專利名稱：多價(jià)禽流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于接種面對(duì)疾病爆發(fā)的易感禽類的新穎多價(jià)禽流感疫苗。本發(fā)明亦涉及用于預(yù)防或減輕家禽中禽流感病毒性疾病的新穎方法。
背景技術(shù)：
禽流感，亦稱為“AI”，為一急性且高觸染性的皺雞及其它家禽病毒性感染。作為一流感病毒，可基于血凝素(HA；亦可縮寫為H)及神經(jīng)氨酸酶(NA；亦可縮寫為N)分子(隨季節(jié)轉(zhuǎn)換而重排或變異)的抗原差異將其分成多個(gè)亞型。因其不斷地發(fā)生變異，故疫苗制備由于在隨后季節(jié)中將會(huì)出現(xiàn)的病毒株種類的不確定性而難于實(shí)現(xiàn)。用于疫苗制備的病毒株通常不會(huì)在生產(chǎn)條件下以很快的速度復(fù)制，因此，等待一特定病毒株出現(xiàn)并隨后生產(chǎn)恰當(dāng)?shù)囊呙鐏?lái)防止所述病毒株不能提供可行的選擇。通常，特定病毒株的流行病將流行數(shù)月，并隨后可能消失數(shù)年。
消滅法是控制禽類疾病的主要方法，且無(wú)顯著的經(jīng)濟(jì)損失，但是若可生產(chǎn)一種具有快速的免疫性起始的疫苗，則此產(chǎn)品可為大批屠殺整個(gè)禽群提供一可能的替代方法。
已知流感病毒可根據(jù)病毒攜帶的群抗原以不同的A、B、C拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分類。A、B、C型的流感病毒可基于可在病毒核衣殼(NP)及基質(zhì)(M)蛋白中發(fā)現(xiàn)的抗原差異而相互區(qū)別。具體而言，基于血凝素(HA)及神經(jīng)氨酸酶(NA)分子中的抗原差異可將A型流感病毒分成多個(gè)亞型。當(dāng)前，已經(jīng)鑒別出9種亞型的神經(jīng)氨酸酶NA蛋白，命名為NA 1至NA 9，及15種不同亞型的血清血凝素HA蛋白，命名為HA 1至HA 15。在鳥(niǎo)類中，攜帶任一所述不同HA(或H)及NA(或N)亞型的病毒皆已經(jīng)分離出來(lái)。
HA為一包含約560個(gè)氨基酸并可代表總病毒蛋白的25的病毒表面糖蛋白。其在感染初期主要負(fù)責(zé)病毒顆粒與宿主細(xì)胞的粘附并負(fù)責(zé)其向后者中的侵入。在病毒蛋白質(zhì)中，血凝素為最容易出現(xiàn)翻譯后重排者。當(dāng)其合成完成后，所述分子遵循宿主細(xì)胞的外釋途徑，在此期間，HA發(fā)生折疊，在三聚體中進(jìn)行組裝并進(jìn)行糖基化。最后，其分離為兩個(gè)亞單位H1及H2；此分離在所述分子的活化中及在病毒體的感染能力的獲得中是關(guān)鍵步驟。
事實(shí)上，人們已熟知，分離位點(diǎn)的不同組合(關(guān)于基本的氨基酸殘基)可轉(zhuǎn)化成禽流感病毒產(chǎn)生定域的、或癥狀性的感染、或(反過(guò)來(lái))對(duì)于許多禽類而言具有一致命結(jié)果的全身性感染的能力。因此，已有人建議，此事實(shí)可能影響所述病毒的器官取向性、宿主特異性、以及致病力。就所述病毒的致病性而言，具有多基位點(diǎn)HA的病毒株可發(fā)現(xiàn)分離HO分子的蛋白酶，在多個(gè)細(xì)胞類型中呈活性形式H1及H2，因此導(dǎo)致產(chǎn)生大量的感染性病毒顆粒的多個(gè)感染循環(huán)并導(dǎo)致感染在短期內(nèi)擴(kuò)大到所有區(qū)域(HPAI病毒株)。所述感染隨后結(jié)果是具有一急性-超急性期，具有極高的死亡率。
神經(jīng)氨酸酶(NA)代表流感A病毒的第二膜糖蛋白，其由一編碼413個(gè)氨基酸肽的1413個(gè)核苷酸長(zhǎng)的基因(病毒RNA的片段6)編碼。此蛋白具有至少兩種重要的功能通過(guò)在唾液酸分子與血凝素自身之間分開(kāi)而破壞病毒血凝素的細(xì)胞受體。以此方式，猜想其可能通過(guò)防止新形成的病毒顆粒沿細(xì)胞膜積聚、以及促進(jìn)所述病毒穿過(guò)粘膜表面上存在的粘液的轉(zhuǎn)運(yùn)而減輕病毒子代的釋放作用。NA此外還代表一重要的易發(fā)生抗原變異的抗原決定簇。
當(dāng)前業(yè)內(nèi)需要可為消滅受感染禽群提供可用選擇的禽流感疫苗。此類疫苗需要在經(jīng)接種的禽類中引起一快速的免疫反應(yīng)，且優(yōu)選為可使經(jīng)接種鳥(niǎo)能與受感染鳥(niǎo)區(qū)別開(kāi)。人們已提出將雙價(jià)或多價(jià)流感疫苗可在所謂的“DIVA”方法中使用，其中投與一具有一與接種所針對(duì)的病毒株不同的N的疫苗，以便提供一將經(jīng)接種鳥(niǎo)與受感染鳥(niǎo)區(qū)別開(kāi)的方法。公開(kāi)的PCT WO 03/086453(其揭示內(nèi)容以引用的方式全部并入本文中)闡述DIVA技術(shù)及在其方法中可利用的某些代表性疫苗。
組合的或多價(jià)的疫苗可提供許多為單價(jià)疫苗所不具有的明顯益處。多價(jià)疫苗的一個(gè)益處是僅需要較少的疫苗接種。在單次接種中可投與單一制劑，且可有效地抑制多種疾病或單一疾病的多個(gè)病毒株。當(dāng)可能病毒株的范圍增加時(shí)，為最小化接種次數(shù)，疫苗的組合變得更加具有強(qiáng)制性。當(dāng)對(duì)疫苗實(shí)施組合時(shí)所需減小次數(shù)的接種應(yīng)最大可能地導(dǎo)致對(duì)接種程序表的增強(qiáng)的順應(yīng)性。此轉(zhuǎn)而應(yīng)最大可能地導(dǎo)致作為結(jié)果的疫苗覆蓋度的增加，此情況應(yīng)最終導(dǎo)致更佳的疾病控制。
對(duì)于組合疫苗未曾預(yù)料到的問(wèn)題是近期確認(rèn)的在組合疫苗中一種疫苗可能會(huì)對(duì)另一種疫苗具不利影響，所謂“抗原干擾效應(yīng)”。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)簡(jiǎn)單地將兩種現(xiàn)有疫苗混合時(shí)，一種或兩種皆可能會(huì)失去其效力(Andre，F(xiàn).E.，″Development of CombinedVaccinesManufacturers′Viewpoint，″Biologicals 22317-321(1994)；Hadler，S.C.，″Costbenefit of combining antigens，″Biologicals 22415-418(1994)；Goldenthal.K，L，等人，″Overview-Combination Vaccines and Simultaneous Administration.Past，Present，andFuture.″于Combined Vaccines and Simultaneous Administration，Current Issues andPerspectives(編輯Williams，J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第1頁(yè)XI-XV(1995)；Clemens，J.，等人，″Interactions between PRP-T Vaccine againstHemophilus influenzae Type b and Conventional Infant Vaccines Lessons for Future Studiesof Simultaneous Immunization and Combined Vaccines.″于Combined Vaccines andSimultaneous Administration.Current Issues and Perspectives(編輯Williams，J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第255-266頁(yè)(1995)；Insel，R.A.，″Potential Alterations in Immunogenicity by Combining or Simultaneously AdministeringVaccine Component，″.于Combined Vaccines and Simultaneous Administration.CurrentIssues and Perspectives(編輯Williams.J.C.，等人)The New York Academy of Sciences，New York，第35-47頁(yè)(1995))。
不幸的是，在實(shí)驗(yàn)室中使用當(dāng)前確定的效力測(cè)試法并不能總是預(yù)測(cè)出是否個(gè)別疫苗組份會(huì)保持其效力。舉例而言，多種獨(dú)立的研究報(bào)告，當(dāng)將Hib疫苗與全細(xì)胞百日咳疫苗組合時(shí)在兩種疫苗之間無(wú)干擾，但當(dāng)將Hib疫苗與非細(xì)胞百日咳疫苗組合時(shí)則Hib免疫原性具有實(shí)質(zhì)的損失。據(jù)顯示，當(dāng)將Hib與DTaP組合時(shí)，如果在分開(kāi)的位點(diǎn)給出那么其可保持其免疫原性，然而當(dāng)所用疫苗在相同位點(diǎn)組合投與時(shí)那么免疫原性低5至15倍。此未曾預(yù)料到的結(jié)果證實(shí)，組合兩種現(xiàn)有的疫苗可能不是簡(jiǎn)單的或常規(guī)的過(guò)程，且此組合經(jīng)常會(huì)得到在最初研究期間未檢測(cè)到的極不可預(yù)知的結(jié)果。證明無(wú)干擾性所需要的研究經(jīng)常會(huì)額外增加數(shù)月或數(shù)年研究來(lái)證明無(wú)干擾性及應(yīng)用適合性。
雙價(jià)禽流感疫苗已經(jīng)可在市場(chǎng)上獲得，例如由Merial銷售的名為Fluvac的疫苗，但是當(dāng)前仍需要經(jīng)改良的雙價(jià)或多價(jià)禽流感疫苗，其會(huì)引起快速的免疫反應(yīng)及更高的滴度反應(yīng)，且因此可利用其快速地保護(hù)面臨疾病爆發(fā)的鳥(niǎo)類。

發(fā)明內(nèi)容
一方面，本發(fā)明涉及一種有效預(yù)防或減輕禽流感的疫苗組合物，且其可在DIVA技術(shù)中使用，且其進(jìn)一步具有可提供快速免疫反應(yīng)起始的益處，其包括大于約200HA/劑、且最優(yōu)選在約250至300HA/劑范圍內(nèi)的HA/劑范圍。
因此，本發(fā)明提供一包含至少兩種禽流感病毒株的疫苗組合物，其中組合的HA/劑大于約200HA/劑，且優(yōu)選為為約250至300HA/劑。各禽流感病毒株的HA/劑的數(shù)量可變化，但通常至少約75HA/劑，且最優(yōu)選為大于約128HA/劑。
所選擇用于本發(fā)明雙價(jià)或多價(jià)疫苗的特定禽流感病毒株視所述疫苗擬施用區(qū)域中所流行的特定病毒株而定。最優(yōu)選為所述病毒株之一應(yīng)具有一與流行病毒株或激發(fā)病毒株的HA亞型相同的HA亞型，及一不同的N組份，以便容許使用DIVA技術(shù)。另外的病毒株可選自在擬治療區(qū)域中具有一發(fā)病率的其它HA亞型，優(yōu)選為具有不同的N亞型。
在本發(fā)明另一部分中，提供有一可有效預(yù)防或減輕禽流感病毒感染的疫苗組合物，其包含至少兩種滅活的禽流感病毒株，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約200HA/劑所述疫苗組合物，且其中各所述病毒株為至少約128HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒的相同的HA亞型，且其中至少一所述病毒株具有一與激發(fā)病毒不同的NA亞型。
本發(fā)明亦提供一種預(yù)防或減輕禽流感病毒感染爆發(fā)的方法，其包括向家禽成員投與一包含至少兩種滅活禽流感病毒株的疫苗組合物，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約200HA/劑所述疫苗組合物，且其中各病毒株為至少約128HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與一激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一所述病毒株具有一與激發(fā)病毒不同的NA亞型。
亦提供一種可有效預(yù)防或減輕禽流感病毒感染的疫苗組合物，其包含至少兩種滅活的禽流感病毒株，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約250HA/劑所述疫苗組合物，且其中各病毒株為至少約150HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一種所述病毒株具有與激發(fā)病毒不同的NA亞型，并且其中所述組合物包含兩種主要由去水山梨糖醇油酸酯組成的表面活性劑。
自下文給出的具體實(shí)施方式
及隨附權(quán)利要求書，可明確了解本發(fā)明此等及其它實(shí)施例、特征及益處。
具體實(shí)施例方式
一方面，本發(fā)明涉及新穎的具有大于約200HA/劑的總HA含量的多價(jià)禽流感疫苗。
可用于本發(fā)明疫苗的禽流感分離株可利用業(yè)內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施分離。舉例而言，受感染皺雞的組織或血清可自市售雞群中獲得。隨后可將所述病毒轉(zhuǎn)移至組織或其它適宜介質(zhì)中以建立種源病毒。由熟練的技術(shù)人員實(shí)施的進(jìn)一步特征分析亦可使用現(xiàn)有方法進(jìn)行。舉例而言，所述病毒可利用現(xiàn)有方法實(shí)施滅活，例如熱處理法及化學(xué)處理法。
在本文另一方面中，本發(fā)明亦包含一種含有至少兩種禽流感病毒株的疫苗組合物。
本發(fā)明疫苗組合物可利用現(xiàn)有技術(shù)、優(yōu)選為使用藥理學(xué)上可接受的載劑進(jìn)行調(diào)配。舉例而言，在一實(shí)施例中涵蓋水性調(diào)配物。此等調(diào)配物利用水、鹽水、或磷酯鹽或其它適宜緩沖液。在另一實(shí)施例中，所述疫苗組合物優(yōu)選為油包水或水包油乳液。亦涵蓋雙乳液，通常表征為水包油包水乳液。所述油可協(xié)助穩(wěn)定調(diào)配物且可進(jìn)一步起到佐劑或增強(qiáng)劑的作用。適合的油包括(但不限于)白油、Drakeoil、角鯊?fù)榛蚪酋徬⒁约捌渌麆?dòng)物油、植物油、或礦物油，無(wú)論是天然來(lái)源的或是合成來(lái)源的。
并且，所述疫苗組合物可包含其它適宜的業(yè)內(nèi)可用佐劑。舉例而言，此等可包括氫氧化鋁及磷酸鋁，以及其它金屬鹽。
該疫苗組合物中亦可包含另外的賦形劑，例如表面活性劑或其它濕潤(rùn)劑或調(diào)配助劑。表面活性劑可包括去水山梨糖醇單油酸酯類(TWEEN系列)，以及氧化乙烯/氧化丙烯嵌段共聚物類(PLURONIC系列)、以及業(yè)內(nèi)可用其它表面活性劑。在所述疫苗中亦可包含其它經(jīng)確認(rèn)為穩(wěn)定劑或保存劑的化合物。舉例而言，所述化合物包括(但不限于)糖類，例如山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、糊精或葡萄糖及諸如此類，以及防腐劑福爾馬林。
該疫苗組合物亦可調(diào)配成干燥粉劑，實(shí)質(zhì)上不含外源的水，隨后可由最終用戶在施用前對(duì)其實(shí)施再構(gòu)成。
所述疫苗組合物最優(yōu)選為利用失效的或滅活的病毒進(jìn)行調(diào)配。亦涵蓋用于本文中者為重組疫苗，其可表達(dá)所需水平的HA蛋白，以便提供大于約200的總HA含量。
本發(fā)明疫苗組合物優(yōu)選應(yīng)包含來(lái)自其流感病毒組份的最少約200HA總量。在本發(fā)明一實(shí)施例中，所述疫苗包含來(lái)自每一病毒株的約128HA/劑，且甚至更優(yōu)選為來(lái)自每一病毒株的約192HA/劑。
抑制其它疾病的其它家禽抗原亦可包括在內(nèi)并隨本發(fā)明疫苗組合物施用。舉例而言，抑制雛雞皰疹病毒、雛雞貧血病毒(CAV)、新城疫病毒、及傳染性支氣管炎(IB)病毒的疫苗抗原以及呼腸病毒抗原可作為本發(fā)明疫苗組合物的部分包括在內(nèi)。一或多種呼腸病毒抗原作為本發(fā)明疫苗組合物的部分尤其優(yōu)選。
本發(fā)明亦涉及一種用于誘導(dǎo)可抑制禽流感病毒感染的防護(hù)作用的方法。所述方法涉及向家禽動(dòng)物投與一包含至少兩種禽流感病毒株的疫苗組合物，其中該疫苗組合物具有大于約200HA/劑、尤其優(yōu)選為250至300HA/劑的組合HA含量。
投與方法可由熟練的技術(shù)人員進(jìn)行選擇。舉例而言，所述疫苗組合物可經(jīng)由飲用水、噴劑或眼滴劑投給孵化后的幼小(幾天至數(shù)周大小)雛雞。本文涵蓋卵內(nèi)投藥。舉例而言，通?？蓪?duì)胚胎實(shí)施接種，通常在約第18至19天實(shí)施。本發(fā)明亦涵蓋如下其它方法——其中本發(fā)明疫苗組合物依照可根據(jù)預(yù)期可能暴露于致病禽流感病毒載體的時(shí)間確定的程序表以有效量通過(guò)非經(jīng)腸的、皮下的、腹膜的、經(jīng)口的、鼻內(nèi)的方式或通過(guò)其它可用方式投與，優(yōu)選為通過(guò)非經(jīng)腸方式、更優(yōu)選為通過(guò)肌內(nèi)方式投與。
劑量通常為每只家禽動(dòng)物約0.25mL至約2.0mL，更優(yōu)選為每只動(dòng)物為約0.5mL至約1.0mL。因此，本文涵蓋一次、兩次或更多次劑量，盡可能少的劑量次數(shù)尤其優(yōu)選。
如上文給出，本發(fā)明涉及新穎的禽流感疫苗組合物及其用于家禽的方法。術(shù)語(yǔ)“家禽”欲涵蓋(但不限于)所有商業(yè)繁殖的家禽動(dòng)物，包括雛雞、鴨、鵝、火雞、孔雀、矮腳雞、及諸如此類。
實(shí)例以下實(shí)例闡明本發(fā)明多個(gè)優(yōu)選方面，但不應(yīng)以任何方式將基理解為對(duì)本發(fā)明完整范圍加以限制。
實(shí)例1產(chǎn)品組成(每劑)


研制制劑POULVACi-AI H5N9，H7N1中包含的病毒株基于區(qū)域中疾病流行情況選擇用于POULVAC i-AI H5N9，H7N1的病毒株(禽流感病毒H5N9及禽流感病毒H7N1)。兩病毒株皆由Instituto Zooprofilattico Sperimentaledelle Venezie(IZS)，Italy提供。其有效性已經(jīng)雛雞血清轉(zhuǎn)化法證明。
POULVAC i-AI H5N9，H7N1包含的佐劑基于礦物油乳劑確定的免疫刺激影響對(duì)所述佐劑進(jìn)行選擇，調(diào)配為油包水(W/O)乳液。在調(diào)配物中使用一藥物級(jí)的輕質(zhì)礦物油(NF)Drakeol 5。
為獲得穩(wěn)定的油包水乳液(W/O)，需要使用表面活性劑。選擇表面活性劑去水山梨糖醇倍半油酸酯(植物的)(一疏水性表面活性劑)及聚山梨醇酯80(植物的)(一親水性表面活性劑)，因其具有乳化特性?，F(xiàn)已顯示，使用這些表面活性劑的組合可得到穩(wěn)定的乳液。
Arlacel 83V＝去水山梨糖醇倍半油酸酯，等摩爾的單酯及二酯的混合物；CAS號(hào)＝8007-43-9。其在乳霜、乳液及軟膏制劑中使用。
TWEEN80V＝聚山梨醇酯80＝聚氧乙烯(20)去水山梨糖醇單油酸酯；CAS號(hào)＝9005-65-6。其在穩(wěn)定的水包油乳液制劑中使用。
脫水山梨糖醇酯(象Arlacel 83V)產(chǎn)生穩(wěn)定的W/O乳液，但經(jīng)常與變化比例的聚山梨糖醇酯(象TWEEN80V)組合使用以產(chǎn)生W/O乳液。
用于調(diào)配所述產(chǎn)品的Arlacel 83V及TWEEN80V皆為植物來(lái)源的。
劑量體積&接種程序表在養(yǎng)禽業(yè)中使用時(shí)通常為0.5ml的劑量體積。
POULVAC i-AI H5N9，H7N1基于血清學(xué)研究的效力1.探究性劑量反應(yīng)研究實(shí)施一探究性劑量反應(yīng)研究以測(cè)定針對(duì)變化的抗原HA水平的抗體反應(yīng)。制備包含256、128、64或32HA單位的抗原濃度的四種實(shí)驗(yàn)疫苗，并對(duì)10只SPF雛雞在兩周齡及四周齡時(shí)用每一種疫苗經(jīng)肌內(nèi)實(shí)施接種。一組10只相似的雛雞未實(shí)施接種，作為對(duì)照。在每次接種前及在第二次接種后兩周、6周及10周時(shí)采集血樣以監(jiān)測(cè)血清情況。在室內(nèi)使用血細(xì)胞凝集作用抑制劑對(duì)血清樣品實(shí)施評(píng)估(HI測(cè)試)并亦在IstitutoZooprofilattico Sperimentale(IZS)通過(guò)HI測(cè)試實(shí)施評(píng)估。
血清學(xué)數(shù)據(jù)顯示，所有鳥(niǎo)在接種前皆對(duì)兩禽流感病毒株呈血清反應(yīng)陰性，且所有未經(jīng)接種鳥(niǎo)在研究期間始終皆保持了血清反應(yīng)陰性。
H5N9血清學(xué)結(jié)果在我方實(shí)驗(yàn)室中所獲得的結(jié)果普遍高于在IZS獲得的結(jié)果，但處于2-4稀釋度范圍內(nèi)(參見(jiàn)下表1)。用包含128或256HA單位的疫苗進(jìn)行首次接種后兩周時(shí)，所有10只經(jīng)接種雛雞皆具有至少16HI單位(我方數(shù)據(jù))及4HI單位(IZS)的滴度。第二次劑量的疫苗在所有雛雞中皆引起了對(duì)H5N9強(qiáng)烈的回憶反應(yīng)，并且兩周后在所有接受了較高滴度疫苗的鳥(niǎo)中皆觀察到了至少64HI單位的滴度。
H7N1血清學(xué)結(jié)果在我方實(shí)驗(yàn)室中獲得的結(jié)果再次普遍高于在IZS的結(jié)果，但3-8倍的差異較H5N9更大。在任一情況下，自IZS結(jié)果取更保守的滴度，顯而易見(jiàn)的是，首次接種兩周后所有接受了具有128或256HA單位的疫苗的雛雞皆具有至少8HI單位的滴度。第二次劑量的疫苗在所有雛雞中皆誘導(dǎo)了針對(duì)H7N1的極強(qiáng)的回憶反應(yīng)，并且兩周后在所有接受了較高滴度疫苗的鳥(niǎo)中皆觀察到了至少512HI單位的滴度。
這些結(jié)果表明，POULVAC i-AI H5N9，H7N1可誘導(dǎo)高于1∶16的水平的抑制H5N9及H7N1的滴度——據(jù)European Council(Council Directive 92/40/EEC)認(rèn)為其具有保護(hù)作用。
表1在Fort Dodge Veterinaria S.A.(FD)及Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie(IZSV)之間對(duì)HI滴度實(shí)施匯總比較HI幾何平均滴度


FD在FORT DODGE VETERINARIA S.A.獲得的HI滴度IZSV在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE獲得的HI滴度2W首次接種及采血的周齡4W第二次接種及采血的周齡6W第二次接種及采血后兩周、6周、10周或14周PR未確定的結(jié)果為計(jì)算目的，若血清未進(jìn)行滴度測(cè)定，則認(rèn)為其具有滴度1。
2.有效性研究通過(guò)以下程序?qū)OULVAC i-AI H5N9，H7N1在雛雞中的有效性進(jìn)行評(píng)估。
110-A1-E-14-04。在兩周齡時(shí)用兩抗原皆以最小滴度(128HA單位)調(diào)配的0.5ml單次劑量以肌內(nèi)方式對(duì)20只SPF雛雞實(shí)施接種。3周后當(dāng)這些鳥(niǎo)為5周齡時(shí)投與第二次劑量疫苗。20只相似雛雞未實(shí)施接種，作為比較用的對(duì)照。在每次接種前及第二次接種3周后采集血樣以便對(duì)血清情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在室內(nèi)用一血細(xì)胞凝集作用抑制劑(HI測(cè)試)對(duì)血清樣品進(jìn)行評(píng)估，并亦在Istituto Zooprofilattico Sperimentale(IZS)通過(guò)HI測(cè)試對(duì)其實(shí)施評(píng)估。
血清學(xué)數(shù)據(jù)顯示，所有鳥(niǎo)在接種前皆對(duì)兩禽流感病毒株呈血清反應(yīng)陰性，且所有未經(jīng)接種鳥(niǎo)在研究期間始終皆保持了血清反應(yīng)陰性。
H5N9血清學(xué)結(jié)果在我方實(shí)驗(yàn)室中所獲得的結(jié)果普遍高于在IZS獲得的結(jié)果，但處于2-4稀釋度范圍內(nèi)(參見(jiàn)下表2)。首次接種三周后，所有20只經(jīng)接種雛雞皆具有至少128HA單位(我方數(shù)據(jù))及64HA單位(IZS)的滴度。此表明，一單劑量的POULVAC i-AI H5N9，H7N1可誘導(dǎo)高于1∶16的水平的抑制H5N9的滴度，據(jù)European Council(CouncilDirective 92/40/EEC)認(rèn)為其具有保護(hù)作用。
第二次劑量的疫苗在所有雛雞中皆誘導(dǎo)了針對(duì)H5N9的強(qiáng)烈的回憶反應(yīng)，并再次預(yù)示將可觀察到抑制激發(fā)的良好保護(hù)作用。
H7N1血清學(xué)結(jié)果在我方實(shí)驗(yàn)室中獲得的結(jié)果再次普遍高于在IZS的結(jié)果，但3-8倍的差異較H5N9更大。當(dāng)前仍未了解為何在測(cè)試中此差異如此之大。在任一情況下，自IZS結(jié)果取更保守的滴度，顯而易見(jiàn)的是，首次接種三周后所有20只經(jīng)接種雛雞皆具有一至少128HA單位的滴度。此表明，一單劑量的POULVAC i-AI H5N9，H7N1可誘導(dǎo)顯著高于1∶16的水平的抑制H7N1的滴度，據(jù)European Council(Council Directive 92/40/EEC)認(rèn)為其具有保護(hù)作用。
第二次劑量的疫苗在所有雛雞中皆誘導(dǎo)了對(duì)H7N1極強(qiáng)的回憶反應(yīng)，并再次預(yù)示將可觀察到抑制激發(fā)的良好保護(hù)作用。
表2在Fort Dodge Veterinaria S.A.(FD)及Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie(IZSV)之間對(duì)HI滴度的匯總比較將HI表示為幾何平均滴度

為計(jì)算目的，若血清未進(jìn)行滴度測(cè)定，則認(rèn)為其具有滴度1。
比較實(shí)例2對(duì)于此實(shí)例，參考兩篇公開(kāi)文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1Capua等人，Developments of a DIVA(Differentiating Infected from Vaccinated Animals)Strategy Using a Vaccine Containing aHerterologous Neuraminidase for the Control of Avian Influenza；Avian Pathology 32，47-55(2003)；及參考文獻(xiàn)2Ellis等人，Vacination of Chickens Against H5N1 AvianInfluenza in the Face of an Outbreak Interrupts Virus Transmission。參考文獻(xiàn)1記錄，在2周及4周齡時(shí)用2次劑量的競(jìng)爭(zhēng)者的疫苗H7N3接種的鳥(niǎo)在第6周時(shí)血清幾何平均滴度為45(由HI測(cè)得)，其中13只鳥(niǎo)中有11只鳥(niǎo)達(dá)到了大于1∶16HI的滴度(據(jù)認(rèn)為具有保護(hù)作用)。在3周齡時(shí)經(jīng)接種一次的鳥(niǎo)在第6周時(shí)實(shí)施血清學(xué)測(cè)試顯示一值為19的滴度(由HI測(cè)得)。在此情況下，13只鳥(niǎo)中僅8只鳥(niǎo)達(dá)到了大于1∶16的HI滴度。相比較而言，本文所述H7N1部分的結(jié)果在單次劑量及雙次劑量程序中皆顯著高于此結(jié)果。參考文獻(xiàn)2記錄在56-99天齡的鳥(niǎo)中用1次劑量的另一競(jìng)爭(zhēng)者的流感疫苗實(shí)施接種的鳥(niǎo)。接種后15天時(shí)，幾何平均滴度為11.7(由HI測(cè)得)，其中60只鳥(niǎo)中有32只鳥(niǎo)顯示1∶16或更大的HI滴度。接種后22天時(shí)，幾何平均滴度為33.9(由HI測(cè)得)，其中60只鳥(niǎo)中有49只鳥(niǎo)顯示1∶16或更大的HI滴度。然而本文所獲得的結(jié)果似乎顯示更大的有效性。
實(shí)例3在火雞中實(shí)施預(yù)防性接種的POULVAC XXX有效性試驗(yàn)結(jié)果一般信息概述·在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE，PADOVA，ITALY實(shí)施，其為OIE AND NATIONAL REFERENCE LABORATORYFORAIAND ND·試驗(yàn)基于先前工作，但對(duì)其實(shí)施開(kāi)發(fā)以測(cè)試POULVAC XXX作為一用于預(yù)防性接種抑制下述情況的工具的有效性-高度適應(yīng)性病毒的重新出現(xiàn)(A/Ty/Italy/8000/H7N3/2002)-對(duì)家庭宿主具有低適應(yīng)程度的新穎病毒株的引入(A/ty/Italy/H5N2/1980)-在雛雞及火雞中用不同的感染劑量實(shí)施的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)火雞·在8、34、60天齡時(shí)用POULVAC XX實(shí)施接種，0.5ml/SC·4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，2組實(shí)施接種及2組未實(shí)施接種第三次接種后21天用104EID/50于100ul中/鼻內(nèi)實(shí)施激發(fā)-LPAI A/ty/Italy/8000/2002/H7N3-LPAI A/ty/Italy/H5N2/1980·一未經(jīng)接種的對(duì)照組·對(duì)泄出物(在第3、5、7、10、14、20天收集的氣管及泄殖腔的試樣)、血清學(xué)及臨床征象進(jìn)行評(píng)估方法·根據(jù)EU DIRECTIVE 92/40/EC實(shí)施病毒分離·根據(jù)EU DIRECTIVE 92/40/EC實(shí)施血細(xì)胞凝集作用抑制測(cè)試·根據(jù)CATTOLI等人，(2004)，AVIAN PATHOLOGY，33(4)，第432-437頁(yè)實(shí)施實(shí)時(shí)RT-PCR·根據(jù)CAPUA等人，(2003)AVIAN PATHOLOGY 32(1)，47-55實(shí)施抗N抗體檢測(cè)測(cè)試“DIVA”測(cè)試定義及統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試·感染通過(guò)RRT-PCR(氣管或泄殖腔的)獲得病毒學(xué)陽(yáng)性率和對(duì)于“DIVA”的血清轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性率的組合·血清轉(zhuǎn)化至少4log的增加(激發(fā)前及激發(fā)后的滴度)·介于經(jīng)接種組與未經(jīng)接種組間的泄出物比較費(fèi)希爾氏(FISHER′S)精確P值·激發(fā)前及激發(fā)后滴度比較非參數(shù)性征象測(cè)試(之前-之后，在同組內(nèi)實(shí)施)及威爾科克森(wilcoxon)(MANN-WHITNEY)雙樣本測(cè)試(在不同組之間對(duì)滴度增加實(shí)施比較，DZ以確立在激發(fā)后于經(jīng)接種組與未經(jīng)接種組之間是否存在滴度增加差異)結(jié)果火雞H5N2 104EID/50激發(fā)1.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)感染結(jié)果指標(biāo)進(jìn)行比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0005(＜0.01)顯著經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)相比較達(dá)成感染的鳥(niǎo)數(shù)之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異

2.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)泄出物(泄殖腔及氣管的試樣)水平實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0005(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中泄出物水平顯著低于未經(jīng)接種鳥(niǎo)

3.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)激發(fā)前及激發(fā)后HI滴度實(shí)施比較非參數(shù)性征象測(cè)試未經(jīng)接種鳥(niǎo)H5N2P＝0.0039(＜0.01)；H5N9P＝0.0039(＜0.01)
經(jīng)接種鳥(niǎo)H5N2P＝0.1797(＞0.05)；H5N9P＝0.0039(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中針對(duì)激發(fā)病毒的血清學(xué)滴度上升不顯著。在未經(jīng)接種鳥(niǎo)中存在一顯著的滴度上升。

*log 2火雞H7N3 104EID/50激發(fā)1.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)感染結(jié)果指標(biāo)實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0001(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間存在感染結(jié)果間的在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異。

2.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)泄出物(泄殖腔及氣管的試樣)水平實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝.0000(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中泄出物水平顯著低于未經(jīng)接種鳥(niǎo)

3.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)激發(fā)前及激發(fā)后的HI滴度實(shí)施比較非參數(shù)性征象測(cè)試未經(jīng)接種鳥(niǎo)H7N1P＝0.0039(＜0.01)；H7N3P＝0.0039(＜0.01)經(jīng)接種鳥(niǎo)H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝0.0215(＜0.05)不顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中存在一可與在未經(jīng)接種鳥(niǎo)中觀察到的結(jié)果相比較的針對(duì)激發(fā)病毒的顯著的血清學(xué)滴度上升。

*log 2°欲將與H7N1病毒較高的血清學(xué)反應(yīng)性歸因于特定的病毒株。為評(píng)估顯著性，必須考慮激發(fā)病毒的滴度。
結(jié)論-火雞·一3次注射程序的POULVAC XXX能夠
顯著地減少用104EID/50的為意大利火雞種群所特有的H7N3病毒株激發(fā)的受感染鳥(niǎo)數(shù)、泄出及臨床征象顯著地減小用104EID/50的經(jīng)選擇以模擬新引入H5N2病毒株激發(fā)的受感染鳥(niǎo)數(shù)及泄出·對(duì)火雞實(shí)施預(yù)防性接種已導(dǎo)致群組對(duì)實(shí)驗(yàn)性感染的較低感病性及顯著較低的泄出物水平實(shí)例4在火雞中實(shí)施預(yù)防性接種的Poulvac XXX功效試驗(yàn)結(jié)果概述總說(shuō)明·在ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLE VENEZIE，PADOVA，ITALY實(shí)施，其為OIE AND NATIONAL REFERENCE LABORATORYFORAIAND ND·試驗(yàn)基于先前工作，但對(duì)其實(shí)施開(kāi)發(fā)以測(cè)試POULVAC XXX作為一用于預(yù)防性接種抑制下述情況的工具的功效-高度適應(yīng)性病毒的重新出現(xiàn)(A/Ty/Italy/8000/H7N3/2002)-對(duì)家庭宿主具有低適應(yīng)程度的新穎病毒株的引入(A/ty/Italy/H5N2/1980)-在雛雞及火雞中用不同的感染劑量實(shí)施的試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)火雞·在2周齡及5周齡時(shí)用POULVAC XX(0.5ml/IM)實(shí)施接種。
·4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，2個(gè)實(shí)施接種及2個(gè)未實(shí)施接種在實(shí)施第二次接種后21天后用106EID/50in 100ul/鼻內(nèi)實(shí)施激發(fā)-LPAI A/ty/Italy/8000/2002/H7N3-LPAI A/ty/Italy/H5N2/1980·一未經(jīng)接種的對(duì)照組·對(duì)泄出物(在第3、5、7、10、14、20天收集的氣管及泄殖腔的試樣)、血清學(xué)及臨床征象進(jìn)行評(píng)估方法·根據(jù)EU DIRECTIVE 92/40/EC實(shí)施病毒分離·根據(jù)EU DIRECTIVE 92/40/EC實(shí)施血細(xì)胞凝集作用抑制測(cè)試·根據(jù)CATTOLI等人，(2004)，AVIAN PATHOLOGY，33(4)，第432-437頁(yè)實(shí)施實(shí)時(shí)RT-PCR。
·根據(jù)CAPUA等人，(2003)AVIAN PATHOLOGY 32(1)，47-55實(shí)施抗N抗體檢測(cè)測(cè)試“DIVA”測(cè)試定義及統(tǒng)計(jì)學(xué)測(cè)試·感染通過(guò)RRT-PCR(氣管或泄殖腔的)獲得的病毒學(xué)陽(yáng)性率及對(duì)于“DIVA”的血清轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性率的組合·血清轉(zhuǎn)化至少4log的增加(激發(fā)前及激發(fā)后的滴度)·介于經(jīng)接種組與未經(jīng)接種組間的泄出物比較費(fèi)希爾氏精確P值·激發(fā)前及激發(fā)后滴度比較非參數(shù)性征象測(cè)試(之前-之后，在同組內(nèi)實(shí)施)及威爾科克森(MANN-WHITNEY)雙樣本測(cè)試(在不同組之間對(duì)滴度增加實(shí)施比較，IE以確立在激發(fā)后于經(jīng)接種組與未經(jīng)接種組之間是否存在滴度增加差異)結(jié)果雛雞H5N2 106EID/50激發(fā)1.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)感染結(jié)果指標(biāo)進(jìn)行比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0433(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中未達(dá)成感染

2.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)泄出物(泄殖腔及氣管的試樣)水平實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0008(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中泄出物水平顯著低于未經(jīng)接種鳥(niǎo)-(因?yàn)槲催_(dá)成感染)

3.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)激發(fā)前及激發(fā)后的HI滴度實(shí)施比較非參數(shù)性征象測(cè)試未經(jīng)接種鳥(niǎo)H5N2P＝0.0039(＜0.01)；H5N9P＝0.0078(＜0.01)經(jīng)接種鳥(niǎo)H5N2P＝0.4531(＞0.05)；H5N9P＝0.6875(＞0.05)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中針對(duì)激發(fā)病毒的血清學(xué)滴度上升不顯著(因?yàn)槲催_(dá)成感染)。在未經(jīng)接種鳥(niǎo)中存在一顯著的滴度上升。

_*log 2火雞H7N3 106EID/50激發(fā)1.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)感染結(jié)果指標(biāo)實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0015(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中未達(dá)成感染

2.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間對(duì)泄出物(泄殖腔及氣管的試樣)水平實(shí)施比較費(fèi)希爾氏精確p值＝0.0000(＜0.01)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中泄出物水平顯著低于未經(jīng)接種鳥(niǎo)——(因?yàn)槲催_(dá)成感染)

3.在經(jīng)接種鳥(niǎo)與未經(jīng)接種鳥(niǎo)之間實(shí)施激發(fā)前及激發(fā)后HI滴度之間的比較非參數(shù)性征象測(cè)試未經(jīng)接種鳥(niǎo)H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝0.0020(＜0.01)經(jīng)接種鳥(niǎo)H7N1P＝0.0020(＜0.01)；H7N3P＝1.0000(＞0.05)顯著在經(jīng)接種鳥(niǎo)中不存在針對(duì)激發(fā)病毒的血清學(xué)滴度顯著上升(因?yàn)槲催_(dá)成感染)。在未經(jīng)接種鳥(niǎo)中存在一顯著的滴度上升。

*log 2°欲將與H7N1病毒較高的血清學(xué)反應(yīng)性歸因于特定的病毒株。為評(píng)估顯著性，必須考慮激發(fā)病毒的滴度。
結(jié)論——火雞·一兩次注射程序的POULVAC XXX能夠預(yù)防被106EID/50的為意大利火雞種群所特有的H7N3病毒株感染預(yù)防被106EID/50的經(jīng)選擇以模擬新引入病毒的H5N2病毒株感染·對(duì)雛雞的預(yù)防性接種已防止了雛雞中活性感染的形成盡管在本發(fā)明多個(gè)實(shí)施例中對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了闡述，但預(yù)期業(yè)內(nèi)熟練的技術(shù)人員可對(duì)其實(shí)施及完成某些修改而不背離如于先前闡述中所給出及如以下權(quán)利要求書中進(jìn)一步體現(xiàn)的本發(fā)明真實(shí)精神及范圍。
權(quán)利要求
1.一種可有效預(yù)防或減輕禽流感病毒感染的疫苗組合物，其包含至少兩種滅活的禽流感病毒株，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約200HA/劑所述疫苗組合物，且其中各所述病毒株為至少約128HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一種所述病毒株具有與所述激發(fā)病毒不同的NA亞型。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其進(jìn)一步包含藥理學(xué)上可接受的載劑。
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其進(jìn)一步包含至少一種另外的家禽抗原。
4.如權(quán)利要求3所述的疫苗組合物，其中所述載劑為至少一種選自由水性載劑和乳劑組成的群組的成員。
5.如權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中所述載劑為油包水乳劑。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗組合物，其中所述乳劑包含至少兩種表面活性劑。
7.如權(quán)利要求6所述的疫苗組合物，其中所述表面活性劑選自由去水山梨糖醇油酸酯和氧化乙烯/氧化丙烯嵌段共聚物組成的群組。
8.如權(quán)利要求7所述的疫苗組合物，其中所述乳劑包含至少兩種去水山梨糖醇油酸酯。
9.如權(quán)利要求8所述的疫苗組合物，其中所述酯為TWEEN80和去水山梨糖醇倍半油酸酯。
10.如權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中所述抗原選自由在水浴中經(jīng)滅活的病毒抗原組成的群組。
11.一種預(yù)防或減輕禽流感病毒感染爆發(fā)的方法，其包括向家禽成員投與包含至少兩種滅活的禽流感病毒株的疫苗組合物，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約200HA/劑所述疫苗組合物，且其中各所述病毒株為至少約128HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一種所述病毒株具有與所述激發(fā)病毒不同的NA亞型。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述疫苗組合物經(jīng)由飲用水或噴霧劑投與。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述劑量在每只家禽成員約0.25mL至2.0mL的范圍內(nèi)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述疫苗僅以一次劑量投與。
15.一種可有效預(yù)防或減輕禽流感病毒感染的疫苗組合物，其包含至少兩種滅活的禽流感病毒株，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約250HA/劑所述疫苗組合物，且其中各所述病毒株為至少約150HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一種所述病毒株具有與所述激發(fā)病毒不同的NA亞型，并且其中所述組合物包含兩種主要由去水山梨糖醇油酸酯組成的表面活性劑。
16.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述表面活性劑為TWEEN80和去水山梨糖醇倍半油酸酯。
17.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中各所述病毒株為約192HA/劑。
18.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述組合物在接種后約22天時(shí)產(chǎn)生大于約33.9的幾何平均滴度，其中60只家禽成員中有超過(guò)約49只具有至少約1∶16的HI滴度。
19.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述病毒株經(jīng)鑒別分別為H5N9和H7N1。
20.如權(quán)利要求15所述的組合物，其中總HA/劑為至少約300。
全文摘要
本發(fā)明揭示一種能有效預(yù)防或減輕禽流感病毒感染的疫苗組合物和方法。所述疫苗包含至少兩種滅活的禽流感病毒株，其中組合的血凝素(HA)總量為至少約200HA/劑疫苗組合物，且其中各所述病毒株為至少約128HA/劑，且另外其中所述病毒株之一具有與激發(fā)病毒相同的HA亞型，且其中至少一種所述病毒株具有與所述激發(fā)病毒不同的NA亞型。
文檔編號(hào)A61K39/39GK101035559SQ200580033697
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2005年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月7日
發(fā)明者胡安·普拉納-杜蘭, 魯特·比拉-金塔納, 若爾迪·塔雷斯-考爾, 馬埃什·庫(kù)馬爾 申請(qǐng)人:惠氏公司