一個(gè)或多個(gè)片段以及一種或多種其它蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段組成。
完整的pp65或其一個(gè)或多個(gè)片段可以存在于融合蛋白中，這適用于下文提及的所有實(shí)施方案。為了本申請(qǐng)的目的，陳述“pp65(組成)的融合蛋白”不應(yīng)該理解成限于完整的pp65。融合蛋白中存在的蛋白的“片段”或“部分”包括至少6個(gè)，優(yōu)選地至少8個(gè)，最優(yōu)選地至少9，15或20個(gè)衍生得到其的蛋白的連續(xù)氨基酸。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括pp65(ppUL83)和病毒糖蛋白gB或gH的一個(gè)或多個(gè)中和表位的融合蛋白。這種類型的顆粒可以按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/EP 00/01794所述而產(chǎn)生。通過(guò)抗原-特異性的吸收，所述融合蛋白可以進(jìn)入糖蛋白-特異性B細(xì)胞，其在II類MHC情形中又能夠呈遞糖蛋白和pp65的表位。另外，在II類MHC情形中也可以通過(guò)專職抗原-呈遞細(xì)胞(APC)呈遞部分所述融合蛋白。在這兩種情形中，結(jié)果是針對(duì)pp65和針對(duì)病毒糖蛋白的TH反應(yīng)的有效刺激。這些TH細(xì)胞能夠刺激糖蛋白-特異性B細(xì)胞，其在II類MHC情形中呈遞pp65和病毒糖蛋白的肽，以形成同源和異源的中和抗體。另外，如同感染性病毒體，這種類型的顆?？梢员晃盏郊?xì)胞中，并且可以通過(guò)外源負(fù)荷到I類MHC途徑而引入pp65肽。不同于死的疫苗，這實(shí)現(xiàn)針對(duì)HCMV的CTL應(yīng)答的刺激。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒含有融合蛋白，所述融合蛋白由pp65和HCMV的另一種蛋白IE1蛋白(ppUL123)的一個(gè)或多個(gè)片段組成。特別地，要被呈遞的IE1蛋白的片段是在天然感染過(guò)程中在人中針對(duì)其形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的那些片段。在一些情形中，IE1蛋白的肽通過(guò)除pp65肽之外的不同I類MHC分子呈遞。IE1的這樣的其它“CTL”表位的加入意欲保證，在免疫后，表達(dá)不同I類MHC分子的接種的受試者能夠以一種盡可能全面的方式產(chǎn)生針對(duì)HCMV的CTL。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒含有這樣的融合蛋白，即，其由pp65、HCMV糖蛋白的一個(gè)或多個(gè)中和表位以及IE1的一個(gè)或多個(gè)CTL表位組成。pp65與中和表位和CTL表位的融合意欲保證，對(duì)于由接種的受試者以盡可能全面的方式(即，通過(guò)在I類MHC模式上不同的人的最大數(shù)目)同時(shí)形成中和抗體和CTL。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒含有pp65和另一種人病原體的一個(gè)或多個(gè)表位的融合蛋白。適當(dāng)部分的其它人病原體是在人中針對(duì)其形成中和抗體的抗原。與使用分離的“中和一種抗原”相比，可以通過(guò)將這樣的“中和抗原”與T-細(xì)胞抗原pp65融合而預(yù)測(cè)免疫應(yīng)答(抗體應(yīng)答)的顯著增加。應(yīng)該提及的這樣的“中和抗原”的實(shí)例是下列各項(xiàng)的表面蛋白乙型肝炎病毒(從HBsAG區(qū)域)、丙型肝炎病毒(例如E2)、人免疫缺陷病毒(HIV，從Env區(qū)域)、流感病毒(血凝素、神經(jīng)氨酸酶、核蛋白)或其它病毒病原體。其它適宜的人病原體是細(xì)菌，諸如流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、百日咳博德特氏菌、結(jié)核分枝桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)及其它。最后，來(lái)自真核病原體如瘧原蟲(chóng)(瘧疾)的抗原可以與pp65融合。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒含有pp65與其它病原體蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段的融合蛋白，當(dāng)天然感染這些病原體時(shí)，在人中針對(duì)所述病原體產(chǎn)生CTL?？梢蕴峒暗倪@樣的CTL表位的實(shí)例是下列各項(xiàng)的蛋白片段HIV-1、HBV、HCV或流感病毒。這樣的流程的目的是在人中利用密體的獨(dú)特免疫原性特性來(lái)產(chǎn)生針對(duì)異源病原體的保護(hù)性CTL。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述顆粒含有這樣的融合蛋白，即，其由pp65、異源病原體的一個(gè)或多個(gè)中和表位以及同一病原體的一個(gè)或多個(gè)CTL表位組成。這種融合意欲保證接種的受試者能夠形成針對(duì)這一病原體的保護(hù)性抗體和CTL。
另外，本發(fā)明涉及包含至少兩種不同的糖蛋白的病毒顆粒，其中所述糖蛋白為來(lái)自不同HCMV毒株的相同糖蛋白的變體。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案恰好包含兩種變體，一種變體對(duì)應(yīng)HCMV Towne毒株，和另一種變體對(duì)應(yīng)HCMV Ad169毒株。所述優(yōu)選的實(shí)施方案包含Towne毒株和Ad169毒株的糖蛋白gB。
在被感染的細(xì)胞中，這兩種蛋白可以以相同的效率結(jié)合到重組密體的膜上。這樣的重組密體適合誘導(dǎo)針對(duì)這兩種原型HCMV毒株的不僅是毒株-重疊性而且是毒株-特異性的中和免疫應(yīng)答。
最后，本發(fā)明還涉及一種方法，通過(guò)這種方法制備完全沒(méi)有感染性病毒的病毒顆粒。當(dāng)優(yōu)選地用于本文時(shí)，術(shù)語(yǔ)沒(méi)有感染性病毒意指，在檢測(cè)水平上，這樣獲得的制劑是非-感染性的。如果顆粒是從已經(jīng)感染了HCMV的細(xì)胞群體產(chǎn)生的，那么，在純化所述顆粒的過(guò)程中，將存在一直攜帶感染性病毒顆粒的危險(xiǎn)。這代表了疫苗的一種缺點(diǎn)。
本發(fā)明的方法將這種危險(xiǎn)最小化。為了這一目的，最初產(chǎn)生一種攜帶重要基因的缺失的HCMV毒株。這意味著所述基因功能的缺失。在大多數(shù)情形中，這基于功能基因產(chǎn)物的不存在，但是也可能以使得HCMV不再存活的方法方式擾亂調(diào)控基因序列的功能。這可以通過(guò)改變HCMV的核酸序列而發(fā)生，例如，通過(guò)點(diǎn)突變、實(shí)際刪除、插入或者其它突變而發(fā)生。這種缺陷型病毒只可以在表達(dá)在HCMV中已經(jīng)被刪除的基因的細(xì)胞中復(fù)制，并且因此，使得病毒體的組裝可行。目前，初級(jí)成纖維細(xì)胞代表用于HCMV體外復(fù)制的唯一合理允許的系統(tǒng)。到目前為止，只在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移方法的輔助下，這樣的細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為可能。然而，如果使用這樣的細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生疫苗，那么這是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)。本發(fā)明的方法可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其可以不用反轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)移但是在其中也可以復(fù)制HCMV而產(chǎn)生。
一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括已經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了主要?dú)んw蛋白基因UL86的人包皮成纖維細(xì)胞。所述轉(zhuǎn)染優(yōu)選地在引起非常高的轉(zhuǎn)染效率的包含脂質(zhì)的輔助下進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將可以從Roche Diagnostics，Mannheim購(gòu)買(mǎi)的“Fugene試劑”用于轉(zhuǎn)染。
其主要?dú)んw蛋白基因UL86已經(jīng)被刪除的缺陷型病毒可以在這些細(xì)胞中復(fù)制。如果“非互補(bǔ)性”成纖維細(xì)胞感染了這種缺陷型病毒，那么可以從其中分離沒(méi)有感染性病毒顆粒的病毒疫苗顆粒。
生產(chǎn)本發(fā)明沒(méi)有感染危險(xiǎn)的顆粒的另一種可能是在沒(méi)有感染HCMV的細(xì)胞中重組所述顆粒。為了這一目的，編碼所述顆粒成分的所有基因必須在這些細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。為了這一目的，這些基因必須插入到所述細(xì)胞中。
對(duì)于這一目的，優(yōu)選使用被桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞。將編碼所述顆粒的多肽成分的基因克隆到桿狀病毒表達(dá)載體中。重組桿狀病毒產(chǎn)生后，通過(guò)各種病毒共感染昆蟲(chóng)細(xì)胞，優(yōu)選地感染Sf9細(xì)胞。所述基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，并且得到的多肽組合給出需要的顆粒。最后，昆蟲(chóng)細(xì)胞釋放所述顆粒。這代表產(chǎn)生可以用作疫苗的非感染性顆粒的一種可能性。
一種備選的可能是在HCMV主要IE啟動(dòng)子/增強(qiáng)子(MIEP)的控制下，將重建密體必需的成分克隆到重組桿狀病毒中。已表明，重組桿狀病毒能夠感染更高等的真核細(xì)胞，諸如例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且在強(qiáng)真核啟動(dòng)子諸如MIEP的控制下，外來(lái)基因在這樣的細(xì)胞中強(qiáng)烈地表達(dá)。這樣的方法的優(yōu)點(diǎn)在于，密體抗原性蛋白的任何重要的修飾，諸如糖基化，可以以比在昆蟲(chóng)細(xì)胞中更自然的方式發(fā)生在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。另外，存在許多這樣的已經(jīng)核準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是一種抗原呈遞細(xì)胞，其中這樣的抗原呈遞細(xì)胞呈遞適于引發(fā)針對(duì)結(jié)核的免疫應(yīng)答的抗原，并且更具體地適于引發(fā)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、M.canettii、非洲分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答的抗原。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗原呈遞細(xì)胞是微生物，更具體地是選自包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、M.canettii、非洲分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的的組的微生物。包括細(xì)菌細(xì)胞作為第一成分以及這樣的抗原呈遞細(xì)胞或這樣的抗原本身作為第二成分或作為生物活性劑的按照本發(fā)明的組合，可以優(yōu)選地用于預(yù)防和/或治療結(jié)核病。優(yōu)選地所述抗原是抗原85。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，以本文公開(kāi)的各種形式的按照本發(fā)明的組合物的第一成分，以及特別是在其各種實(shí)施方案如rBCG:Hly和rBCGΔureC:Hly中具有吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域的微生物，其發(fā)揮作用，并且因此可以用作佐劑，這意味著它是增強(qiáng)要被治療或者需要治療的患者的免疫狀態(tài)的原因，更優(yōu)選地，所述免疫狀態(tài)是關(guān)于TH1的，并且甚至更優(yōu)選地所述免疫狀態(tài)特征在于TH1應(yīng)答的增加，因而與未治療的個(gè)體相比較，這樣的TH1應(yīng)答增加了。
當(dāng)在本文中公開(kāi)時(shí)，由于它是提供患者的特異性生物、生化、生理或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的試劑，在這種情況下，所述第二成分優(yōu)選地在物理上與第一成分不同，或者在物理上與第一成分分離。第一和第二成分在物理上分離的事實(shí)允許所述兩種成分的獨(dú)立的或分別的施用。如果所述生物活性劑是表達(dá)細(xì)胞因子的遺傳操作的細(xì)胞，并且更優(yōu)選地這樣的細(xì)胞是癌癥細(xì)胞，那么，所述特異性免疫應(yīng)答是針對(duì)由這樣遺傳操作的細(xì)胞而引入的抗原的。然而，必須意識(shí)到，由于它們的作用模式，如同由所述第一成分已經(jīng)提供的那樣，所述細(xì)胞因子提供全面有利的作用，這也可以被視為佐劑作用。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包括按照本發(fā)明的組合，并且任選地包括藥用載體、稀釋劑或佐劑或其它賦形劑。優(yōu)選地，這樣的載體、稀釋劑、佐劑和賦形劑是惰性的，并且是無(wú)毒的。在它的各種實(shí)施方案中，所述藥物組合物適于以各種方式施用。這樣的施用包括全身性的和局部施用，以及口服、皮下、腸胃外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、intrategral以及眼內(nèi)施用。一種優(yōu)選的藥物組合物是含有所述第一和第二成分的水性或生理緩沖液。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，要施用的藥物組合物的量取決于個(gè)體患者的臨床狀況、施用的位點(diǎn)和方法、施用的時(shí)間安排、患者年齡、性別、體重以及執(zhí)業(yè)醫(yī)生所知的其它因素。因此，用于預(yù)防和/或治療目的的藥物有效用量由醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已知的考慮而確定。優(yōu)選地，所述用量有效獲得這樣的改善，其包括但不限于改善疾病狀況，或者提供更快的康復(fù)，改善或者消除癥狀以及被醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員選作適當(dāng)?shù)臏y(cè)定的其它指示。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的藥物組合物可以包括其它藥物活性化合物。
優(yōu)選地配制所述藥物組合物，以提供單劑量施用或者多劑量施用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一成分和第二成分本身或者作為藥物組合物的部分或者作為藥物組合物而同時(shí)提供，作為單一的制劑或者分別作為獨(dú)立的制劑。在獨(dú)立制劑的情形中，第一制劑含有第一成分，并且第二制劑含有第二成分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第一和所述第二制劑分別配制成本文所述的任何藥物制劑。
也在本發(fā)明范圍內(nèi)，分別獨(dú)立地施用所述第一和第二成分。優(yōu)選地，第一和第二成分之間的時(shí)間差異分別為大約1小時(shí)或小于1小時(shí)，優(yōu)選地約30分鐘或更少，并且更優(yōu)選地大約15分鐘或更少。
應(yīng)該意識(shí)到，也在本發(fā)明范圍內(nèi)的是，所述第一或第二成分或者兩種成分可以以本文所述的多種形式用于預(yù)防本文所述的任何疾病。
本發(fā)明將通過(guò)參考附圖和實(shí)例而進(jìn)一步舉例說(shuō)明，本發(fā)明的其它特點(diǎn)、實(shí)施方案和優(yōu)點(diǎn)可以取自所述附圖和實(shí)例，其中

圖1顯示與對(duì)照相比，當(dāng)組合施用BKG和疫苗時(shí)，描述表示為CD8+Tet+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的圖表；圖2-4顯示預(yù)防性腫瘤接種的免疫方案；圖5-7顯示用于治療性腫瘤接種的免疫方案；和圖8和9是描述當(dāng)使用不同肽刺激時(shí)，不同免疫方案對(duì)IFN-γ陽(yáng)性CD8 T細(xì)胞數(shù)目的影響的圖表。
實(shí)施例1使用BKG作為腫瘤疫苗的佐劑。
在這一實(shí)施例中，描述確定BKG作為腫瘤疫苗的佐劑的適合性的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)在本文提及時(shí)，BKG表達(dá)來(lái)自單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(Hly)的吞噬溶酶體逃逸肽，并且還是ureC缺陷型的。這樣修飾的BCG在本文也叫作rBCG:ΔureC:Hly。
基本地，患者和動(dòng)物模型分別必須通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)接種流程進(jìn)行接種，所述標(biāo)準(zhǔn)接種流程也叫作致敏增強(qiáng)流程。隨后，將動(dòng)物置于腫瘤刺激下。在這樣的條件下，在腫瘤刺激后，具有BKG/腫瘤細(xì)胞接種的動(dòng)物將不會(huì)發(fā)展腫瘤，或者可以比接受腫瘤接種但是沒(méi)有BKG作佐劑的動(dòng)物更久地抵抗腫瘤刺激。與接受腫瘤接種但是沒(méi)有BKG作佐劑的患者相比，具有BKG/腫瘤細(xì)胞接種的患者可以更久地抵抗他們的腫瘤。
如果沒(méi)有相反地指明，使用下列材料和方法細(xì)胞使用下列細(xì)胞系J558mOVA(表達(dá)OVA并且將其結(jié)合在細(xì)胞膜上的J558-細(xì)胞)，J558sOVA(表達(dá)OVA并且將其分泌到環(huán)境中的J558-細(xì)胞)和EL-4OVA(表達(dá)OVA的EL-4-細(xì)胞)。開(kāi)始將細(xì)胞培養(yǎng)物保持在G418-壓力下14天。支原體檢測(cè)是陰性的。在初始傳代增加細(xì)胞數(shù)目后，將3種細(xì)胞系以10×106的分量用DMSO冷凍，并且在第一次用于動(dòng)物之前在液N2中保存至少7天。
細(xì)菌將所用的細(xì)菌標(biāo)記BKG(rBCGΔureC:Hly)；也叫作“BKG”。BKG生長(zhǎng)在7H9完全培養(yǎng)基中，并且在10％甘油/PBS中冷凍。所述細(xì)菌可以被解凍和再冷凍一次(但是只在沒(méi)有之前的稀釋時(shí)再冷凍)。
對(duì)于初級(jí)接種和接著的2次增強(qiáng)-接種，將19,3μl＝1×106BKG注射到小鼠中。
疫苗制備將冷凍的細(xì)胞解凍，并且在無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基中洗滌兩次。隨后，將細(xì)胞重懸在無(wú)菌DMEM中并且計(jì)數(shù)?？偟淖⑸潴w積是100μl(按照Tabelle 1制備)。在注射之前，將細(xì)胞在無(wú)菌注射器中輻射(150 Gy γ輻射)。體外對(duì)照在輻射之前和輻射之后，分別從解凍的細(xì)胞每種細(xì)胞系移出一等分，并且放到細(xì)胞培養(yǎng)物中。這些對(duì)照表明解凍后(未輻射的細(xì)胞)良好的復(fù)蘇，并且在輻射后多于14天沒(méi)有細(xì)胞增殖。
小鼠C57/B6雌鼠，12周齡(在6周齡分送，并且在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)6周)；s.c.接種100μl；25G針頭；尾巴底部；7天后，在常規(guī)麻醉下，取出0,3ml血液用于免疫監(jiān)測(cè)(OVA的四聚體)。小鼠的使用得到各自的權(quán)威的公認(rèn)。
BKG exp.#1的時(shí)間表第0天 初級(jí)接種(致敏)第7天 第一次血液收集第28天第一次增強(qiáng)接種(1st增強(qiáng))第35天第二次血液收集第53天第二次增強(qiáng)接種(2st增強(qiáng))第60天第三次血液收集第74天腫瘤刺激將所用小鼠分成2個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組●疫苗組加BKG(n＝9)亞組#1.1，#1.3和#1.5(見(jiàn)表1)●疫苗組減BKG(n＝9)亞組#1.2，#1.4和#1.6●對(duì)照組(n＝2) 亞組#1.7表1亞組和注射的疫苗
籠養(yǎng)動(dòng)物S2-條件，IVC-籠，2籠；3-4天時(shí)間間隔更換。
FACS分析
進(jìn)行FACS-運(yùn)行，以便以不知情的方式檢測(cè)SIINFEKEL-特異性T細(xì)胞的數(shù)量。在將細(xì)胞成分分類之后，將血漿冷凍，并且保存在-80℃以備進(jìn)一步的評(píng)估。
體外實(shí)驗(yàn)的平行細(xì)胞培養(yǎng)物 產(chǎn)生用于接種和腫瘤刺激的細(xì)胞在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)使用細(xì)胞的體外對(duì)照在FACS實(shí)驗(yàn)中用作對(duì)照的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，產(chǎn)生四聚體載體學(xué) 為IL-2、IFNγ和OVA重組設(shè)計(jì)載體(SINvector)。這一載體用來(lái)產(chǎn)生與LNCaP-IL-2-IFNγ細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的小鼠腫瘤細(xì)胞系。
結(jié)果圖1中描述的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)的第一結(jié)果表明存在這樣的趨向，即，在具有BKG作為佐劑的小鼠組中比沒(méi)有佐劑的動(dòng)物組有更高數(shù)量的T細(xì)胞能夠識(shí)別OVA-肽。這說(shuō)明BKG是腫瘤接種的佐劑，其增強(qiáng)針對(duì)所述疫苗的免疫反應(yīng)。
實(shí)施例2最優(yōu)化使用BKG的腫瘤接種治療方案下述是用于將實(shí)施例1列出的治療觀念的施用方案最優(yōu)化的流程，以便允許本領(lǐng)域的技術(shù)人員將本文公開(kāi)的基本治療方案最優(yōu)化。如果沒(méi)有相反指明，材料和方法同上述實(shí)施例1所列出的一樣。
方案1使用表達(dá)IL-2、IFNγ和卵清蛋白的穩(wěn)定的三重-轉(zhuǎn)染的J558(H2Kb)細(xì)胞系，將3種不同劑量的這些細(xì)胞注射到小鼠(C57 BL/6(H2Kb))中，即5×106個(gè)細(xì)胞，10×106個(gè)細(xì)胞和15×106個(gè)細(xì)胞。對(duì)于每一劑量，小鼠組由5只動(dòng)物組成，并且它們的注射方案如下致敏免疫和每30天的3次增強(qiáng)；其中注射有或無(wú)BKG(1×106CFU)而發(fā)生。對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫學(xué)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)它們是否表現(xiàn)出卵清蛋白-特異的免疫應(yīng)答，并且特別地是否表現(xiàn)出由BKG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的增加。
方案2這一試驗(yàn)由一系列預(yù)備實(shí)驗(yàn)(“預(yù)備實(shí)驗(yàn)1-7”)和4個(gè)主要實(shí)驗(yàn)(“實(shí)驗(yàn)1-4”)組成。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)1有或無(wú)BKG作為佐劑，接種腫瘤的劑量發(fā)現(xiàn)。
將總共14組小鼠(每組由5只小鼠組成)(C57 BL/6(H2Kb))用增加劑量的接種腫瘤免疫(14組中每2組接受相同劑量的接種腫瘤)。所述接種腫瘤由輻射的表達(dá)卵清蛋白的同種異基因J558腫瘤細(xì)胞(H2Kb)組成，其通過(guò)s.c.注射。在7組中，將腫瘤細(xì)胞與劑量為1×106CFU的BKG一起注射。一周以及5，9和13周后，從動(dòng)物采取0.5ml血液，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色方法檢測(cè)卵清蛋白-特異的免疫反應(yīng)。使用總共7種有或無(wú)BKG的不同的接種腫瘤細(xì)胞劑量。所述劑量分別為0,1×106，0,5×106，1,0×106，5,0×106，10,0×106，50,0×106，100×106，其中與人類臨床試驗(yàn)相對(duì)應(yīng)使用具有10×106-300×106個(gè)細(xì)胞的優(yōu)選范圍的劑量。在總共2個(gè)對(duì)照組中的小鼠不接受接種腫瘤。一個(gè)對(duì)照組接受BKG注射。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)2檢測(cè)腫瘤B16OVA黑素瘤的劑量發(fā)現(xiàn)在這一試驗(yàn)中，4組小鼠(C57 BL/6(H2Kb))接受增加劑量的檢測(cè)腫瘤(B16OVA黑素瘤s.c.)。監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)到腫瘤體積達(dá)到2cm。一旦達(dá)到這一腫瘤體積，將小鼠處死，收集和保持血液和腫瘤物質(zhì)用于體外分析。如果不存在腫瘤生長(zhǎng)，12周后將小鼠處死。同樣，每組由5只小鼠組成，其中使用4種不同的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞劑量，即1,0×106個(gè)細(xì)胞，5,0×106，10,0×106和50,0×106個(gè)細(xì)胞。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)3確定佐劑劑量基于在預(yù)備實(shí)驗(yàn)1中確定的劑量，變化BKG的劑量，其中佐劑的劑量與用于預(yù)備實(shí)驗(yàn)1的劑量相比，以10，100和1000以及0,1，0,01和0,001的系數(shù)而變化。在1周以及5，9和13周后，從動(dòng)物采集0.5ml血液，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色方法而檢測(cè)卵清蛋白-特異的免疫反應(yīng)。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)4關(guān)于施用模式的研究在預(yù)備實(shí)驗(yàn)1中確定的接種腫瘤細(xì)胞的劑量和在預(yù)備實(shí)驗(yàn)3中確定的BKG的劑量隨著施用模式而變化。施用模式為靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和身體同側(cè)的s.c.。對(duì)于每種施用模式，BKG的劑量是預(yù)備實(shí)驗(yàn)3中定義的劑量的1倍，0.1倍或0.01倍。本文所檢測(cè)的施用模式類似于用于人的潛在的臨床應(yīng)用，并且隨著最先與佐劑接觸的免疫系統(tǒng)的compartment而不同。在1周以及5，9和13周后，從動(dòng)物采集0.5ml血液，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色方法而檢測(cè)卵清蛋白-特異的免疫反應(yīng)。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)5關(guān)于免疫方案的研究使用在預(yù)備實(shí)驗(yàn)1中確定的接種腫瘤細(xì)胞的劑量和在預(yù)備實(shí)驗(yàn)3中確定的BKG劑量，檢驗(yàn)下述免疫方案1.免疫方案1 單次同時(shí)注射接種腫瘤和佐劑(對(duì)照組)2.免疫方案2 本方案與一些疾病如麻疹的預(yù)防性免疫相對(duì)應(yīng)，其中有3次基本的免疫和1次增強(qiáng)，其中所述基本免疫在開(kāi)始時(shí)、2周和4周后進(jìn)行，并且再過(guò)6周后施行增強(qiáng)。
3.免疫方案3 本方案與證明對(duì)于治療性接種是重要的方案相對(duì)應(yīng)，所述治療性接種以不同的接種時(shí)間間隔與疫苗的當(dāng)前應(yīng)用一起使用。更具體地，可以確定下列3種亞方案。
免疫方案3a 每3周接種(在12周后進(jìn)行最后的血液取樣并處死)；免疫方案3b 每6周接種(在25周后進(jìn)行最后的血液取樣并處死)；免疫方案3c 每12周接種(在43周后進(jìn)行最后的血液取樣并處死)。
重復(fù)所有3種免疫方案，其中佐劑BKG的劑量為在預(yù)備實(shí)驗(yàn)3中確定的劑量，或者所述劑量的10倍或0.1倍。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)6有或無(wú)BKG的接種腫瘤(TRAMP)的劑量發(fā)現(xiàn)將總共12組TRAMP小鼠(Jackson Laboratory Lines Nos.003135)接種0.1倍，1倍和10倍劑量的文獻(xiàn)中定義的TRAMP-C1接種腫瘤細(xì)胞(5×106個(gè)細(xì)胞)。所述接種腫瘤細(xì)胞沒(méi)有任何遺傳修飾(wtTRAMP)而進(jìn)行使用，或者作為IL-2/IFNγ轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行使用。使用5×105，5×106和5×107個(gè)TRAMP細(xì)胞，對(duì)小鼠進(jìn)行s.c.免疫。6組接受作為活性佐劑的1×106CFUBKG以及腫瘤細(xì)胞。免疫后1周和之后每6周后，取樣0.5ml血液，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色而確定TRAMP-C1-特異的免疫反應(yīng)。為了監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展，每12周進(jìn)行CT。為了避免不必要的折磨，在32-35周齡，將患有無(wú)影響的(uneffected)前列腺癌疾病的TRAMP小鼠處死。為了研究由于接種是否可以觀察到疾病進(jìn)展的變化，小鼠應(yīng)該觀察到第40周。
預(yù)備實(shí)驗(yàn)7關(guān)于佐劑劑量的研究在預(yù)備實(shí)驗(yàn)6中確定的接種腫瘤細(xì)胞的劑量隨著B(niǎo)KG劑量而變化(在預(yù)備實(shí)驗(yàn)6中確定的BKG劑量的0.1倍、1倍和10倍)。與預(yù)備實(shí)驗(yàn)6相似，檢測(cè)了wtTRAMP-C1和遺傳加工的IL-2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞。免疫后1周和隨后的每6周，從動(dòng)物采集0.5ml血液樣品，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色而確定TRAMP-C1特異的免疫反應(yīng)。每12周進(jìn)行一次CT，以便監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。在第40周進(jìn)行最后的血液取樣和處死。
實(shí)驗(yàn)1使用卵清蛋白系統(tǒng)的預(yù)防性腫瘤接種以在預(yù)備實(shí)驗(yàn)1確定的劑量，將C57BL/6小鼠(H2Kb)用接種腫瘤細(xì)胞，即，輻射的卵清蛋白-表達(dá)同種異基因J558腫瘤細(xì)胞(H2Kb)進(jìn)行免疫。一些動(dòng)物接受活性佐劑BKG(在預(yù)備實(shí)驗(yàn)3中確定的劑量)和接種腫瘤。一周后，從動(dòng)物采集0.5ml血液樣品，并且通過(guò)ELISA、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色或四聚體染色而確定卵清蛋白特異的免疫反應(yīng)。再過(guò)4周后，通過(guò)使用與預(yù)備實(shí)驗(yàn)2中確定的劑量相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞劑量，s.c.注射表達(dá)卵清蛋白的B16腫瘤細(xì)胞并且規(guī)律地控制腫瘤生長(zhǎng)的方法，而確定免疫系統(tǒng)針對(duì)活的腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性。
另外，將BKG對(duì)腫瘤-特異性免疫反應(yīng)增加的影響與野生型BCG細(xì)菌相比較。作為一種施用模式，在預(yù)備實(shí)驗(yàn)4中確定的最佳模式與在預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的2種最優(yōu)免疫方案組合應(yīng)用，所述最優(yōu)免疫方案包括最佳致敏增強(qiáng)方案和最佳連續(xù)應(yīng)用方案。
實(shí)驗(yàn)2使用卵清蛋白系統(tǒng)的治療性腫瘤接種與在實(shí)驗(yàn)1中報(bào)道的預(yù)防性腫瘤免疫相反，使用在預(yù)備實(shí)驗(yàn)2中確定的劑量，通過(guò)s.c.注射未輻射的檢測(cè)腫瘤細(xì)胞，而在C57BL/6小鼠(H2Kb)中生成腫瘤生長(zhǎng)。一旦腫瘤具有0.5cm的直徑，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)1中描述的接種方案。當(dāng)腫瘤達(dá)到2cm的直徑時(shí)，停止檢測(cè)。然而，動(dòng)物監(jiān)測(cè)持續(xù)最多1年。為了反映發(fā)生的免疫學(xué)過(guò)程，每4周從小鼠采樣0.5ml血液，以確定實(shí)驗(yàn)1中定義的免疫應(yīng)答。
實(shí)驗(yàn)3預(yù)防性腫瘤接種(TRAMP)在第6到第7周，TRAMP小鼠首次表現(xiàn)出上皮內(nèi)瘤形成，從第15周開(kāi)始表現(xiàn)出顯著的前列腺癌臨床圖片。開(kāi)始時(shí)，這樣的前列腺癌是局部限制性的，但是從第24周開(kāi)始，大約10％的動(dòng)物發(fā)生了轉(zhuǎn)移，并且從第32-35周開(kāi)始，可以預(yù)計(jì)嚴(yán)重的疾病病況。預(yù)防性腫瘤接種從第5周開(kāi)始。使用無(wú)佐劑和有佐劑的接種腫瘤細(xì)胞的單次注射。致死性輻射的TRAMP-C1細(xì)胞用作接種腫瘤細(xì)胞，其是來(lái)源于TRAMP小鼠的前列腺癌細(xì)胞系。接種腫瘤細(xì)胞沒(méi)有進(jìn)行遺傳加工(wtTRAMP)而應(yīng)用或者作為IL-2/IFNγ-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞而應(yīng)用。另外，檢測(cè)預(yù)備實(shí)驗(yàn)中確定的兩種最佳免疫方案(致敏增強(qiáng)方案和長(zhǎng)期方案)。為了控制Pca發(fā)展，每12周動(dòng)物應(yīng)該進(jìn)行CT。可以確定下列各組HV3.1沒(méi)有接種(對(duì)照組)HV3.2只s.c.接種腫瘤(wtTRAMP-C1細(xì)胞)
HV3.3s.c.BKG疫苗(wtTRAMP-C1細(xì)胞+BKG)HV3.4s.c.BCG疫苗(wtTRAMP-C1細(xì)胞+BCG)HV3.5只有接種腫瘤(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.6BKG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.7BCG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.8只有接種腫瘤(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV3.9BKG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV3.10 BCG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV3.11 只s.c.接種腫瘤(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞)HV3.12 s.c.BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞+BKG)HV3.13 s.c.BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞+BCG)HV3.14 只有接種腫瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.15 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.16 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV3.17 只有接種腫瘤(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV3.18 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV3.19 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫組HV3.2-HV3.4和HV3.11-HV3.13的免疫方案如圖2所述，數(shù)字代表1小鼠的出生；第-5周2接種；時(shí)間0(5周齡的小鼠)31周后血液取樣47周后血液取樣
513周后血液取樣和CT619周后血液取樣725周后血液取樣和CT831周后血液取樣937周后血液取樣和CT1040周后血液取樣和小鼠的處死組HV3.5-HV3.7和HV3.14-HV3.16的免疫方案如圖3所述，數(shù)字代表1小鼠的出生；第-2周2接種；時(shí)間0(致敏I)31周后血液取樣42周后接種(致敏II)54周后接種(致敏III)(在6周齡)65周后血液取樣710周后接種(增強(qiáng)接種)(在12周齡)8增強(qiáng)接種后1周血液取樣和CT9增強(qiáng)接種后7周血液取樣10增強(qiáng)接種后13周血液取樣和CT11增強(qiáng)接種后19周血液取樣12增強(qiáng)接種后25周血液取樣和CT13增強(qiáng)接種后28周血液取樣(在40周齡)和小鼠的處死組HV3.8-HV3.10和HV3.17-HV3.19的免疫方案如圖4所述，數(shù)字代表1小鼠的出生；第-2周2第1次接種；時(shí)間031周后血液取樣46周后第2次接種(接種的時(shí)間間隔在預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定)51周后血液取樣
612*周后第3次接種71周后血液取樣和CT818*周后第4次接種91周后血液取樣1024*周后第5次接種111周后血液取樣和CT1230*周后第6次接種131周后血液取樣146周后血液取樣1540周后血液取樣和小鼠的處死*接種的時(shí)間間隔取決于預(yù)備實(shí)驗(yàn)5的結(jié)果實(shí)驗(yàn)4治療性腫瘤接種(TRAMP)在15周齡，所有的TRAMP小鼠發(fā)展了前列腺腫瘤，其在第32周完全發(fā)展并且對(duì)動(dòng)物引起臨床問(wèn)題。因此，動(dòng)物應(yīng)該在第24周進(jìn)行免疫。一旦實(shí)現(xiàn)一條終止標(biāo)準(zhǔn)，就停止實(shí)驗(yàn)。最多動(dòng)物應(yīng)該監(jiān)測(cè)40周。為了監(jiān)測(cè)免疫學(xué)過(guò)程，每6周從小鼠采集0.5ml血樣，并且每12周，聯(lián)系實(shí)驗(yàn)1所述研究免疫應(yīng)答，并且使用成像方法，諸如CT。使用與聯(lián)系實(shí)驗(yàn)3所述的相同的腫瘤細(xì)胞。
檢測(cè)了下列各組。
HV4.1 沒(méi)有接種(對(duì)照組)HV4.2 只s.c.接種腫瘤(wtTRAMP-C1細(xì)胞)HV4.3 s.c.BKG疫苗(wtTRAMP-C1細(xì)胞+BKG)HV4.4 s.c.BCG疫苗(wtTRAMP-C1細(xì)胞+BCG)HV4.5 只有接種腫瘤(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.6 BKG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.7 BCG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.8 只有接種腫瘤(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV4.9 BKG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV4.10 BCG疫苗(wtTRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫
HV4.11 只s.c.接種腫瘤(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞)HV4.12 s.c.BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞+BKG)HV4.13 s.c.BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP-C1細(xì)胞+BCG)HV4.14 只有接種腫瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.15 BKG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.16 BCG疫苗(IL2/IFNγ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的致敏增強(qiáng)HV4.17 只有接種腫瘤(IL2/IFNγ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV4.18 BKG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫HV4.19 BCG疫苗(IL2/IFN γ-TRAMP)作為預(yù)備實(shí)驗(yàn)5中確定的長(zhǎng)期免疫圖5顯示用于組HV4.2-HV4.4和HV4.11-HV4.13的免疫方案1，數(shù)字代表1小鼠的出生26周后血液取樣312周后血液取樣和CT418周后血液取樣524周后接種625周后血液取樣和CT730周后血液取樣836周后血液取樣和CT940周后血液取樣和小鼠的處死圖6顯示用于組HV4.5-HV4.7和HV4.14-HV4.16的免疫方案2，數(shù)字代表
1小鼠的出生26周后血液取樣312周后血液取樣和CT418周后血液取樣524周后接種(致敏I)625周后血液取樣和CT726周后接種(致敏II)828周后接種(致敏III)930周后血液取樣1034周后接種(增強(qiáng)接種)1136周后血液取樣和CT1240周后血液取樣和小鼠的處死圖7顯示用于組HV4.8-HV4.10和HV4.17-HV4.19的免疫方案3，數(shù)字代表1小鼠的出生26周后血液取樣312周后血液取樣和CT418周后血液取樣524周后接種(致敏I)625周后血液取樣和CT730周后接種(致敏II)831周后血液取樣936周后接種(致敏III)1037周后血液取樣和CT1142周后接種(致敏IV)1243周后血液取樣和小鼠的處死接種的時(shí)間間隔優(yōu)選地取決于預(yù)備實(shí)驗(yàn)5的結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)3治療前列腺癌的組合物適于治療前列腺癌的組合物包含作為第一成分的BCG，其表達(dá)單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(Hly)的吞噬溶酶體逃逸肽并且是ure C-缺陷型的。這樣的修飾BCG在本文中還叫作rBCG:ΔureC:Hly。所述組合物包含作為第二成分的遺傳加工的LNCaP細(xì)胞。這些細(xì)胞是表達(dá)重組白介素-2(IL2)和干擾素-γ(IFNγ)的前列腺癌細(xì)胞。優(yōu)選地，這樣的LNCaP細(xì)胞以大約等摩爾的方式表達(dá)兩種細(xì)胞因子。這種LNCaP細(xì)胞如在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 94/18995中所述。將這樣的重組前列腺癌細(xì)胞用γ射線輻射，以便破壞它們?cè)谑褂弥暗膹?fù)制能力。
將兩種成分懸浮在磷酸緩沖鹽溶液中，并且準(zhǔn)備給患者施用。所述組合物含有1×106個(gè)BCG細(xì)胞和1×106個(gè)LNCaP細(xì)胞，包含在50μl中。i.v.注射所述組合物。為了檢測(cè)功效，進(jìn)行ELISPOT分析。這樣的ELISPOT分析如在Mollenkopf H.J.，Dietrich G.，F(xiàn)ensterle J.，Grode L.，Diehl K.D.，Knapp B.，Singh M.，O’Hagan D.T.，Ulmer J.B.，和Kaufmann S.H.Enhancedprotective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine by adsorption onto cationicPLG microparticles.Vaccine.2004 Jul 29；22(21-22)2690-5中所述。
在一個(gè)備選的治療方案中，前面提及的組合物施用一次，之后再僅施用LNCaP細(xì)胞。在這一范圍內(nèi)，所述第一和第二成分可以以不同的頻率和按照不同的時(shí)間模式進(jìn)行施用，這是本發(fā)明的基本原理。
登記臨床檢測(cè)組織學(xué)和臨床腫瘤病期以及進(jìn)行這樣的治療的患者的健康狀況。一個(gè)替代的參數(shù)是PSA水平的進(jìn)程(course)以及具有有利的PSA水平進(jìn)程的患者人數(shù)。
由于給患者施用獨(dú)特的組合，將觀察到PSA水平和提高的存活率的有利進(jìn)程，與沒(méi)有佐劑，即只施用LNCaP細(xì)胞時(shí)觀察到的效果相比，其更高。
實(shí)驗(yàn)4使用BKG作為HCMV疫苗的佐劑本實(shí)例報(bào)道本文所述的作為佐劑的BKG和HCMV密體的成功組合，以便誘導(dǎo)針對(duì)人巨細(xì)胞病毒感染的細(xì)胞免疫。更具體地，據(jù)報(bào)道，所述細(xì)胞免疫可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)。在進(jìn)行骨髓移植的患者中，這樣快速的HCMV免疫誘導(dǎo)特別重要，所述骨髓移植很經(jīng)常地伴隨著威脅生命的HCMV感染。對(duì)于移植患者，由于沒(méi)有時(shí)間按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的接種，所以存在對(duì)快速產(chǎn)生細(xì)胞免疫的需求。
使用下列接種方案抗原 密體劑量20μg/動(dòng)物免疫方案D第0/7/21天C第0/7天B第0天佐劑 劑量1×106/動(dòng)物免疫方案第0天組的結(jié)構(gòu)
在最后一次免疫后，分別每8和9天進(jìn)行準(zhǔn)備。
結(jié)果在圖8和9中描述，其中圖9是描述當(dāng)用HCMV-特異性肽混合物(來(lái)自JPT Peptide Technologies GmbH，Berlin，Germany)刺激時(shí)，每105個(gè)CD8+T細(xì)胞IFN-γ-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目的圖表。所述序列來(lái)自HCMV pp65蛋白。它是138種表現(xiàn)出11個(gè)氨基酸重疊的肽(每種15個(gè)氨基酸)的混合物(預(yù)混合物)。圖8是與圖9相似的圖表，其中當(dāng)用非特異性對(duì)照肽刺激時(shí)，確定CD8+T細(xì)胞的代表性數(shù)目。如果在初始接種時(shí)將BKG用作佐劑，在每一情形中，可以從所述圖得出每105CD8的IFN-γ-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。T細(xì)胞顯著地增加。最顯著的增加可以在組B2和C2中觀察到。這意味著，用BKG與密體組合的基本接種，其中密體在第0天和7天后施用，已經(jīng)足以顯著地增加IFN-γ-陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。這證實(shí)了本發(fā)明潛在的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組合密體和BKG時(shí)，可以誘導(dǎo)針對(duì)HCMV的細(xì)胞免疫。
實(shí)驗(yàn)5治療和預(yù)防瘧疾的組合物用于治療和預(yù)防瘧疾的組合物包括作為第一成分的rBCG:ΔureC:Hly和作為第二成分的瘧疾抗原gp190/MSP1。應(yīng)該意識(shí)到，所述抗原可以作為肽或者更大的肽、多肽或甚至是蛋白的片段而存在。
在50μl PBS緩沖液中，所述組合物包括50μg的MSP1蛋白和大約1×106rBCG:ureC:Hly。將所述組合物s.c.施用給小鼠。免疫后，收集免疫小鼠的脾和血液并且用于分析方法中。
使用ELISPOT技術(shù)(Mollenkopf H.J.，同前所述)和裂殖子侵入-抑制檢測(cè)(Merozoite invasion-inhibition assay)(Blackman等.1990 J.Exp.Med.Volume 172 P379-382)，再監(jiān)測(cè)接種過(guò)程的進(jìn)展。在用MSP-1特異性肽刺激后，我們預(yù)測(cè)提高的免疫刺激和IFN-γ分泌。我們還預(yù)測(cè)由從免疫小鼠收集的血清誘導(dǎo)的侵入-抑制。IFN-γELISPOT和裂殖子-抑制結(jié)果與保護(hù)性有關(guān)。
在說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求、序列表和/或附圖中公開(kāi)的本發(fā)明的特征，獨(dú)立地和以它們的任何組合，可以是以其各種方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。
序列表<110>疫苗工程管理有限公司<120>細(xì)菌細(xì)胞和生物活性劑的組合<130>V 10001 PCT<140>
<141>
<150>
<151>
<160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1881<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述重組核酸分子<220>
<223>包括吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域(211-1722 nt)和終止密碼子(1879-1881)的CDS<400>1atgacagacg tgagccgaaa gattcgagct tggggacgcc gattgatgat cggcacggca60gcggctgtag tccttccggg cctggtgggg cttgccggcg gagcggcaac cgcgggcgcg120ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcagtctg caaagcaatc cgctgcaaat180aaattgcact cagcaggaca aagcacgaaa gatgcatctg cattcaataa agaaaattca240atttcatcca tggcaccacc agcatctccg cctgcaagtc ctaagacgcc aatcgaaaag300aaacacgcgg atgaaatcga taagtatata caaggattgg attacaataa aaacaatgta360ttagtatacc acggagatgc agtgacaaat gtgccgccaa gaaaaggtta caaagatgga420aatgaatata ttgttgtgga gaaaaagaag aaatccatca atcaaaataa tgcagacatt480caagttgtga atgcaatttc gagcctaacc tatccaggtg ctctcgtaaa agcgaattcg540gaattagtag aaaatcaacc agatgttctc cctgtaaaac gtgattcatt aacactcagc600attgatttgc caggtatgac taatcaagac aataaaatcg ttgtaaaaaa tgccactaaa660tcaaacgtta acaacgcagt aaatacatta gtggaaagat ggaatgaaaa atatgctcaa720gcttatccaa atgtaagtgc aaaaattgat tatgatgacg aaatggctta cagtgaatca780caattaattg cgaaatttgg tacagcattt aaagctgtaa ataatagctt gaatgtaaac840ttcggcgcaa tcagtgaagg gaaaatgcaa gaagaagtca ttagttttaa acaaatttac900tataacgtga atgttaatga acctacaaga ccttccagat ttttcggcaa agctgttact960aaagagcagt tgcaagcgct tggagtgaat gcagaaaatc ctcctgcata tatctcaagt1020gtggcgtatg gccgtcaagt ttatttgaaa ttatcaacta attcccatag tactaaagta1080aaagctgctt ttgatgctgc cgtaagcgga aaatctgtct caggtgatgt agaactaaca1140aatatcatca aaaattcttc cttcaaagcc gtaatttacg gaggttccgc aaaagatgaa1200gttcaaatca tcgacggcaa cctcggagac ttacgcgata ttttgaaaaa aggcgctact1260tttaatcgag aaacaccagg agttcccatt gcttatacaa caaacttcct aaaagacaat1320gaattagctg ttattaaaaa caactcagaa tatattgaaa caacttcaaa agcttataca1380gatggaaaaa ttaacatcga tcactctgga ggatacgttg ctcaattcaa catttcttgg1440gatgaagtaa attatgatcc tgaaggtaac gaaattgttc aacataaaaa ctggagcgaa1500aacaataaaa gcaagctagc tcatttcaca tcgtccatct atttgccagg taacgcgaga1560aatattaatg tttacgctaa agaatgcact ggtttagctt gggaatggtg gagaacggta1620attgatgacc ggaacttacc acttgtgaaa aatagaaata tctccatctg gggcaccacg1680ctttatccga aatatagtaa taaagtagat aatccaatcg aatatgcatt agcctatgga1740agtcagggtg atcttaatcc attaattaat gaaatcagca aaatcatttc agctgcagtt1800ctttcctctt taacatcgaa gctacctgca gagttcgtta ggcgcggatc cggaattcga1860
agcttatcga tgtcgacgta g 1881<210>2<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述核酸序列1相應(yīng)的氨基酸序列<400>2Met Thr Asp Val Ser Arg Lys Ile Arg Ala Trp Gly Arg Arg Leu Met1 5 10 15Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Val Gly Leu Ala20 25 30Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val35 40 45Glu Tyr Leu Gln Ser Ala Lys Gln Ser Ala Ala Asn Lys Leu His Ser50 55 60Ala Gly Gln Ser Thr Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys Glu Asn Ser65 70 75 80Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser Pro Lys Thr85 90 95Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr Ile Gln Gly100 105 110Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly Asp Ala Val115 120 125Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn Glu Tyr Ile130 135 140Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn Ala Asp Ile145 150 155 160Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Val165 170 175Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val Leu Pro Val180 185 190Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly Met Thr Asn195 200 205Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser Asn Val Asn210 215 220Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys Tyr Ala Gln225 230 235 240Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp Glu Met Ala245 250 255Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala Phe Lys Ala260 265 270
Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser Glu Gly Lys275 280 285Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr Asn Val Asn290 295 300Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys Ala Val Thr305 310 315 320Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn Pro Pro Ala325 330 335Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu Lys Leu Ser340 345 350Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Val355 360 365Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn Ile Ile Lys370 375 380Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Lys Asp Glu385 390 395 400Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp Ile Leu Lys405 410 415Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro Ile Ala Tyr420 425 430Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile Lys Asn Asn435 440 445Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp Gly Lys Ile450 455 460Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn Ile Ser Trp465 470 475 480Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val Gln His Lys485 490 495Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe Thr Ser Ser500 505 510Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr Ala Lys Glu515 520 525Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile Asp Asp Arg530 535 540Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp Gly Thr Thr545 550 555 560Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile Glu Tyr Ala565 570 575Leu Ala Tyr Gly Ser Gln Gly Asp Leu Asn Pro Leu Ile Asn Glu Ile580 585 590Ser Lys Ile Ile Ser Ala Ala Val Leu Ser Ser Leu Thr Ser Lys Leu595 600 605
Pro Ala Glu Phe Val Arg Arg Gly Ser Gly Ile Arg Ser Leu Ser Met610 615 620Ser Thr62權(quán)利要求
1.一種包括第一成分和第二成分的組合，其中所述第一成分是細(xì)菌細(xì)胞，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；其中所述第二成分是生物活性劑。
2.按照權(quán)利要求1的組合，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是脲酶-缺陷型的。
3.按照權(quán)利要求1或2的組合，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是分枝桿菌細(xì)胞。
4.按照權(quán)利要求3的組合，其中所述細(xì)胞是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)細(xì)胞。
5.按照權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)菌細(xì)胞的至少一種細(xì)胞脲酶亞基編碼核酸被滅活。
6.按照權(quán)利要求5的組合，其中至少細(xì)菌脲酶C亞基-編碼序列被滅活。
7.按照權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合，其中所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是利斯特氏菌吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
8.按照權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的組合，其中所述吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)域由選自包括下列各項(xiàng)的組的核酸分子編碼a)包括SEQ.ID.NO.1中顯示的核苷酸211-1.722的核苷酸序列；b)編碼同來(lái)自a)的序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列；和c)在嚴(yán)緊條件下與a)或b)的序列雜交的核苷酸序列。
9.按照權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)菌細(xì)胞包括至少一種編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的肽或多肽的重組核酸分子。
10.按照權(quán)利要求9的組合，其中所述肽或多肽選自自體抗原、腫瘤抗原、病毒抗原、寄生蟲(chóng)抗原、細(xì)菌抗原以及它們的免疫原性片段。
11.按照權(quán)利要求9或10的組合，其中所述肽或多肽是融合多肽的片段。
12.按照權(quán)利要求11的組合，其中所述融合多肽包括a)來(lái)自多肽的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中所述多肽結(jié)構(gòu)域能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答，和b)吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域。
13.按照權(quán)利要求12的組合，其中所述多肽是權(quán)利要求9定義的多肽或其片段。
14.按照權(quán)利要求12或13的組合，其中所述吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域是權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)定義的吞噬溶酶體逃逸結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域。
15.按照權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)菌細(xì)胞是rBCG:Hly或rBCGΔureC:Hly。
16.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是真核細(xì)胞，并且更優(yōu)選地是表達(dá)細(xì)胞因子的遺傳操作的真核細(xì)胞。
17.按照權(quán)利要求16的組合，其中所述細(xì)胞因子選自包括白介素-2、白介素-4、白介素-12和干擾素-γ的組。
18.按照權(quán)利要求17的組合，其中所述細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種或多種細(xì)胞因子。
19.按照權(quán)利要求18的組合，其中所述細(xì)胞同時(shí)表達(dá)IL-2和干擾素-γ。
20.按照權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)胞相對(duì)于施用或者要施用所述細(xì)胞和/或組合物的受試者是自體同源性的。
21.按照權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)胞相對(duì)于施用或者要施用所述細(xì)胞和/或組合物的受試者是同種異基因性的。
22.按照權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)胞選自包括非專職抗原呈遞細(xì)胞、專職抗原呈遞細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞的組。
23.按照權(quán)利要求22的組合，其中所述腫瘤細(xì)胞是免疫原性腫瘤，并且其中所述腫瘤細(xì)胞優(yōu)選地選自包括黑素瘤細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、乳腺瘤細(xì)胞、腦瘤細(xì)胞、前列腺腫瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和頭頸鱗狀腫瘤的組。
24.按照權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)胞是同種異基因型細(xì)胞，并且是與I類HLA匹配的。
25.按照權(quán)利要求16-24中任一項(xiàng)的組合，其中所述細(xì)胞表達(dá)另外的免疫分子，所述免疫分子選自包括下列各項(xiàng)的組細(xì)胞因子、黏著分子、共刺激性因子、腫瘤相關(guān)的抗原、腫瘤特異性抗原和寄生蟲(chóng)抗原。
26.按照權(quán)利要求25的組合，其中所述寄生蟲(chóng)抗原是瘧原蟲(chóng)，優(yōu)選惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)的gp190/MSP1蛋白，或其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
27.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是瘧原蟲(chóng)，優(yōu)選惡性瘧原蟲(chóng)的gp190/MSP1蛋白，或其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
28.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是人巨細(xì)胞病毒。
29.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是病毒顆?；蚱淙后w，其優(yōu)選地在人巨細(xì)胞病毒感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后釋放，其中所述顆粒(a)被脂膜包圍，病毒糖蛋白內(nèi)含在脂膜中，并且(b)不含病毒DNA，也不含殼體。
30.按照權(quán)利要求29的組合，其中所述顆粒包含融合蛋白，所述融合蛋白包括T-細(xì)胞抗原pp65(UL83)的一個(gè)或多個(gè)片段以及一種或多種非pp65蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段。
31.按照權(quán)利要求30的組合，其中所述T-細(xì)胞抗原pp65與人巨細(xì)胞病毒糖蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段融合，其中所述糖蛋白選自包括HCMV糖蛋白gH、HCMV蛋白IE1(ppUL123)和HCMV糖蛋白gB的組。
32.按照權(quán)利要求30的組合，其中所述T-細(xì)胞抗原融合到蛋白的一個(gè)或多個(gè)片段上，所述蛋白為除了HCMV以外的人病原體片段。
33.按照權(quán)利要求32的組合，其中所述病原體選自包括HIV-1、HBV、HCV和流感的組。
34.按照權(quán)利要求29-33的組合，其中所述顆粒包含至少兩種糖蛋白的片段，所述糖蛋白是來(lái)自不同HCMV毒株的特別的糖蛋白的變體。
35.按照權(quán)利要求34的組合，其中兩種特別的HCMV糖蛋白變體中的一種是HCMV Towne毒株的變體，另一種是HCMV Ad169毒株的變體。
36.按照權(quán)利要求29-35中任一項(xiàng)的組合，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，優(yōu)選地是包皮成纖維細(xì)胞。
37.按照權(quán)利要求29-36中任一項(xiàng)的組合，其中所述顆粒是密體。
38.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是密體，優(yōu)選地是HCMV的密體，或者按照權(quán)利要求37的密體。
39.按照權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合，其中所述生物活性劑是分枝桿菌的抗原，優(yōu)選地是分枝桿菌亞種的抗原。
40.按照權(quán)利要求39的組合，所述分枝桿菌選自包括結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)、M.canettii、非洲分枝桿菌(M.africanum)和副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)的組。
41.按照權(quán)利要求39和40的組合，其中所述抗原是抗原85。
42.組合物，優(yōu)選地藥物組合物，其包括按照權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的組合，以及任選地藥用載體。
43.按照權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的組合，按照權(quán)利要求42的組合物或者這樣的組合的每一成分用于制備藥物的應(yīng)用。
44.按照權(quán)利要求43的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療和/或預(yù)防選自包括癌癥和傳染性疾病的組的疾病。
45.按照權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述癌癥是免疫原性腫瘤，并且更優(yōu)選地選自包括前列腺癌、黑素瘤、腎癌、乳腺瘤、腦瘤、非小肺癌、結(jié)腸癌、和頭頸鱗狀腫瘤的組。
46.按照權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述傳染性疾病是瘧疾。
47.按照權(quán)利要求46的應(yīng)用，其中所述生物活性劑是瘧原蟲(chóng)的gp190/MSP1蛋白或其能夠在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答的片段。
48.按照權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述傳染性疾病是HCMV感染。
49.按照權(quán)利要求48的應(yīng)用，其中所述生物活性劑是在任一前述權(quán)利要求中定義的密體。
50.按照權(quán)利要求44的應(yīng)用，其中所述傳染性疾病是結(jié)核病。
51.按照權(quán)利要求50的應(yīng)用，其中所述生物活性劑是分枝桿菌的抗原，優(yōu)選地是分枝桿菌亞種的抗原。
52.按照權(quán)利要求51的應(yīng)用，其中所述分枝桿菌選自包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、M.canettii、非洲分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌的組。
53.按照權(quán)利要求51或52的任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述抗原是抗原85。
54.按照權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的組合或者這樣的組合的每一成分用于制備治療性和/或預(yù)防性疫苗的應(yīng)用。
55.一種治療患有疾病并且需要這樣的治療的患者的方法，其包括施用按照權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的組合或按照權(quán)利要求42的藥物組合。
56.一種制備藥物組合，優(yōu)選地按照權(quán)利要求42的藥物組合物的方法，其包括步驟-提供細(xì)菌細(xì)胞作為第一成分，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；-提供生物活性劑作為第二成分；和-將所述第一成分和第二成分配制成藥物組合物。
57.一種制備藥物組合，優(yōu)選地按照權(quán)利要求42的藥物組合物的方法，其包括步驟-提供細(xì)菌細(xì)胞作為第一成分，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；-提供生物活性劑作為第二成分；和-獨(dú)立地配制第一成分和第二成分。
58.按照權(quán)利要求57的方法，其中所配制的第一成分和所配制的第二成分包裝在一個(gè)包裝中。
59.按照權(quán)利要求57的方法，其中所配制的第一成分和所配制的第二成分包裝在獨(dú)立的包裝中。
60.按照權(quán)利要求58和59中任一項(xiàng)的方法，其中所述包裝是單一劑型或包括多個(gè)單一劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及包括第一成分和第二成分的組合，其中所述第一成分是細(xì)菌細(xì)胞，其包括至少一種編碼吞噬溶酶體逃逸肽或多肽的重組核酸分子；其中所述第二成分是生物活性劑。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101048178SQ200580036326
公開(kāi)日2007年10月3日 申請(qǐng)日期2005年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者阿爾布雷希特·勞費(fèi)爾, 貝恩德·艾澤勒, 萊安德·格羅德 申請(qǐng)人:疫苗工程管理有限公司