專利名稱：鉑耐受性癌癥的療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聯(lián)合有效抑制HER二聚化的HER2抗體及吉西他濱來治療鉑耐受性的卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌或輸卵管癌的方法。
背景技術(shù)：
HER抗體受體酪氨酸激酶的HER家族是細胞生長、分化和存活的重要介質(zhì)。該受體家族包括4個獨特的成員表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2(ErbB2或p185neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。
由erbB1基因編碼的EGFR已被認為是人類惡性腫瘤的病因。具體而言，在乳房、膀胱、肺、頭、頸和胃癌以及成膠質(zhì)細胞瘤中已經(jīng)觀察到EGFR表達的升高。EGFR受體表達的升高常常與EGFR配體，轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)的產(chǎn)量增加有關(guān)，這樣的腫瘤細胞通過自分泌刺激途徑導致受體活化。Baselga and Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994)。針對EGFR或其配體TGF-α或EGF的單克隆抗體已經(jīng)作為治療此類惡性腫瘤的治療劑進行了評估。參見例如Baselga and Mendelsohn，同上；Masui et al.，CancerResearch 441002-1007(1984)；及Wu et al.，J.Clin.Invest.951897-1905(1995)。
HER家族的第二個成員p185neu最初被鑒定成轉(zhuǎn)化基因的產(chǎn)物，來自經(jīng)化學處理的大鼠的成神經(jīng)細胞瘤。neu原癌基因的活化形式產(chǎn)生自所編碼蛋白質(zhì)跨膜區(qū)中的點突變(纈氨酸變成谷氨酸)。在乳房和卵巢癌中觀察到neu的人同系物的擴增，而且這與預(yù)后不良有關(guān)(Slamon et al.，Science 235177-182(1987)；Slamon et al.，Science 244707-712(1989)；及美國專利4,968,603)。迄今為止，就人類腫瘤而言尚無neu原癌基因中與之類似的點突變的報道。在其它癌癥中也已觀察到HER2的過表達(頻繁但不均一，原因在于基因擴增)，包括胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰和膀胱癌。參見King et al.，Science 229974(1985)；Yokota et al.，Lancet 1765-767(1986)；Fukushige et al.，Mol.Cell Biol.6955-958(1986)；Guerin et al.，Oncogene Res.321-31(1988)；Cohen et al.，Oncogene 481-88(1989)；Yonemura et al.，Cancer Res.511034(1991)；Borst et al.，Gynecol.Oncol.38364(1990)；Weinere et al.，Cancer Res.50421-425(1990)；Kern et al.，CancerRes.505184(1990)；Park et al.，Cancer Res.496605(1989)；Zhau et al.，Mol.Carcinog.3254-257(1990)；Aasland et al.，Br.J.Cancer57358-363(1988)；Williams et al.，Pathobiology 5946-52(1991)；及McCann et al.，Cancer 6588-92(1990)等。HER2可在前列腺癌中過表達(Gu et al.，Cancer Lett.99185-9(1996)；Ross et al.，Hum.Pathol.28827-33(1997)；Ross et al.，Cancer 792162-70(1997)；及Sadasivan et al.，J.Urol.150126-31(1993))。
還描述了針對大鼠p185neu和人HER2蛋白質(zhì)產(chǎn)物的抗體。Drebin及其同事制備了針對大鼠neu基因產(chǎn)物，p185neu的抗體。參見例如Drebin et al.，Cell 41695-706(1985)；Myers et al.，Meth.Enzym.198277-290(1991)；及WO94/22478。Drebin et al.，Oncogene 2273-277(1988)報道了與p185neu的兩個獨特區(qū)域有反應(yīng)性的抗體混合物對植入裸鼠的neu轉(zhuǎn)化NIH-3T3細胞產(chǎn)生協(xié)同的抗腫瘤作用。還可參見1998年10月20日發(fā)布的美國專利5,824,311。
Hudziak et al.，Mol.Cell.Biol.9(3)1165-1172(1989)描述了一組HER2抗體的生成，并利用人乳房腫瘤細胞系SK-BR-3鑒定。通過72小時后單層細胞的結(jié)晶紫染色測定了暴露于抗體后SK-BR-3細胞的相對細胞增殖。利用此測定法，用稱作4D5的抗體獲得了最大抑制，它抑制細胞增殖達56％。該組其它抗體在此測定法中以較低程度降低細胞增殖。還發(fā)現(xiàn)抗體4D5使過表達HER2的乳房腫瘤細胞系對TNF-α的細胞毒性作用變得敏感。還可參見1997年10月14日發(fā)布的美國專利5,677,171。Hudziak等人的文章中論述的抗體還在以下文獻中進行了鑒定Fendly et al.，Cancer Research501550-1558(1990)；Kotts et al.，In Vitro 26(3)59A(1990)；Sarup et al.，GrowthRegulation 172-82(1991)；Shepard et al.，J.Clin.Immunol.11(3)117-127(1991)；Kumar et al.，Mol.Cell.Biol.11(2)979-986(1991)；Lewis et al.，CancerImmunol.Immunother.37255-263(1993)；Pietras et al.，Oncogene 91829-1838(1994)；Vitetta et al.，Cancer Research545301-5309(1994)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)14661-14665(1994)；Scott et al.，J.Biol.Chem.26614300-5(1991)；D′souza et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.917202-7206(1994)；Lewis et al.，Cancer Research561457-1465(1996)；及Schaefer et al.，Oncogene 151385-1394(1997)。
鼠HER2抗體4D5的重組人源化型式(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2，Trastuzumab或HERCEPTIN；美國專利5,821,337)在臨床上對患有HER2過表達的轉(zhuǎn)移性乳癌并已接受廣泛的早期抗癌療法的患者起作用(Baselga etal.，J.Clin. Oncol.14737-744(1996))。1998年9月25日Trastuzumab得到了食品和藥品管理局的銷售許可，可用于治療所患腫瘤過表達HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳癌患者。
以下文獻中描述了具有各種特性的其它HER2抗體Tagliabue et al.，Int.J.Cancer 47933-937(1991)；McKenzie et al.，Oncogene 4543-548(1989)；Maier et al.，Cancer Res.515361-5369(1991)；Bacus et al.，MolecularCarcinogenesis 3350-362(1990)；Stancovski et al.，PNAS(USA)888691-8695(1991)；Bacus et al.，Cancer Research 522580-2589(1992)；Xu et al.，Int.J.Cancer 53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyk et al.，Cancer Research522771-2776(1992)；Hancock et al.，Cancer Res.514575-4580(1991)；Shawveret al.，Cancer Res.541367-1373(1994)；Arteaga et al.，Cancer Res.543758-3765(1994)；Harwerth et al.，J.Biol.Chem.26715160-15167(1992)；美國專利5,783,186；及Klapper et al.，Oncogene 142099-2109(1997)。
同源性篩選使得HER受體家族的兩個其它成員得以鑒定HER3(美國專利5,183,884和5,480,968以及Kraus et al.，PNAS(USA)869193-9197(1989))和HER4(歐洲專利申請599,274；Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 901746-1750(1993)；及Plowman et al.，Nature 366473-475(1993))。這兩種受體均在至少有些乳癌細胞系中顯示出表達升高。
通常發(fā)現(xiàn)HER受體在細胞中有多種組合，而且認為它的二聚化增加了細胞對各種HER配體的應(yīng)答的多樣性(Earp et al.，Breast Cancer Researchand Treatment 35115-132(1995))。EGFR受到6種不同配體的結(jié)合表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)、雙調(diào)蛋白、肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)、betacellulin和epiregulin(Groenen et al.，Growth Factors 11235-257(1994))。由單一基因的可變剪接產(chǎn)生的一個調(diào)蛋白蛋白質(zhì)家族是HER3和HER4的配體。調(diào)蛋白家族包括α、β和γ調(diào)蛋白(Holmes et al.，Science 2561205-1210(1992)；美國專利5,641,869；及Schaefer et al.，Oncogene 151385-1394(1997))；neu分化因子(NDF)；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF)；乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)；及感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。有關(guān)綜述參見Groenen et al.，Growth Factors 11235-257(1994)；Lemke，G.，Molec.& Cell.Neurosci.7247-262(1996)及Lee et al.，Pharm.Rev.4751-85(1995)。最近還鑒定了另外三種HER配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)，據(jù)報道結(jié)合HER3或HER4(Chang et al.，Nature 387509-512(1997)；及Carraway et al.，Nature 387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，結(jié)合HER4(Zhang et al.，PNAS(USA)94(18)9562-7(1997))；及神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4，結(jié)合HER4(Harari et al.，Oncogene 182681-89(1999))。HB-EGF、betacellulin和epiregulin也結(jié)合HER4。
盡管EGF和TGFα不結(jié)合HER2，但是EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，它活化EGFR并導致異二聚體中HER2的轉(zhuǎn)磷酸作用。二聚化作用和/或轉(zhuǎn)磷酸作用看來活化HER2酪氨酸激酶。參見Earp et al.，同上。同樣，當HER3與HER2共表達時，形成了有活性的信號復合物，而針對HER2的抗體能破壞此復合物(Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)14661-14665(1994))。此外，在與HER2共表達時，HER3對調(diào)蛋白(HRG)的親和力提高到了較高的親和力狀態(tài)。還可參見有關(guān)HER2-HER3蛋白質(zhì)復合物的文獻Levi et al.，Journal of Neuroscience 151329-1340(1995)；Morrissey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 921431-1435(1995)；及Lewis etal.，CancerRes.561457-1465(1996)。HER4，與HER3類似，與HER2形成有活性的信號復合物(Carraway and Cantley,Cell785-8(1994))。
卵巢癌卵巢癌是女性生殖道惡性腫瘤中最常見的死因。據(jù)估計在美國每年有大約24,000名新診斷的患者，有大約13,000人死于該病。晚期卵巢癌患者常常用基于鉑的化療法治療，常常與紫杉烷(taxane)聯(lián)合。在這些藥劑失敗后，就只有很少的治療選擇了?；笺K敏感性疾病的患者常常用鉑復治，但相當一部分患者在復治后只有短暫的響應(yīng)持續(xù)時間。對于那些患鉑耐受性疾病的患者，結(jié)果就不太有利。托泊替康(topotecan)被食品和藥品管理局(FDA)批準用于初始或后續(xù)化療失敗的患者；脂質(zhì)體多柔比星(liposomal doxorubicin)只被批準用于以基于鉑和紫杉醇(paclitaxel)的化療方案二者均難以控制的卵巢癌患者。托泊替康和脂質(zhì)體多柔比星已在鉑耐受性疾病患者中分別顯示6％和12％的部分響應(yīng)率(partial response rate)，同時有14-18周的中值無進展存活(median progression-free survival)。最近，報道了吉西他濱(gemcitabine)在鉑耐受性卵巢癌中部分響應(yīng)為16％的有希望結(jié)果，導致越來越多的將此藥劑用作第二梯隊療法。然而，無疑仍需要新的改進的治療選擇用于現(xiàn)有療法失敗的晚期卵巢癌患者。
卵巢癌的發(fā)病機理中涉及受體酪氨酸激酶的ErbB或人表皮生長因子受體(BER)家族。為了靶向HER信號途徑，將pertuzumab(rhuMAb 2C4)開發(fā)成抑制HER2與其它HER受體二聚化的人源化抗體，從而抑制配體驅(qū)動的磷酸化作用和活化作用，以及RAS和AKT途徑的下游激活。
吉西他濱已經(jīng)用于多種腫瘤，并且指明用于胰和肺癌。單獨使用吉西他濱藥劑的最常見毒性包括血細胞減少，貧血和嗜中性白血球減少的發(fā)生率分別為68％和63％。另一常見的毒性是惡心和嘔吐，聯(lián)合發(fā)生率為69％，其中三級13％，四級1％。腹瀉的發(fā)生率稍低，為19％。皮疹的發(fā)生更常見，為30％，只有1％是三級。已將吉西他濱與許多其它化療劑聯(lián)合，諸如紫杉烷、蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)和鉑，沒有任何顯著的毒性增加或未預(yù)料到的毒性。
在二期試驗中，在不同化療劑的幾種組合中將trastuzumab與吉西他濱聯(lián)合，而且耐受同樣良好，未觀察到心臟毒性或未預(yù)料到的毒性。Safran et al.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20130a(2001)；Miller et al.，Oncology15(2)38-40(2001)。有關(guān)trastuzumab和吉西他濱的聯(lián)合還可參見Zinner et al.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20328a(2001)；Nagoumey et al.，Breast Cancer Res.Treat.57116，Abstract 475(1999)；Bun et al.，Proc.Am.Assoc.Canc.Res.41719，Abstract#4571(2000)；Konecny et al.，Breast Cancer Res.Treat.57114，Abstract 467(1999)；O′Shaugnessy et al.，Sem.Oncol.2(suppl3)22-26(2004)；Sledge et al.，Sem.Oncol.2(suppl3)19-21(2003)；Zinner et al.，Lung Cancer44(1)99-110(2004)；Gatzemeier et al.，Ann.of Oncol.1519-27(2004)。
在Omnitarg作為單一藥劑用于治療實體瘤的一期試驗中，用pertuzumab治療3名晚期卵巢癌患者。其中一人具有持久的部分響應(yīng)，而另一名受試者在15周內(nèi)病情穩(wěn)定。Agus et al.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22192，Abstract771(2003)。
發(fā)明概述第一方面，本發(fā)明涉及用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚化的HER2抗體及抗代謝物化療劑(antimetabolite chemotherapeutic agent)。
另一方面，本發(fā)明提供了用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用結(jié)合HER2上異二聚體結(jié)合位點的HER2抗體及吉西他濱。
又一方面，本發(fā)明涉及用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的HER2抗體及吉西他濱。
附圖簡述

圖1A和1B描述了HER2胞外域(ECD)內(nèi)殘基22-645的表位定位(氨基酸序列，包括信號序列，如圖1A所示；SEQ ID NO13)，是通過截短突變體分析和定點誘變測定的(Nakamura et al.，J.of Virology 61(10)6179-6191(1993)；及Renz et al.，J.Cell Biol.125(6)1395-1406(1994))。使用聚合酶鏈式反應(yīng)從cDNA制備各種HER2-ECD截短或點突變。將HER2突變體作為gD融合蛋白在哺乳動物表達質(zhì)粒中表達。此表達質(zhì)粒使用細胞巨化病毒啟動子/增強子，SV40終止及聚腺苷酸化信號位于所插入cDNA的下游。將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到293細胞中。轉(zhuǎn)染后那天，在無甲硫氨酸和半胱氨酸、含1％透析胎牛血清和35S甲硫氨酸和35S半胱氨酸各25μCi的低葡萄糖DMEM中通過新陳代謝將細胞標記過夜。收獲上清液，然后將HER2單克隆抗體或?qū)φ湛贵w加入上清液，并在4℃溫育2-4小時。將復合物沉淀，加到10-20％Tricine SDS梯度凝膠上，并用100V進行電泳。將凝膠電印跡至膜上，并通過放射自顯影進行分析。如圖1B所示，HER2抗體7C2、7F3、2C4、7D3、3E8、4D5、2H11和3H4結(jié)合各種HER2 ECD表位。
圖2A和2B顯示了HER2單克隆抗體2C4和7F3對MCF7細胞rHRGβ1活化的影響。圖2A顯示了2C4或7F3對HRG刺激酪氨酸磷酸化的抑制作用的劑量-應(yīng)答曲線。圖2B顯示了2C4或7F3對125I標記rHRGβ1177-244結(jié)合MCF7細胞的抑制作用的劑量-應(yīng)答曲線。
圖3描繪了HER2單克隆抗體2C4或7F3對特異性125I標記rHRGβ1177-244結(jié)合一組人腫瘤細胞系的抑制作用。單克隆抗體對照是不阻斷rHRG結(jié)合的同種型匹配的鼠單克隆抗體。在存在100nM rHRGβ1的條件下進行平行溫育，由此測定非特異性125I標記rHRGβ1177-244結(jié)合。非特異性125I標記rHRGβ1177-244結(jié)合的數(shù)值小于所有被測細胞系總值的1％。
圖4A和4B顯示了單克隆抗體2C4和4D5對MDA-MB-175(圖4A)和SK-BR-3(圖4B)細胞增殖的影響。將MDA-MB-175和SK-BR-3細胞接種于96孔板中并使其粘附2小時。實驗在含1％血清的培養(yǎng)基中進行。加入HER2抗體或者只加入培養(yǎng)基，并將細胞在37℃溫育2小時。隨后加入rHRGβ1(1nM)或者只加入培養(yǎng)基，并將細胞溫育4天。對細胞單層進行清洗，并用0.5％結(jié)晶紫染色/固定。測量540nm處的吸光度以測定細胞增殖。
圖5A和5B顯示了在表達低/正常水平HER2的MCF7細胞中(圖5A)和表達高水平HER2的SK-BR-3細胞中(圖5B)，單克隆抗體2C4、Trastuzumab抗體或抗EGFR抗體對HER2與HER3的調(diào)蛋白(HRG)依賴性結(jié)合的影響；參見下文實施例2。
圖6A和6B比較了完整鼠單克隆抗體2C4(mu 2C4)與嵌合2C4 Fab片段的活性。圖6A顯示了嵌合2C4 Fab或完整鼠單克隆抗體2C4對125I-HRG結(jié)合MCF7細胞的抑制作用。將MCF7細胞接種于24孔板中(1×105個細胞/孔)并培養(yǎng)兩天至大約85％匯合。結(jié)合實驗如Lewis et al.，Cancer Research561457-1465(1996)中所述進行。圖6B描繪了對MCF7細胞中rHRGβ1激活p180酪氨酸磷酸化的抑制作用，如Lewis et al.，Cancer Research 561457-1465(1996)中所述進行。
圖7A和7B描述了鼠單克隆抗體2C4的輕鏈可變區(qū)(VL)(圖7A)和重鏈可變區(qū)(VH)(圖7B)(分別是SEQ ID NO1和2)；人源化2C4型式574的VL和VH結(jié)構(gòu)域(分別是SEQ ID NO3和4)；及人VL和VH共有框架(humκ1，輕鏈κ亞組I；humIII，重鏈亞組III)(分別是SEQ ID NO5和6)的氨基酸序列對比。星號標示人源化2C4型式574和鼠單克隆抗體2C4之間或者人源化2C4型式574和人框架之間的差異。括弧內(nèi)是互補決定區(qū)(CDR)。
圖8A至C顯示了實施例3中通過ELISA測定的嵌合Fab 2C4(Fab.vl)及幾種人源化2C4變體與HER2胞外域(ECD)的結(jié)合。
圖9是單克隆抗體2C4的VL和VH結(jié)構(gòu)域的帶狀圖，標示了白色CDR主鏈(L1、L2、L3、H1、H2、H3)。還顯示了人源化過程中通過誘變評估的VH側(cè)鏈(參見實施例3，表2)。
圖10描繪了單克隆抗體2C4或Trastuzumab對EGF、TGF-α或HRG介導的活化促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的影響。
圖11A和11B分別顯示了Trastuzumab輕鏈(SEQ ID NO14)和Trastuzumab重鏈(SEQ ID NO15)的氨基酸序列。
圖12A和12B分別顯示了Pertuzumab輕鏈(SEQ ID NO16)和Pertuzumab重鏈(SEQ ID NO17)的氨基酸序列。
圖13以圖描繪了2C4在HER2異二聚體結(jié)合位點處的結(jié)合，從而阻止與活化EGFR或HER3的異二聚化。
圖14描述了HER2/HER3與MAPK和Akt途徑的偶聯(lián)。
圖15比較了Trastuzumab和Pertuzumab的活性。
圖16以圖描繪了HER2的各個結(jié)構(gòu)域。
優(yōu)選實施方案的詳述I.定義“HER受體”是屬于HER受體家族的受體蛋白質(zhì)酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、HER3和HER4受體及未來將鑒定的此家族其它成員。HER受體通常將包含胞外結(jié)構(gòu)域，它可結(jié)合HER配體；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和含有幾個可被磷酸化的酪氨酸殘基的羧基末端信號結(jié)構(gòu)域。HER受體可以是“天然序列”HER受體或其“氨基酸序列變體”。優(yōu)選HER受體是天然序列人HER受體。
HER2的胞外域包含4個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域I(大約第1-195位氨基酸殘基)、結(jié)構(gòu)域II(大約第196-320位氨基酸殘基)、結(jié)構(gòu)域III(大約第321-488位氨基酸殘基)和結(jié)構(gòu)域IV(大約第489-632位氨基酸殘基)(殘基編號不包括信號肽)。參見Garrett et al.，Mol.Cell.11495-505(2003)；Cho et al.，Nature421756-760(2003)；Franklin et al.，Cancer Cell 5317-328(2004)；或Plowman et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.901746-1750(1993)以及本文圖16。
術(shù)語“ErbB1”、“HER1”、“表皮生長因子受體”和“EGFR”在本文中可互換使用，指例如Carpenter et al.，Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中公開的EGFR，包括其天然存在的突變體形式(例如刪除突變體EGFR，如Humphrey et al.，PNAS(USA)874207-4211(1990))。erbB1指編碼EGFR蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互換使用，指例如Semba et al.，PNAS(USA)826497-6501(1985)和Yamamoto et al.，Nature 319230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(Genebank編號X03363)。術(shù)語“erbB2”指編碼人ErbB2的基因，而“neu”指編碼大鼠p15neu的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。
“ErbB3”和“HER3”指例如美國專利5,183,884和5,480,968及Kraus etal.，PNAS(USA)869193-9197(1989)中公開的受體多肽。
術(shù)語“ErbB4”和“HER4”在本文中指例如歐洲專利申請599,274；Plowmanet al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 901746-1750(1993)；及Plowman et al.，Nature 366473-475(1993)中公開的受體多肽，包括其同種型(isoform)，例如1999年4月22日發(fā)布的WO99/19488中所公開的。
“HER配體”指結(jié)合和/或活化HER受體的多肽。本文中特別感興趣的HER配體是天然序列人HER配體，諸如表皮生長因子(EGF)(Savage etal.，J.Biol.Chem.2477612-7621(1972))；轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)(Marquardt et al.，Science 2231079-1082(1984))；雙調(diào)蛋白，又稱為施旺氏細胞瘤(schwanoma)或角質(zhì)形成細胞自分泌生長因子(Shoyab et al.，Science 2431074-1076(1989)；Kimura et al.，Nature 348257-260(1990)；及Cook et al.，Mol.Cell.Biol.112547-2557(1991))；betacellulin(Shing et al.，Science 2591604-1607(1993)；及Sasada et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1901173(1993))；肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama et al.，Science 251936-939(1991))；epiregulin(Toyoda et al.，J.Biol.Chem.2707495-7500(1995)；及Komurasaki et al.，Oncogene 152841-2848(1997))；α調(diào)蛋白(見下文)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway et al.，Nature 387512-516(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3(NRG-3)(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.949562-9567(1997))；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-4(NRG-4)(Harari et al.，Oncogene 182681-89(1999))；或cripto(CR-1)(Kannan et al.，J.Biol.Chem.272(6)3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的HER配體包括EGF、TGF-α、雙調(diào)蛋白、betacellulin、HB-EGF和epiregulin。結(jié)合HER3的HER配體包括調(diào)蛋白。能結(jié)合HER4的HER配體包括betacellulin、epiregulin、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和調(diào)蛋白。
“調(diào)蛋白”(HRG)在用于本文時指由調(diào)蛋白基因編碼的多肽，如美國專利5,641,869或Marchionni et al.，Nature 362312-318(1993)中所公開的。調(diào)蛋白的例子包括調(diào)蛋白-α、調(diào)蛋白-β1、調(diào)蛋白-β2和調(diào)蛋白-β3(Holmeset al.，Science 2561205-1210(1992)；及美國專利5,641,869)；neu分化因子(NDF)(Peles et al.，Cell 69205-216(1992))；乙酰膽堿受體誘導活性(ARIA)(Falls et al.，Cell 72801-815(1993))；神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGF)(Marchionniet al.，Nature 362312-318(1993))；感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Hoet al.，J.Biol.Chem.27014523-14532(1995))；γ-調(diào)蛋白(Schaefer et al.，Oncogene 151385-1394(1997))。此術(shù)語包括天然序列HRG多肽的生物學活性片段和/或氨基酸序列變體，諸如其EGF樣結(jié)構(gòu)域片段(例如HRGβ1177-244)。
“HER二聚體”在本文中指包含至少兩個不同HER受體的非共價結(jié)合二聚體。當表達兩種或多種HER受體的細胞暴露于HER配體時可能形成此類復合物，可通過免疫沉淀進行分離并通過SDS-PAGE進行分析，如例如Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.269(20)14661-14665(1994)中所述。此類HER二聚體的例子包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4異二聚體。此外，HER二聚體可包含與諸如HER3、HER4或EGFR等不同HER受體結(jié)合的兩個或多個HER2受體。其它蛋白質(zhì)，諸如細胞因子受體亞基(例如gp130)可與所述二聚體結(jié)合。
HER2上的“異二聚體結(jié)合位點”指HER2胞外域中在與EGFR、HER3或HER4形成二聚體時，接觸EGFR、HER3或HER4胞外域中某區(qū)域或與EGFR、HER3或HER4胞外域中某區(qū)域形成介面的區(qū)域。已發(fā)現(xiàn)所述區(qū)域在HER2的結(jié)構(gòu)域II中。Franklin et al.，Cancer Cell5317-328(2004)。
“HER活化”或“HER2活化”指任一種或多種HER受體或者HER2受體的活化或磷酸化作用。一般而言，HER活化導致信號轉(zhuǎn)導(例如由HER受體胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域引起的，磷酸化HER受體或底物多肽中的酪氨酸殘基)。HER活化可由結(jié)合包含目的HER受體的HER二聚體的HER配體介導。結(jié)合HER二聚體的HER配體可活化二聚體中一種或多種HER受體的激酶結(jié)構(gòu)域，從而導致一種或多種HER受體中酪氨酸殘基的磷酸化作用和/或其它底物多肽中酪氨酸殘基的磷酸化作用，諸如Akt或MAPK胞內(nèi)激酶。
“天然序列”多肽是與衍生自自然界的多肽(例如HER受體或HER配體)具有相同氨基酸序列的多肽。這樣的天然序列多肽可從自然界中分離或者可通過重組或合成手段產(chǎn)生。因此，天然序列多肽可具有天然存在的人多肽、鼠多肽或來自任何其它哺乳動物物種的多肽的氨基酸序列。
術(shù)語“氨基酸序列變體”指具有某種程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列變體與天然HER配體的至少一個受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者與天然HER受體的至少一個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒕哂兄辽偌s70％的同源性，而且優(yōu)選的是，它們與所述受體或配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒅辽偌s80％，更優(yōu)選至少約90％同源。氨基酸序列變體在天然氨基酸序列的氨基酸序列內(nèi)的某些位置具有替代、刪除和/或插入。
“同源性”定義為在必要時對比序列和引入缺口以獲取最大百分比同一性后，氨基酸序列變體中相同殘基的百分比。用于對比的方法和計算機程序在本領(lǐng)域是眾所周知的。一種這樣的計算機程序是“Align 2”，由Genentech，Inc.創(chuàng)作，已經(jīng)在1991年12月10日與用戶文檔(user documentation)一起提交給美國版權(quán)局(Washington，DC 20559)。
術(shù)語“ 抗體”在本文中使用最廣的含義，具體覆蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展示所需生物學活性。
術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的變體外，此類變體通常以極少量存在。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制品不同，每種單克隆抗體針對抗原上的同一決定簇。除了它們的特異性以外，單克隆抗體的優(yōu)越性體現(xiàn)在它們未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克隆”指示由基本上同質(zhì)的抗體群獲得的抗體的特征，并不解釋為需要通過任何特定方法來生產(chǎn)抗體。例如，依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler et al.，Nature256495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(參見例如美國專利4,816,567)?！皢慰寺】贵w”還可使用例如Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)中描述的技術(shù)由噬菌體抗體庫分離。
單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展示所需生物學活性(美國專利4,816,567；及Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984))。本文中感興趣的嵌合抗體包括包含衍生自非人靈長類動物(如舊大陸猴類(Old World Monkey)、猿等)的可變區(qū)抗原結(jié)合序列及人恒定區(qū)序列的“靈長類化(primatized)”抗體。
“抗體片段”包含完整抗體的一部分，優(yōu)選包含其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。
“完整抗體”指包含抗原結(jié)合可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)CH1、CH2和CH3的抗體。恒定區(qū)可以是天然序列恒定區(qū)(如人天然序列恒定區(qū))或其氨基酸序列變體。優(yōu)選的是，完整抗體具有一項或多項效應(yīng)物功能。
抗體“效應(yīng)物功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物學活性?？贵w效應(yīng)物功能的例子包括C1q結(jié)合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用細胞表面受體(如B細胞受體；BCR)的下調(diào)等。
根據(jù)完整抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將其歸入不同的“類”(class)。完整抗體有五種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進一步分為“亞類”(subclass)(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。將與不同抗體類別對應(yīng)的重鏈恒定區(qū)分別稱作α、δ、ε、γ和μ。不同類別免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的。
“抗體依賴性細胞介導的細胞毒性”和“ADCC”指由細胞介導的反應(yīng)，其中表達Fc受體(FcR)的非特異性細胞毒性細胞(如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)識別靶細胞上結(jié)合的抗體，隨后引起靶細胞溶解。介導ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達FcγRIII，而單核細胞表達FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)中第464頁表3總結(jié)了造血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國專利5,500,362或5,821,337中所描述的。可用于此類測定法的效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS(USA)95652-656(1998)中所公開的。
“人效應(yīng)細胞”指表達一種或多種FcR并行使效應(yīng)物功能的白細胞。優(yōu)選的是，該細胞至少表達FcγRIII并執(zhí)行ADCC效應(yīng)物功能。介導ADCC的人白細胞的例子包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和嗜中性粒細胞，優(yōu)選PBMC和NK細胞。效應(yīng)細胞可以從其天然來源中分離，例如血液或PBMC，正如本文所述。
術(shù)語“Fc受體”和“FcR”用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是與IgG抗體結(jié)合的FcR(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體和可變剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(“活化受體”)和FcγRIIB(“抑制受體”)，它們具有相似的氨基酸序列，區(qū)別主要在于其胞質(zhì)域?；罨荏wFcγRIIA在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其胞質(zhì)域中包含基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述Daёron，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997))。FcR的綜述參見Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 425-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126330-341(1995))。術(shù)語“FcR”在本文中涵蓋其它FcR，包括未來將會鑒定的FcR。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負責將母體的IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyer et al.，J.Immunol.117587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24249(1994))。
“補體依賴性細胞毒性”或“CDC”指在存在補體時分子溶解靶物的能力。補體激活途徑是由補體系統(tǒng)第一組分(C1q)結(jié)合與關(guān)聯(lián)抗原復合的分子(如抗體)起始的。為了評估補體激活，可進行CDC測定法，例如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202163(1996)中所描述的。
“ 天然抗體”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構(gòu)成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵的數(shù)目在具有不同免疫球蛋白同種型的重鏈中有所變化。每條重鏈和輕鏈還具有間隔規(guī)律的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈在一端具有一個可變區(qū)(VH)，接著是多個恒定區(qū)。每條輕鏈在一端具有一個可變區(qū)(VL)，而另一端是一個恒定區(qū)。輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)排列在一起，而輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)排列在一起。認為特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成界面。
術(shù)語“可變的”指可變區(qū)中的某些部分在抗體序列中差異廣泛且用于每種特定抗體針對其特定抗原的結(jié)合和特異性的實情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱作高變區(qū)的三個區(qū)段?？勺儏^(qū)中更加高度保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各自包含四個FR，它們大多采取β-折疊構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在某些情況中形成β-折疊結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等人，《Sequences of Proteins of ImunologicalInterest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991)。恒定區(qū)不直接涉及抗體與抗原的結(jié)合，但顯示出多種效應(yīng)物功能，諸如抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)中抗體的參與。
術(shù)語“高變區(qū)”在用于本文時指抗體中負責抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自“互補決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，《Sequences of Proteins ofImmunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991)和/或那些來自“高變環(huán)”的殘基(例如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia and Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987))?！翱蚣堋被颉癋R”殘基指本文定義的高變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段，稱作“Fab”片段，各自具有一個抗原結(jié)合位點，和一個殘余“Fc”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab′)2片段，它具有兩個抗原結(jié)合位點，并且仍能夠交聯(lián)抗原。
“Fv”是包含完整抗原識別和抗原結(jié)合位點的最小抗體片段。該區(qū)域由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。正是在這種構(gòu)造中，各個可變區(qū)的三個高變區(qū)相互作用而在VH-VL二聚體表面確定了一個抗原結(jié)合位點。六個高變區(qū)共同賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含對抗原特異的三個高變區(qū)的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。
Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一恒定區(qū)(CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基而與Fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個或多個半胱氨酸。Fab’-SH是本文中對其中恒定區(qū)的半胱氨酸殘基攜帶至少一個游離硫醇基的Fab’的稱謂。F(ab′)2抗體片段最初是作為成對Fab’片段生成的，在Fab’片段之間具有鉸鏈半胱氨酸。還知道抗體片段的其它化學偶聯(lián)。
來自任何脊椎動物物種的抗體的“輕鏈”，根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列，可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡帕(κ)和拉姆達(λ)。
“單鏈Fv”或“scFv”抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于一條多肽鏈上。優(yōu)選的是，該Fv多肽在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還包含多肽接頭，使得scFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述參見Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore編，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。HER2抗體scFv片段描述于WO93/16185；美國專利5,571，894；和美國專利5,587,458。
術(shù)語“雙抗體”指具有兩個抗原結(jié)合位點的小型抗體片段，該片段在同一條多肽鏈(VH-VL)中包含相連的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)。通過使用過短的接頭使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對，迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點。雙抗體更完整的描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)。
非人(如嚙齒類)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有所需特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。通常，人源化抗體將包含基本上不少于至少一個、通常兩個如下可變區(qū)，其中所有或基本上所有的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。任選的是，人源化抗體還將包含至少部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。
人源化HER2抗體包括huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或Trastuzumab(HERCEPTIN)，如美國專利5,821,337的表3中所述，明確收入本文作為參考；人源化520C9(WO93/21319)和人源化2C4抗體，如本文所述。
為了本文的目的，“Trastuzumab”、“HERCEPTIN”和“huMAb4D5-8”指包含分別在SEQ ID NO14和15中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。
在本文中，“Pertuzumab”和“OMNITARGTM”指包含分別在SEQ ID NO16和17中的輕鏈和重鏈氨基酸序列的抗體。
“裸的”抗體指未偶聯(lián)異源分子，諸如細胞毒性模塊或放射性標記物的抗體(如本文所定義的)。
“分離的”抗體指已經(jīng)由其天然環(huán)境的一種成分鑒別和分離和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染成分指將會干擾抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95％，最優(yōu)選重量超過99％，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)通過使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染的還原或非還原條件下的SDS-PAGE達到同質(zhì)。既然抗體的天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。
“比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚化的”HER2抗體指比Trastuzumab更有效(例如有效性至少增強約2倍)地減少或消除HER二聚體的抗體。優(yōu)選的是，這樣的抗體至少大約像選自下組的抗體那樣有效地抑制HER二聚化鼠單克隆抗體2C4、鼠單克隆抗體2C4的Fab片段、Pertuzumab和Pertuzumab的Fab片段?？梢灾苯油ㄟ^研究HER二聚體，或者通過評估由HER二聚化引起的HER活化或下游信號傳導，和/或通過評估抗體-HER2結(jié)合位點等來評估對HER二聚化的抑制。用于篩選有能力比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚化的抗體的測定法見Agus et al.，CancerCell2127-137(2002)和本文實施例1-2和4。只是作為例示，可以通過評估例如下列各項來分析對HER二聚化的抑制對HER二聚體形成的抑制(見例如Agusetal.，Cancer Cell2127-137(2002)的附圖1A-B和本文實施例2)；降低表達HER二聚體的細胞中的HER配體活化(例如本文實施例1和Aguset al.，Cancer Cell2127-137(2002)的附圖2A-B)；阻斷HER配體結(jié)合表達HER二聚體的細胞(例如本文實施例1和Agus et al.，Cancer Cell2127-137(2002)的附圖2E)；在存在(或缺乏)HER配體時對表達HER二聚體的癌細胞(如MCF7、MDA-MD-134、ZR-75-1、MD-MB-175、T-47D細胞)的細胞生長的抑制(例如本文實施例1和Agus et al.，Cancer Cell2127-137(2002)的附圖3A-D)；對下游信號傳導的抑制(例如對HRG依賴性AKT磷酸化的抑制或?qū)RG或TGFα依賴性MAPK磷酸化的抑制)(見例如本文實施例4和Agus et al.，Cancer Cell 2127-137(2002)的附圖2C-D)。還可以通過研究抗體-HER2結(jié)合位點來評估抗體是否抑制HER二聚化，例如通過評估與HER2結(jié)合的抗體的結(jié)構(gòu)或模型，諸如晶體結(jié)構(gòu)(見例如Franklin et al.，Cancer Cell 5317-328(2004))。
HER2抗體可比Trastuzumab更有效(例如至少2倍更有效)地“抑制HRG依賴性AKT磷酸化”和/或抑制“HRG或TGFα依賴性MAPK磷酸化”(見例如Agus et al.，Cancer Cell 2127-137(2002)和本文實施例4)。
HER2抗體可以是“不抑制HER2胞外域切割”的抗體(Molina et al.，Cancer Res.614744-4749(2001))。
“結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點的”HER2抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基(且任選還結(jié)合HER2的胞外域以外的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基)，且至少在一定程度上能在空間上阻礙HER2-EGFR、HER2-HER3或HER2-HER4異二聚體的形成。Franklin et al.，Cancer Cell5317-328(2004)表征了存放在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(ID Code IS78)的HER2-Pertuzumab晶體結(jié)構(gòu)，舉例說明了結(jié)合HER2的異二聚體結(jié)合位點的例示性抗體。
“結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的”抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域II中的殘基和任選HER2的其它結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)構(gòu)域I和III中的殘基。優(yōu)選的是，結(jié)合結(jié)構(gòu)域II的抗體結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域I、II和III之間的連接處。
“卵巢”是女性體內(nèi)位于子宮任一側(cè)的兩個小杏仁形器官之一。
“法羅皮氏管(fallopian tube)”或“輸卵管”是從雌性哺乳動物卵巢通入子宮的兩條細管之一。
“腹膜”是諸如腹部等體腔的上皮層。
“卵巢癌(Ovarian cancer)”是在一個或兩個卵巢中發(fā)生的有可能威脅生命的惡性腫瘤。到卵巢癌的癥狀出現(xiàn)時，卵巢腫瘤可能已經(jīng)長大到足以使癌細胞發(fā)散到整個腹部。已經(jīng)擴散到卵巢以外的卵巢癌細胞稱為轉(zhuǎn)移性卵巢癌。卵巢腫瘤趨向于擴散至膈、腸和/或網(wǎng)膜(腹部覆蓋和襯墊器官的脂肪層)。癌細胞還可通過淋巴管和血流擴散到其它器官。本文待治療的卵巢癌包括三種主要類型的惡性卵巢腫瘤，即上皮腫瘤、生殖細胞腫瘤和基質(zhì)腫瘤。
“原發(fā)性腹膜癌(primary peritoneal carcinoma)”指在腹膜中發(fā)生的癌癥。原發(fā)性腹膜癌在微觀形態(tài)、癥狀、擴散模式和預(yù)后上可能與上皮卵巢癌非常相似。卵巢被切除的婦女仍然可能患上原發(fā)性腹膜癌。
“輸卵管癌(Fallopian tube carcinoma)”指輸卵管和/或?qū)掜g帶的癌癥。
“上皮腫瘤”發(fā)生于圍繞在卵巢外周，稱為生殖上皮的一層立方形細胞中。上皮腫瘤占全部卵巢癌的可多達90％。
“生殖細胞腫瘤”發(fā)現(xiàn)于卵巢的卵成熟細胞中。生殖細胞腫瘤占所有卵巢癌的約3％，多數(shù)發(fā)生于青少年和年輕女性中。
“基質(zhì)腫瘤”由將卵巢維持在一起并產(chǎn)生雌性激素、雌激素和孕酮的結(jié)締組織細胞發(fā)生?；|(zhì)瘤占全部卵巢癌的6％。
“腫瘤樣品”在本文中指衍生自患者腫瘤的樣品或者包含來自患者腫瘤的腫瘤細胞的樣品。腫瘤樣品的例子在本文中包括但不局限于腫瘤活組織切片檢查、循環(huán)中腫瘤細胞、循環(huán)中血漿蛋白質(zhì)、腹水、衍生自腫瘤或呈現(xiàn)腫瘤樣特性的原代細胞培養(yǎng)物或細胞系，以及保存的腫瘤樣品，諸如福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤樣品。
“生長抑制劑”在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細胞，尤其是表達HER的癌細胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低S期的表達HER細胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春花生物堿類(長春新堿和長春堿)、紫杉醇、和拓撲異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星、表柔比星、柔紅霉素、依托泊苷和博來霉素。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑諸如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴嗪、雙氯乙基甲胺、順鉑、甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和ara-C。其它信息可參見在《The Molecular Basis of Cancer》中，Mendelsohn和Israel編，第1章，題為“Cell cycle regulation，oncogenes，and antieioplasticdrugs”，Murakaini等人，WB Saunders，Philadelphia，1995，尤其是第13頁。
“生長抑制性”抗體的例子是那些結(jié)合HER2并抑制過表達HER2的癌細胞生長的抗體。優(yōu)選的生長抑制性HER2抗體在約0.5-30μg/ml的抗體濃度對細胞培養(yǎng)中SK-BR-3乳房腫瘤細胞的生長抑制大于20％，優(yōu)選大于50％(例如從約50％至約100％)，其中生長抑制是在SK-BR-3細胞暴露于抗體后6天測定的(參見1997年10月14日發(fā)布的美國專利5,677,171)。該專利及下文中更詳細的描述了SK-BR-3細胞生長抑制測定法。優(yōu)選的生長抑制性抗體是鼠單克隆抗體4D5的人源化變體，例如Trastuzumab。
“誘導凋亡”的抗體指那些根據(jù)膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA斷裂、細胞收縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細胞破裂和/或膜囊形成(稱作凋亡小體)的測定，誘導程序性細胞死亡的抗體。所述細胞通常是過表達HER2受體的細胞。優(yōu)選所述細胞是腫瘤細胞，例如乳房、卵巢、胃、子宮內(nèi)膜、唾液腺、肺、腎、結(jié)腸、甲狀腺、胰和膀胱細胞。在體外，所述細胞可以是SK-BR-3、BT474、Calu3細胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。有多種方法可用于評估與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測量磷脂酰絲氨酸(PS)易位；可通過DNA梯化(laddering)來評估DNA斷裂；而可通過亞二倍體細胞的任何增加來評估伴隨著DNA斷裂的核/染色質(zhì)濃縮。優(yōu)選的是，誘導凋亡的抗體是在利用BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定法(見下文)中導致對膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導相對于未處理細胞提高約2至50倍，優(yōu)選約5至50倍，最優(yōu)選約10至50倍的抗體。誘導凋亡的HER2抗體的例子是7C2和7F3。
“表位2C4”指HER2胞外域中抗體2C4所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合2C4表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉封閉測定法，諸如《Antibodies，ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和DavidLane，1988中所描述的?；蛘撸蛇M行表位作圖以評估抗體是否結(jié)合HER2的2C4表位(例如HER2的大約第22位殘基至大約第584位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個或多個殘基，含；參見圖1A-B)。表位2C4包含來自HER2胞外域中結(jié)構(gòu)域II的殘基。2C4和Pertuzumab在結(jié)構(gòu)域I、II和III的連接處結(jié)合HER2的胞外域。Franklin et al.，Cancer Cell5317-328(2004)。
“表位4D5”指HER2胞外域中抗體4D5(ATCC CRL 10463)和Trastuzumab所結(jié)合的區(qū)域。此表位接近HER2的跨膜域，且在HER2的結(jié)構(gòu)域IV之內(nèi)。為了篩選結(jié)合4D5表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉封閉測定法，諸如《(Antibodies，ALaboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所描述的?；蛘撸蛇M行表位作圖以評估抗體是否結(jié)合HER2的4D5表位(例如HER2的大約第529位殘基至大約第625位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個或多個殘基，含；參見圖1A-B)。
“表位7C2/7F3”指HER2胞外域的結(jié)構(gòu)域I內(nèi)N末端處7C2和/或7F3抗體(各自保藏于ATCC，見下文)所結(jié)合的區(qū)域。為了篩選結(jié)合7C2/7F3表位的抗體，可進行常規(guī)的交叉封閉測定法，諸如《Antibodies，A LaboratoryManual》，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所描述的?；蛘?，可進行表位作圖以確定抗體是否結(jié)合HER2上的7C2/7F3表位(例如HER2的大約第22位殘基至大約第53位殘基區(qū)域內(nèi)的任何一個或多個殘基；參見圖1A-B)。
“ 治療”指治療性處理和預(yù)防性措施二者。需要治療的受試者包括早就患有癌癥的受試者以及要預(yù)防癌癥的受試者。因此，本文中待治療的患者可能已經(jīng)診斷為患有癌癥或者可能有患上癌癥的傾向性或易感性。
術(shù)語“有效量”指在患者中有效治療癌癥的藥物量。藥物的有效量可減少癌細胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)癌細胞浸潤到周圍器官中；抑制(即減緩到一定程度和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在某種程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥相關(guān)的癥狀。在藥物可阻止生長和/或殺死現(xiàn)有癌細胞的程度上，它可以是抑制細胞的和/或細胞毒性的。有效量可延長無進展存活(例如通過實體瘤的響應(yīng)評估標準(Response Evaluation Criteria for Solid Tumors，RECIST)或CA-125變化來測量)，導致客觀響應(yīng)(包括部分響應(yīng)，PR或完全響應(yīng)，CR)，增加總體存活時間，和/或改善癌癥的一種或多種癥狀(例如通過FOSI來評估)。
“總體存活(Overall survival)”指確定的一段時間，諸如例如從診斷或治療開始1年、5年等，仍活著的患者。
“無進展存活(progression free survival)”指仍活著且癌癥未惡化的患者。
“客觀響應(yīng)(objective response)”指可測量的響應(yīng)，包括完全響應(yīng)(complete response，CR)或部分響應(yīng)(partial response，PR)。
“完全響應(yīng)”或“部分響應(yīng)”意指響應(yīng)治療而發(fā)生癌癥的所有體征消失。這并非總是意味著癌癥已經(jīng)治愈。
“部分響應(yīng)”指響應(yīng)治療而發(fā)生一個或多個腫瘤或病變的尺寸縮小，或者體內(nèi)癌癥的范圍縮小。
“表達HER的癌癥”是包含在其細胞表面存在HER蛋白質(zhì)的細胞的癌癥。
“表達HER2的癌癥”是在其細胞表面產(chǎn)生足夠水平的HER2的癌癥，使得HER2抗體可與之結(jié)合并具有對于所述癌癥的治療效果。
“過表達”HER受體的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，在其細胞表面具有顯著更高水平的HER受體諸如HER2的癌癥。這樣的過表達可以是由基因擴增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的?？稍谠\斷或預(yù)后測定法中通過評估細胞表面上存在的HER蛋白質(zhì)水平的增加(例如通過免疫組化測定法，IHC)來確定HER受體的過表達?；蛘?另外，可測量細胞中HER編碼核酸的水平，例如通過熒光原位雜交(FISH；參見1998年10月公布的WO98/45479)、DNA印跡或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)，諸如實時定量PCR(RT-PCR)。還可通過測量諸如血清等生物學流體中的脫落抗原(例如HER胞外域)來研究HER受體過表達(參見例如1990年6月12日發(fā)布的美國專利4,933,294；1991年4月18日發(fā)布的WO91/05264；1995年3月28日發(fā)布的美國專利5,401,638；以及Sias et al.，J.Immunol.Methods 13273-80(1990))。除了上述測定法之外，熟練技術(shù)人員還可利用多種體內(nèi)測定法。例如，可將患者體內(nèi)細胞暴露于任選用例如放射性同位素等可檢測標記物標記的抗體，并且可評估抗體與患者體內(nèi)細胞的結(jié)合，例如通過外部掃描放射性或通過分析取自事先已暴露于所述抗體的患者的活組織檢查切片。
相反，“不過表達HER2受體”的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，不表達高于正常水平的HER2受體的癌癥。
“過表達”HER配體的癌癥是與同一組織類型的非癌細胞相比，產(chǎn)生顯著更高水平的該配體的癌癥。這樣的過表達可以是由基因擴增或者轉(zhuǎn)錄或翻譯增加引起的。可通過評估患者體內(nèi)，例如腫瘤活組織檢查切片中所述配體(或編碼它的核酸)的水平，或者通過諸如IHC、FISH、DNA印跡、PCR或上述體內(nèi)測定法等各種診斷測定法從診斷上確定HER配體的過表達。
術(shù)語“胞毒劑”在用于本文時指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意欲包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)、化療劑、和毒素諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體。
“化療劑”指可用于治療癌癥的化學化合物。化療劑的例子包括烷化劑類，諸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimine)和甲基蜜胺類(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝內(nèi)酯類(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素類(colchicine)；白樺脂酸(betulinic acid)；喜樹堿(camptothecin)(包括合成類似物拓撲替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隱藻素類(cryptophycin)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合成類似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、膽磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如烯二炔類(enediyne)抗生素(如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素γ1I和加利車霉素ωI1(見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33183-186(1994))；蒽環(huán)類(dynemicin)抗生素，包括dynemicin A；二碳磷酸鹽類(bisphosphonate)，諸如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素(mitomycin)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培來霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、多西氟尿啶(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸羥甲雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfomithine)；醋酸羥吡咔唑(elliptinium acetate)；epothilone；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物堿類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和美登醇(maytansinol)；安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK多糖復合物(JHSNatural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、桿孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺；噻替哌；紫杉烷類(taxane)，如TAXOL紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM紫杉醇的不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(doxetaxel)(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，F(xiàn)rance)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉑類似物，諸如順鉑和卡鉑；長春堿(vinblastine)(VELBAN)；鉑；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)(ONCOVIN)；奧沙利鉑(oxaliplatin)；亞葉酸(leucovovin)；長春瑞賓(vinorelbine)(NAVELBINE)；諾安托(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(xeloda)；伊拜膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構(gòu)酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維A酸，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；以及上述任何物質(zhì)的制藥學可接受的鹽、酸或衍生物；以及上述兩種或多種的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸(leucovovin)的治療方案的縮寫)。
該定義還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、keoxifene、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene)；抑制調(diào)節(jié)腎上腺中雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿納托唑(anastrozole)；及抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘著性細胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-α、Ralf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；PROLEUKINrIL-2；LURTOTECAN拓撲異構(gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH；及上述任何物質(zhì)的制藥學可接受的鹽、酸或衍生物。
“抗代謝物化療劑”是結(jié)構(gòu)類似于代謝物，但不以生產(chǎn)性方式被身體所利用的藥劑。許多抗代謝物化療劑干擾核酸，RNA和DNA的生成。抗代謝物化療劑的例子包括吉西他濱(GEMZAR)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他濱(XELODATM)、6-巰基嘌呤、甲氨喋呤、6-硫鳥嘌呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲塞(raltitrexed)、阿糖胞苷(arabinosylcytosine，ARA-C，cytarabine)(CYTOSAR-U)、達卡巴嗪(DTIC-DOME)、azocytosine、脫氧胞嘧啶(deoxycytosine)、pyridmidene、氟達拉濱(FLUDARA)、克拉屈濱(cladribine)、2-脫氧-D-葡萄糖等。優(yōu)選的抗代謝物化療劑是吉西他濱。
“吉西他濱”或“2′-脫氧-2′，2′-二氟胞嘧啶單鹽酸(b-異構(gòu)體)”是展示抗腫瘤活性的核苷類似物。鹽酸吉西他濱的實驗式是C9H11F2N3O4·HCl。鹽酸吉西他濱由Eli Lilly以商標GEMZAR銷售。
“基于鉑的化療劑”包括含有鉑作為分子的整體組成部分的有機化合物?；阢K的化療劑的例子包括卡鉑、順鉑和奧沙利鉑(oxaliplatinum)。
“基于鉑的化療”意指用一種或多種基于鉑的化療劑任選聯(lián)合一種或多種其它化療劑的療法。
“鉑耐受性”癌癥意指在接受基于鉑的化療時病情仍進展的癌癥患者(即患者是“鉑難以控制的”)，或者在完成基于鉑的化療方案后12個月內(nèi)(例如6個月內(nèi))病情有進展的患者。
在用于本文時，術(shù)語“EGFR靶向藥物”指結(jié)合EGFR并任選抑制EGFR活化的治療劑。此類藥劑的例子包括結(jié)合EGFR的抗體和小分子。結(jié)合EGFR的抗體的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506)、MAb 455(ATCC CRLHB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(參見Mendelsohn等人的美國專利4,943,533及其變體，諸如嵌合化225(C225或Cetuximab；ERBUTIX)和重構(gòu)人225(H225)(參見Imclone Systems Inc.的WO 96/40210)；結(jié)合II型突變體EGFR的抗體(美國專利5,212,290)；結(jié)合EGFR的人源化和嵌合抗體，如美國專利5,891,996中所述；及結(jié)合EGFR的人抗體，諸如ABX-EGF(參見Abgenix的WO 98/50433)?？笶GFR抗體可與胞毒劑偶聯(lián)，由此產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物(參見例如EP 659,439 A2，MerckPatent GmbH)。結(jié)合EGFR的小分子的例子包括ZD1839或Gefitinib(IRESSATM；AstraZeneca)、CP-358774或Erlotinib HCl(TARCEVATM；Genentech/OSI)和AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)。
“酪氨酸激酶抑制劑”是在某種程度上抑制酪氨酸激酶諸如HER受體的酪氨酸激酶活性的分子。這樣的抑制劑的例子包括上一段中提到的EGFR靶向藥物，以及小分子HER2酪氨酸激酶抑制劑諸如可從Takeda購買的TAK165、優(yōu)先結(jié)合EGFR但抑制HER2和EGFR過表達細胞的雙重HER抑制劑諸如EKB-569等(可從Wyeth購買)、GW572016(可從Glaxo購買)一種口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制劑、及PKI-166(可從Novartis購買)；泛HER(pan-HER)抑制劑，諸如canertinib(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制劑，諸如可從ISIS Pharmaceuticals購買的，抑制Raf-1信號傳導的反義劑ISIS-5132；非HER靶向TK抑制劑，諸如可從Glaxo購買的Imatinibmesylate(GleevacTM)；MAPK胞外調(diào)控激酶I抑制劑CI-1040(可從Pharmacia購買)；喹唑啉類，諸如PD 153035，4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶類；嘧啶并嘧啶類；吡咯并嘧啶類，諸如CGP 59326、CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶類，4-(苯氨基)-7H-吡咯[2，3-d]嘧啶；姜黃素(二阿魏酰甲烷，4，5-雙(4-氟苯胺基)-酞亞胺)；含硝基噻吩模塊的tyrphostines；PD-0183805(Warner-Lambert)；反義分子(如那些結(jié)合HER編碼核酸的反義分子)；喹喔啉(美國專利5,804,396)；tryphostins(美國專利5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制劑，諸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；Imatinib mesylate(Gleevec；Novartis)；PKI 166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Sugen)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone)；或任何如下專利出版物中所記載的美國專利5,804,396；WO 99/09016(American Cyanimid)；WO98/43960(American Cyanamid)；WO 97/3 8983(Warner Lambert)；WO99/06378(Wamer Lambert)；WO 99/06396(Warner Lambert)；WO 96/30347(Pfizer，Inc.)；WO 96/33978(Zeneca)；WO 96/3397(Zeneca)；及WO96/33980(Zeneca)。
“抗血管生成劑”指阻斷或在某種程度上干擾血管發(fā)育的化合物?？寡苌梢蜃涌梢允抢缃Y(jié)合涉及促進血管生成的生長因子或生長因子受體的小分子或抗體。在本文中優(yōu)選的抗血管生成因子是結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抗體，諸如Bevacizumab(AVASTEN)。
術(shù)語“細胞因子”指由一種細胞群釋放的、作為細胞間介質(zhì)作用于另一細胞的蛋白質(zhì)的通稱。此類細胞因子的例子是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素，諸如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素、和牛生長激素；甲狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松馳素；松馳素原；糖蛋白激素類，諸如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體激素(LH)；肝生長因子；成纖維細胞生長因子；促乳素；胎盤催乳激素；腫瘤壞死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物質(zhì)；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；激活素(activin)；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生長因子，諸如NGF-β；血小板衍生生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，諸如TGF-α和TGF-β；胰島素樣生長因子-I和-II；促紅細胞生成素(EPO)；骨誘導因子(osteoinductive factor)；干擾素，諸如干擾素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，諸如巨噬細胞CSF(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)和粒細胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，諸如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；腫瘤壞死因子，諸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。在用于本文時，術(shù)語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)和天然序列細胞因子的生物學活性等效物。
II.HER2抗體的產(chǎn)生下文描述了用于生成依照本發(fā)明使用的抗體的例示性技術(shù)。用于生成抗體的HER2抗原可以是例如可溶形式的HER2胞外域或其含有所需表位的部分?；蛘撸谄浼毎砻姹磉_HER2的細胞(例如經(jīng)轉(zhuǎn)化而過表達HER2的NIH-3T3細胞；或癌細胞系，諸如SK-BR-3細胞，參見Stancovski et al.，PNAS(USA)888691-8695(1991))可用于生成抗體。可用于生成抗體的其它形式HER2對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
(i)多克隆抗體多克隆抗體優(yōu)選通過在動物中多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑來生成。使用雙功能或衍生化試劑，例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺酯(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烴基，將相關(guān)抗原與在待免疫的物種中有免疫原性的蛋白質(zhì)偶聯(lián)可能是有用的，例如匙孔血藍蛋白、血清清蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑。
通過將例如100μg或5μg蛋白質(zhì)或偶聯(lián)物(分別用于兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混和，并將該溶液皮內(nèi)注射于多個部位，由此將動物針對抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物進行免疫。一個月后，通過多個部位的皮下注射，用弗氏完全佐劑中肽或偶聯(lián)物初始量的1/5-1/10對動物進行強化。7-14天后，采集動物的血液，并測定血清的抗體滴度。對動物進行強化直到滴度達到穩(wěn)定。優(yōu)選的是，將動物用相同抗原但與不同蛋白質(zhì)和/或通過不同交聯(lián)劑偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物進行強化。偶聯(lián)物還可在重組細胞培養(yǎng)物中作為蛋白質(zhì)融合物來制備。同樣，適當使用凝聚劑諸如明礬來增強免疫應(yīng)答。
(ii)單克隆抗體單克隆抗體是由一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以很少量存在的可能的天然存在突變外。因此，修飾語“單克隆”表示抗體的特征，即不是分立抗體的混合物。
例如，單克隆抗體可通過最初由Kohler et al.，Nature 256495(1975)描述的雜交瘤方法來制備，或者可通過重組DNA方法來制備(美國專利4,816,567)。
在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合適的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘?，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，使用合適的融合劑諸如聚乙二醇將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成雜交瘤細胞(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。
將如此制備的雜交瘤細胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏酶次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，則用于雜交瘤的培養(yǎng)基通常將含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細胞生長。
優(yōu)選的骨髓瘤細胞是那些高效融合、支持所選抗體生成細胞穩(wěn)定的高水平生成抗體、并對諸如HAT培養(yǎng)基等培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細胞。在這些細胞中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是鼠源骨髓瘤系，諸如那些可從Salk Institute CellDistribution Center(San Diege，California，USA)獲得的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤的衍生系，以及可從American Type Culture Collection(Rockville，Maryland，USA)獲得的SP-2或X63-Ag8-653細胞。用于生成人單克隆抗體的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系也已有描述(Kozbor，J. Immunol.1333001(1984)；及Brodeur等人，《Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications》，51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
可對雜交瘤細胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)，測定由雜交瘤細胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。
單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過例如Munson et al.，Anal.Biochem.107220(1980)的Scatchard分析來測定。
在鑒定得到生成具有所需特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，所述克隆可通過有限稀釋流程進行亞克隆，并使用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，《Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice》，59-103，Academic Press，1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可在動物中作為腹水瘤進行體內(nèi)培養(yǎng)。
可通過常規(guī)抗體純化流程，諸如例如蛋白A-Sepharose、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析，將亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當分開。
編碼單克隆抗體的DNA易于通過常規(guī)流程分離并測序(例如使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠源抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。以雜交瘤細胞作為所述DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，可將DNA置于表達載體中，然后將該表達載體轉(zhuǎn)染到宿主細胞中，諸如不另外產(chǎn)生抗體蛋白質(zhì)的大腸桿菌細胞、猿猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述性論文包括Skerra et al.，Curr.Opinion in Immunol.5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。
在另一個實施方案中，可從使用McCafferty et al.，Nature 348552-554(1990)所述技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫中分離抗體或抗體片段。Clackson et al.，Nature 352624-628 (1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分別描述了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。后續(xù)出版物描述了通過鏈改組(Marks et al.，Bio/Technology10779-783(1992))，以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的噬菌體文庫的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.212265-2266(1993))，生成高親和力(nM范圍)的人源抗體。因此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
還可以修飾DNA，例如通過替代即用人重鏈和輕鏈恒定區(qū)的編碼序列代替同源鼠源序列(美國專利4,816,567；及MorTison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851(1984))，或通過共價接合免疫球蛋白編碼序列和非免疫球蛋白多肽的整個或部分編碼序列。
通常，用此類非免疫球蛋白多肽替代抗體的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點及對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。
(iii)人源化抗體本領(lǐng)域已經(jīng)描述了用于將非人抗體人源化的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作“輸入”殘基，它們通常取自“輸入”可變區(qū)。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法進行(Jones et al.，Nature 321522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 2391534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567)，其中本質(zhì)上少于整個人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體通常是其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代的人抗體。
用于制備人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈，對于降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂的“最適(best-fit)”方法，用嚙齒類抗體可變區(qū)序列對已知的人可變區(qū)序列的整個文庫進行篩選。然后選擇與嚙齒類最接近的人序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims et al.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一種方法使用由特定輕鏈或重鏈可變區(qū)亞組的所有人抗體的共有序列衍生的特定框架區(qū)。同一框架可用于數(shù)種不同的人源化抗體(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 894285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.1512623(1993))。
更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高親和力及其它有利的生物學特性。為了實現(xiàn)這一目的，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可獲得的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉。還可獲得圖解和顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像能夠分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選出FR殘基并進行組合，從而獲得所需抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。通常，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)的涉及對抗原結(jié)合的影響。
下文實施例3描述了結(jié)合HER2并阻斷HER受體的配基活化的例示性人源化HER2抗體的生成。本文中特別感興趣的人源化抗體基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的阻斷EGF、TGF-α和/或HRG介導的MAPK激活，和/或基本上像鼠單克隆抗體2C4(或其Fab片段)一樣有效的結(jié)合HER2。本文中的人源化抗體可以例如包含摻入人重鏈可變區(qū)的非人高變區(qū)殘基，而且還可以在選自69H、71H和73H的位置包含框架區(qū)(FR)替代，采用的是Kabat等人，《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中給出的可變區(qū)編號系統(tǒng)。在一個實施方案中，人源化抗體在69H、71H和73H的兩個或所有位置包含F(xiàn)R替代。
本文中的例示性目的人源化抗體包含重鏈可變區(qū)互補決定殘基GFTFTDYTMX，其中X優(yōu)選是D或S(SEQ ID NO7)；DVNPNSGGSIYNQRFKG(SEQ ID NO8)；和/或NLGPSFYFDY(SEQ IDNO9)，任選包含這些CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述重鏈可變區(qū)CDR序列中具有約1個到約7個或者約5個氨基酸替代。這樣的抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO4中的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。
例如，除了前一段落中的那些重鏈可變區(qū)CDR殘基之外，人源化抗體還可包含輕鏈可變區(qū)互補決定殘基KASQDVSIGVA(SEQ ID NO10)；SASYX1X2X3，其中X1優(yōu)選是R或L，X2優(yōu)選是Y或E，而X3優(yōu)選是T或S(SEQ ID NO11)；和/或QQYYIYPYT(SEQ ID NO12)。這樣的人源化抗體任選包含上述CDR殘基的氨基酸修飾，例如其中修飾基本上保持或改善抗體的親和力。例如，目的抗體變體可在上述輕鏈可變區(qū)CDR序列中具有約1個到約7個或者約5個氨基酸替代。這樣的抗體變體可通過親和力成熟來制備，例如如下文所述。最優(yōu)選的人源化抗體包含SEQ ID NO3中的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。
本申請還設(shè)想了親和力成熟的抗體，它結(jié)合HER2并阻斷HER受體的配基活化。親本抗體可以是人抗體或人源化抗體，例如包含輕鏈和/或重鏈可變區(qū)序列分別為SEQ ID NO3和4的抗體(即變體574)。親和力成熟的抗體優(yōu)選以高于鼠2C4或變體574的親和力結(jié)合HER2受體(例如根據(jù)采用HER2胞外域(ECD)ELISA的評價，例如親和力改善約2倍或約4倍到約100倍或約1000倍)。例示性的用于替代的重鏈可變區(qū)CDR殘基包括H28、H30、H34、H35、H64、H96、H99，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2、3、4、5、6或7個)。用于改變的輕鏈可變區(qū)CDR殘基的例子包括L28、L50、L53、L56、L91、L92、L93、L94、L96、L97，或者兩個或多個的組合(例如這些殘基中的2至3、4、5或直到約10個)。
還設(shè)想了各種形式的人源化抗體或親和力成熟的抗體。例如，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是抗體片段，諸如Fab，它任選與一種或多種胞毒劑偶聯(lián)以產(chǎn)生免疫偶聯(lián)物?；蛘?，人源化抗體或親和力成熟的抗體可以是完整抗體，諸如完整的IgG1抗體。
(iv)人抗體作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫后生成人抗體完整全集的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大量人種系免疫球蛋白基因?qū)е略诳乖艉笊扇丝贵w。參見例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year in Immuno.733(1993)；及美國專利5,591,669、5,589,369和5,545,807。
或者，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty et al.，Nature 348552-553(1990))可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)區(qū)基因全集生成人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V區(qū)基因克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因的讀碼框中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進行的選擇也導致編碼展示那些特性的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；有關(guān)綜述參見例如Johnson，Kevin S.and Chiswell，David J.，CurrentOpinion in Structural Biology 3564-571(1993)。V基因區(qū)段的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature 352624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫分離得到大量不同的抗噁唑酮抗體。可本質(zhì)上依照Marks et al.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffth et al.，EMBO J.12725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集，并分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利5,565,332和5,573,905。
還可通過體外激活B細胞(參見美國專利5,567,610和5,229,275)來生成人抗體。
1998年6月30日發(fā)布的美國專利5,772,997和1997年1月3日出版的WO 97/00271中描述了人HER2抗體。
(v)抗體片段已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來衍生這些片段(參見例如Morimoto et al.，Journal of Biochemicaland Biophysical Methods 24107-117(1992)及Brennan et al.，Science 22981(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細胞生成這些片段。例如，可從上文討論的噬菌體抗體庫分離抗體片段?；蛘撸芍苯訌拇竽c桿菌回收Fab′-SH片段，并通過化學方法偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)物分離F(ab′)2片段。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對熟練從業(yè)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO 93/16185；美國專利5,571,894；和美國專利5,587,458?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如如美國專利5,641,870中所述。所述線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。
(vi)雙特異性抗體雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合HER2蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此類抗體可將HER2結(jié)合位點與EGFR、HER3和/或HER4的結(jié)合位點進行組合?；蛘?，HER2臂可與結(jié)合白細胞上觸發(fā)分子諸如T細胞受體分子(例如CD2或CD3)或IgG的Fc受體(FcγR)，諸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的臂組合，使得細胞防御機制聚焦于HER2表達細胞。雙特異性抗體還可用于將胞毒劑定位于表達HER2的細胞。這些抗體擁有HER2結(jié)合臂及結(jié)合胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-α、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab′)2雙特異性抗體)。
WO 96/16673描述了一種雙特異性HER2/FcγRIII抗體，而美國專利5,837,234公開了一種雙特異性HER2/FcγRI抗體IDM1(Osidem)。WO98/02463顯示了一種雙特異性HER2/Fcα抗體。美國專利5,821,337教導了一種雙特異性HER2/CD3抗體。MDX-210是一種雙特異性HER2-FcγRIII抗體。
用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生成基于兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein et al.，Nature 305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進行的正確分子的純化相當麻煩，且產(chǎn)物產(chǎn)量低。WO 93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.103655-3659(1991)中公開了類似的流程。
根據(jù)一種不同的方法，將具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。融合優(yōu)選使用包含至少部分鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。優(yōu)選的是，在至少一種融合物中具有包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物以及，如果需要，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了很大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比率表達導致高產(chǎn)量時或在該比率沒有特別意義時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入同一個載體。
在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了分離的便利途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將所需雙特異性復合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法公開于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的其它細節(jié)參見例如Suresh et al.，Methodsin Enzymology 121210(1986)。
根據(jù)美國專利5,731,168中描述的另一種方法，可改造一對抗體分子之間的界面，將從重組細胞培養(yǎng)物中回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分CH3抗體恒定區(qū)。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大氨基酸側(cè)鏈，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生針對大側(cè)鏈的相同或相似大小的補償性“空腔”。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。
雙特異性抗體包括交聯(lián)或“異源偶聯(lián)”抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體建議用于將免疫系統(tǒng)細胞靶向不想要的細胞(美國專利4,676,980)，和用于治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373和EP 03089)?？墒褂萌魏伪憷慕宦?lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)一起公開于美國專利4,676,980。
文獻中還描述了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學連接來制備雙特異性抗體。Brennan et al.，Science 22981(1985)描述了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab′)2片段的方法。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab’片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸郊姿狨?TNB)衍生物。然后將Fab′-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復成Fab′-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab′-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。
最近的進展使得從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段變得更加容易，這些片段可化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175217-225(1992)描述了生成完全人源化的雙特異性抗體F(ab′)2分子。每個Fab′片段由大腸桿菌分開分泌，并在體外進行定向化學偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。如此形成的雙特異性抗體能夠結(jié)合過表達HER2受體的細胞和正常人T細胞，以及觸發(fā)人細胞毒性淋巴細胞針對人乳房腫瘤靶的溶解活性。
還描述了從重組細胞培養(yǎng)物直接制備和分離雙特異性抗體片段的多種技術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab′部分連接。抗體同二聚體在鉸鏈區(qū)還原而形成單體，然后重新氧化而形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。由Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 906444-6448(1993)描述的“雙抗體”技術(shù)提供了制備雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)，所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的VH和VL結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補VL和VH結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gruber et al.，J.Immunol.1525368(1994)。
設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt et al.，J.Immunol. 14760(1991)。
(vii)其它氨基酸序列修飾設(shè)想了本文所述HER2抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學特性。通過將適當?shù)暮塑账岣淖円際ER2抗體核酸或者通過肽合成法來制備HER2抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如HER2抗體氨基酸序列中的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有所需特性，可進行刪除、插入和替代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可能改變HER2抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。
可用于鑒定HER2抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作“丙氨酸掃描突變”，如Cunningham and Wells，Science 2441081-1085(1989)所述。這里，鑒定了一個或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與HER2抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變體，推敲那些對替代顯示功能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析在指定位點處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進行丙氨酸掃描誘變或隨機突變，并對所表達的HER2抗體變體篩選所需活性。
氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-末端的融合，長度范圍從一個殘基到包含上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰殘基的HER2抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。HER2抗體分子的其它插入變體包括在HER2抗體的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或提高抗體血清半衰期的多肽。
另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在HER2抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進行替代誘變的位點包括高變區(qū)，但也考慮了FR改變。保守替代在表1中顯示在標題“優(yōu)選替代”下。如果此類替代導致生物學活性的改變，那么可以引入表1中稱為“例示替代”的更實質(zhì)性改變，或如下文中關(guān)于氨基酸種類的進一步描述，并篩選產(chǎn)物。
表1
對抗體生物學特性的實質(zhì)性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積。根據(jù)其側(cè)鏈特性的相似性，可將氨基酸如下分組(A.L.Lehninger，在《Biochemistry》中，第2版，73-75，Worth Publishers，New York，1975)(1)非極性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不帶電荷的、極性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)堿性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，可將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的Asp、Glu；(4)堿性的His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro；(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。
非保守替代將需要用這些類別之一中的一個成員交換另一個類別的。
任何不涉及保持HER2抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改進分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當抗體是抗體片段諸如Fv片段時)。
特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改進的生物學特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，將數(shù)個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)突變，在各個位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可進行丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合具有重要貢獻的高變區(qū)殘基。或者/另外，分析抗原-抗體復合物的晶體結(jié)構(gòu)，以鑒定抗體和人HER2之間的接觸點可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進行替代的候選位點。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對該組變體進行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進一步的開發(fā)。
抗體的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗體中發(fā)現(xiàn)的一個或多個碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位點。
抗體的糖基化通?；蚴荖-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列其中任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
向抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上文描述的三肽序列而便利的完成(用于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(用于O-連接的糖基化位點)。
編碼HER2抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域已知的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對早期制備的變體或非變體型式的HER2抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。
可能希望在效應(yīng)物功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而使得在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改善的內(nèi)在化能力和/或提高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J.Exp.Med.1761191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.1482918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al.，Cancer Research 532560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯(lián)劑來制備。或者，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，并由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson etal.，Anti-Cancer Drug Design3219-230(1989)。
為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5,739,277中所述將補救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術(shù)語“補救受體結(jié)合表位”指IgG分子(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區(qū)中負責提高IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。
(viii)篩選具有期望特性的抗體上文已經(jīng)描述了用于生成抗體的技術(shù)。如果需要，還可以選擇具有某些生物學特征的抗體。
為了鑒定阻斷HER受體的配體活化的抗體，可測定抗體阻斷HER配體結(jié)合表達HER受體(例如偶聯(lián)另一種HER受體，該HER受體與目的HER受體形成HER異寡聚體)的細胞的能力。例如，可將天然表達或者經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達HER異寡聚體的HER受體的細胞與抗體一起溫育，然后暴露于經(jīng)標記的HER配體。然后可評估HER2抗體阻斷配體結(jié)合HER異寡聚體中的HER受體的能力。
例如，可以基本上如下文實施例1中所述，以24孔板的形式在冰上使用單層MCF7培養(yǎng)物進行HER2抗體對HRG結(jié)合MCF7乳房腫瘤細胞系的抑制?？蓪ER2單克隆抗體添加到各個孔中，并溫育30分鐘。然后可加入125I標記的rHRGβ1177-224(25pm)，并可繼續(xù)溫育4-16小時?？衫L制劑量-應(yīng)答曲線，并可計算目的抗體的IC50值。在一個實施方案中，阻斷HER受體的配體活化的抗體在此測定法中抑制HRG結(jié)合MCF7細胞的IC50為約50nM或更低，更優(yōu)選10nM或更低。當抗體是抗體片段諸如Fab片段時，在此測定法中抑制HRG結(jié)合MCF7細胞的IC50可以是例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
或者/另外，可評估HER2抗體阻斷HER異寡聚體中存在的HER受體的HER配體刺激的酪氨酸磷酸化的能力。例如，可將內(nèi)源表達或者經(jīng)轉(zhuǎn)染而表達HER受體的細胞與抗體一起溫育，然后使用抗磷酸酪氨酸單克隆(任選偶聯(lián)有可檢測標記物)測定HER配體依賴性酪氨酸磷酸化活性。美國專利5,766,863中描述的激酶受體活化測定法也可用于測定HER受體活化和抗體對該活性的阻斷。
在一個實施方案中，可以基本上如下文實施例1中所述，篩選在MCF7細胞中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抗體。例如，可將MCF7細胞鋪到24孔板中，并將HER2的單克隆抗體加入每個孔中，于室溫溫育30分鐘；然后可向每個孔中加入rHRGβ1177-244至終濃度0.2nM，并可繼續(xù)溫育8分鐘。從每個孔中吸走培養(yǎng)基，通過加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mMDTT，25mM Tris-HCl，pH 6.8)來終止反應(yīng)?？稍?-12％梯度凝膠(Novex)上對每一份樣品(25μl)進行電泳，然后通過電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。可對抗磷酸酪氨酸(以1μg/ml)免疫印跡顯影，并通過反射密度法(reflectancedensitometry)量化Mr約180,000的主要反應(yīng)性條帶的強度。在此測定法中，所選抗體優(yōu)選將HRG刺激p180酪氨酸磷酸化顯著抑制至對照的約0-35％?？衫L制通過反射密度法測定的對HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的抑制作用的劑量-應(yīng)答曲線，并可計算目的抗體的IC50。在一個實施方案中，阻斷HER受體的配體活化的抗體在此測定法中抑制p180酪氨酸磷酸化的HRG刺激的IC50為約50nM或更低，更優(yōu)選10nM或更低。當該抗體是抗體片段諸如Fab片段時，在此測定法中抑制HRG刺激p180酪氨酸磷酸化的IC50可以是例如約100nM或更低，更優(yōu)選50nM或更低。
還可評估抗體對MDA-MB-175細胞的生長抑制作用，例如基本上如Schaefer etal.，Oncogene 151385-1394(1997)中所述。依照此測定法，可將MDA-MB-175細胞用HER2單克隆抗體(10μg/mL)處理4天，并用結(jié)晶紫染色。與HER2抗體的溫育對此細胞系顯示的生長抑制作用可能與使用單克隆抗體2C4相似。在還有一個實施方案中，外源HRG不會顯著逆轉(zhuǎn)這種抑制作用。優(yōu)選的是，無論是否存在外源HRG，該抗體將能夠以大于單克隆抗體4D5的程度(并且任選以大于單克隆抗體7F3的程度)抑制MDA-MB-175細胞的細胞增殖。
在一個實施方案中，根據(jù)免疫共沉淀實驗的測定，諸如實施例2中所述，目的HER2抗體可在MCF7和SK-BR-3細胞中阻斷調(diào)蛋白依賴性的HER2與HER3結(jié)合，實質(zhì)上比單克隆抗體4D5更有效，且優(yōu)選實質(zhì)上比單克隆抗體7F3更有效。
為了鑒定生長抑制性HER2抗體，可篩選抑制過表達HER2的癌細胞生長的抗體。在一個實施方案中，在約0.5-30μg/ml的抗體濃度，所選生長抑制性抗體能夠?qū)⒓毎囵B(yǎng)中的SK-BR-3細胞生長抑制約20-100％，優(yōu)選約50-100％。為了鑒定這樣的抗體，可進行美國專利5,677,171中描述的SK-BR-3測定法。依照此測定法，在添加了10％胎牛血清、谷氨酰胺和青霉素鏈霉素的，F(xiàn)12和DMEM培養(yǎng)基的1∶1混合液中培養(yǎng)SK-BR-3細胞。以20,000個細胞將SK-BR-3細胞鋪入35mm細胞培養(yǎng)皿(2ml/35mm培養(yǎng)皿)。每個培養(yǎng)皿加入0.5-30μg/ml HER2抗體。6天后，用電子COULTERTM細胞計數(shù)器對細胞數(shù)計數(shù)，與未處理細胞比較?？蛇x擇那些將SK-BR-3細胞生長抑制約20-100％或約50-100％的抗體作為生長抑制性抗體。關(guān)于用于篩選生長抑制性抗體，諸如4D5和3E8的測定法，參見美國專利5,677,171。
為了選擇誘導凋亡的抗體，可利用使用BT474細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定法。如前一段落所討論的，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)和接種BT474細胞。然后除去培養(yǎng)基，只用新鮮培養(yǎng)基或者含有10μg/ml單克隆抗體的培養(yǎng)基替換。在3天溫育期后，用PBS洗滌細胞單層，通過胰蛋白酶消化脫離。然后如上文關(guān)于細胞死亡測定法所討論的，離心細胞，重懸于Ca2+結(jié)合緩沖液中，并等分到試管中。然后往試管中加入經(jīng)標記的膜聯(lián)蛋白(如膜聯(lián)蛋白V-FTIC)(1μg/ml)?？捎肍ACSCANTM流式細胞計數(shù)儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(Becton Dickinson)來分析樣品。選擇那些相對于對照誘導統(tǒng)計學顯著水平的膜聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體作為誘導凋亡的抗體。除了膜聯(lián)蛋白結(jié)合測定法，還可利用使用BT474細胞的DNA染色測定法。為了進行此測定法，將已經(jīng)如前面兩段所述用目的抗體處理過的BT474細胞與9μg/mlHOECHST 33342TM于37℃溫育2小時，然后用MODFIT LTTM軟件(VeritySoftware House)在EPIC S ELITETM流式細胞計數(shù)儀(Coulter Corporation)上進行分析?？蛇x擇在此測定法中誘導的凋亡細胞百分比變化比未處理細胞高2倍或更高(優(yōu)選3倍或更高)(直到100％凋亡細胞)的抗體作為促凋亡(pro-apoptotic)抗體。
為了篩選結(jié)合HER2上目的抗體所結(jié)合的表位的抗體，可進行常規(guī)交叉阻斷測定法，諸如《Antibodies，A Laboratory Manual》，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow和David Lane，1988中所述，以評估所述抗體是否交叉阻斷諸如2C4或Pertuzumab等抗體與HER2的結(jié)合?；蛘?另外，可通過本領(lǐng)域已知的方法進行表位作圖(參見例如本文圖1A和1B)，并且/或者可研究抗體-HER2結(jié)構(gòu)(Franklin et al.，Cancer Cell5317-328(2004))以了解抗體結(jié)合HER2的哪個/哪些結(jié)構(gòu)域。
(ix)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及包含抗體偶聯(lián)胞毒劑的免疫偶聯(lián)物，所述胞毒劑諸如化療劑、毒素(例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)。
上文已經(jīng)描述了可用于生成此類免疫偶聯(lián)物的化療劑。本文還設(shè)想了抗體與一種或多種小分子毒素的偶聯(lián)物，諸如加利車霉素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢菌毒素和CC1065。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將抗體與一個或多個美登素分子偶聯(lián)(例如每個抗體分子偶聯(lián)約1個至約10個美登素分子)。例如可將美登素轉(zhuǎn)變?yōu)镸ay-SS-Me，后者可還原為May-SH3并與經(jīng)修飾抗體反應(yīng)(Chari et al.，Cancer Research 52127-131(1992))以產(chǎn)生美登木素生物堿-抗體免疫偶聯(lián)物。
另一種目的免疫偶聯(lián)物包含偶聯(lián)有一個或多個加利車霉素分子的HER2抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾氐慕Y(jié)構(gòu)類似物包括但不限于γ1I、α2I、α3I、N-乙?；?γ1I、PSAG和θI1(Hinman et al.，Cancer Research 533336-3342(1993)和Lode et al.，Cancer Research 582925-2928(1998))。還參見美國專利5,714,586；5,712,374；5,264,586；和5,773,001，明確收入本文作為參考。
可使用的酶活毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、α-帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin)和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日出版的WO 93/21232。
本發(fā)明還設(shè)想了抗體與具有核酸水解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶諸如脫氧核糖核酸酶；DNA酶)之間形成的免疫偶聯(lián)物。
有多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)HER2抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
可使用多種雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如3-(2-吡啶基二巰基)丙酸N-琥珀酰亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己胺-1-羧酸琥珀酰亞胺酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞胺二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲?；?己二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2，6-二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可如Vitettaet al.，Science 2381098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苷酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO 94/11026。接頭可以是便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari et al.，Cancer Research52127-131(1992))。
或者，可例如通過重組技術(shù)或肽合成法來制備包含HER2抗體和胞毒劑的融合蛋白。
在另一個實施方案中，可以將抗體與“受體”(諸如鏈霉親合素)偶聯(lián)，用于腫瘤的預(yù)定位，其中對患者施用抗體-受體偶聯(lián)物，隨后使用清除劑從循環(huán)中除去未結(jié)合的偶聯(lián)物，然后施用與胞毒劑(例如放射性核苷)偶聯(lián)的“配體”(例如親合素)。
(x)抗體依賴性酶介導的前體藥物療法(ADEPT)通過將抗體與前體藥物活化酶偶聯(lián)，本發(fā)明的抗體還可用于ADEPT，所述前體藥物活化酶將前體藥物(例如肽基化療劑，參見WO 81/01145)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚钥拱┧帯⒁娎鏦O 88/07378和美國專利4,975,278。
可用于ADEPT的免疫偶聯(lián)物的酶組分包括能夠以這樣一種方式作用于前體藥物從而將其轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘募毎拘孕问降娜魏蚊浮?br> 可用于本發(fā)明方法的酶包括但不限于可將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的芳基硫酸酯酶；可將無毒5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)榭拱┧幬?-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸替代的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的碳水化合物切割酶類，諸如β-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；可將β-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x藥物的β-內(nèi)酰胺酶；及可將在其氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙?；苌乃幬镛D(zhuǎn)變成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶活性的抗體，本領(lǐng)域也稱作“抗體酶”，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x活性藥物(參見例如Massey，Nature 328457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細胞群。
可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將本發(fā)明的酶與HER2抗體共價結(jié)合，諸如使用上文討論的異雙功能交聯(lián)劑?；蛘撸墒褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的重組DNA技術(shù)構(gòu)建包含與本發(fā)明酶的至少功能活性部分連接的本發(fā)明抗體的至少抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白(參見例如Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984))。
(xi)其它抗體修飾本文還設(shè)想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物中的一種連接，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980。
本文公開的HER2抗體還可配制成脂質(zhì)體。可通過本領(lǐng)域已知的方法來制備包含抗體的脂質(zhì)體，諸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 823688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774030(1980)；美國專利4,485,045和4,544,545；及1997年10月23日出版的WO 97/38731中所述。美國專利5,013,556中公開了循環(huán)時間延長的脂質(zhì)體。
特別有用的脂質(zhì)體可用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物通過反相蒸發(fā)法生成。將脂質(zhì)體擠過具有設(shè)定孔徑的濾器，以產(chǎn)生具有所需直徑的脂質(zhì)體?？扇鏜artin et al.，J.Biol.Chem.257286-288(1982)中所述，將本發(fā)明抗體的Fab’片段經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)。任選在脂質(zhì)體中包含化療劑。參見Gabizon et al.，J.NationalCancer Inst.81(19)1484(1989)。
III.藥用配制劑制備依照本發(fā)明使用的抗體的治療用配制劑，即將具有所需純化程度的抗體與任選的制藥學可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980)，以凍干配制劑或水溶液的形式貯存。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，還包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬復合物(如Zn-蛋白質(zhì)復合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。WO 97/04801中描述了優(yōu)選的凍干HER2抗體配制劑，明確收入本文作為參考。
本文中的配制劑還可含有所治療具體適應(yīng)癥所必需的超過一種活性化合物，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的化合物。例如，可能還希望在配制劑中提供結(jié)合EGFR、HER2(例如結(jié)合HER2上不同表位的抗體)、HER3、HER4或血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的抗體?；蛘?另外，配制劑中還可包含化療劑、胞毒劑、細胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、EGFR靶向藥物、抗血管生成劑和/或心臟保護劑。此類分子適于以有效用于所需目的的量而聯(lián)合存在。
活性成分還可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠囊中，例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊、在膠狀藥物傳遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于例如《Remington′sPharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.編，1980。
可制備持續(xù)釋放配制劑。持續(xù)釋放配制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)以定型產(chǎn)品的形式存在，如薄膜或微膠囊。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。
IV.篩選適于治療的患者依照本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，為治療選擇的患者具有呈現(xiàn)HER(且優(yōu)選HER2)活化的腫瘤。在一個實施方案中，癌細胞中HER(或HER2)活化的程度顯著超過同一組織類型的非癌細胞中該受體的活化水平。這樣的過度活化可能是由于癌細胞中HER受體過表達和/或可用于活化HER受體的HER配體高于正常水平造成的。這樣的過度活化可能引起癌細胞的惡性狀態(tài)和/或是由癌細胞的惡性狀態(tài)引起的。在有些實施方案中，將對癌癥進行診斷或預(yù)后測定法以確定是否存在導致所述HER受體過度活化的HER受體擴增和/或過表達?；蛘?另外，可對癌癥進行診斷或預(yù)后測定法以確定癌中是否存在造成所述受體過度活化的HER配體擴增和/或過表達。在此類癌癥的子集中，所述受體的過度活化可能是由自分泌刺激途徑造成的。下文將更為詳細的描述用于測定HER活化的多種測定法。
(i)HER二聚體可對腫瘤樣品評估HER二聚體的存在，如指示HER或HER2活化?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來探測腫瘤中的HER2二聚體，諸如EGFR-HER2、HER2-HER3。下文描述了數(shù)種優(yōu)選方法。這些方法檢測非共價蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或者另外指示目的蛋白之間的接近性。
可使用基于免疫親和的方法，諸如免疫沉淀或ELISA來檢測HER二聚體。在一個實施方案中，用HER2抗體免疫沉淀包含來自腫瘤細胞的HER2的復合物，然后通過免疫印跡對所得免疫沉淀物探查EGFR或HER3的存在。在另一個實施方案中，可將EGFR或HER3抗體用于免疫沉淀步驟，然后用HER2抗體探查免疫沉淀物。在又一個實施方案中，可用對EGFR、HER3、EGFR/HER2復合物或HER2/HER3復合物特異的HER配體來沉淀復合物，然后探查HER2的存在。例如，可將配體與親合素偶聯(lián)，并用生物素柱純化復合物。
在其它實施方案中，諸如ELISA或抗體“夾心(sandwich)”型測定法中，將HER2的抗體固定在固相支持物上，接觸腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物，洗滌，然后暴露于針對EGFR或HER3的抗體。后一種抗體的結(jié)合，可直接檢測或者通過偶聯(lián)有可檢測標記物的二抗來檢測，指示異二聚體的存在。在某些實施方案中，固定EGFR或HER3抗體，將HER2抗體用于檢測步驟。在其它實施方案中，可使用HER配體，取代或聯(lián)合HER抗體。
化學或紫外交聯(lián)也可用于共價連接活細胞表面的二聚體。Hunter et al.，Biochem.J.320847-53?；瘜W交聯(lián)劑的例子包括二硫代雙(琥珀酰亞胺基)丙酸酯(DSP)和3，3′-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基)丙酸酯(DTSSP)。在一個實施方案中，通過SDS-PAGE分析來自化學交聯(lián)腫瘤細胞的細胞提取物，并用EGFR和/或HER3的抗體進行免疫印跡。適當分子量的超位移帶(supershiftedband)最有可能代表EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體，因為HER2是EGFR和HER3的優(yōu)選二聚化配偶。此結(jié)果可通過后續(xù)使用HER2抗體的免疫印跡得以證實。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)也可用于檢測EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體。根據(jù)能量從供體熒光團向受體熒光團的轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET檢測體內(nèi)和體外的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。Selvin，Nat.Struct.Biol.7730-34(2000)。只有在供體熒光團足夠接近受體熒光團時才發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。在典型的FRET實驗中，用不同熒光探針標記兩個蛋白質(zhì)或單一蛋白質(zhì)上的兩個位點。用指定波長的入射光將探針之一，供體探針激發(fā)至較高的能量狀態(tài)。然后供體探針將其能量傳遞給第二種探針，受體探針，導致供體的熒光強度下降，而受體的熒光發(fā)射增加。為了測量能量轉(zhuǎn)移的程度，將用供體和受體探針標記的樣品中的供體強度與只用供體探針標記的樣品中它的強度進行比較。任選的是，比較供體/受體以及只有受體的樣品中受體的強度。合適的探針是本領(lǐng)域已知的，包括例如膜滲入染料，諸如熒光素和羅丹明；有機染料，諸如花青染料；以及鑭系元素原子。Selvin，同上。檢測和測量能量轉(zhuǎn)移的方法和儀器也是本領(lǐng)域已知的。Selvin，同上。
適于檢測和測量個體細胞中蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基于FRET的技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的。例如，可使用供體光漂白熒光共振能力轉(zhuǎn)移(pbFRET)顯微術(shù)和熒光壽命成像顯微術(shù)(FLIM)來檢測細胞表面受體的二聚化。Selvin，同上；Gadella & Jovin，J.Cell Biol.1291543-58(1995)。在一個實施方案中，將pbFRET用于“懸浮液中”或“原位”細胞以檢測和測量EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體的形成，如Nagy et al.，Cytometry 32120-131(1998)中所述。這些技術(shù)測量由于能量轉(zhuǎn)移而造成的供體熒光壽命的縮短。在一個具體的實施方案中，可使用流式細胞術(shù)Foerster型FRET技術(shù)(FCET)來研究EGFR-HER2和HER2-HER3二聚化，如Nagy et al.，同上；及Brockhoff et al.，Cytometry 44338-48(2001)中所述。
優(yōu)選將FRET與標準免疫組化標記技術(shù)聯(lián)合使用。Kenworthy，Methods24289-96(2001)。例如，可將偶聯(lián)有合適熒光染料的抗體作為探針用于標記兩種不同的蛋白質(zhì)。如果蛋白質(zhì)彼此接近，則所述熒光染料起到FRET的供體和受體的作用。通過標準方法檢測能量轉(zhuǎn)移?？赏ㄟ^流式細胞術(shù)手段或者通過數(shù)字顯微鏡系統(tǒng)諸如與電荷耦合器件(CCD)相機偶聯(lián)的共聚焦顯微鏡或?qū)捯曇盁晒怙@微鏡來檢測能量轉(zhuǎn)移。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用兩種不同熒光團直接標記HER2抗體以及或是EGFR或是HER3抗體，例如如Nagy et al.，同上中所述。使腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物接觸差異標記的抗體，它們在存在EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體時起到FRET的供體和受體的作用?；蛘?，將未標記的針對HER2以及或是EGFR或是HER3的抗體連同用作供體和受體的差異標記的二抗一起使用。參見例如Brockhoff et al.，同上。檢測能量轉(zhuǎn)移并確定二聚體的存在，如果在極接近處發(fā)現(xiàn)標記物的話。
在其它實施方案中，熒光標記對HER2以及或是HER1或是HER3特異的HER受體配體并用于FRET研究。
在本發(fā)明的其它實施方案中，通過使用標準的直接或間接的免疫熒光技術(shù)和共聚焦激光掃描顯微術(shù)得出的HER2與或是EGFR或是HER3的共定位，證明了腫瘤細胞表面上二聚體的存在?；蛘撸眉す鈷呙璩上?LSI)以高通量的形式諸如微孔板檢測抗體結(jié)合以及HER2與或是EGFR或是HER3的共定位，如Zuck et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611122-27(1999)中所述。
在其它實施方案中，通過鑒定依賴于二聚體組分接近的酶活性來確定EGFR-HER2和/或HER2-HER3二聚體的存在。將HER2抗體與一種酶偶聯(lián)，而將EGFR或HER3抗體與第二種酶偶聯(lián)。加入第一種酶的第一種底物，且該反應(yīng)產(chǎn)生第二種酶的第二種底物。這導致與另一種分子的反應(yīng)，從而產(chǎn)生可檢測的化合物，諸如染料。另一種化學藥品的存在破壞第二種底物，從而阻止與第二種酶的反應(yīng)，除非第一種和第二種酶以及因此兩種抗體極其接近。在一個具體的實施方案中，使腫瘤細胞或細胞裂解物接觸偶聯(lián)有葡萄糖氧化酶的HER2抗體以及偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的HER3或HER1抗體。向反應(yīng)中加入葡萄糖以及染料前體，諸如DAB，以及過氧化氫酶。通過DAB染色后的顯色來確定二聚體的存在。
還可使用基于eTagTM測定體系(Aclara Bio Sciences，Mountain View，CA)的方法來檢測二聚體，如例如2001年12月6日發(fā)布的美國專利申請2001/0049105中所述，將其全文明確收入本文作為參考。eTagTM或“電泳標簽”包含可檢測報導物模塊，諸如熒光基團。它還可包含“遷移率修飾物”，基本上由具有獨特電泳遷移率的模塊組成。這些模塊容許在規(guī)定的電泳條件諸如毛細管電泳(CE)下從復雜混合物中分離并檢測eTagTM。將eTagTM中含有報導物模塊和任選的遷移率修飾物的部分通過可切割連接基團與第一靶結(jié)合模塊連接以產(chǎn)生第一結(jié)合化合物。第一靶結(jié)合模塊特異性識別特定的第一靶物，諸如核酸或蛋白質(zhì)。第一靶結(jié)合模塊不受任何形式的限制，它可以是例如多核苷酸或多肽。優(yōu)選的是，第一靶結(jié)合模塊是抗體或抗體片段?；蛘?，第一靶結(jié)合模塊可以是HER受體配體或其有結(jié)合能力的片段。
連接基團優(yōu)選包含可切割模塊，諸如酶底物，或者可在規(guī)定條件下斷裂的任何化學鍵。當?shù)谝话薪Y(jié)合模塊與其靶物結(jié)合時，引入和/或活化裂解劑，連接基團遭到切斷，由此釋放eTagTM中含有報導物模塊和遷移率修飾物的部分。因此，“游離”eTagTM的出現(xiàn)指示靶結(jié)合模塊與其靶物的結(jié)合。
優(yōu)選的是，第二結(jié)合化合物包含裂解劑和特異性識別第二靶物的第二靶結(jié)合模塊。第二靶結(jié)合模塊也不受任何方式的限制，它可以是例如抗體或抗體片段或HER受體配體或有結(jié)合能力的配體片段。裂解劑是這樣的，它在第一結(jié)合化合物和第二結(jié)合化合物極其接近的情況下將只切割連接基團。
在本發(fā)明的一個實施方案中，第一結(jié)合化合物包含eTaTM，其中HER2的抗體擔當?shù)谝话薪Y(jié)合模塊。第二結(jié)合化合物包含與能切割eTagTM連接基團的裂解劑連接的EGFR或HER3抗體。優(yōu)選的是，所述裂解劑必須活化才能切割連接基團。使腫瘤細胞或腫瘤細胞裂解物接觸結(jié)合HER2的eTagTM以及結(jié)合細胞表面上的EGFR或HER3的經(jīng)修飾EGFR或HER3抗體。如果需要，優(yōu)選除去未結(jié)合的結(jié)合化合物并活化裂解劑。如果出現(xiàn)EGFR-HER2或HER2-HER3二聚體，由于裂解劑接近連接基團，裂解劑將切割連接基團并釋放eTagTM。然后可通過本領(lǐng)域已知的任何方法來檢測游離eTagTM，諸如毛細管電泳。
在一個實施方案中，所述裂解劑是作用于連接基團的可活化化學藥品。例如，所述裂解劑可以通過使樣品暴露于光照而活化。
在另一個實施方案中，使用EGFR或HER3抗體作為第一靶結(jié)合模塊來構(gòu)建eTagTM，而第二結(jié)合化合物則由HER2抗體來構(gòu)建。
在又一個實施方案中，使用與其對二聚體中任一HER受體的結(jié)合相比，特異或優(yōu)先結(jié)合二聚體的抗體或其它試劑來檢測HER二聚體。
(ii)HER2磷酸化如前一節(jié)所論述的，用EGFR、HER2或HER3抗體免疫沉淀后，可任選進行二聚體的功能性測定法，作為免疫印跡的替代或補充。在一個實施方案中，用HER3抗體免疫沉淀后測定免疫沉淀物中的受體酪氨酸激酶活性。因為HER3不具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，所以免疫沉淀物中存在酪氨酸激酶活性指示HER3最有可能與HER2相結(jié)合。Graus-Porta et al.，EMBO J.161647-55(1997)；Klapper et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 964995-5000(1999)。此結(jié)果可通過用HER2抗體進行免疫印跡得到證實。在另一個實施方案中，用HER2抗體免疫沉淀后測定EGFR受體酪氨酸激酶活性。在此測定法中，使免疫沉淀物接觸放射性ATP和模擬EGFR對HER2的轉(zhuǎn)磷酸作用的體內(nèi)位點的肽底物。所述肽的磷酸化指示共沉淀及由此EGFR與HER2的二聚化。受體酪氨酸激酶活性測定法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括檢測靶底物磷酸化的測定法，例如用磷酸酪氨酸抗體，以及檢測相關(guān)信號轉(zhuǎn)導途徑，諸如MAPK途徑激活的測定法。
可通過一種或多種HER受體諸如HER(HER2)受體的免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡分析來評估HER受體的磷酸化。例如，使用抗磷酸酪氨酸抗體來檢測免疫沉淀的HER受體中磷酸化酪氨酸殘基，通過凝膠上存在出現(xiàn)磷酸-HER2帶確定為陽性?？沽姿崂野彼峥贵w可購自Pan Vera(Madison，WI)，Invitrogen的子公司、Chemicon International Inc.(Temecula，CA)或UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)。通過缺乏該條帶而確定為陰性。
在另一個實施方案中，使用磷酸特異性HER2抗體(克隆PN2A；Thor etal.，J.Clin Oncol.18(18)3230-3239(2000))通過免疫組化來評估HER(HER2)受體的磷酸化。
用于檢測HER受體磷酸化的其它方法包括但不限于KIRA、ELISA(美國專利5,766,863；5,891,650；5,914,237；6,025,145；和6,287,784)、質(zhì)譜(比較磷酸化和未磷酸化HER2的大小)、以及使用HER(例如HER2)抗體和磷酸特異性或磷酸酪氨酸特異性抗體二者的e-標簽接近性測定法(例如使用購自Aclara BioSciences(Mountain View，CA)的eTagTM測定試劑盒)。有關(guān)eTag測定法的細節(jié)見上文。
還可在細胞陣列中使用磷酸特異性抗體來檢測細胞樣品中信號轉(zhuǎn)導蛋白的磷酸化狀態(tài)(US 2003/0190689)。
(iii)HER2配體可依照已知流程來測定腫瘤中或與腫瘤相關(guān)的HER配體諸如TGF-α的水平。這樣的測定法可檢測待測樣品中的蛋白質(zhì)和/或編碼它的核酸。在一個實施方案中，可使用免疫組化(IHC)來測定腫瘤中的HER配體水平；參閱例如Scheer et al.，Clin.Cancer Research 1545-550(1995)。或者/另外，可評估待測樣品中HER配體編碼核酸的水平；例如通過FISH、DNA印跡或PCR技術(shù)。
(iv)非HER2過表達癌癥盡管癌癥的特征可以是HER2受體的過表達，但本申請還提供了用于治療不認為是HER2過表達的癌癥的方法。
為了測定癌癥中的HER2表達，可以利用多種診斷/預(yù)后測定法。在一個實施方案中，可通過IHC來分析HER2過表達，例如使用HERCEPTEST(Dako)。可將來自腫瘤活組織檢查的石蠟包埋組織切片進行IHC測定并遵循如下HER2蛋白質(zhì)染色強度標準得分0在少于10％的腫瘤細胞中未觀察到染色或者觀察到膜染色。
得分1+在超過10％的腫瘤細胞中檢測到微弱的/剛剛可察覺的膜染色。所述細胞只在其部分膜上有染色。
得分2+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到微弱至中等的完全膜染色。
得分3+在超過10％的腫瘤細胞中觀察到中等至強烈的完全膜染色。
那些HER2過表達評估得分0或1+的腫瘤可鑒定為未過表達HER2，而那些得分2+或3+的腫瘤可鑒定為過表達HER2。
過表達HER2的腫瘤可根據(jù)對應(yīng)于每個細胞表達的HER2分子拷貝數(shù)的免疫組化得分進行定級，并且可通過生化方法測定0＝0-10,000個拷貝/細胞，1+＝至少約200,000個拷貝/細胞，2+＝至少約500,000個拷貝/細胞，3+＝至少約2,000,000個拷貝/細胞。
導致酪氨酸激酶的配體依賴性活化的3+水平的HER2過表達(Hudziak etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847159-7163(1987))發(fā)生于約30％的乳癌中，而且在這些患者中，無復發(fā)存活和總體存活減少(Slamon et al.，Science 244707-712(1989)；Slamon et al.，Science 235177-182(1987))。
或者/另外，可對福爾馬林固定、石蠟包埋的腫瘤組織進行FISH測定法諸如INFORMTM(由Ventana，Arizona銷售)或PATHVISIONTM(Vysis，Illinois)以測定腫瘤中HER2過表達的程度(如果有的話)。
在一個實施方案中，所述癌癥將是表達(且可以是過表達)EGFR的癌癥，可對所述過表達進行評估，作為用于評估如上所述HER2表達的方法。
還可利用體內(nèi)診斷測定法來評估HER受體或HER配體過表達或擴增，例如通過施用結(jié)合待檢測分子且標記有可檢測標記物(例如放射性同位素)的分子(諸如抗體)，然后對患者進行外部掃描以定位所述標記物。
V.使用HER2抗體的治療依照本發(fā)明，設(shè)想了HER2抗體可用于治療化療耐受性癌癥或鉑耐受性癌癥，諸如鉑耐受性癌癥。所述癌癥通常將包含HER2表達細胞，使得本文的HER2抗體能結(jié)合所述癌細胞。
用HER2抗體，優(yōu)選Pertuzumab和抗代謝物化療劑，優(yōu)選吉西他濱聯(lián)合治療患者。聯(lián)合施用包括使用分開的配制劑或單一的藥用配制劑的共施用或同時施用，以及任一次序的連續(xù)施用，其中優(yōu)選有一段時間所有兩種(或多種)活性劑同時發(fā)揮其生物學活性。因此，可在施用HER2抗體之前或之后施用抗代謝物化療劑。在此實施方案中，至少一次抗代謝物制劑的施用和至少一次HER2抗體的施用之間的計時優(yōu)選為約1個月或更短，且最優(yōu)選約2周或更短?；蛘?，以單一的配制劑或分開的配制劑同時對患者施用抗代謝物化療劑和HER2抗體。
聯(lián)合療法將導致癌癥的體征或癥狀改善。例如，這樣的治療可導致相對于只用抗代謝物化療劑進行治療的患者，存活有所提高(總體存活和/或無進展存活)，并且/或者可導致客觀臨床響應(yīng)(部分的或完全的)。此外，抗代謝物化療劑(例如吉西他濱)和HER2抗體(例如Pertuzumab)的聯(lián)合治療可對患者產(chǎn)生協(xié)同的、或者大于累加的治療效益。
優(yōu)選的，所施用的HER2抗體是裸抗體。然而，所施用的HER2抗體可偶聯(lián)胞毒劑。優(yōu)選的是，免疫偶聯(lián)物和/或其所結(jié)合的HER2蛋白質(zhì)受到細胞的內(nèi)在化，導致免疫偶聯(lián)物殺傷其所結(jié)合的癌細胞的治療功效提高。在一個優(yōu)選的實施方案中，胞毒劑靶向或干擾癌細胞中的核酸。此類胞毒劑的例子包括美登木素生物堿、加利車霉素、核糖核酸酶和DNA內(nèi)切核酸酶。
依照已知方法對人類患者施用HER2抗體(或HER2抗體免疫偶聯(lián)物)和抗代謝物化療劑，諸如靜脈內(nèi)施用，例如推注或一段時間的連續(xù)輸注，通過肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerebrospinal)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部或吸入路徑。HER2抗體和抗代謝物化療劑可以但不是必須通過相同的施用路徑施用。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用抗體和抗代謝物化療劑二者。
對于疾病的預(yù)防或治療，HER2抗體的適當劑量將取決于如上定義的待治療疾病的類型、疾病的嚴重程度和進程、施用HER2抗體是為了預(yù)防還是治療目的、先前的療法、患者的臨床史和對HER2抗體的響應(yīng)，以及主治醫(yī)師的判斷。適當?shù)脑谀骋粫r間或者通過一系列治療對患者施用HER2抗體。根據(jù)疾病的類型和嚴重程度，對患者施用的初始候選劑量是約1μg/kg至50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)HER2抗體，無論是通過例如一次或多次分開的施用，或者通過連續(xù)輸注。在一個實施方案中，HER2抗體的初始輸注時間可以長于后續(xù)輸注時間，例如初始輸注為約90分鐘，而后續(xù)輸注為約30分鐘(如果初始輸注耐受良好的話)。優(yōu)選的HER2抗體劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg的范圍內(nèi)。因此，可對患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意組合)的一劑或多劑。這樣的劑量可間歇施用，例如，每周或每三周(例如使得患者接受約2劑至約20劑，例如約6劑HER2抗體)?？梢允紫仁┯幂^高的加載劑量，后續(xù)較低的一劑或多劑。在一個實施方案中，首先以約840mg的加載劑量施用HER2抗體，然后大約每三周施用約420mg。在另一個實施方案中，大約每3周以1050mg的一劑施用HER2抗體。
抗代謝物化療劑通常以其已知劑量施用，或者任選由于藥物的聯(lián)合作用或者由于施用抗代謝物化療劑造成的不良副作用而降低劑量。可依照制造商的說明書使用此類化療劑的制備和服藥時間表，或者憑熟練技術(shù)人員的經(jīng)驗確定。此類化療劑的制備和服藥時間表還可參見Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。其中抗代謝物化療劑是吉西他濱，優(yōu)選的是，例如在三周循環(huán)的第1天和第8天施用約600mg/m2至1250mg/m2之間(例如約1000mg/m2)的一劑。
除了HER2抗體和抗代謝物化療劑之外，還可聯(lián)合其它治療方案。例如，可施用第二(第三、第四、等等)化療劑，其中第二種化療劑或是另一種不同的抗代謝物化療劑，或是非抗代謝物的化療劑。例如，第二種化療劑可以是紫杉烷(諸如Paclitaxel或Docetaxel)、卡培他濱或基于鉑的化療劑(諸如卡鉑、順鉑和奧沙利鉑)、蒽環(huán)類抗生素(諸如多柔比星，包括脂質(zhì)體多柔比星)、托泊替康、培美曲塞、長春花生物堿(諸如長春瑞濱)和TLK 286。可以施用不同化療劑的“雞尾酒”。
可與HER2抗體和抗代謝物化療劑聯(lián)合的其它治療劑包括以下任一種或多種第二種不同的HER2抗體(例如生長抑制性HER2抗體諸如Trastuzumab等或誘導HER2過表達細胞凋亡的HER2抗體諸如7C2、7F3或其人源化變體)；靶向另一種腫瘤相關(guān)抗原諸如EGFR、HER3、HER4的第二種抗體；抗激素化合物，例如抗雌激素化合物諸如他莫昔芬，或芳香酶抑制劑；心臟保護劑(以預(yù)防或減輕與治療有關(guān)的任何心肌功能障礙)；細胞因子；EGFR靶向藥物(諸如TARCEVA、IRESSA或Cetuximab)；抗血管生成劑(尤其是Genentech銷售的Bevacizumab，商標為AVASTINTM)；酪氨酸激酶抑制劑；COX抑制劑(例如COX-1或COX-2抑制劑)；非類固醇抗炎藥，Celecoxib(CELEBREX)；法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(例如可從Johnson and Johnson購買的Tipifarnib/ZARNESTRAR115777或可從Schering-Plough購買的Lonafarnib SCH66336)；結(jié)合癌胚蛋白CA 125的抗體，諸如Oregovomab(MoAb B43.13)；HER2疫苗(諸如Pharmexia的HER2Auto Vac疫苗，或Dendreon的APC8024蛋白質(zhì)疫苗，或GSK/Corixa的HER2肽疫苗)；其它HER靶向療法(例如trastuzumab、cetuximab、gefitinib、erlotinib、CI1033、GW2016等)；Raf和/或ras抑制劑(參見例如WO 2003/86467)；Doxil；托泊替康(Topetecan)；紫杉烷；GW572016；TLK286；EMD-7200；治療惡心的藥物，諸如血清素拮抗劑、類固醇或苯并二氮卓類(benzodiazepien)；預(yù)防或治療皮疹的藥物或標準痤瘡療法，包括局部或口服抗生素；降體溫藥物，諸如醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或哌替啶(meperidine)；造血生長因子，等等。
任何上述共施用藥劑的合適劑量就是那些目前所使用的劑量，并且可由于該藥劑與HER2抗體的聯(lián)合作用(協(xié)同作用)而降低。
除了上述治療方案，還可對患者進行手術(shù)去除癌細胞和/或放療。
除了對患者施用抗體，本申請設(shè)想了通過基因療法來施用抗體。表述“施用抗體”涵蓋編碼抗體的核酸的此類施用。參見例如1996年3月14日出版的WO 96/07321，它關(guān)注通過基因療法來生成胞內(nèi)抗體。
有兩種主要方法使核酸(任選包含在載體中)進入患者的細胞，即體內(nèi)和回體(ex vivo)。對于體內(nèi)投遞，通常在需要抗體的部位將核酸直接注射到患者體內(nèi)。對于回體治療，采集患者的細胞，將核酸導入這些分離的細胞，并將經(jīng)過修飾的細胞或是直接施用于患者，或是例如裝入多孔膜內(nèi)并植入患者體內(nèi)(參見例如美國專利4,892,538和5,283,187)。有多種技術(shù)可用于將核酸導入活細胞。這些技術(shù)根據(jù)是將核酸轉(zhuǎn)移至目的宿主的體外培養(yǎng)細胞還是體內(nèi)細胞而有所變化。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移到哺乳動物細胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸鈣沉淀法等。常用于回體投遞基因的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(諸如腺病毒、I型單純皰疹病毒或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(可用于脂質(zhì)介導的基因轉(zhuǎn)移的脂質(zhì)有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行的轉(zhuǎn)染。在有些情況中，希望與靶向靶細胞的試劑一起提供核酸源，諸如對細胞表面膜蛋白或靶細胞特異的抗體、靶細胞上受體的配體等。在采用脂質(zhì)體時，與胞吞作用相關(guān)細胞表面膜蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)可用于靶向和/或促進攝入，例如對特定細胞類型具有向性的衣殼蛋白或其片段、在循環(huán)中進行內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗體、和靶向細胞內(nèi)定位和增加細胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。例如Wu et al.，J.Biol.Chem.2624429-4432(1987)；及Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873410-3414(1990)中描述了受體介導的胞吞技術(shù)。關(guān)于目前已知的基因標記和基因治療方案的綜述參見Anderson et al.，Science 256808-813(1992)。還可參見WO93/25673及其引用的參考文獻。
VI.材料的保藏以下雜交瘤細胞系已保藏于美國典型培養(yǎng)物保存中心(American TypeCulture Collection，ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，USA)
下面的非限制性實施例例示了本發(fā)明的更多細節(jié)。說明書中所有引用文獻的內(nèi)容均明確收入本文作為參考。
實施例實施例1單克隆抗體2C4的生成和鑒定如Fendly et al.，Cancer Research 501550-1558(1990)所述生成特異結(jié)合HER2胞外域的鼠單克隆抗體2C4、7F3和4D5。簡而言之，用含25mM EDTA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)收獲如Hudziak et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.(USA)847159-7163(1987)中所述生成的NIH 3T3/HER2-3400細胞(表達約1x105個HER2分子/細胞)，并用于免疫BALB/c小鼠。在第0、2、5和7周給小鼠腹膜內(nèi)注射懸浮于0.5ml PBS中的107個細胞。在第9和13周給具有免疫沉淀32P標記HER2的抗血清的小鼠腹膜內(nèi)注射小麥胚芽凝集素-Sepharose(WGA)純化的HER2膜提取物。隨后靜脈內(nèi)注射0.1ml HER2制備物，并將脾細胞與小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653融合。
通過ELISA和放射免疫沉淀對雜交瘤上清液篩選HER2結(jié)合。
通過競爭性結(jié)合分析確定單克隆抗體4D5、7F3和2C4所結(jié)合的HER2表位(Fendly et al.，Cancer Research 501550-1558(1990))。使用PANDEXTMScreen Machine來量化熒光，在完整細胞上通過直接熒光來進行抗體的交叉封閉研究。使用已建立的方法，將各單克隆抗體與異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)(Wofsy et al.，Selected Methods in Cellular Immunology p.287，Mishel andSchiigi(eds.)San FranciscoW.J.Freeman Co.，1980)。將NIH 3T3/HER2-3400細胞的匯合單層胰酶消化，洗滌一次，并以1.75×106個細胞/ml重懸于含0.5％牛血清清蛋白(BSA)和0.1％NaN3的冷PBS中。加入終濃度1％的膠乳顆粒(IDC，Portland，OR)以減少PANDEXTM平板膜的堵塞。將20μl細胞懸浮液和20μl純化的單克隆抗體(100μg/ml至0.1μg/ml)加入PANDEXTM平板孔中并在冰上溫育30分鐘。將20μl預(yù)定稀釋度的FITC標記的單克隆抗體加入各孔中，溫育30分鐘，洗滌，并用PANDEXTM量化熒光。如果與無關(guān)單克隆抗體對照相比，各種單克隆抗體相互阻斷結(jié)合達50％或更多，則認為這些單克隆抗體共享某一表位。在此實驗中，單克隆抗體4D5、7F3和2C4分別指派表位I、G/F和F。
用乳房腫瘤細胞系SK-BR-3評估單克隆抗體2C4、7F3和4D5的生長抑制特征(參見Hudziak et al.，Molec.Cell.Biol.9(3)1165-1172(1989))。簡而言之，用0.25％(vol/vol)胰蛋白酶使SK-BR-3細胞脫離，并以4×105個細胞/ml的密度懸浮于完全培養(yǎng)基。將100μl(4×104個細胞)等分試樣鋪入96孔微量稀釋板，使細胞粘附，然后加入100μl單純的培養(yǎng)基或含單克隆抗體(終濃度5μg/ml)的培養(yǎng)基。72小時后，用PBS(pH7.5)洗滌平板兩次，用結(jié)晶紫(0.5％溶于甲醇)染色，并分析相對細胞增殖，如Sugarman et al.，Science 230943-945(1985)中所述。單克隆抗體2C4和7F3抑制SK-BR-3相對細胞增殖分別達約20％和約38％，比較而言用單克隆抗體4D5則達到約56％的抑制。
對單克隆抗體2C4、4D5和7F3評估它們抑制來自MCF7細胞全細胞裂解物、Mr180,000范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的HRG刺激的酪氨酸磷酸化的能力(Lewisetal.，Cancer Research561457-1465(1996))。據(jù)報道，MCF7細胞表達所有已知的HER受體，但水平相對較低。由于HER2、HER3和HER4具有近乎相同的分子量大小，因此在通過蛋白質(zhì)印跡分析評估全細胞裂解物時不可能辨別哪種蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化了。
然而，這些細胞是HRG酪氨酸磷酸化測定法的理想材料，因為在所用測定條件下，在缺乏外源添加的HRG時，它們在分子量Mr180,000范圍內(nèi)呈現(xiàn)出低至不可檢測水平的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)。
將MCF7細胞鋪入24孔板并將HER2的單克隆抗體加入各孔中，于室溫溫育30分鐘，然后向各孔中加入rHRGβ1177-244至終濃度0.2nM，繼續(xù)溫育8分鐘。小心從各孔中吸出培養(yǎng)基，并加入100μl SDS樣品緩沖液(5％SDS，25mM DTT和25mM Tris-HCl，pH 6.8)終止反應(yīng)。將各樣品(25μl)在4-12％梯度凝膠(Novex)上進行電泳，然后電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。對抗磷酸酪氨酸(4G10，來自UBI，以1μg/ml使用)免疫印跡顯影，并如前文所述，通過反射密度法對分子量約180,000處的主要反應(yīng)性條帶強度進行定量(Holmes et al.，Science 2561205-1210(1992)；Sliwkowski et al.，J.Biol.Chem.26914661-14665(1994))。
單克隆抗體2C4、7F3和4D5顯著抑制分子量180,000處的HRG誘導的酪氨酸磷酸化信號的產(chǎn)生。在缺乏HRG時，這些抗體都不能刺激分子量180,000范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化。同樣，這些抗體不與EGFR(Fendlyet al.，Cancer Research 501550-1558(1990))、HER3或HER4發(fā)生交叉反應(yīng)?？贵w2C4和7F3顯著抑制HRG刺激的p180酪氨酸磷酸化，達到小于對照的25％。單克隆抗體4D5能阻斷HRG刺激的酪氨酸磷酸化，達約50％。圖2A顯示了通過反射密度法測定的2C4或7F3抑制HRG刺激的p180酪氨酸磷酸化的劑量-應(yīng)答曲線。使用4參數(shù)擬合評估這些抑制曲線，得到2C4和7F3的IC50分別為2.8±0.7nM和29.0±4.1nM。
以24孔板的形式在冰上用單層培養(yǎng)物進行HER2抗體對HRG結(jié)合MCF7乳房腫瘤細胞系的抑制(Lewis et al.，Cancer Research 561457-1465(1996))。將HER2單克隆抗體加入各孔中并溫育30分鐘。加入125I標記的rHRGβ1177-224(25pm)，繼續(xù)溫育4至16小時。圖2B提供了2C4或7F3抑制HRG結(jié)合MCF7細胞的劑量-應(yīng)答曲線。在存在125I標記rHRGβ1的情況下，將不同濃度的2C4或7F3與MCF7細胞一起溫育，抑制曲線如圖2B所示。分析這些數(shù)據(jù)得到2C4和7F3的IC50分別為2.4±0.3 nM和19.0±7.3 nM。2C4和7F3的最大抑制約74％是與酪氨酸磷酸化數(shù)據(jù)一致的。
為了確定在MCF7細胞上觀察到的HER2抗體的效果是否是普遍現(xiàn)象，將人腫瘤細胞系與2C4或7F3一起溫育并測定特異性125I標記的rHRGβ1結(jié)合的程度(Lewis et al.，Cancer-Research 561457-1465(1996))。此項研究的結(jié)果如圖3所示。在所有細胞系中121I標記rHRGβ1的結(jié)合可受到或是2C4或是7F3的抑制，只有乳癌細胞系MDA-MB-468例外，據(jù)報導該細胞系表達很少的HER2或者不表達HER2。據(jù)報導其余細胞系都表達HER2，但HER2的表達水平在這些細胞系中變化較大。事實上，所測細胞系中HER2表達的變化范圍超過2個數(shù)量級。例如，BT-20、MCF7和Caov3表達約104個HER2受體/細胞，而BT-474和SK-BR-3表達約106個HER2受體/細胞。根據(jù)這些細胞中HER2表達的寬范圍和以上數(shù)據(jù)得出結(jié)論，HER2與HER3或HER4之間的相互作用自身是發(fā)生于質(zhì)膜表面上的高親和力相互作用。
在存在或缺乏外源rHRGβ1的條件下評估單克隆抗體2C4和4D5對MDA-MB-175和SK-BR-3細胞的生長抑制效果(Schaefer et al.，Oncogene 151385-1394(1997))。MDA-MB-175細胞中的HER2水平比正常乳房上皮細胞中發(fā)現(xiàn)的水平高4-6倍，而且在MDA-MB-175細胞中HER2-HER4受體組成性的酪氨酸磷酸化。用HER2單克隆抗體2C4和4D5(10μg/mL)處理MDA-MB-175細胞4天。在結(jié)晶紫染色測定法中，與2C4一起溫育顯示出對此細胞系的強烈生長抑制效果(圖4A)。外源HRG不顯著逆轉(zhuǎn)此抑制作用。另一方面，2C4對HER2過表達細胞系SK-BR-3沒有顯示出抑制效果(圖4B)。在存在和缺乏外源HRG的兩種情況下，單克隆抗體2C4都能比單克隆抗體4D5更大程度的抑制MDA-MB-175細胞的細胞增殖。4D5對細胞增殖的抑制作用依賴于HER2表達水平(Lewis et al.，Cancer Immunol.Immunother.37255-263(1993))?？蓹z測到SK-BR-3細胞中的最大抑制達66％(圖4B)。然而，此效果可被外源HRG克服。
實施例2HER2與HER3的HRG依賴性結(jié)合受到單克隆抗體2C4阻斷在免疫共沉淀實驗中測試HER3與HER2結(jié)合的能力。將1.0×106個MCF7或SK-BR-3細胞接種于6孔組織培養(yǎng)板中含10％胎牛血清(FBS)和10mM HEPES，pH7.2的50∶50 DMEM/Ham氏F12培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)中，使其粘附過夜。在開始實驗之前將細胞在無血清的生長培養(yǎng)基中饑餓兩小時。
用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)簡單洗滌細胞，然后與在含0.2％w/v胎牛血清清蛋白(BSA)的RPMI培養(yǎng)基，10mM HEPES，pH 7.2(結(jié)合緩沖液)中稀釋的100nM指定抗體或者單純的結(jié)合緩沖液(對照)一起保溫。室溫一小時后，在半數(shù)孔中(+)加入終濃度5nM的HRG。其它孔中(-)加入相似體積的結(jié)合緩沖液。繼續(xù)溫育約10分鐘。
吸出上清液并將細胞在含0.2mM PMSF，10μg/ml亮抑酶肽和10TU/ml抑酶肽的RPMI，10mM HEPES，pH 7.2，1.0％v/v TRITON X-100TM，1.0％w/vCHAPS(裂解緩沖液)中溶解。通過離心清除裂解物中的不溶物質(zhì)。
用共價偶聯(lián)有親和凝膠的單克隆抗體(Affi-Prep 10，Bio-Rad)免疫沉淀HER2。此抗體(Ab-3，Oncogene Sciences)識別胞質(zhì)域表位。如下進行免疫沉淀，向各裂解物中添加含有約8.5μg固定化抗體的10μl凝膠漿體，并使樣品于室溫混合兩小時。然后通過離心收集凝膠。用裂解緩沖液分批洗滌凝膠三次以去除未結(jié)合物質(zhì)。然后加入SDS樣品緩沖液，并在沸水浴中短暫加熱樣品。
將上清液進行4-12％聚丙烯酰胺凝膠電泳并電印跡至硝酸纖維素膜上。用針對其胞外域表位的多克隆抗體(c-17，Santa Cruz Biotech)通過探查印跡來評估HER3的存在。用化學發(fā)光底物(ECL，Amersham)使印跡顯現(xiàn)。
如圖5A和5B中分別為MCF7和SK-BR-3細胞的對照道所示，只有在用HRG刺激細胞時HER2免疫沉淀中才出現(xiàn)HER3。如果首先將細胞與單克隆抗體2C4一起溫育，則HER3信號在MCF7細胞中消失(圖5A，道2C4+)，或者在SK-BR-3細胞中實質(zhì)性降低(圖5B，道2C4+)。如圖5A-B所示，單克隆抗體2C4比Trastuzumab實質(zhì)性更有效的阻斷MCF7和SK-BR-3兩種細胞中HER3與HER2的調(diào)蛋白依賴性結(jié)合。與Trastuzumab預(yù)溫育降低MCF7溶解物中的HER3信號，但對從SK-BR-3溶解物共沉淀的HER3的量具有很小影響或者沒有影響。與針對EGF受體的抗體(Ab-1，OncogeneSciences)預(yù)溫育對這兩種細胞系中HER3與HER2共沉淀的能力沒有影響。
實施例3人源化2C4抗體首先將鼠單克隆抗體2C4的可變區(qū)克隆到允許生成小鼠/人嵌合Fab片段的載體中。使用Stratagene RNA提取試劑盒依照制造商的方案從雜交瘤細胞分離總RNA。如先前所述(Carter et al.，PNAS(USA)894285(1992)；及美國專利5,821,337)，將可變區(qū)通過RT-PCR擴增，凝膠純化，并插入含有人κ恒定區(qū)和人CH1結(jié)構(gòu)域的基于pUC119的質(zhì)粒的衍生物中。將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株16C9中以表達Fab片段。培養(yǎng)物的生長、蛋白質(zhì)表達的誘導和Fab片段的純化均如先前所述(Werther et al.，J.Immunol.1574986-4995(1996)；Presta et al.，Cancer Research 574593-4599(1997))。
將純化的嵌合2C4 Fab片段與鼠親本抗體2C4在它們抑制125I-HRG結(jié)合MCF7細胞的能力以及抑制MCF7細胞中rHRG激活p180酪氨酸磷酸化的能力方面進行比較。如圖6A所示，嵌合2C4 Fab片段非常有效的破壞人乳癌細胞系MCF7上高親和力HER2-HER3結(jié)合位點的形成。計算得出完整鼠2C4的相對IC50是4.0±0.4nM，而Fab片段的此值是7.7±1.1nM。如圖6B所示，單價嵌合2C4 Fab片段非常有效的破壞HRU依賴性HER2-HER3活化。計算得出完整鼠單克隆抗體2C4的IC50值是6.0±2nM，而Fab片段的此值是15.0±2nM。
嵌合克隆的DNA測序容許鑒定CDR殘基(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，NaionalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991))(圖7A和B)。如先前所述(Prestaet al.，Cancer Research574593-4599(1997))，利用寡核苷酸定點誘變，將所有6個這些CDR區(qū)引入質(zhì)粒VX4上所包含的完整人框架(VLκ亞型I和VH亞型III)中。如上表達并純化來自所得“CDR交換”的蛋白質(zhì)。進行結(jié)合研究以比較兩種型式。簡而言之，將NUNC MAXISORPTM板用50mM碳酸鹽緩沖液pH 9.6中的1μg/ml HER2胞外域(ECD；如WO 90/14357中所述產(chǎn)生)在4℃包被過夜，然后用ELISA稀釋液(0.5％BSA，0.05％聚山梨醇酯20，PBS)在室溫封閉1小時。將樣品在ELISA稀釋液中的連續(xù)稀釋液在板上溫育2小時。洗滌后，用生物素化鼠抗人κ抗體(ICN 634771)以及后續(xù)的鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶(Sigma)檢測結(jié)合的Fab片段，使用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD)作為底物。讀取450nm處的吸光度。如圖8A所示，在構(gòu)建CDR交換的人Fab片段后，所有結(jié)合都喪失了。
為了恢復人源化Fab的結(jié)合，使用來自CDR交換的DNA作為模板來構(gòu)建突變體。利用計算機產(chǎn)生的模型(圖9)，將這些突變設(shè)計成在改變可能影響CDR構(gòu)象或抗體-抗原界面的位置將人框架區(qū)殘基改變成它們的鼠對應(yīng)物。突變體如表2所示。
表2人源化2C4 FR突變的名稱
各種突變體的結(jié)合曲線如圖8A-C所示。人源化Fab型式574，具有改變ArgH71VaI、AspH73Arg和IleH69Leu，表現(xiàn)出結(jié)合恢復至原始嵌合2C4 Fab片段的水平?？尚揎椓硗獾腇R和/或CDR殘基，諸如L2、L54、L55、L56、H35和/或H48(例如如下替代IleL2Thr；ArgL54Leu；TyrL55Glu；ThrL56Ser；AspH35Ser；和ValH48Ile)以進一步改善或增強人源化抗體的結(jié)合?；蛘?另外，可對人源化抗體進行親和力成熟(見上文)以進一步提高或改善其親和力和/或其它生物學活性。
使用噬菌體展示方法對人源化2C4型式574進行親和力成熟。簡而言之，將人源化2C4.574 Fab克隆到噬菌體展示載體中成為基因III融合物。在通過M13KO7輔助噬菌體感染來誘導噬菌體顆粒時，此融合物使得Fab展示在噬菌體尾絲蛋白質(zhì)基因III的N-末端(Baca et al.，J.Biol.Chem.27210678(1997))。
對于上文鑒定的6個CDR，對每一個構(gòu)建單獨的文庫。在這些文庫中，對于CDR中利用計算機產(chǎn)生的模型(圖9)鑒定為對與HER2的結(jié)合可能重要的氨基酸，使用包含“NNS”作為其密碼子的寡核苷酸進行隨機化。然后將文庫針對包被到NUNC MAXISORPTM板上的HER2 ECD進行淘選，使用溶于含0.2％TWEEN 20(MPBST)的PBS的3％奶粉代替所有封閉液。為了選擇親和力高于2C4.574的噬菌體，在第3、4和5輪淘選中，在洗滌步驟中加入可溶性HER2 ECD或可溶性Fab 2C4.574作為競爭劑。洗滌時間延長至室溫1小時。
經(jīng)5輪淘選后，通過噬菌體-ELISA再次分析個別克隆。在Costar 96孔U底組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)個別克隆，通過添加輔助噬菌體來誘導噬菌體。培養(yǎng)過夜后，沉淀大腸桿菌細胞，將含噬菌體的上清液轉(zhuǎn)移至96孔板中，其中噬菌體用MPBST在室溫封閉1小時。包被了HER2 ECD的NUNCMAXISORPTM板也如上用MPBST進行封閉。將經(jīng)過封閉的噬菌體在平板上溫育2小時。洗滌后，用在MPBST中1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13單克隆抗體(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.27-9421-01)檢測結(jié)合的噬菌體，隨后以3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺作為底物。讀取450nm處的吸光度。
對來自各文庫產(chǎn)生最高信號的48個克隆進行DNA測序。將那些其序列最頻繁出現(xiàn)的克隆亞克隆到上文所述允許表達可溶性Fab的載體。如上所述誘導這些Fab，純化蛋白質(zhì)，并通過ELISA分析純化的Fab的結(jié)合，并將結(jié)合情況與起始人源化2C4.574型式進行比較。
在鑒定了各個CDR中的有趣突變后，構(gòu)建這些突變的各種組合的其它突變體并如上進行測試。相對于574產(chǎn)生結(jié)合提高的突變體見表3。
表3由2C4.574的親和力成熟衍生的突變體的名稱
*在HER2-ECD ELISA中產(chǎn)生標準曲線OD中值所需的突變體的量與產(chǎn)生標準曲線OD中值所需的574的量的比率。數(shù)值小于1.0表明突變體比574更好的結(jié)合Erb2。
還構(gòu)建了下列突變體，并且目前正在評估
根據(jù)同源性掃描所提出的下列突變體目前正在構(gòu)建中
H34處優(yōu)選的氨基酸是甲硫氨酸。如果在此位置發(fā)現(xiàn)氧化，則可改變成亮氨酸。
發(fā)現(xiàn)asnH52和asnH53是結(jié)合所強烈優(yōu)選的。將這些殘基改變成丙氨酸或天冬氨酸顯著降低結(jié)合。已經(jīng)制備了包含人源化型式574的輕鏈和重鏈可變區(qū)及人IgG1重鏈恒定區(qū)的完整抗體(參見美國專利5,821,337)。此完整抗體是用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生成的。該分子在本文中稱為Pertuzumab。
實施例4單克隆抗體2C4阻斷EGF、TGF-α或HRG介導的MAPK和Akt激酶活化許多生長因子受體通過促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑發(fā)信號。這些雙重特異性激酶是最終觸發(fā)癌細胞分裂的信號轉(zhuǎn)導途徑中的關(guān)鍵終點之一。以如下方式評估單克隆抗體2C4或Trastuzumab抑制EGF、TGF-α或HRG激活MAPK的能力。
將MCF7細胞(105個細胞/孔)鋪入12孔細胞培養(yǎng)板中含血清的培養(yǎng)基中。第二天，除去細胞培養(yǎng)基并向各孔中加入含0.1％血清的新鮮培養(yǎng)基。然后在次日重復此步驟并在測定前用無血清結(jié)合緩沖液置換培養(yǎng)基(Jones etal.J.Biol.Chem.27311667-74(1998)；及Schaefer et al.，J.Biol.Chem.274859-66(1999))。將細胞平衡至室溫，然后與0.5mL 200nM Trastuzumab或單克隆抗體2C4一起溫育30分鐘。然后將細胞用1nM EGF、1nM TGF-α或0.2nM HRG處理15分鐘。通過吸出細胞培養(yǎng)基并隨后加入0.2mL含1％DTT的SDS-PAGE樣品緩沖液來終止反應(yīng)。如先前所述用抗活性MAPK抗體(Promega)通過蛋白質(zhì)印跡評估MAPK激活(Jones et al.，J.Biol.Chem.27311667-74(1998))。
如圖10所示，單克隆抗體2C4比Trastuzumab更大程度的顯著阻斷EGF、TGF-α和HRG介導的MAPK激活。這些資料說明，單克隆抗體2C4結(jié)合HER2上用于其結(jié)合EGFR或HER3的表面，從而阻止了信號受體復合物的形成。
單克隆抗體2C4還顯示出抑制調(diào)蛋白(HRG)依賴性Akt激活。PI3激酶信號轉(zhuǎn)導途徑的激活對于細胞存活是重要的(Carraway et al.，J.Biol.Chem.2707111-6(1995))。在腫瘤細胞中，PI3激酶活化可能在侵襲性表型中起作用(Tan et al.，Cancer Reearch 591620-1625(1999))。存活途徑主要由絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT介導(Bos et al.，Trends Biochem.Sci.20441-442(1995))。HER2與HER3或EGFR之間形成的復合物可分別響應(yīng)調(diào)蛋白或EGF而起動這些途徑(Olayioye et al.，Mol.&Cell.Biol.185042-51(1998)；Karunagaranet al.，EMBO Journal 15254-264(1996)；及Krymskaya et al.，Am.J.Physiol.276L246-55(1999))。MCF7乳癌細胞與2C4的溫育抑制調(diào)蛋白介導的Akt激活。Agus et al.，Cancer Cell 2127-137(2002)。此外，通過加入2C4進一步降低了在缺乏調(diào)蛋白時存在的Akt激活的基礎(chǔ)水平。
實施例5鉑耐受性癌癥的療法此實施例證明了pertuzumab與吉西他濱聯(lián)合治療患鉑耐受性卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌或輸卵管癌的患者時的安全性、耐受性和功效。在所有患者中以及其腫瘤含有指示HER2活化的標記物的患者子集評估pertuzumab和吉西他濱對無進展存活的效果。
正在接受基于鉑的化療方案或者在接受此方案6個月內(nèi)病情有進展的患者將符合此項研究的條件?；颊邔㈦S機接受或是吉西他濱與pertuzumab的組合或是吉西他濱與安慰劑的組合。在此治療的患者包括那些在加入研究前未接受過鉑耐受性疾病的先前補救方案治療(previous salvage regimen treatment)的患者，以及那些已接受過鉑耐受性疾病的先前方案的患者。
在每個21天循環(huán)的第1和8天以1000mg/m2施用吉西他濱。首先輸注吉西他濱30分鐘。由于毒性問題允許降低劑量。在21天循環(huán)的第1天施用安慰劑或pertuzumab。隨機接受pertuzumab的受試者將施用840mg的起始加載劑量(initial loading dose)(循環(huán)1)，隨后在循環(huán)2和后續(xù)循環(huán)中施用420mg。隨機接受安慰劑的受試者將在循環(huán)1、循環(huán)2及后續(xù)循環(huán)中施用與pertuzumab組相同體積的安慰劑。無疾病進展的受試者可接受治療長達17個循環(huán)或1年。
由于血細胞減少，患者將降低標準吉西他濱劑量和施用維持劑量(helddoses)。針對任何第1天吉西他濱的維持劑量，Pertuzumab也將維持。后續(xù)劑量將是降低的劑量并且不再增加。如果超過4次(4 occasions)需要劑量降低或維持劑量，或者如果維持劑量超過3周，那么將停用吉西他濱，并且經(jīng)主治醫(yī)師和醫(yī)療監(jiān)控者同意可繼續(xù)施用盲試藥物直至病情進展。如果第8天吉西他濱劑量是維持的，那么該第8天的劑量可省略，后續(xù)處理將從下一個循環(huán)開始(前一循環(huán)的第22天)。
如下表推薦維持和降低吉西他濱的劑量
需要降低劑量的任何患者的后續(xù)劑量將是降低的劑量。如果由于血細胞減少，維持劑量超過3周，將假設(shè)患者具有無法接受的毒性并將停用吉西他濱。如果沒有其它附加的III級或IV級毒性，根據(jù)醫(yī)師和醫(yī)療監(jiān)控者的判斷將繼續(xù)施用盲試藥物。吉西他濱的血液學毒性與施藥速率有關(guān)。不管總劑量如何，吉西他濱的給藥都應(yīng)超過30分鐘。根據(jù)主治醫(yī)師的判斷可對NCI-CTC2級血小板減少使用集落刺激劑。
還將提供與單一藥劑pertuzumab交換(crossover)的選擇。還將在預(yù)期的下一個循環(huán)時施用840mg的加載劑量，后續(xù)每21天的后續(xù)循環(huán)的420mg。獲取石蠟包埋的腫瘤樣本或含癌的代表性腫瘤的未染色石蠟切片，并評估HER2磷酸化狀態(tài)。約20-40％的卵巢癌患者可能具有可檢測的HER2磷酸化。
在第2、4、6、8、12和17個循環(huán)結(jié)束時評估響應(yīng)。通過臨床評估和CT掃描或等效手段，用實體瘤響應(yīng)評估標準(Response Evaluation Criteria forSolid Tumors，RECIST)來評估可測量的疾病。根據(jù)CA-125變化以及疾病的臨床和放射學證據(jù)，評估患可評估疾病的患者的響應(yīng)。應(yīng)當在最初記錄響應(yīng)后4-8周確認響應(yīng)?？稍u估的受試者將包括已具有至少一次響應(yīng)評估且在其腫瘤樣本中確定了HER2磷酸化狀態(tài)的受試者。
將評估下列結(jié)果測量值。
主要功效終點(Primary Efficacy Endpoint)無進展存活(Progression free survival)，根據(jù)調(diào)查人員使用RECIST或CA-125變化進行的評估確定，在各組所有受試者中開始指定的試驗治療后進行。
無進展存活，根據(jù)調(diào)查人員使用RECIST或CA-125變化進行的評估確定，在各組以下亞組中開始指定的試驗治療后進行有HER2活化的可檢測標志的受試者。
無HER2活化的可檢測標志的受試者。
次要功效終點(Secondary Efficacy Endpoints)客觀響應(yīng)(PR或CR)
響應(yīng)持續(xù)時間存活時間4個月沒有進展將在各組以及下列亞組的所有受試者中評估這些終點有HER2活化的可檢測標志的受試者。
無HER2活化的可檢測標志的受試者。
為了預(yù)防或治療可能的惡心和嘔吐，可對患者前驅(qū)用藥血清素(serotonin)拮抗劑、類固醇和/或苯并二氮卓類(benzodiazepines)。為了預(yù)防或治療可能的皮疹，可使用標準痤瘡療法，包括局部和/或口服抗生素。其它可能的伴隨藥療有任何處方藥物或非處方藥制劑，由受試者在間隔中使用，在第1天之前7天開始并持續(xù)至隨訪期(follow up period)的最后一天。由于輸注導致溫度升高至＞38.5℃或其它與輸注有關(guān)癥狀的受試者可用醋氨酚(acetaminophen)、苯海拉明(diphenhydramine)或哌替啶(meperidine)進行對癥處理?？蓪CI-CTC2級血細胞減少施用非實驗性造血生長因子。
根據(jù)任何一項或多項主要或次要功效終點的評估，如上所述治療的患者將顯示出卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌或輸卵管癌的體征或癥狀的改善。此外，與只用吉西他濱治療的鉑耐受性患者相比，如上所述用Pertuzumab和吉西他濱聯(lián)合治療的鉑耐受性患者將顯示出癌癥任何一種體征體征或癥狀的較大改善。
權(quán)利要求
1.用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用比Trastuzumab更有效地抑制HER二聚化的HER2抗體及抗代謝物化療劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述HER2抗體結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述HER2抗體是Pertuzumab。
4.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述抗代謝物化療劑是吉西他濱。
5.任一前述權(quán)利要求的方法，其中來自患者的腫瘤樣品呈現(xiàn)出HER活化。
6.權(quán)利要求5的方法，其中來自患者的腫瘤樣品呈現(xiàn)出HER2活化。
7.任一前述權(quán)利要求的方法，相對于只用抗代謝物化療劑治療的患者，它導致存活有所改善。
8.權(quán)利要求7的方法，相對于只用抗代謝物化療劑治療的患者，它導致無進展存活有所改善。
9.權(quán)利要求7的方法，相對于只用抗代謝物化療劑治療的患者，它導致整體存活有所改善。
10.任一前述權(quán)利要求的方法，它導致客觀響應(yīng)。
11.權(quán)利要求10的方法，它導致完全響應(yīng)。
12.權(quán)利要求10的方法，它導致部分響應(yīng)。
13.任一前述權(quán)利要求的方法，其中先以約840mg的加載劑量施用HER2抗體，后續(xù)大約每3周約420mg。
14.權(quán)利要求1至12任一項或多項的方法，其中以大約每3周施用約1050mg的劑量施用HER2抗體。
15.權(quán)利要求4的方法，其中在3周循環(huán)的第1天和第8天以約600mg/m2至1250mg/m2之間的劑量施用吉西他濱。
16.任一前述權(quán)利要求的方法，其中在施用HER2抗體之前或之后施用抗代謝物化療劑。
17.權(quán)利要求16的方法，其中至少一次施用抗代謝物化療劑和至少一次施用HER2抗體之間的時間間隔是約1個月或更短。
18.權(quán)利要求17的方法，其中至少一次施用抗代謝物化療劑和至少一次施用HER2抗體之間的時間間隔是約2周或更短。
19.權(quán)利要求1至15中任一項的方法，其中在單一配制劑或分開配制劑中同時對患者施用抗代謝物化療劑和HER2抗體。
20.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌不過表達HER2。
21.任一前述權(quán)利要求的方法，還包括對患者施用第二種化療劑。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述第二種化療劑選自紫杉烷、卡培他濱、基于鉑的化療劑、蒽環(huán)類抗生素、脂質(zhì)體多柔比星、托泊替康、培美曲塞、長春花生物堿類和TLK 286。
23.任一前述權(quán)利要求的方法，其中聯(lián)合抗代謝物化療劑和HER2抗體的治療對患者產(chǎn)生協(xié)同的、或者大于累加的治療效益。
24.權(quán)利要求4的方法，其中聯(lián)合吉西他濱和HER2抗體的治療對患者產(chǎn)生協(xié)同的、或者大于累加的治療效益。
25.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述HER2抗體是裸抗體。
26.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述HER2抗體是完整的抗體。
27.權(quán)利要求1至25任一項的方法，其中所述HER2抗體是包含抗原結(jié)合區(qū)的抗體片段。
28.任一前述權(quán)利要求的方法，其中所述癌癥是卵巢癌。
29.權(quán)利要求1至27任一項的方法，其中所述癌癥是原發(fā)性腹膜癌。
30.權(quán)利要求1至27任一項的方法，其中所述癌癥是輸卵管癌。
31.用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用結(jié)合HER2上異二聚體結(jié)合位點的HER2抗體及吉西他濱。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述抗體阻斷HER2與EGFR或HER3的異二聚化。
33.用于治療鉑耐受性癌癥的方法，所述癌癥選自卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌和輸卵管癌，所述方法包括各自以有效治療癌癥的量對患者施用結(jié)合HER2結(jié)構(gòu)域II的HER2抗體及吉西他濱。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述HER2抗體結(jié)合HER2的結(jié)構(gòu)域I、II和III之間的連接處。
全文摘要
本發(fā)明涉及聯(lián)合有效抑制HER二聚化的HER2抗體及吉西他濱來治療鉑耐受性的卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌或輸卵管癌的方法。
文檔編號A61P35/00GK101014366SQ200580027930
公開日2007年8月8日 申請日期2005年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月16日
發(fā)明者斯蒂芬·M·凱爾西 申請人:健泰科生物技術(shù)公司