專利名稱：：用于治療過量一氧化氮或氰化物中毒的方法與組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明主要涉及鈷啉醇酰胺及鈷啉醇酰胺的生物活性衍生物和類似物，其調(diào)節(jié)患者的一氧化氮(NO)或過量的氰化物水平。本發(fā)明還涉及含有鈷啉醇酰胺與生物活性衍生物和類似物的藥物組合物，及其使用方法。
背景技術：
：一氧化氮(NO)是一種重要的信號分子，且已開發(fā)了許多NO合成抑制劑和清除劑以允許NO功能的研究，并降低疾病狀態(tài)中過量的NO水平。敗血癥性休克具有頑固性低血壓的特征，且具有極高的死亡率。許多細胞因子和信號分子促成此敗血癥性狀態(tài)，在該低血壓的發(fā)展中，一氧化氮(NO)起了主要作用。NO由三種不同的NO合酶產(chǎn)生神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)。iNOS顯著的誘導是敗血癥中形成增加的NO水平的主要原因。非選擇性的NOS抑制劑在敗血癥的動物模型中顯示了一些成功，但在大量III期試驗中，這些藥劑中的一種導致副作用和死亡率增加。選擇性的iNOS抑制劑已在動物模型中顯示更有希望，但還未在人類中試驗。降低敗血癥中的NO水平的另一途徑是使用NO清除劑，且一些NO清除劑包括血紅蛋白、二硫代氨基甲酸鹽衍生物，及維生素B12(鈷胺素)已在敗血癥的動物模型中顯示有益。先前已證明鈷胺素結(jié)合NO，并因此抑制維生素B12依賴的酶-甲硫氨酸合成酶(Danishpajooh，J.Biol.Chem.27627296-27303，2001)。氰化物是一種高毒劑，其抑制線粒體的細胞色素C氧化酶，從而消耗細胞的ATP。其促成火災中的煙吸入死亡，并可用作一種大規(guī)模毀滅性武器。由于目前常見的大量塑料材料，因此氰化物在家庭火災中被產(chǎn)生。在歐洲，鈷胺素已用于治療氰化物中毒，而盡管已顯示出高度有效，它還未被用于本國(美國)。類似地，一氧化碳(CO)在火災中產(chǎn)生，且在火災中最常見的死亡原因是煙吸入，且特別是氰化物和CO的吸入。因此，期望提供預防和治療受治療者的過量一氧化氮或過量氰化物，且無不利的副作用的新方法及組合物。本發(fā)明的方法和藥物組合物涉及這些，以及其他重要的目標。發(fā)明概述本發(fā)明提供預防和治療患者的過量一氧化氮或過量氰化物的方法。更明確地，本發(fā)明涉及預防和治療患者一種疾病狀態(tài)或緩解患者一種疾病狀態(tài)的多種癥狀的方法，所述的患者疾病狀態(tài)或患者疾病狀態(tài)的多種癥狀是在患者中由在該患者中的過量一氧化氮或過量氰化物的存在而引起或加重。在一方面，提供了一種用于治療受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的方法，其包括對受治療者施用藥學有效量的鈷啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或類似物。在一些方法中，該疾病狀態(tài)為敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷。在一些方法中，鈷啉醇酰胺按1至500mg的劑量進行給藥。在一些這樣的方面，此方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在一方面，本發(fā)明提供了一種用于緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的癥狀的方法，其包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受治療者被診斷為遭受由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)發(fā)展的痛苦或處于由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)疾病狀態(tài)發(fā)展的危險。在一些方法中，所述疾病狀態(tài)為敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷。在一些這樣的方法中，鈷啉醇酰胺按1至500mg的劑量進行給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療受治療者敗血癥的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。在一些方法中，所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。在一些這樣的方面，此方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的方法，其包括對受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在一些方法中，所述受治療者為吸煙者或血液透析患者。在其他方面，所述疾病狀態(tài)為囊性纖維病。在一些方法中，所述過量的氰化物由大規(guī)模毀滅性武器致使。在其他方面，所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。在一些這樣的方法中，所述方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于緩解受治療者因過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的癥狀的方法，其包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受試者被診斷為遭受發(fā)展病狀態(tài)的痛苦或處于發(fā)展疾病狀態(tài)的危險，所述疾病狀態(tài)是由過量氰化物的存在而引起或加重的。在一些方法中，所述受治療者為吸煙者或血液透析患者。在其他方法中，所述疾病狀態(tài)為囊性纖維病。在一些方法中，所述過量的氰化物由大規(guī)模毀滅性武器產(chǎn)生。在其他方法中，所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。在一些方面，所述方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種治療受治療者氰化物中毒的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。在一些方法中，所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。在一些方面，此方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療受治療者煙吸入的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。在一些方法中，所述鈷啉醇酰胺以500mg至5g的劑量進行給藥。在一些方面，此方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療對哺乳動物受治療者施用硝普鹽有關的副作用的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。在一些方法中，所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。在一些方面，此方法還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。在另一方面，本發(fā)明提供包括鈷啉醇酰胺和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一些方面，所述藥物組合物還包括鈷胺素與藥學上可接受的載體。在其他方面，所述藥物組合物還包括鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物，及藥學上可接受的載體。在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括被配制成向受治療者遞送的一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，其中所述組合物可有效地治療受治療者因過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)。在一些方面，所述藥物組合物還包括被配制成遞送的鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物。在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括被配制成向受治療者遞送的一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，其中所述組合物可有效緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的一或多種癥狀。在一些方面，所述藥物組合物還包括被配制成遞送的鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物。在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括被配制成向受治療者遞送的一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，其中所述組合物可有效治療受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)。在一些方面，所述藥物組合物還包括被配制成遞送的鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物。在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括被配制成向受治療者遞送的一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，其中所述組合物可有效緩解受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的一或多種癥狀。在一些方面，所述藥物組合物還包括被配制成遞送的鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物。圖1.鈷啉醇酰胺與鈷胺素的結(jié)構(gòu)。顯示了鈷胺素的結(jié)構(gòu)。鈷啉醇酰胺缺少灰色顯示的5，6-二甲基苯并咪唑核苷酸末端。圖2.鈷啉醇酰胺的光譜分析。如典型的實施方案中所描述的，鈷啉醇酰胺從羥鈷胺素制備，并在C18固相萃取柱上純化。在濃縮后，試樣被回復至pH值為3.0，且二水合鈷啉醇酰胺產(chǎn)物的光譜被記錄在300與700nm之間。圖3.鈷啉醇酰胺對NO-刺激的馬爾皮吉安氏小管分泌和亞硝酸鹽及硝酸鹽濃縮物的影響。組A及組B從野生型果蠅中除去馬爾皮吉安氏小管，且管的分泌率通過測量在10分鐘間隔期間小管對的單輸尿管的微滴形成進行確定。測量基礎的小管分泌率30分鐘，并接著用10μMDeta-NO親核復合體(組A)或1μM的脂多糖(LPS，組B)處理小管；在兩組中，藥物加入的時間被用楔形記錄。最終濃度在10μM的鈷啉醇酰胺被在60分鐘加入一些小管中(在組A及B中通過箭頭和實心圈記錄藥物的加入)；一些小管接收到10μM的鈷啉醇酰胺加10μM的鈷胺素(組A和組B中的實心三角)。各數(shù)據(jù)點代表在20對馬爾皮吉安氏小管上進行的至少三次獨立實驗的平均值±標準差。組C10對小管用10μMDeta-NO親核復合體或10μM的LPS，在無(空心柱)或有(實心柱)10μM鈷啉醇酰胺(Cbi)情況下，被溫育在200μl的Schneider’s培養(yǎng)基中60分鐘。培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽和硝酸鹽通過基于Griess試劑的方法進行測量，且通過與標準值比較進行定量。該數(shù)據(jù)是三份中進行的至少兩次獨立實驗的平均值±標準差；左邊的y軸用來表示Deta-NO親核復合體的數(shù)據(jù)，右邊的y軸用來表示LPS的數(shù)據(jù)。培養(yǎng)基中檢測不到未經(jīng)處理的小管的亞硝酸鹽或硝酸鹽。圖4.喂養(yǎng)鈷啉醇酰胺的果蠅對LPS具有衰減的流體分泌反應。野生型果蠅在標準果蠅飼料或含250μM鈷啉醇酰胺(Cbi)的果蠅飼料上生長48小時。從對照和喂養(yǎng)鈷啉醇酰胺的果蠅除去馬爾皮吉安氏小管并將所述小管用于如圖3描述的流體分泌分析中。測量基礎分泌率30分鐘；接著用1μM脂多糖(LPS)刺激該小管，且再測量流體分泌30分鐘。結(jié)果被表示為LPS刺激的讀數(shù)超過基礎讀數(shù)的增長百分數(shù)，且為三次獨立實驗的平均值±標準差。圖5.鈷啉醇酰胺對VASP磷酸化及亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度的影響。大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(組A-C)與CS-54血管平滑肌細胞(組D)使用編碼VSV表位標記的VASP的表達載體轉(zhuǎn)染；C6細胞使用G-激酶I共轉(zhuǎn)染。16小時后提取該細胞，且使用單克隆抗VSV抗體對該提取物進行蛋白質(zhì)印跡分析。組A細胞被放置不經(jīng)處理(泳道1)或在提取前用100μM鈷啉醇酰胺(Cbi，泳道2、4、6及8)，和/或15μM(泳道3和4)、30μM(泳道5和6)或60μM(泳道7和8)NO供體PAPA-NO親核復合體(Papa)處理30分鐘。磷酸化的VASP(pVASP)比非磷酸化的VASP移動得慢。組B細胞被放置不經(jīng)處理(泳道1)或在提取前用30μMPAPA-NO親核復合體(Papa)(泳道2-5)處理30分鐘；向有些細胞另外加入30μM鈷啉醇酰胺(泳道4)或30μM鈷啉醇酰胺加30μM鈷胺素(泳道5)。組C細胞被放置不經(jīng)處理(泳道1)，或在提取前用30μM8-pCPT-cGMP(泳道2-4)與30μM鈷啉醇酰胺(泳道3)或30μM鈷啉醇酰胺與30μM鈷胺素的組合物(泳道4)處理30分鐘。組DCS-54細胞被放置不經(jīng)處理(泳道1)，或在提取前用100μM鈷啉醇酰胺(泳道2和3)，和/或100nM的鈣離子載體A23187(泳道3和4)處理60分鐘。組EC6細胞(圖的左半部分)和CS-54(圖的右半部分)被分別用15μMPAPA-NO親核復合體和300nMA23187處理30分鐘。向一半的培養(yǎng)物再加入15μM鈷啉醇酰胺(實心柱)。收集培養(yǎng)基，且如圖3的說明中所述測量亞硝酸鹽加硝酸鹽的總和。該數(shù)據(jù)是三份中進行的至少兩次獨立實驗的平均值±標準差；左邊的y軸用來表示PAPA-NO親核復合體處理的C6細胞，且右邊的y軸用來表示A23187處理的CS-54細胞。在未經(jīng)處理的細胞的培養(yǎng)基中低亞硝酸鹽和/或硝酸鹽濃度是從那些處理的細胞提取出的。圖6.鈷啉醇酰胺對BHK、C6及CS-54細胞生長的影響。在添加10％FBS的DME培養(yǎng)基中，BHK、C6及CS-54細胞被置于每孔1.5-3×105細胞的六孔培養(yǎng)皿中，并持續(xù)三天每天計數(shù)。在缺少鈷啉醇酰胺(連續(xù)線，實心圈)或存在50μM、100μM或200μM鈷啉醇酰胺情況下(分別用帶有空心三角、菱形和方塊的虛線表示)培養(yǎng)細胞。主要的數(shù)字顯示BHK細胞的數(shù)據(jù)，插入的數(shù)字顯示針C6和CS-54細胞的數(shù)據(jù)。一些使用200μM鈷啉醇酰胺處理的BHK細胞還接受了200μM鈷胺素(點線，實心方塊)。該數(shù)據(jù)是來自代表性的實驗的兩份培養(yǎng)物的平均值。圖7.鈷啉醇酰胺對甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶的體內(nèi)活性的影響。BHK細胞使用六孔培養(yǎng)皿在含10％FBS的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)。該細胞被分別用10μCi的[14C]-甲酸鹽(實心柱)或[14C]-丙酸(空心柱)培養(yǎng)90分鐘或16小時。在加入如指出的甲酸鹽標記物之前6小時及與加入丙酸標記物同時，加入濃度在100μM的鈷啉醇酰胺(Cbi)。一些培養(yǎng)物在加入鈷啉醇酰胺時另外加入100μM鈷胺素(Cbl)。在培養(yǎng)期的最后，所述細胞用0.4N的高氯酸(甲酸鹽標記物)或10％三氯乙酸(丙酸標記物)提取，并如典型實施方案中描述的進行處理。該數(shù)據(jù)是兩份中進行的至少三次獨立實驗的平均值±標準差。結(jié)合甲酸鹽評價在體內(nèi)的甲硫氨酸合酶活性，并結(jié)合丙酸評價在體內(nèi)的甲基丙二酰輔酶A變位酶活性。圖8.鈷啉醇酰胺恢復氰化物處理的中國倉鼠細胞中的呼吸活性。以約3×107細胞/毫升的濃度轉(zhuǎn)移中國倉鼠細胞到代謝艙，并通過使用氧電極測量氧消耗來評價呼吸活性。在未加入底物(sub，5mM琥珀酸鈉及5mM3-磷酸甘油)時，氧消耗是低的——如在圖A中描記的近乎水平線所指示的，在指示的時間加入KCN、鈷啉醇酰胺(Cbi)及鈷胺素(Cbl)至最終濃度為250μM。在圖A中顯示了兩個標繪在相同曲線上的代表性的描記，且在圖B中顯示了鈷啉醇酰胺與鈷胺素的恢復百分數(shù)；后者的數(shù)據(jù)是兩份中進行的至少五次獨立實驗的概要(平均值±S.D.)。圖9.在果蠅中攝取鈷啉醇酰胺進行氰化物氣體及KCN解毒。果蠅在標準果蠅飼料糊(正常飼料，空心及實心柱)，或含有100μM鈷胺素(Cbl，左斜紋柱)或100μM鈷啉醇酰胺(Cbi，交叉影線柱)的標準飼料上從第一齡幼蟲期生長。組A在各標明的條件下，20只果蠅被以2.2ppm或22ppm暴露于HCN1分鐘。HCN引起所有果蠅在20秒內(nèi)虛脫不活動；標繪于縱坐標上的是恢復并在暴露1小時后能走動或飛行的果蠅數(shù)目。未暴露于HCN的果蠅被在最右端以實心柱示出。組B如標明的，在各條件下，對約10只果蠅注射1μl的10mMNa2CO3(pH9.5，實心柱)或Na2CO3中的100μM的KCN。該數(shù)據(jù)作為1小時后活動的果蠅的百分數(shù)被提供。兩組中的數(shù)據(jù)為兩份中進行的至少三次獨立實驗的平均值±S.D.。圖10.在果蠅中注射或吸入鈷啉醇酰胺進行氰化物氣體解毒。通過注射(1μl的水或500μMCbl或Cbi，組A)或使用含水或100μM的Cbl或Cbi(組B)的噴霧器進行吸入，使果蠅接受水(空心及實心柱)、鈷胺素(Cbl，左斜紋柱)，或鈷啉醇酰胺(Cbi，交叉影線柱)。所述果蠅在接受鈷啉醇酰胺或鈷胺素之前(各圖右半部分的柱)或在接受鈷啉醇酰胺或鈷胺素之后(各圖左半部分的柱)被暴露于22ppm(組A)或2.2ppm(組B)的HCN1分鐘。被使用水噴霧但未暴露于HCN的果蠅被示于組B的實心柱中。該數(shù)據(jù)是兩份中進行的至少三次獨立實驗的平均值±S.D.。圖11.鈷啉醇酰胺減少氰化物對馬爾皮吉安氏小管分泌的抑制。從果蠅中除去成對的馬爾皮吉安氏小管，且流體分泌率通過測量在10分鐘間隔期間輸尿管的微滴形成進行確定。在向全部小管加入100μMKCN前，在三個10分鐘間隔測量分泌率。組A在零點時間向小管加入濃度為100μM的鈷啉醇酰胺(空心圈)與鈷胺素(三角)。組B在除去果蠅的馬爾皮吉安氏小管之前，它們在標準果蠅飼料(實心圈)，或含有100μM鈷啉醇酰胺(空心圈)或100μM鈷胺素(三角)的飼料從第一齡幼蟲期生長。組C在加入KCN(空心圈)10分鐘后，向小管加入100μM濃度的鈷啉醇酰胺。數(shù)據(jù)是在20對馬爾皮吉安氏小管上進行的至少三次獨立實驗的平均值±S.D.。發(fā)明詳述1.引言本發(fā)明提供了許多方法、藥劑及組合物，其可用于治療受治療者由過量一氧化氮(NO)或過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)。應該理解的是本發(fā)明不限于特定的方法、藥劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，其當然可以改變。也應該理解的是用于此處的術語僅為了說明特定的實施方案，并非意在限制。如用于此說明書及所附的權利要求中的，單數(shù)形式的“一”、“一個”及“該”包括復數(shù)所指對象，文中另外指明的除外。因此，例如，“細胞”包括兩種或多種細胞的組合，等等。如用于此處的“約”，當指可測量的值例如數(shù)量、短暫的時間持續(xù)等，意味著包括自特定值的±20％或±10％、更優(yōu)選地±5％、甚至更優(yōu)選地±1％且還更優(yōu)選地±0.1％的變化，因為這樣的變化對進行所述公開的方法是合適的。用于本發(fā)明的方法中的化合物可按本領域技術人員公知的許多方法進行制備。貫穿文中描述的化合物可以可替代的形式使用或制備。例如，許多含氨基的化合物可作為酸加成的鹽使用或制備。通常，這樣的鹽改善所述化合物的分離和處理性質(zhì)。例如，根據(jù)試劑、反應條件等，此處所述的化合物可例如作為它們的氫氯化物或甲苯磺酸鹽被使用或制備。本發(fā)明的范圍內(nèi)還意在包括同型的晶型、所有的手性和消旋形式、N-氧化物、水合物、溶劑合物，及酸式鹽水合物。所有與本發(fā)明有關的公開的方法意在以任何數(shù)值范圍進行實施，包括毫克、克、多克、千克、多千克或市售的工業(yè)上的數(shù)值范圍。除非另外說明，否則用于此處的所有技術及科學術語具有與本發(fā)明所屬領域中的普通技術人員所通常理解的相同的意思。盡管與那些此處描述的方法和材料類似或等效的任何方法和材料可用于測試本發(fā)明的實踐，但優(yōu)選的材料和方法是描述于此的。在說明和要求本發(fā)明的權利時，將使用下列術語。用于此處的一些縮寫包括BHK，幼倉鼠腎細胞；CoA，輔酶A；Deta-NO親核復合體，(Z)-1-[2-(2-氨乙基)-N-(2-銨乙基)氨基]二氮烯-1-鎓-1，2-二醇鹽；DEM，達爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基；FBS，胎牛血清；G-激酶，依賴于cGMP的蛋白激酶；HPLC，高效液相色譜；LPS，脂多糖；NO，一氧化氮；NOS，NO合酶；OH-Cbl，羥鈷胺素；PAPA-NO親核復合體，(Z)-1-[N-(3-銨丙基)-N-(正丙氨基)氨基]二氮烯-1-鎓-1，2-二醇鹽；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水；8-pCPT-cGMP，8-對氯苯基硫代環(huán)GMP；及VASP，血管舒張劑刺激磷蛋白?！皵⊙Y”或“敗血癥性休克”指的是由宿主對感染或創(chuàng)傷的免疫應答引起的一系列臨床情況，并以全身性炎癥和血凝固為特征。其包括從全身性炎癥反應到器官功能異常到多器官衰竭，并最終到許多患者的死亡。特別是在上了年紀的、免疫抑制的及重癥患者中，敗血癥是在世界范圍的重癥監(jiān)護病房(ICUs)中的發(fā)病率和死亡率的主因。在美國，敗血癥是非冠脈ICU患者的主要死亡原因，而來自疾病控制中心(CDC)1998年的數(shù)據(jù)顯示它在所有主要死亡原因中名列第11位(NationalVitalStatisticsReport，2000)。敗血癥與從28％到50％的死亡率有關?！案涡阅X病”描述了一種病癥，其用于描述肝衰竭對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有害作用。其特征包括從精神混亂到反應遲鈍(昏迷)。肝性腦病的常見原因是酒精性肝硬化。“肝腎綜合征”描述了一種病癥，其中急性腎功能衰竭的發(fā)生伴隨肝或膽管疾病，其原因被認為是腎血流量的減少或如四氯化碳中毒或鉤端螺旋體病對肝和腎兩者的損傷。肝腎綜合征也被認為是肝腎的綜合征?！案畏尉C合征”描述了一種發(fā)生在慢性肝病患者的綜合征，其典型的表現(xiàn)是肺中的血管擴張和損傷的氧合作用。呼吸困難可為常見癥狀，指甲杵狀變及發(fā)紺為常見表現(xiàn)?！案斡不孕募〔　蓖ǔ１欢x為在高靜息心排出量情況下對應激的亞正常心室反應。肝硬化的實驗動物模型中的機理研究表明多種因素是造成肝硬化的原因，包括異常的生物物理膜特征、損傷的β-腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導及由cGMP介導的增強活性的心臟抑制劑系統(tǒng)。肝硬化性心肌病由肝移植、經(jīng)頸內(nèi)靜脈肝內(nèi)門體分流術的插入以及感染促成或惡化。其能在肝腎綜合征的發(fā)病機制中起作用?！把和肝稣T導的低血壓”指的是在腎替代治療中最嚴重的并發(fā)癥之一。透析中低血壓的主因是移出的流體量與血管內(nèi)隔室再充填的容量間的不平衡造成的血容量不足。當移出的過量流體完全超過血容量不足的代償機制時，將發(fā)生低血壓。只要腎替代治療被限制在每周僅幾小時，透析中低血壓將繼續(xù)是一個相關問題?！暗脱獕骸敝傅氖莿用}壓(MAP)＜70mmHg的情況；收縮壓(SBP)＜100mmHg被用作次要結(jié)果。“心源性休克”指的是心臟泵功能的基本衰竭導致的休克，如在心肌梗塞、嚴重的心肌病，或心臟的機械梗阻或壓迫中；臨床特征類似于低血容量性休克的那些?！叭毖?再灌注損傷”指的是在低氧狀態(tài)下，流至組織的血流量恢復期間發(fā)生的損傷?！叭毖酢敝傅氖墙M織的氧供應減少的情況?！皠?chuàng)傷”在醫(yī)學上指的是嚴重或危急的身體損傷、創(chuàng)傷，或休克?！扒杌镏卸尽敝傅氖乔杌镒鳛橹卸緛碓?。住宅或工業(yè)火災的煙吸入患者中相對頻繁地發(fā)生氰化物暴露。氰化物中毒也可在工業(yè)中發(fā)生，特別是在金屬貿(mào)易、采礦、電鍍、珠寶生產(chǎn)及x光片回收中。也會在船舶、倉庫及其他結(jié)構(gòu)的熏蒸消毒中遇到。氰化物也用作自殺劑，特別是在衛(wèi)生保健和實驗室職工中。存在許多形式的氰化物，包括氣態(tài)氰化氫(HCN)、水溶性的氰化鉀和氰化鈉鹽，及水溶性差的氰化汞、氰化銅、氰化金，及氰化銀鹽。此外，許多含氰化物的化合物，被稱為氰，可在代謝期間釋放氰化物。這些包括，但不限于，氯化氰及溴化氰(具有潛在肺刺激效應的氣體)、腈(R-CN)，及硝普鈉，其可在延長的或高劑量治療期間產(chǎn)生氰化物中毒。工業(yè)廣泛應用腈作為溶劑及將其用在塑料的生產(chǎn)中。腈可在燃燒期間或在皮膚或胃腸道吸收后進行代謝時釋放HCN。許多合成的(如聚丙烯腈、聚氨基甲酸酯、聚酰胺、脲甲醛、三聚氰胺)及天然的(如羊毛、絲)化合物在燃燒時產(chǎn)生HCN。這些燃燒氣體可能促成煙吸入的發(fā)病率和死亡率。最后，長期消費含氰化物的食物，例如木薯，可導致氰化物中毒。根據(jù)其形式，氰化物可通過吸入、攝食或皮膚吸收引起中毒。氰化物實際上影響所有的身體組織，其結(jié)合普遍存在的金屬酶并致使它們失活。它的主要毒性很可能由細胞色素氧化酶(細胞色素aa3)的失活并因此細胞呼吸的失活而引起，甚至在足夠氧儲存的存在下也是如此。因此，具有高需氧量的組織(如腦、心臟、肝)最深受急性氰化物中毒影響。長期消費含氰化物的食物導致共濟失調(diào)和視神經(jīng)病變。不完全的氰化物代謝引起遺傳性視神經(jīng)萎縮，導致失明。氰化物可引起與長期吸煙有關的一些有害作用，如煙草中毒性弱視。“一氧化碳(CO)中毒”指的是作為燃燒有機化合物的副產(chǎn)物形成的一氧化碳(CO)的中毒。排氣系統(tǒng)發(fā)生故障或阻塞的爐、便攜式加熱器及汽車廢氣可引起CO中毒。吸煙也是CO的重要來源。天然氣不含CO，但不適當排氣的氣水加熱器、煤油空間對流加熱器、木炭烤架、木炭火盆，及Sterno爐都放出CO。CO中毒也通過吸入二氯甲烷蒸汽-一種在脫脂劑、溶劑，及脫漆劑中發(fā)現(xiàn)的揮發(fā)性液體而發(fā)生。皮膚的二氯甲烷暴露不會導致顯著的全身效應，但能引起顯著皮膚燒傷。肝代謝三分之一吸入的二氯甲烷為CO。顯著百分數(shù)的二氯甲烷被儲存在組織中，且連續(xù)釋放導致CO水平比直接吸入CO時提高至少兩倍?！把和肝觥敝傅氖且环N腎透析的類型(常用于患有腎衰竭的患者，但也可用于在急性情況中快速排出藥物或毒藥)。血液透析經(jīng)由專門的濾器通過循環(huán)血液進行工作。血液量連同幫助從血液中去除毒素的溶液一起流過半透膜(透析器或濾器)。血液透析通常需要每分鐘400至500毫升(ml/min)的血流量。“囊性纖維病”指的是外分泌腺的遺傳疾病，通常在幼童時期發(fā)展，并主要累及胰腺、呼吸系統(tǒng)，及汗腺。其特征在于通過受累的腺體產(chǎn)生異常的粘稠粘液，通常導致慢性呼吸道感染和胰臟功能受損。囊性纖維病也被稱為粘液粘稠病?！澳I衰竭”指的是腎不能適當起作用。其可被粗分為兩類急性腎功能衰竭和慢性腎功能衰竭?！凹毙阅I功能衰竭”是腎功能快速累進的降低，通常以少尿(尿產(chǎn)生減少，定量為成人少于400-500毫升/天，兒童少于0.5毫升/千克/小時或嬰兒少于1毫升/千克/小時)、體液失調(diào)及電解質(zhì)紊亂為特征。必須確定根本原因以阻止該進展，且有必要進行透析以彌補處理這些根本原因所需的時間缺口。慢性腎功能衰竭發(fā)展緩慢并最初產(chǎn)生很少的癥狀。其可為許多腎臟疾病的并發(fā)癥，所述腎臟疾病例如IgA腎炎、腎小球腎炎、慢性腎盂腎炎及尿潴留。終末期腎功能衰竭(ESRF)是最終的結(jié)果，在病例中，當尋找供腎移植的供體時，通常需要透析。慢性腎功能衰竭可由許多疾患引起，其包括長期高血壓、糖尿病、充血性心力衰竭、狼瘡或鐮狀細胞性貧血。慢性腎功能衰竭可由許多急性疾病過程引發(fā)。例子包括敗血癥(感染)、休克、創(chuàng)傷、腎結(jié)石、腎臟感染、藥物中毒(阿司匹林或鋰)、毒藥或毒素(藥物濫用)或用碘化的對比染料注射后(不良反應)。兩種形式的腎衰竭都導致威脅生命的代謝紊亂。“大規(guī)模毀滅性武器”或“WMD”是被設計用于殺戮大量人類的武器，典型的目標是平民和軍事人員等。http//encyclopedia.1aborlawtalk.com/Weaponsofmassdestruction。有些類型的WMDs被認為具有心理學的影響，而不是嚴格的軍事用途。盡管該術語被在1937年創(chuàng)造以描述大量通過常規(guī)爆炸的炸彈進行空中轟擊，目前認為屬于此類的多種武器常常指的是如NBC武器或ABC武器核武器(包括放射學武器)、生物武器、化學武器，及爆炸物。WMDs也被稱為無差別毀滅性武器、大規(guī)模破壞性武器及大規(guī)模效應武器。現(xiàn)代軍事定義是“能夠高度有序的毀滅和/或以毀滅大量人類的方式使用的武器。大規(guī)模毀滅性武器可以是烈性炸藥或核武器、生物武器、化學武器，及放射性武器，但當運輸或推進該武器的工具是該武器的可分離和可分割部分時，則不包括這樣的工具?！?來源JointPublication1-02，http//www.dtic.mil/doctrine/iel/newpubs/ipl02.pdf)。化學WMD的一個例子包括，但不限于，氰化物中毒。如用于美國民防活動中的，該定義要廣得多。此類別現(xiàn)包括CBRNE武器——化學武器、生物武器、放射性武器、核武器，及爆炸武器。在此列表中，“大規(guī)模毀滅性武器”已被定義為“(1)任何爆炸武器、燃燒武器，毒氣、炸彈、手榴彈，或具有超過4盎司推進劑裝料的火箭、具有超過四分之一盎司的爆炸或燃燒裝料的導彈，或地雷或與上述類似的裝置。(2)毒氣。(3)任何包含疾病生物體的武器。(4)任何被設計用以危及人類生命水平釋放輻射的武器。”18U.S.C.§2332a?！把苌铩敝傅氖且环N化合物，其通過被另一原子、分子或基團的取代的置換，從類似結(jié)構(gòu)的另一化合物中產(chǎn)生。例如化合物的氫原子可被烷基、?；?、氨基等取代，以產(chǎn)生該化合物的衍生物。術語“穩(wěn)定的”，如用于此處的，指的是其具有允許被生產(chǎn)的能力，且在用于此處詳述的目的的足夠長的時間階段保持其完整性。一般，本發(fā)明的化合物在無水或無其他化學的反應條件時40℃或更低溫度下至少持續(xù)一周是穩(wěn)定的。“患者”、“受治療者”，或“哺乳動物”可互換地使用，指的是哺乳動物，例如人類患者和非人類的靈長類，以及實驗動物，例如家兔、大鼠，及小鼠，以及其他動物。動物包括所有脊椎動物，如哺乳動物和非哺乳動物，例如綿羊、狗、母牛、小雞、兩棲動物，及爬行動物?！爸委煛敝傅氖窃谥委熁蚋纳苹蝾A防疾病、病癥或疾患中的任何成功的標志，包括任何客觀的或主觀的參數(shù)，例如，減輕；緩和；癥狀的減少或使病癥對患者來說為更可容忍；惡化率或衰退率的減少；或使得惡化的終點較不弱。癥狀的治療或改善能以客觀或主觀的參數(shù)為基礎；包括醫(yī)生檢查的結(jié)果。因此，術語“治療”包括進行本發(fā)明的化合物或藥劑的給藥以預防或延遲、減輕，或阻止或抑制與此處描述的疾病、病癥或疾患有關的癥狀或病癥的發(fā)展。術語“療效”指的是減輕、消除或預防受治療者疾病、疾病的癥狀，或疾病的副反應。使用本發(fā)明的方法的“治療”或“療法”包括防止受治療者癥狀的發(fā)作(所述受治療者可能處于與此處描述的疾病、病癥或疾患有關的疾病或疾患的增加的危險中，但未經(jīng)歷或表現(xiàn)癥狀)、抑制疾病或疾患的癥狀(減慢或阻止其發(fā)展)、減輕疾病的癥狀或副反應(包括姑息療法)，以及緩解疾病的癥狀(引起消退)。治療可以在表現(xiàn)疾病或病癥后，癥狀的預防性的(預防或延遲疾病的發(fā)作，或預防其臨床的或亞臨床的癥狀的表現(xiàn))或治療的抑制或減輕。術語“療法”，如用于此處的，包括預防療法(如預防劑)、根治療法或姑息療法。術語“給藥”，如用于此處的，表示直接進行本發(fā)明的化合物或組合物的給藥，或者進行前藥、衍生物或類似物的給藥，所述前藥、衍生物或類似物將在體內(nèi)形成等量的活性化合物或物質(zhì)。術語“同時給藥”或“聯(lián)合給藥”或如此處使用的類似說法意思是包括對單個患者進行所選的治療劑的給藥，且意在包括所述藥劑不必要經(jīng)由相同的給藥途徑或在相同的時間進行給藥的治療方案?！八帉W上可接受的賦形劑”表示用于制備通常安全、無毒及合乎需要的藥物組合物的賦形劑，并包括對獸用和人類藥學用途可接受的賦形劑。這樣的賦形劑可為固體、液體、半固體，或在氣溶膠組合物的情況下為氣體。“藥學上可接受的鹽或酯”意思是藥學上可接受的并具有理想的藥理性質(zhì)的鹽或酯。這樣的鹽包括在所述化合物中存在的酸性質(zhì)子能與無機的或有機的堿反應可形成的鹽。合適的無機鹽包括那些與堿金屬如鈉和鉀、鎂、鈣及鋁形成的鹽。合適的有機鹽包括那些與有機堿例如胺堿形成的，如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-泛影葡胺等。這樣的鹽也包括與無機酸(如氫氯酸和氫溴酸)和有機酸(如乙酸、檸檬酸、馬來酸，及烷磺酸與芳烴磺酸例如甲磺酸及苯磺酸)形成的酸加成鹽。藥學上可接受的酯包括從化合物如C1-6烷基酯中存在的羧基、磺酰氧基及膦酰氧基形成的酯。當存在兩個酸性基團時，藥學上可接受的鹽或酯可為單酸單鹽或單酸單酯或雙鹽或雙酯；且類似地，在存在超過兩個酸性基團時，一些或全部這樣的基團可被成鹽或酯化。本發(fā)明中命名的化合物可以未成鹽或未酯化的形式，或以成鹽和/或酯化的形式存在，且這樣的化合物的命名意在包括最初的(未成鹽且未酯化)化合物及其藥學上可接受的鹽和酯。本發(fā)明中命名的某些化合物也能以超過一種的立體異構(gòu)體形式存在，且這樣的化合物的命名意在包括這樣的立體異構(gòu)體的全部單個的立體異構(gòu)體和全部混合物(不論消旋與否)?！八帉W上可接受的載體(或介質(zhì))”，其可與“生物相容的載體或介質(zhì)”互換使用，指的是藥劑、細胞、化合物、材料、組合物，和/或劑型，其在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)，適于與人類和動物的組織接觸而使用并沒有過度的毒性、刺激、過敏反應，或與合理的利益/風險率相應的其他并發(fā)癥。如在此更詳細描述的，適于在本發(fā)明中使用的藥學上可接受的載體包括液體、半固體(如凝膠)及固體物質(zhì)(如細胞支架)。如用于此處的，術語“可生物降解的”描述了物質(zhì)在體內(nèi)被分解(如被降解、被蝕解、被溶解)的能力。該術語包括從身體消除或不消除(如通過再吸收)的情況下在體內(nèi)的降解。所述半固體和固體物質(zhì)可被設計為在體內(nèi)抗降解(不能生物降解的)或它們可被設計為在體內(nèi)降解(可生物降解的、可生物蝕解的)?？缮锝到獾牟牧线€可為可生物再吸收的或可生物吸收的，即其可被溶解或吸收進體液(水溶性的植入物是一個例子)，或降解并最終從體內(nèi)排出，經(jīng)由轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)或者分解并經(jīng)由自然途徑排出。貫穿本文描述的化合物可以可替換的形式使用或制備。例如許多含氨基的化合物可作為酸加成的鹽使用或制備。常常是這樣的鹽改善了所述化合物的分離和處理性質(zhì)。例如根據(jù)試劑、反應條件等，此處所述的化合物可例如作為它們的氫氯化物或甲苯磺酸鹽被使用或制備。本發(fā)明的范圍內(nèi)還意在包括同型的晶型、所有的手性和消旋形式、N-氧化物、水合物、溶劑合物，及酸式鹽水合物。本發(fā)明的某些酸性或堿性化合物可作為兩性離子存在。本發(fā)明的范圍內(nèi)意在包括所述化合物的所有形式，包括游離酸、游離堿及兩性離子。本領域眾所周知的是，含氨基和羧基的化合物通常與它們的兩性離子平衡存在。因此，貫穿本文所描述的含有例如氨基和羧基的任何化合物，也包括它們相應的兩性離子。術語“藥學上可接受的”、“生理上允許的”及其語法變化，當它們指的是組合物、載體、稀釋劑及藥劑時可互換使用，并表示所述物質(zhì)能夠給藥于人類而不產(chǎn)生阻止所述組合物給藥的不希望的生理效應?！爸委熡行Я俊?、“有效量”及其語法變化，當它們指的是本發(fā)明的藥物組合物時，可互換使用，并表示當給藥于受治療者以治療疾病或病癥時足夠影響所述疾病或病癥治療的量。此處所用的“治療有效量”指的是在劑量和必需的時間周期上有效實現(xiàn)理想效果的量。特別地，“治療有效量”指的是治療在受治療者由過量一氧化氮或氰化物中毒的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的化合物或化合物的組合物的量。應該理解的是本發(fā)明的成分的有效量將不僅隨所選的特定化合物、成分或組合物、給藥途徑，及成分(單獨或與一或多種復方藥劑結(jié)合)在個體中引起期望的反應的能力而在患者間不同，而且隨一些因素例如將被減輕的疾病狀態(tài)或病癥的嚴重度、個體的激素水平、年齡、性別、體重、患者疾病狀態(tài)及正被治療的病理狀態(tài)的嚴重度、由特定患者正遵循的并行的藥物療法或特殊飲食，以及本領域技術人員將認識到的其他因素，而在患者間不同，合適的劑量最終在監(jiān)護醫(yī)生的慎重考慮下。給藥方案可被調(diào)整以提供改善的治療反應。治療有效量也是這樣一種量即其中治療的有益效果超過成分的任何有毒或有害作用的量。已知的治療藥物與本發(fā)明的藥物組合物的“共同給藥”表示所述藥物與包括鈷啉醇酰胺或其生物活性衍生物或類似物的組合物的給藥，此時已知藥物和所述組合物將均具有治療效果。這樣的共同給藥可包括與本發(fā)明的化合物給藥同時(即在相同的時間)、之前或之后進行抗微生物藥物的給藥。本領域的普通技術人員將不難確定對于本發(fā)明的特定藥物和組合物的合適的給藥周期、順序及劑量。術語“聯(lián)合治療”指的是兩種或多種治療劑或化合物的給藥，用于治療本發(fā)明中描述的治療學的病癥或疾患，例如敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，或創(chuàng)傷。其他描述于本發(fā)明的治療學的病癥或疾患包括，例如氰化物中毒。這樣的給藥包括以同時的方式進行這些治療劑或化合物的共同給藥，例如，以具有鈷啉醇酰胺活性的單個化合物，或以多種具有鈷啉醇酰胺與鈷胺素活性的獨立的化合物(包括單劑量單元的獨立的化合物的給藥)。此外，這樣的給藥也包括以同時的方式使用各類型的治療劑。在任一情況中，該治療方案將在治療此處描述的病癥或疾患中提供聯(lián)合用藥的有益效果。通常，術語“良好耐受的”指的是沒有作為治療結(jié)果并將影響治療決定的病癥不利變化?！皡f(xié)同的相互作用”指的是一種相互作用，其中兩種或多種藥劑的合用效果要大于它們的個別效果的代數(shù)和?！伴L期”給藥指的是以連續(xù)的方式而非急性方式進行藥劑的給藥，以保持對于長期的時間階段維持其最初的治療效果(活性)?！伴g斷”給藥不是沒有間斷的連續(xù)的治療，而實際上是循環(huán)的治療。如用于此處的，“劑量單元”指的是適于作為用于將被治療的特定個體的單一劑量的物理分離單元。各單元可含有預定量的活性化合物，其經(jīng)計算與需要的藥學載體聯(lián)合以產(chǎn)生理想的治療效果。對于本發(fā)明劑量單元形式的說明可通過下述來描述(a)活性化合物的獨特特征與將實現(xiàn)的特定治療效果，及(b)在所述活性化合物的配藥法中固有的局限性。術語“成分”、“藥物”、“生物活性劑”、“藥理活性劑”、“活性劑”或“藥劑”在此處可互換使用，用來指有關的一種化合物或幾種化合物或組合物，當被給藥于生物體(人類或動物)時，其通過局部的和/或全身作用引起期望的藥理學的和/或生理學的效應。術語“調(diào)節(jié)”指的是增強或抑制生物活性或過程例如受體結(jié)合或信號活動的功能。這樣的增強或抑制可隨特定事件例如信號轉(zhuǎn)導途徑活化的發(fā)生而發(fā)生，和/或僅以特定的細胞類型出現(xiàn)。所述調(diào)節(jié)劑意在包含任何化合物，如抗體、小分子、肽、寡肽、多肽，或蛋白質(zhì)，優(yōu)選小分子，或肽。如用于此處的，“前藥”指的是被特別設計以最大化達到理想的反應位點的活性物的量，其自身對于理想的活性具有典型地無活性或最小活性的性質(zhì)，但通過生物轉(zhuǎn)化被轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚源x物。前藥的許多形式是本領域已知的，例如，如下述中所討論Bundgaard，(編)，DESIGNOFPRODRUGS(前藥的設計)，Elsevier，1985；Widder等人(編)，METHODSINENZYMOLOGY(酶學方法)，第4卷，AcademicPress，1985；Krogsgaard-Larsen等人(編)?！錎esignandApplicationofProdrugs(前藥的設計與應用)，″TEXTBOOKOFDRUGDESIGNANDDEVELOPMENT(藥物設計與開發(fā)的教科書)，第5章113-191，1991，Bundgaard等人，JournalofDrugDeliverReviews81-38，1992，Bundgaard，J.ofPharmaceuticalSciences77285，1988.；及Higuchi與Stella(編)PRODRUGSASNOVELDRUGDELIVERYSYSTEMS(作為新型藥物遞送系統(tǒng)的前藥)，AmericanChemicalSociety，1975。用于本發(fā)明的方法中的化合物能以前藥形式存在。如用于此處的，“前藥”意在包括任何共價結(jié)合的載體，當其被給藥于哺乳動物時，在體內(nèi)釋放活性母體藥物或其他被應用于本發(fā)明的方法中的制劑或化合物。由于已知前藥提高藥物的許多期望的性質(zhì)(如溶解度、生物利用度、生產(chǎn)等)，如果期望的話，應用于本方法的化合物可按前藥形式被遞送。因此，本發(fā)明意在設計遞送前藥的方法。用于本發(fā)明的化合物如鈷啉醇酰胺的前藥，可通過修飾存在于化合物中的官能團進行制備，以這樣的方式，所述修飾物或者按常規(guī)處理或者在體內(nèi)被裂解為母體化合物。因此，前藥包括，例如描述于此的化合物，其中羥基、氨基或羧基被鍵合至任何基團，當該前藥被給藥于哺乳動物受治療者時，分別裂解形成游離羥基、游離氨基或羧酸。例子包括但不限于醇的乙酸鹽、甲酸鹽和苯甲酸鹽衍生物及胺官能團；以及烷基、碳環(huán)、芳基，及烷基芳基酯，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、環(huán)丙基、苯基、芐基，及苯乙基酯等。2.概述A.一氧化氮(NO)的清除及鈷啉醇酰胺一氧化氮(NO)具有多種細胞功能，包括細胞生長、分化及凋亡的調(diào)節(jié)，以及許多生理作用包括血壓、血小板聚集及突觸可塑性的調(diào)節(jié)(Lloyd-Jones與Bloch，Annu.Rev.Med.47365-375，1996；Ignarro，L.與Murad，F(xiàn).(1995)Nitricoxide.Biochemistry，molecularbiologyandtherapeuticimplications，AcademicPress，SanDiego；Hlsher，TrendsNeurosci.20298-303，1997)。NO功能的研究已通過提高或降低NO水平的藥理劑進行輔助(Moncada等人，Pharmacol.Rev.43109-142，1991)。許多疾病狀態(tài)包括敗血癥和肝衰竭以產(chǎn)生異常高的NO為特征，因此除去過量的NO可具有有益效果(Shah等人，Gastroenterology126903-913，2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.6653-57，2004；Pfeilschifter等人，PflugersArch.442479-486，2001)。降低NO濃度的一個方法是減少NO合成。在哺乳動物中，存在四種NO合酶(NOS)亞型神經(jīng)元型NOS(nNOS或NOSI)、誘導型NOS(iNOS或NOSII)，內(nèi)皮型NOS(eNOS或NOSIII)，及一種近來描述的線粒體NOS(mtNOS)(Nedvetsky等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A9916510-16512，2002；Elfering等人，J.Biol.Chem.27738079-38086，2002)。nNOS與eNOS在許多組織中構(gòu)成性表達，并在對細胞內(nèi)鈣增加的反應中產(chǎn)生皮摩爾或納摩爾濃度的NO(Clancy與Abramson，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.21093-101，1995)。iNOS在多種細胞類型中表達，且其水平可通過內(nèi)毒素(脂多糖，LPS)和α-腫瘤壞死因子被成倍地誘導，伴隨iNOS生成濃度高于nNOS及eNOS幾乎1000倍——即納摩爾至微摩爾——的NO(Pfeilschifler等人，PflugersArch.442479-486，2001Poon等人，Circulation1081107-1112，2003；Morin等人，CritCareMed.261258-1264，1998；Nathan，F(xiàn)ASEBJ.63051-3064，1992)。人們對mtNOS了解較少，但它在鼠肝中占細胞NO產(chǎn)量的50％，且低微摩爾的NO濃度已在鼠心臟線粒體中發(fā)現(xiàn)(Elfering等人，J.Biol.Chem.27738079-38086，2002；Saavedra-Molina等人，AminoAcids2495-102，2003)。已產(chǎn)生許多NOS抑制劑，其中的大多數(shù)是精氨酸類似物，包括異硫脲衍生物，且因為精氨酸的多重生化作用，這些藥劑除NOS抑制外，還可具有其他作用(Garvey等人，J.Biol.Chem.26926669-26676，1994；ElMabrouk等人，LifeSci.671613-1623，2000；Hallemeesch等人，Clin.Nutr.21111-117，2002)。減少NO水平的另一方法是使用NO清除劑。例如，血紅蛋白的血紅素部分以強烈的親合力與NO結(jié)合，但和游離的細胞外血紅蛋白可以是高度毒性的，尤其是在整體動物中(Kim與Greenburg，Shock17423-426，2002)。因此，其他NO清除劑已被認為包括二硫代氨基甲酸鹽衍生物，其螯合鐵并因此結(jié)合NO，但這些也可具有有害作用(Menezes等人，Am.J.Physiol.277G144-G151，1999；Nadler等人，Am.J.Physiol.281G173-G181，2001)。鈷胺素(維生素B12)在結(jié)構(gòu)上類似于血紅素，且也結(jié)合NO，但具有比血紅素小得多的效能(Greenberg等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.273257-265，1995)。鈷胺素前體鈷啉醇酰胺缺少鈷胺素的二甲基苯并咪唑核甘酸末端(圖1)，對NO的親和力超過鈷胺素100多倍；此外，與鈷胺素僅結(jié)合一個NO分子相比，各個鈷啉醇酰胺分子可潛在地中和兩個NO分子(Sharma等人，Biochemistry428900-8908，2003)。如此處公開的，提出了證明鈷啉醇酰胺在果蠅模型與培養(yǎng)的哺乳動物細胞中被用作NO清除劑用途的研究。鈷啉醇酰胺在比在體內(nèi)中和所產(chǎn)生的NO所需要的高得多的濃度對細胞有毒，且該毒性是完全由鈷胺素逆轉(zhuǎn)的；鈷胺素不影響經(jīng)由鈷啉醇酰胺的NO清除，且因此這兩種類咕啉的聯(lián)合可為清除NO的一種非常有效的方法。B.氰化物中毒與鈷啉醇酰胺對于動物，氰化物具有KCN的LD50為2-8mg/kg范圍的有效力的毒素，且在人類中，僅僅50mg可為致命的(Salkowski與Penney，Vet.Hum.Toxicol.36455-466，1994)?？v觀歷史，其被用作殺人劑和自殺劑，且被用于第一次世界大戰(zhàn)的化學戰(zhàn)、第二次世界大戰(zhàn)中納粹進行的猶太人的大規(guī)模中毒(被稱為ZyklonB)中，且可能被用在20世紀80年代早期的伊朗伊拉克戰(zhàn)爭期間(Way，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.24451-481，1984；2004.FactSheet，CDC.Dept.HealthandHumanServices)。氰化物具有被用作大規(guī)模毀滅性武器的可能，尤其是在例如機場和火車站的封閉空間中(Greenfield等人，Am.J.Med.Sci.323326-340，2002；Rotenberg，Pediatr.Ann.32236-240，2003；Eckstein，JEMS29suppl-31，2004)。氰化物氣體在燃燒任何含碳和氮的材料期間被產(chǎn)生，所述材料包括棉花、塑料、絲及羊毛，且因此，其在住宅和工業(yè)火災中產(chǎn)生(Alcorta，JEMS29suppl-31，2004)。隨著出現(xiàn)在建筑中的更多基于合成的材料的使用，氰化物可為和一氧化碳一樣多的源自煙吸入的死亡的主要原因(Alcorta，JEMS29suppl-15，2004；Alarie，CritRev.Toxicol.32259-289，2002；Esposito與Alarie，J.FireSci.6195-242，1988；Silverman等人，J.Trauma28171-176，1988)。氰化物結(jié)合金屬蛋白酶，且其基本的細胞內(nèi)靶被認為是細胞色素氧化酶，從而解偶聯(lián)氧化磷酸化并消耗細胞的ATP。有幾種針對氰化物中毒的解毒劑，包括亞硝酸鈉、硫代硫酸鈉，及羥鈷胺素(維生素B12b)(Gracia與Shepherd，Pharmacotherapy241358-1365，2004；Cummings，Occup.Med.(Lond)5482-85，2004；Megarbane等人，J.ChinMed.Assoc.66193-203)。亞硝酸鈉通過產(chǎn)生甲基血紅蛋白(高鐵血紅蛋白)起作用，其對氰化物具有高親和力但不再與氧結(jié)合，且因此在煙吸入的受害者中，亞硝酸鈉可加重由一氧化碳誘導的攜氧能力的降低(Moore等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.24270-73，1987)。硫代硫酸鈉作為硫氰酸生成酶的硫供體而起作用，硫氰酸生成酶轉(zhuǎn)化氰化物為硫氰酸鹽-一種無毒的氰化物衍生物。羥鈷胺素通過以比較高的親和力(大約1012的KA)結(jié)合氰化物而起作用，且因為氰基鈷胺素的高度穩(wěn)定性，它是在維生素制品中鈷胺素的常見形式。在美國，亞硝酸鈉和硫代硫酸鈉被用作氰化物解毒劑，而在法國和其他一些歐洲國家，多用羥鈷胺素(Fortin等人，JEMS29suppl-21，2004)。鈷啉醇酰胺是在鈷胺素的生物合成中的次末級前體，其沒有鈷胺素的二甲基苯并咪唑(DBZ)核苷酸末端。DBZ基團在下部的中軸位置與鈷原子配位，且因此，而鈷胺素僅有一個上部的配體結(jié)合位點，鈷啉醇酰胺同時具有上部和下部的配體結(jié)合位點。此外，在鈷胺素中，DBZ基團對上部的結(jié)合位點具有負的反位效應，因此降低了鈷胺素對配體的結(jié)合親和力。凈效應是鈷啉醇酰胺比鈷胺素對氰化物離子具有大得多的親和力，有約1022的KA。如此處使用兩種不同的生物系統(tǒng)所公開的，鈷啉醇酰胺比鈷胺素更有效地進行氰化物解毒，且如前所示，鈷啉醇酰胺的臨床相應濃度對哺乳動物細胞是無毒的(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。因此，鈷啉醇酰胺可被用作氰化物中毒的解毒劑。3.疾病適應證A.一氧化氮疾病狀態(tài)本發(fā)明的方法涉及治療和預防受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)，包括對受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺或其生物活性衍生物或類似物的給藥。本發(fā)明的方法也涉及緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的癥狀，包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受治療者被診斷為遭受由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)發(fā)展的痛苦或處于由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)發(fā)展的危險。敗血癥性休克以藥物難治性低血壓為特征，且具有極高的死亡率。各種細胞因子和信號分子促成敗血癥的狀態(tài)，在嚴重低血壓的發(fā)展中，一氧化氮(NO)起了主要作用。NO由三種不同的NO合酶產(chǎn)生神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導型NOS(iNOS)和內(nèi)皮型NOS(eNOS)。iNOS的顯著的誘導是敗血癥中NO水平增加的主要原因。非選擇性的NOS抑制劑在敗血癥的動物模型中顯示了一些成功，但在大量III期臨床試驗中，這些藥劑中的一種導致死亡率增加。選擇性的iNOS抑制劑已在動物模型中顯示更有希望，但還未在人類中試驗。降低敗血癥中的NO水平的另一途徑是使用NO清除劑，且一些NO清除劑包括血紅蛋白和維生素B12(鈷胺素)已在敗血癥的動物模型中顯示有益。如此處公開的，鈷啉醇酰胺沒有鈷胺素的二甲基苯并咪唑(DBZ)核苷酸末端，在生理緩沖液和人血清中比鈷胺素結(jié)合NO更牢固約100倍。如此處公開的，在培養(yǎng)的哺乳動物細胞和完善構(gòu)建的果蠅模型中，鈷啉醇酰胺是一種有效的NO清除劑，且在敗血癥中，其在清除NO所需的濃度未顯示出毒性。除休克外，幾種其他的臨床狀態(tài)以過量NO的生成為特征。這包括肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷(Pfeilschifter等人，PflugersArch.442479-486，2001；Shah等人，Gastroenterology126903-913，2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.6653-57，2004)。在這些情況中的一些中，NO增加的機理是經(jīng)由伴隨增加的iNOS表達的全身炎癥反應(Shah等人，Gastroenterology126903-913，2004；Hochman，Circulation1072998-3002，2003)。因此，例如鈷啉醇酰胺的NO清除劑可用于這些病癥。因此，在某些方面，本發(fā)明的方法可用于治療和預防敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷。B.氰化物中毒本發(fā)明的方法涉及治療和預防受治療者由過量氰化物的存在(即氰化物中毒)而引起或加重的疾病狀態(tài)，包括對受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺或其生物活性衍生物或類似物的給藥。本發(fā)明的方法也涉及緩解受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的癥狀，包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受治療者被診斷為遭受由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)發(fā)展的痛苦或處于由過量NO的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)發(fā)展的危險。氰化物氣體在燃燒任何含碳和氮的材料期間被產(chǎn)生，且因此在燃燒紙、羊毛、絲及塑料期間產(chǎn)生(Alcorta，R.2004)。煙吸入氰化物氣體在燃燒任何含碳和氮的材料期間被產(chǎn)生，且因此在燃燒紙、羊毛、絲及塑料期間產(chǎn)生?；馂牡拇蟛糠质芎φ咚烙跓熚?，且煙霧中兩種最多的毒氣是氰化物和一氧化碳(Alcorta，JEMS29suppl-15，2004；Esposito與Alarie，J.FireSci.6195-242，1988；Alarie，CritRev.Toxicol.32259-289，2002；Silverman等人，J.Trauma28171-176，1988)?；馂牡拇蟛糠质芎φ咚烙跓熚?，且煙霧中兩種最多的毒氣是氰化物和一氧化碳(Alcorta，JEMS29suppl-15，2004；Esposito與Alarie，J.FireSci.6195-242，1988；Alarie，CritRev.Toxicol.32259-289，2002；Silverman等人，J.Trauma28171-176)。隨著出現(xiàn)在建筑中的更多基于合成的材料的使用，氰化物已在住宅和工業(yè)火災期間的死亡中承擔漸增的重要性。吸煙者氰化物從煙草煙霧中產(chǎn)生，且已知吸煙者的血清和尿具有高的硫氰酸根(SCN-)(氰化物的直接分解代謝產(chǎn)物)濃度(Michigami等人，Analyst113389-392，1988；Abou-Seif，J.Biochem.Toxicol.11133-138，1996)。確實，血清和尿的硫氰酸根水平已被用于臨床研究中區(qū)分吸煙者和非吸煙者，并進行估計吸煙者消耗的香煙量。硫氰酸根通過硫氰酸生成酶從氰化物產(chǎn)生，其在肝和呼吸道上皮中具有高濃度。硫氰酸根可被認為是擬鹵化物，且其對于過氧化物酶，特別是髓過氧化物酶、嗜酸性粒細胞過氧化物酶，及乳過氧化物酶是一種非常好的底物(Zhang等人，Blood991802-1810，2002；vanDalen與Kettle，Biochem.J.358233-239，2001；Scanlon等人，Atherosclerosis12123-33，1996；Exner等人，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.37146-155，2004)。在過氧化物酶反應中，H2O2被消耗，且在形成硫氰酸根、低硫氰酸根(OSCN-)的情況下，氧原子被轉(zhuǎn)移至受體。低硫氰酸根是一個比較弱的氧化劑，但除低硫氰酸根外，更有效力的氧化化合物是在硫氰酸根與H2O2的反應中生成的，特別是氰酸根(OCN-)、低硫氰酸(HOSCN)、氰基亞硫酸(HO2SCN)，及氰基硫酸(HO3SCN)。這些化合物各自可氧化血液中的低密度脂蛋白(LDLs)；被氧化的LDLs導致形成脂紋和動脈中的粥樣斑，并因此導致動脈粥樣硬化(Zhang等人，Blood991802-1810，2002；vanDalen與Kettle，Biochem.J.358233-239，2001；Scanlon等人，Atherosclerosis12123-33，1996；Exner等人，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.37146-155，2004)。有大量的流行病學數(shù)據(jù)提示在吸煙者中增加的動脈粥樣硬化疾病可能來自他們增加的硫氰酸根水平，且低硫氰酸根和其他被氧化的硫氰酸衍生物的產(chǎn)生可能是增加的動脈粥樣硬化形成的基礎。慢性腎功能衰竭在慢性腎功能衰竭的患者與血液透析的住院患者中，血清硫氰酸根水平也增加(Hasuike等人，Nephrol.Dial.Transplant.191474-1479，2004)。氰化物存在于一些食物中且還可通過生氰的細菌在腸中產(chǎn)生。推測在腎衰竭中增加的硫氰酸根水平的基礎是因為在自氰化物的正常生成率情況下降低的尿分泌。因為不明的原因，硫氰酸根看起來通過血液透析被不充分地除去。如同吸煙者，血液透析和腎衰竭患者在動脈粥樣硬化性心血管疾病中具有顯著的增加，且對此的基礎可能源自通過針對吸煙者進行描述的機理所增加的硫氰酸根水平。因此，通過降低硫氰酸根水平，鈷啉醇酰胺可用于煙吸入的治療，以及在吸煙者中降低動脈粥樣硬化的風險，還可用于腎衰竭患者。在某些方面，本發(fā)明的方法也可用于治療血液透析患者。在其他方面，本發(fā)明的方法可用于治療囊性纖維病，以及治療由大規(guī)模毀滅性武器產(chǎn)生的過量氰化物。4.藥物組合物的制劑與給藥用于本發(fā)明的方法的組合物可采用任何導致活性劑與患者體內(nèi)藥劑的一個作用部位或多個作用部位相接觸的方式進行給藥。所述化合物可作為單獨的治療劑或與幾種治療劑結(jié)合，采用與藥物制劑協(xié)同加以使用的任何常規(guī)方式進行給藥。例如它們可作為藥物組合物中唯一的活性劑進行給藥，或它們可與其他治療活性成分聯(lián)合使用。所述化合物優(yōu)選地在所選的給藥途徑和所述的標準藥物實踐基礎上與所選擇的藥物載體結(jié)合，例如在最新版的Remington′sPharmaceuticalScience，MackPublishingCompany，Easton，PA(″Remington′s″)中，其全部內(nèi)容通過引用并入本申請。本發(fā)明的化合物可按適合所選的給藥途徑(如口服的)的許多劑型給藥于哺乳動物宿主。其他可接受的給藥途徑是腸胃外的包括靜脈內(nèi)的；經(jīng)上皮的包括經(jīng)皮的、經(jīng)鼻的、眼的、舌下的及口腔的；局部的包括眼的、皮膚的、眼的、及直腸的；通過鼻吸入劑或氣霧劑的鼻吸入或肺吸入；以及直腸全身性系統(tǒng)的?；钚曰衔锟蛇M行口服給藥，如與惰性稀釋劑或與可同化的食用載體，其可被包在硬或軟殼膠囊中，其可被壓進片劑中，或其可直接與飲食的食物混合。對于口服治療給藥，活性化合物可與賦形劑混合且被用于可吸收的片劑、含片劑、錠劑、膠囊、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等。在這樣的治療上有用的組合物中的活性化合物的量為從約10毫克/天至約1000毫克/天的活性化合物。在本發(fā)明的一些方面，鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物、立體異構(gòu)體、前藥、藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑合物、酸式鹽水合物、N-氧化物或其同形的結(jié)晶形式以下述水平進行給藥在至少約10毫克/天的水平，更優(yōu)選地在至少約100毫克/天的水平，甚至更優(yōu)選地在至少約500毫克/天的水平，且還甚至更優(yōu)選地在至少約1000毫克/天的水平。在本發(fā)明的一些方面，鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物、立體異構(gòu)體、前藥、藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑合物、酸式鹽水合物、N-氧化物或其同形的結(jié)晶形式以下述水平進行給藥在少于約100毫克/天的水平，更優(yōu)選地在少于約500毫克/天的水平，甚至更優(yōu)選地在少于約1000毫克/天的水平，且還甚至更優(yōu)選地在少于約2000毫克/天的水平。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述鈷啉醇酰胺化合物可以從約1毫克/天至約1000毫克/天的劑量范圍(及此處劑量范圍和具體劑量的所有組合和亞組合)給藥于患者。在本發(fā)明的一些方面，鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物、立體異構(gòu)體、前藥、藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑合物、酸式鹽水合物、N-氧化物或其同形的結(jié)晶形式以下述時間進行給藥持續(xù)至少約1天，更優(yōu)選地持續(xù)至少約2天，甚至優(yōu)選地持續(xù)至少約3天，且還甚至更優(yōu)選地持續(xù)至少約5天，且進一步更優(yōu)選地持續(xù)至少約7天。片劑、錠劑、丸劑、膠囊等可也含有下述的一或多種粘合劑，如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸二鈣；崩解劑，如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷、冬青油或櫻桃油調(diào)味劑。當劑量單元形式是膠囊，除上述類型的材料外，其可含有液體載體。各種其他材料可作為包衣提供或修飾劑量單元的物理形式。例如片劑、丸劑或膠囊可被蟲膠、糖或兩者進行包衣。糖漿劑或酏劑可含有活性化合物，作為甜味劑的蔗糖，作為防腐劑的對羥苯甲酸甲酯與對羥苯甲酸丙酯，例如櫻桃或橙香料的染料和香料。當然，用于制備任何劑量單元形式的任何材料在所應用的量上優(yōu)選地是藥用純凈的且基本無毒的。此外，活性化合物可被引入緩釋制劑和配方。本發(fā)明的化合物，或其生物活性衍生物或類似物可以持續(xù)遞送或緩釋機制進行給藥，所述持續(xù)遞送或緩釋機制可在內(nèi)部遞送該制劑。本發(fā)明的制劑可包括，例如，可生物降解的微球或膠囊或能持續(xù)遞送肽的其他可生物降解的聚合物構(gòu)型。(例見Putney，Nat.Biotechnol.16153-157，1998)。活性化合物也可腸胃外進行給藥。作為游離堿或藥理學上可接受的鹽的活性化合物的溶液可在水中制備，適當?shù)嘏c表面活性劑如羥丙基纖維素進行混合。分散相也可在丙三醇、液態(tài)聚乙二醇及其混合物及在油脂中制備。在儲存和使用的一般條件下，這些制劑可含有防腐劑以預防微生物的生長。適于注射使用的藥物形式包括，例如，無菌水溶液或分散相及用于無菌可注射的溶液或分散相的臨時制劑的無菌粉末。在各種情況下，該形式優(yōu)選無菌及流體以提供便利的可注射性。該形式在生產(chǎn)和儲存條件下優(yōu)選穩(wěn)定的，且優(yōu)選地被保存以抗微生物(例如細菌和真菌)的污染作用。該載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)，其合適的混合物，及植物油。適當?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^下述而保持例如通過使用包衣，如卵磷脂，通過在分散相中保持所需粒徑，及通過使用表面活性劑。微生物作用的預防可通過各種抗菌劑及抗真菌劑實現(xiàn)，如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在許多情況中，將優(yōu)選地包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。延長可注射的組合物的吸收可通過使用延長吸收的藥劑實現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁及明膠。無菌可注射的溶液可通過下述方法制備在合適的溶劑中，引入需要量的活性化合物，根據(jù)需要添加上述列舉的各種其他成分，繼之以過濾滅菌。通常，分散相可通過在無菌載體中引入已滅菌的活性成分進行制備，所述無菌載體含有那些以上列舉的基本分散介質(zhì)及必需的其他成分。在用于無菌可注射的溶液制劑的無菌粉末的情況中，制劑的優(yōu)選的方法可包括真空干燥和冷凍干燥技術，其產(chǎn)生活性成分的粉末，加上來自其先前無菌過濾的溶液的任何其他理想成分。本發(fā)明的治療化合物可單獨或與藥學上可接受的載體摻入行給藥。如上文所述，活性成分與載體的相對比例可例如通過化合物的溶解度及化學性質(zhì)、所選的給藥途徑及規(guī)范的藥學實踐進行確定。全身給藥也可通過經(jīng)粘膜的或經(jīng)皮的方式。對于經(jīng)粘膜的或經(jīng)皮的給藥，適于將被透過的屏障的滲透劑可用于制劑中。這樣的滲透劑是本領域公知的，且包括，如對于經(jīng)粘膜給藥，膽汁鹽及夫西地酸衍生物。此外，去污劑可用于促進滲透。經(jīng)粘膜的給藥可通過鼻腔噴霧或使用栓劑進行。(例見Sayani，Crit.Rev.Ther.DrugCarrierSyst.1385-184，1996。)對于局部的、經(jīng)皮給藥，藥劑可被配制成軟膏劑、乳膏劑、軟膏、散劑及凝膠劑。經(jīng)皮遞藥系統(tǒng)還可包括，例如貼劑。對于吸入法，本發(fā)明的化合物可使用本領域已知的任何系統(tǒng)進行遞送，包括干粉氣霧劑、液體遞送系統(tǒng)、空氣噴射霧化器、噴射劑系統(tǒng)等。例見Patton，Biotechniques16141-143，1998；例如DuraPharmaceuticals(SanDiego，Calif.)，Aradigrn(Hayward，Calif.)，Aerogen(SantaClara，Calif.)，InhaleTherapeuticSystems(SanCarlos，Calif.)等的針對多肽大分子的產(chǎn)品和吸入遞送系統(tǒng)。例如所述藥物制劑可以氣霧劑或煙霧劑的形式進行給藥。對于氣霧劑給藥，所述制劑可連同表面活性劑及噴射劑按細分的形式被提供。在另一方面，遞送所述制劑至呼吸組織的裝置為吸入器，所述制劑在其中汽化。其他液體遞送系統(tǒng)包括，例如空氣噴射霧化器。在制備本發(fā)明的藥物制劑中，可使用和進行操作多種制劑修飾以改變藥代動力學和生物分布。許多改變藥代動力學和生物分布的方法是本領域的普通技術人員已知的。這樣的方法的例子包括在小囊中保護本發(fā)明的組合物，所述小囊由例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)(例如脂質(zhì)體，見下文)、碳水化合物，或合成的聚合物(上文討論的)組成。對于藥代動力學的全面討論，例見Remington′s。所述藥物組合物通常被配制成無菌、基本等滲的，且完全符合美國食品與藥品管理局的所有藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)的規(guī)定。5.治療方案與藥代動力學本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)給藥方法以多種劑量單元形式進行給藥。劑量是本領域技術人員熟知的。這樣的劑量通常實際上是一般指導的且根據(jù)特定的治療背景、患者耐受性等進行調(diào)節(jié)。足以實現(xiàn)此目的的本發(fā)明的化合物的用量被定義為“治療有效量”。對此用途的劑量日程表及有效量，即“給藥方案”，將取決于許多因素，包括疾病或病癥的發(fā)展階段、疾病或病癥的嚴重度、患者健康的一般狀態(tài)、患者的生理狀態(tài)、年齡、藥物配方及活性劑的濃度等。在考慮針對患者的給藥方案時，同樣要考慮給藥的方式。所述給藥方案也必須考慮藥代動力學，即該藥物組合物的吸收率、生物利用度、代謝、清除率等。例見最新的Remington′s；Egleton，Peptides181431-1439，1997；LangerScience2491527-1533，1990。在治療應用中，組合物被給藥于遭受由過量一氧化氮(NO)或過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的患者，以至少部分地阻止所述病癥或疾病和/或其并發(fā)癥。例如在一方面，可溶的藥物組合物用于靜脈內(nèi)(IV)給藥的劑量在幾小時(通常1、3，或6小時)期間，將為約10毫克/小時至約500毫克/小時，其可按間斷的周期被重復幾周?？墒褂孟喈敻叩膭┝?如高達約1000毫克/小時的范圍)進行給藥，特別是當所述藥物向隔離的部位進行給藥且不進入血流中時，例如進入體腔或進入器官的內(nèi)腔，如腦脊液(CSF)或關節(jié)腔或結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供的藥物組合物包括與藥學上可接受的載體共同配制的一種化合物或幾種化合物的組合，如鈷啉醇酰胺與鈷胺素。在預防性的應用中，藥物組合物或藥劑被給藥于對疾病或病癥敏感、或處于疾病或病癥的危險中的患者(如由過量一氧化氮引起的、敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷、氰化物中毒，由過量氰化物引起的，患者為吸煙者、血液透析、囊性纖維病、硝普鹽，或由大規(guī)模毀滅性武器產(chǎn)生的過量氰化物)，其使用量足以消除或減輕所述危險，減輕嚴重性，或延遲所述疾病的發(fā)作，包括所述疾病的生物化學、組織學和/或行為癥狀，其并發(fā)癥，及在所述疾病的發(fā)展期間呈現(xiàn)的過渡的病理學表現(xiàn)。在治療學的應用中，藥物組合物或藥劑被給藥于懷疑或已遭受這樣一種疾病的患者，其使用量足以治療、或至少部分地阻止所述疾病的癥狀(生物化學的、組織學的，和/或行為學的)，包括其并發(fā)癥及在所述疾病的發(fā)展中的過渡的病理學表現(xiàn)。足以實現(xiàn)治療的或預防性的療法的量被定義為治療或預防的有效劑量。在預防的及治療方案中，藥劑通常以若干劑量被給藥直至取得足夠的反應。一般地，監(jiān)測任何反應，并且如果所述反應開始減弱，那么給予定重復劑量。6.有效劑量將最適于預防或治療的本發(fā)明的化合物的劑量將根據(jù)給藥形式、選擇的特定化合物及經(jīng)受治療的特定患者的生理特征而不同。通常，最初可使用小劑量且，如果必要，通過小的增量直至增加至達到所述情形的預期效應。一般而言，口服給藥可需要更高的劑量。用于本發(fā)明的方法中的組合物，如包括鈷啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或類似物，和另外的活性成分(如鈷胺素)的藥物組合物可為如那些描述于此的多種任何劑量形式，并也可按在此描述的多種方法進行給藥。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的組合物被以單劑量形式(即被共同混合于一膠囊、片劑、粉末或液體等之中)進行共同配制。當組合物未以單劑量形式被共同配制，所述鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物及另外的活性成分(如鈷胺素)可在相同時間或同時(即一起)，或按任何順序給藥。當未按相同時間或同時給藥時，即當順序給藥時，優(yōu)選鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物及另外的活性成分的給藥發(fā)生在間隔少于約1小時，更優(yōu)選地少于約30分鐘間隔，甚至更優(yōu)選地少于約15分鐘間隔，且還更優(yōu)選地少于約5分鐘間隔。盡管如上所述的其他給藥途徑，被意在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的給藥為經(jīng)口的。盡管優(yōu)選地鈷啉醇酰胺、或其生物活性衍生物或類似物及另外的活性成分均被以相同的方式進行給藥(即例如都經(jīng)口地)，但如果需要，它們可各自以不同的方式被給藥(即例如組合物的一種成分可經(jīng)口地給藥，另一成分可由靜脈內(nèi)給藥)。本發(fā)明的組合物的劑量可根據(jù)多種因素而不同，例如特定藥劑的藥效學特征及其給藥模式與途徑、受治療者的年齡、健康狀況及重量、癥狀的性質(zhì)與程度、同時治療的種類、治療的頻率，及期望的效應。特別是當作為單劑量形式被提供時，組合的活性成分間存在化學相互作用的可能性。由于這個原因，本發(fā)明的組合物的優(yōu)選的劑量形式被配制成，這樣盡管活性成分被以單劑量形式化合，但活性成分間的物理接觸被最小化(即被降低)。為了使接觸最小化，產(chǎn)品被經(jīng)口給藥的本發(fā)明的一個實施方案，提供一種組合物，其中一種活性成分是被腸溶包衣的。通過腸溶包衣一或多種活性成分，可能不僅最小化了組合的活性成分間的接觸，而且，可能控制這些成分中的一種在胃腸道中的釋放，這樣這些成分中的一種不在胃中釋放，而在腸中釋放。需要口服給藥的本發(fā)明的另一實施方案，提供一種組合物，其中活性成分中的一種被緩釋材料包衣以在整個胃腸道起緩釋的作用，且也用于最小化組合的活性成分間的物理接觸。此外，所述緩釋成分可被另外腸溶包衣以使這種成分僅在腸中釋放。又一方法將包括組合物的制劑，其中一種成分被用緩釋的和/或腸溶釋放的聚合物包衣，且其他成分也用例如低粘度級別的羥丙基甲基纖維素(HPMC)或本領域已知的其他合適的材料進行包衣，以進一步分隔活性成分。該聚合物包衣用來形成與其他成分相互作用的一種附加屏障。其中一種活性成分被腸溶包衣的本發(fā)明的組合物的劑量形式，可為片劑形式，使得所述腸溶包衣成分與其他活性成分被混合在一起并接著壓成片劑，或使得所述腸溶包衣成分被壓成一片劑層，且另一活性成分被壓成另一層。任選地，為了進一步分隔所述兩層，可存在一或多種安慰劑層以使所述安慰劑層在所述活性成分層之間。另外，本發(fā)明的劑量形式可為膠囊形式，其中一種活性成分被壓成片劑，或為許多微片、微粒、顆粒或小丸母粒(non-pareils)的形式，其接著被腸溶包衣。這些腸溶包衣的微片、微粒、顆粒或小丸母粒被接著置于膠囊中或連同顆?；钠渌钚猿煞直粔褐聊z囊中。結(jié)合本發(fā)明的內(nèi)容，這些以及其他最小化本發(fā)明的組合物的成分之間接觸的方法，是否以單劑量形式給藥或以獨立的形式但通過相同的方式在相同的時間進行給藥，將對本領域技術人員而言是顯而易見的。7.給藥途徑用于治療受治療者由過量一氧化氮(NO)或過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的組合物可作為吸入劑經(jīng)由腸胃外的、局部的、靜脈內(nèi)的、經(jīng)口的、皮下的、動脈內(nèi)的、顱內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的，或肌內(nèi)的方式進行給藥。給藥也可為皮下的。其他途徑可為等效的。另一通常的給藥途徑為肌內(nèi)注射。這種類型的注射最典型地在臂、肩，或腿部肌肉中進行。在一些方法中，藥劑被直接注射進特定組織，例如顱內(nèi)注射或?qū)α髟鰪姷倪f送。肌內(nèi)注射或靜脈輸注也被考慮。在一些方法中，本發(fā)明的組合物被作為緩釋組合物或裝置例如MedipadTM裝置進行給藥。8.藥劑盒用于本發(fā)明的方法的藥劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。容器的滅菌可使用本領域技術人員熟知的常規(guī)滅菌方法進行。如期望的，材料的所述無菌容器的滅菌可包含分離的容器，或一或多部件的容器，如通過UNIVIALTM二部容器所示例的(從AbbottLabs，Chicago，Illinois可得)。所述鈷啉醇酰胺，或其生物活性衍生物或類似物，及任選的另外的活性成分可如上所述各自分開，或被組合進單劑量形式。如果需要，這樣的藥劑盒還可包括一或多種不同的常規(guī)藥劑盒組成部分，如將對本領域技術人員來說是顯而易見的，如例如一或多種藥學上可接受的載體、另外的用于混合所述成分的玻璃瓶等。作為嵌入物或作為標簽的說明書也可被包括在本藥劑盒中，其指明將被給藥的成分、給藥指導方針，和/或混合所述成分的指導方針。本發(fā)明的藥劑可任選地與在治療此處公開的疾病和疾患中至少部分有效的其他藥劑聯(lián)合給藥。本發(fā)明提供了藥物制品，如藥劑盒，其包括a)第一種藥劑，其為此處公開的本發(fā)明的一種化合物，為游離形式或藥學上可接受的鹽的形式，及b)至少一種助劑(coagent)。所述藥劑盒可包括針對其給藥的說明書。典型實施方案A.一氧化氮與鈷啉醇酰胺1.材料與方法鈷啉醇酰胺的生產(chǎn)與分析。在1ml濃鹽酸中溶解約200mg的羥鈷胺素(OH-Cbl，SigmaChemicalCo.)，并在65℃加熱8分鐘以水解結(jié)合二甲基苯并咪唑核苷酸部分至咕啉環(huán)的磷酸酯鍵[圖1，(Hayward等人，J.Chem.Soc.6485-6493，1965)]。該溶液在冰上冷卻并應用于1ml的C18的固相萃取柱上(FisherScientific)。通過分別在水和10％的丙酮中分批洗脫除去HCl和未處理的OH-Cbl，且二水鈷啉醇酰胺(鈷啉醇酰胺)產(chǎn)物在20％丙酮中洗脫并在SpeedVac(真空離心蒸發(fā)濃縮器)(SavantIndustries)中減壓濃縮。鈷啉醇酰胺的純度可通過與發(fā)表的光譜(數(shù)據(jù))(Sharma等人，Biochemistry428900-8908，2003，Baldwin等人，J.Chem.Soc.DaltonTrans.217-223，1983，F(xiàn)ord等人，J.Inorg.Biochem.41235-244，1991)進行比較的分光光度法，以及通過在100mMNaH2PO4(pH4.0)/15％甲醇(v/v)中(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41235-244，1991；Boss，J.Biol.Chem.2592936-2941，1984)使用C18反相柱等度洗脫的高效液相色譜法(HPLC)進行確定；柱流出液通過二極管陣列檢測器在多波長進行檢測。產(chǎn)率一般大于80％或每批生成約160mg的鈷啉醇酰胺。當在-20℃儲存時，該鈷啉醇酰胺在光譜上和生物學上至少穩(wěn)定一個月。果蠅中馬爾皮吉安氏小管分泌的評估。已設計出一種測量經(jīng)由果蠅的馬爾皮吉安氏小管的流體轉(zhuǎn)運的巧妙方法；小管分泌被NO供體和LPS顯著刺激，后者經(jīng)由果蠅NOS基因的誘導(Broderick等人，Am.J.Physiol.285C1207-C1218，2003；Dow與Davies，Physiol.Rev.83687-729，2003)。簡言之，從十只在冰上麻醉的野生型OregonR成年果蠅切除兩對馬爾皮吉安氏小管，各具有一個輸尿管。該小管被固定在液體石蠟中，一小管的遠端被浸在10μl微滴的Schneider′s昆蟲培養(yǎng)基中。在室溫通過每10分鐘測量在輸尿管的末端形成的液滴的大小來確定流體分泌率。持續(xù)三次10分鐘間隔進行測量基礎流體分泌率，然后向Schneider′s培養(yǎng)基的微滴加入10μMDeta-NO親核復合體(CaymanChemicalCo.)或1μMLPS(SigmaChemicalCo.)；在三次以上的10分鐘間隔后，將含有或不含10μMOH-Cbl的10μM鈷啉醇酰胺加至一些小管中，再持續(xù)30分鐘。各數(shù)據(jù)點代表在三次不相連的時機分析至少20對小管得到的平均值。在一些實驗中，在測量小管分泌率之前，果蠅靠添加250μM鈷啉醇酰胺的飼料生長48小時。所述添加的飼料通過加熱標準果蠅飼料糊至約40℃使其液化產(chǎn)生，且在加入鈷啉醇酰胺后，使該飼料冷至室溫。從果蠅中切除馬爾皮吉安氏小管，并如上所述，在缺失或存在1μMLPS情況下測量小管分泌率。哺乳動物細胞的鈷啉醇酰胺攝入的測量。為研究攝入哺乳動物細胞的鈷啉醇酰胺，通過加入2摩爾當量的[14C]-KCN(54mCi/mmol，MoravekBiochemicals)以形成[14C]-二氰基鈷啉醇酰胺([57Co]-鈷胺素不再市售可得)來對鈷啉醇酰胺進行放射標記。氰化物對鈷啉醇酰胺的結(jié)合親和力是極高的(K總-1022M-1)(Pratt，J.M.(1972)InorganicchemistryofvitaminB12(維生素B12的無機化學)，AcademicPress，London-NewYork)，但為了確保沒有[14C]-KCN殘留，pH值被降低至6以形成HCN(KCN的pKa為9.2)，并接著向溶液中通入氬氣以除去任何[14C]-KCN。[14C]-二氰基鈷啉醇酰胺產(chǎn)物的特定活性是104mCi/mmol(在348nm使用2.8×104的摩爾消光系數(shù))(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41235-244，1991)。在攝取研究中，在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改進的Eagle(DME)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的約1×106幼侖鼠腎(BHK)細胞在六孔板中生長至亞融合。在37℃，用濃度從100nM至100μM的[14C]-二氰基鈷啉醇酰胺溫育所述細胞5分鐘。在溫育結(jié)束時，用冰預冷的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)快速洗滌所述細胞4遍，用橡膠刮棒采集，并在10,000g離心15秒進行收集。在500μl的0.1N的NaOH中溶解所述細胞沉淀，并通過液體閃爍計數(shù)測量在樣品等分部分中的放射性。鈷啉醇酰胺攝取在溫育2至15分鐘間是線性的，并為0.5-2×106細胞；在零時樣品中得到的計數(shù)為在2分鐘樣品中得到的計數(shù)的＜10％。VASP磷酸化的評估。血管舒張劑刺激磷蛋白(VASP)在廣泛的多種細胞中表達(Reinhard等人，TrendsBiochem.Sci.26243-249，2001)；在對NO及其他血管舒張劑如cGMP的反應中其被磷酸化，由于磷酸化延遲了蛋白質(zhì)的凝膠遷移率，通過蛋白質(zhì)印跡法可方便地對磷酸化進行定量(Zhuang等人，J.Biol.Chem.27910379-10407，2004)。在12孔板中的約1×106大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞或CS-54血管平滑肌細胞被用50ng如前所述的VSV表位標記的VASP的表達載體轉(zhuǎn)染；C6細胞另外接受25ng依賴于cGMP的蛋白激酶(G-激酶)I″表達載體(Zhuang等人，J.Biol.Chem.27910379-10407，2004；Gudi等人，J.Biol.Chem.2714597-4600，1996)。所述細胞在添加10％FBS的DME培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，并在最后的30分鐘期間，用指示濃度的NO供體PAPA-NO親核復合體(CaymanChemicalCo.)處理，或在C6細胞情況下使用可透過膜的cGMP類似物8-pCPT-cGMP(BiologInc.)處理，或在CS-54細胞情況下使用鈣離子載體A23187(Calbiochem)進行處理；所述培養(yǎng)物中的一些在接受所述PAPA-NO親核復合體的同時接受鈷啉醇酰胺或人類血紅蛋白(Danishpajooh等人，J.Biol.Chem.27627296-27303，2001)]。所述細胞在含有1％十二烷基磺酸鈉的凝膠樣品緩沖液中被原位提取，且溶胞產(chǎn)物被進行聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡法。如前所述，使用小鼠抗VSV單克隆抗體(SigmaChemicalCo.)檢測VASP(Zhuang等人，J.Biol.Chem.27910379-10407，2004)。顯示的印跡被再現(xiàn)至少三遍。亞硝酸鹽與硝酸鹽的測量。NO具有非常短的半衰期，且在生理條件下被快速氧化成亞硝酸鹽和硝酸鹽。因此，最常用的評估NO產(chǎn)生的方法之一是測量亞硝酸鹽與硝酸鹽的濃度，其通常使用Griess試劑進行(Danishpajooh等人，J.Biol.Chem.27627296-27303，2001；Idriss等人，J.Biol.Chem.2749489-9493，1999)。在果蠅馬爾皮吉安氏小管分泌系統(tǒng)中和在C6與CS-54細胞中均測量亞硝酸鹽和硝酸鹽的濃度。在果蠅系統(tǒng)中，20例小管被溫育在100μl的Schneider’s培養(yǎng)基中，且在無或存在10μM鈷啉醇酰胺的情況下時，所述小管用10μMDeta-NO親核復合體或10μMLPS刺激60分鐘。在無或存在15μM鈷啉醇酰胺時，C6與CS-54細胞分別用15μMPAPA-NO親核復合體與300nMA23187溫育30分鐘。在所有情況中，在培養(yǎng)期結(jié)束時收集所述培養(yǎng)基，并使用來自ActiveMotif的NitricOxideQuantitationKit(一氧化氮定量試劑盒)進行測量，其為改進的基于Griess試劑的方法。因為Deta-NO親核復合體與PAPA-NO親核復合體將繼續(xù)釋放NO，甚至在小管和細胞的溫育結(jié)束后也是如此，所以在采集所述培養(yǎng)基后所有后續(xù)步驟立即在室溫進行。鈷啉醇酰胺細胞毒性的評估。鈷啉醇酰胺的不同濃度對BHK、CS-54，及C6細胞，以及人包皮成纖維細胞和人類臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的生長的影響通過使用ModelZMCoulterCounter(庫爾特粒度儀)(CoulterElectronics)，每天進行細胞計數(shù)，持續(xù)3天進行評估。除了HUVECs，所有細胞在含10％FBS的DME中生長，HUVECs在含內(nèi)皮細胞生長添加劑及20％的FBS的M199培養(yǎng)基中生長(Kim等人，J.Biol.Chem.27533920-33928，2000)。細胞以每孔1.5-3×105細胞的初始密度被置于六孔培養(yǎng)皿中。甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶的體外活性的測量。如前所述在含的100mMTrisHCl、5mM二硫蘇糖醇、1mMEDTA及一種蛋白酶抑制劑雞尾酒(cocktail)的緩沖液(pH值7.4)中以約50×106/ml的密度提取BHK細胞(Idriss等人，J.Biol.Chem.2749489-9493，1999)。在無或存在1-200μM鈷啉醇酰胺情況下測量提取物中甲硫氨酸合酶及甲基丙二酰輔酶A變位酶活性。根據(jù)Weissbach的方法(Weissbach等人，J.Biol.Chem.2383318-3324，1963)在37℃測量甲硫氨酸合酶的活性，除了從[14C]-甲硫氨酸產(chǎn)物中通過乙酸纖維素板上以丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶5)顯層的薄層色譜分離[14C]-甲基四氫葉酸酯底物；底物和產(chǎn)物的Rf值分別為0.26和0.44。對于甲基丙二酰輔酶A變位酶，提取物用5μM脫氧腺苷鈷胺素在37℃預培養(yǎng)10分鐘以轉(zhuǎn)化脫輔酶至全酶，繼之以提取緩沖液10倍稀釋。根據(jù)Kikuchi的方法(Kikuchi等人，Clin.Chim.Acta184307-313，1989)，在30℃測量酶活性，通過HPLC在C18反相柱上以含15％甲醇的pH值為4.0的100mM磷酸鈉洗脫，從琥珀酰輔酶A產(chǎn)物分離甲基丙二酰輔酶A底物；底物和產(chǎn)物的量通過與已知的標準物比較進行確定。兩分析都是線性的，時間為從5-15分鐘的，且蛋白質(zhì)濃度為從0.1-0.5mg/ml。甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶的體內(nèi)活性的評估。甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶的活性在完整的BHK細胞中分別通過下列的將[14C]-甲酸鹽摻入嘌呤核苷酸及[14C]-丙酸摻入蛋白質(zhì)進行評估；這兩種分析先前都已被用于酶的體內(nèi)活性的代替測量(Danishpajooh等人，J.Biol.Chem.27627296-27303，2001；Willard等人，Hum.Genet.32277-283，1976)。簡言之，約1×106的BHK細胞在六孔板中用10μCi[14C]-甲酸鹽溫育90分鐘或用20μCi[14C]-丙酸鹽溫育16小時；添加1-200μM的濃度的鈷啉醇酰胺，6小時后，添加甲酸鹽標記物(持續(xù)總計8小時的溫育時間)及同時添加丙酸鹽標記物。溫育結(jié)束時，使用0.4N高氯酸提取[14C]-甲酸鹽溫育的細胞，加熱至100℃持續(xù)70分鐘以轉(zhuǎn)化嘌呤核苷酸為堿基，并應用在Dowex50陽離子交換柱上以從未摻入的[14C]-甲酸鹽分離嘌呤堿基(Boss與Erbe，J.Biol.Chem.2574242-4247，1982)。使用冰預冷的10％三氯乙酸提取[14C]-丙酸鹽溫育的細胞，加熱至80℃持續(xù)30分鐘，溶解沉淀的核苷酸，并在再冷卻至4℃后，在玻璃微纖維濾器上收集沉淀的蛋白質(zhì)(Boss與Erbe，J.Biol.Chem.2574242-4247，1982)。兩分析隨時間和0.5-2×106的細胞數(shù)都是線性的。2.結(jié)果鈷啉醇酰胺的生產(chǎn)與分析。生產(chǎn)鈷啉醇酰胺的標準方法以二水鈷啉醇酰胺開始，通過酸處理和暴露于強光除去氰化物(Hayward等人，J.Chem.Soc.6485-6493，1965)。如先前所述的，鈷啉醇酰胺對氰化物具有非常高的結(jié)合親和力，并因此難于從鈷啉醇酰胺制品中完全除去氰化物。此外，經(jīng)過延長時間的暴露會有可能改變咕啉環(huán)。羥鈷胺素(OH-Cbl)被用作起始底物，因為目的是生成用于生物系統(tǒng)的無氰化物的鈷啉醇酰胺。二甲基苯并咪唑核苷酸末端被通過簡單的酸處理除去，且二水鈷啉醇酰胺通過在如描述于典型實施方案中的小樣品制備柱上分批洗脫進行純化。開始于約200mg的OH-Cbl，得到約150-170mg的高純度的鈷啉醇酰胺。圖2顯示了典型的鈷啉醇酰胺制品在pH值3的吸收光譜，具有348nm的主峰，且在494和520nm具有較小的相對相等的峰(Hayward等人，J.Chem.Soc.6485-6493，1965；Baldwin等人，J.Chem.Soc.DaltonTrans.217-223，1983)；在含有污染物的制品中，所述494和520nm的峰傾向于或者合并在一起成為一個寬峰或者所述520nm的峰變?yōu)橹饕?，且?55nm的一個寬譜帶變得明顯(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41235-244，1991)。所述制品的高純度的更多證據(jù)為在pH值12，A344/A356的吸光度比值為1.06，很好地處于先前報道的純二羥鈷啉醇酰胺的1.05-1.11的范圍中(Ford等人，J.Inorg.Biochem.41235-244，1991)，且當監(jiān)測在300和600nm之間的多波長時，鈷啉醇酰胺產(chǎn)品的HPLC分析得到一個單峰(Ford等人，J.Chromatogr.536185-191，1991)。鈷啉醇酰胺作為NO清除劑在果蠅流體分泌模型中的效能。已清楚的是果蠅對于人類疾病和藥物開發(fā)是極好的模型(Tickoo與Russell，Curr.Opin.Pharmacol.2555-560，2002；O′Kane，Semin.CellDev.Biol.143-10，2003)。果蠅的馬爾皮吉安氏小管為該昆蟲的流體轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)滲透的器官，相當于脊椎動物的腎。小管分泌率可從果蠅提取出小管后在體外測量；NO經(jīng)由可溶的鳥苷酸環(huán)化酶的激活來刺激分泌，從而增加細胞內(nèi)的cGMP濃度并激活cGMP/G-激酶轉(zhuǎn)導途徑(Broderick，Am.J.Physiol.285C1207-C1218，2003；Dow與Davies，Physiol.Rev.83687-729，2003)。研究了鈷啉醇酰胺對小管液分泌的影響，小管液分泌通過NO供體和LPS-果蠅NOS基因的一種誘導物刺激。此外，為模擬整個動物中的病癥，將鈷啉醇酰胺經(jīng)由果蠅飼料給藥于果蠅，接著測量LPS對小管液分泌率的影響。在用NO供體的實驗中，用10μMDeta-NO親核復合體處理小管，Deta-NO親核復合體引起流體分泌率的快速和持續(xù)增加(圖3，組A；在30分鐘基礎期后將Deta-NO親核復合體加入所有小管，如通過楔形標明的)。向Deta-NO親核復合體處理的小管加入10μM鈷啉醇酰胺明顯降低了流體分泌率，幾乎回復到基礎的未受激的水平(圖3，組A；在60分鐘將鈷啉醇酰胺加入一些小管，如通過箭頭及實心圈標明的)。單獨向所述小管加入鈷啉醇酰胺是沒有效果的。為增加經(jīng)由小管的內(nèi)源性NO產(chǎn)生，使用LPS且觀察到小管分泌的顯著的刺激(圖3，組B；在30分鐘加入LPS，如通過楔形標明的)。如在用Deta-NO親核復合體的實驗中，鈷啉醇酰胺快速降低小管分泌，使分泌率回復到接近基礎狀態(tài)(圖3，組B；在60分鐘將鈷啉醇酰胺加入一些小管，如通過箭頭及實心圈標明的)。因此，在果蠅整個器官系統(tǒng)中，鈷啉醇酰胺清除細胞外給藥的和細胞內(nèi)產(chǎn)生的NO。作為這些研究的一部分，測量通過在Schneider’s培養(yǎng)基中溫育小管60分鐘由Deta-NO親核復合體釋放的或LPS處理的小管所產(chǎn)生的NO的量，并測量培養(yǎng)基中亞硝酸鹽或硝酸鹽的總量。在沒有所述兩種藥物時，在所述培養(yǎng)基中不能檢測到亞硝酸鹽或硝酸鹽，提示了通過小管產(chǎn)生的NO的基礎水平是非常低的。用1、10或100μM的Deta-NO親核復合體處理小管增加了培養(yǎng)基中亞硝酸鹽和硝酸鹽的濃度至超過所述藥物起始濃度的水平，其可能由于Deta-NO親核復合體的每摩爾母體化合物釋放兩摩爾的NO(圖3C顯示了對于10μMDeta-NO親核復合體的數(shù)據(jù))。所述小管可能被暴露于略微較低的NO濃度，這是因為如前所述，在測量亞硝酸鹽和硝酸鹽期間Deta-NO親核復合體將繼續(xù)釋放NO。用10μM的LPS處理小管誘導NOS水平也增加了培養(yǎng)基的亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度，但所述水平低于用10μMDeta-NO親核復合體處理的小管中的水平(圖3C)。在Deta-NO親核復合體和LPS處理的小管中，鈷啉醇酰胺降低了約50％結(jié)合的亞硝酸鹽和硝酸鹽的量(圖3C)，其與我們的先前工作一致，先前工作顯示每個鈷啉醇酰胺分子可中和兩個NO分子，轉(zhuǎn)化一個為亞硝酸鹽并與第二個結(jié)合(Sharma等人，Biochemistry428900-8908，2003)；因此，能期待亞硝酸鹽和硝酸鹽的最大50％的降低。為確定是否全身進行鈷啉醇酰胺的給藥將影響小管流體分泌率，所述果蠅被用含250μM的鈷啉醇酰胺的飼料喂養(yǎng)兩天；在該濃度，鈷啉醇酰胺沒有明顯的對果蠅的有害作用。在鈷啉醇酰胺喂養(yǎng)的果蠅和用正常對照飼料喂養(yǎng)的果蠅之間比較LPS刺激的馬爾皮吉安氏小管的分泌率。與對照組果蠅相比，在鈷啉醇酰胺喂養(yǎng)的果蠅中小管分泌率降低了約50％(圖4)。此外，為提供鈷啉醇酰胺作為NO清除劑的效果的進一步證據(jù)，這些數(shù)據(jù)顯示鈷啉醇酰胺通過果蠅的腸被吸收并被轉(zhuǎn)運至馬爾皮吉安氏小管。哺乳動物細胞的鈷啉醇酰胺攝入。一些NO清除劑，例如血紅蛋白，是單獨在細胞外的且僅中和擴散出細胞的NO。果蠅的研究表明鈷啉醇酰胺可能被細胞吸收，但昆蟲和哺乳動物的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)會不相同。為確定哺乳動物細胞中是否鈷啉醇酰胺可以到達細胞內(nèi)的NO，制備了[14C]-二氰基鈷啉醇酰胺，并研究了其在BHK細胞中的攝取。在BHK細胞中，從100nM至100μM的覆蓋1000倍濃度范圍的二氰基鈷啉醇酰胺的放射性的累進曲線線性增加提示二氰基鈷啉醇酰胺的被動擴散和主動轉(zhuǎn)運正在發(fā)生。因為在細胞放射性中的累進的增加，所以不能計算KM。盡管可能鈷啉醇酰胺實際上不是被細胞吸收，而是僅與表面受體結(jié)合，但這好像不太可能，這是因為放射活性以超過二氰基鈷啉醇酰胺濃度的三個對數(shù)級(threelogscale)連續(xù)增加。因此，這些數(shù)據(jù)提示在哺乳動物體系中，鈷啉醇酰胺具有用作細胞內(nèi)的和細胞外的NO清除劑的可能。鈷啉醇酰胺在哺乳動物細胞中作為NO清除劑的效能。為確定鈷啉醇酰胺是否可在哺乳動物細胞中用作NO清除劑，在兩種不同類型的培養(yǎng)細胞中研究了NO刺激的VASP磷酸化。VASP是肌動蛋自動力學及細胞進程例如細胞粘附和活力的一種重要調(diào)節(jié)劑(Zhuang等人，J.Biol.Chem.27910379-10407，2004)。其功能經(jīng)由磷酸化進行調(diào)節(jié)，且通過cGMP/G-激酶轉(zhuǎn)導途徑的活化，NO為VASP磷酸化的主要誘導物。為研究鈷啉醇酰胺對NO誘導VASP的磷酸化的影響，選擇大鼠C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞與CS-54血管平滑肌細胞，兩者都具有活躍的NO/cGMP轉(zhuǎn)導途徑(Idriss等人，J.Biol.Chem.2749489-9493，1999；Chen等人，Mol.Cell.Biol.234066-4082，2003)。在C6細胞中研究了鈷啉醇酰胺對外源性產(chǎn)生的NO的效應，且在CS-54細胞中研究了鈷啉醇酰胺對內(nèi)源性生成的NO的效應。當C6細胞被用15至60μM的釋放NO的化合物PAPA-NO親核復合體處理30分鐘時，VASP磷酸化被誘導，正如通過具有降低的電泳遷移率的VASP形式的產(chǎn)生所證明的(圖5A，將無PAPA-NO親核復合體的泳道1與泳道3、5和7比較，分別顯示15、30和60μM的PAPA-NO親核復合體)。在所有PAPA-NO親核復合體濃度，向培養(yǎng)基加入100μM鈷啉醇酰胺，防止VASP磷酸化的增加(圖5A，將泳道3、5和7與泳道4、6和8相比，顯示用鈷啉醇酰胺和PAPA-NO親核復合體處理的細胞)。人類血紅蛋白(100μM)產(chǎn)生與鈷啉醇酰胺類似的結(jié)果，表明在實驗條件下，鈷啉醇酰胺和血紅蛋白是等效的NO清除劑。當以與PAPA-NO親核復合體等摩爾濃度使用時，鈷啉醇酰胺也阻止VASP磷酸化的增加(圖5，泳道B顯示各為30μM的PAPA-NO親核復合體和鈷啉醇酰胺，但類似的結(jié)果也在15和60μM的各藥劑中發(fā)現(xiàn))。如在下文進一步討論的，PAPA-NO親核復合體釋放2摩爾的NO，且因此如在果蠅馬爾皮吉安氏小管中，每個鈷啉醇酰胺分子看來似乎中和兩個NO分子。因為可能鈷啉醇酰胺可通過不同于NO清除的一些機理來抑制NO刺激的VASP磷酸化，研究了鈷啉醇酰胺對cGMP刺激的VASP磷酸化的影響。檢測了30μM濃度誘導VASP磷酸化的可透過膜的cGMP類似物8-pCPT-cGMP，且沒有發(fā)現(xiàn)從30至100μM濃度的鈷啉醇酰胺的效應(圖5，組C，將僅CPT-cGMP的泳道2與CPT-cGMP加鈷啉醇酰胺的泳道3比較)。因此，鈷啉醇酰胺不妨礙G-激酶的活化或VASP的磷酸化，且因此，其看來似乎經(jīng)由NO清除起作用。因為鈣活化I型和III型NOS，所以CS-54細胞用鈣離子載體A23187處理以增加內(nèi)源性NO的產(chǎn)生。A23187被發(fā)現(xiàn)增加VASP磷酸化(圖5D，比較泳道4與泳道1)，而鈷啉醇酰胺顯著地減弱這種效應(圖5D，比較泳道3與泳道4)。因此，在哺乳動物細胞中，鈷啉醇酰胺是一種有效的細胞內(nèi)和細胞外的NO清除劑。如在馬爾皮吉安氏小管的研究中，測量了亞硝酸鹽和硝酸鹽在C6和CS-54細胞培養(yǎng)基中的濃度。如上所述，PAPA-NO親核復合體，如同Deta-NO親核復合體，每摩爾母體分子釋放兩(摩爾)NO分子，且發(fā)現(xiàn)用15μM的PAPA-NO親核復合體處理C6細胞30分鐘，增加了亞硝酸鹽和硝酸鹽在培養(yǎng)基中的濃度至幾乎30μM(當與未處理的細胞比較時，圖5E)。因為PAPA-NO親核復合體的短半衰期——在37℃15分鐘——絕大部分的NO在溫育期間被釋放，且不在隨后的亞硝酸鹽和硝酸鹽測量期間釋放。用300nM的A23187處理CS-54細胞提高了亞硝酸鹽和硝酸鹽在培養(yǎng)基中的濃度至約12μM(圖5E)。當15μM鈷啉醇酰胺被加至PAPA-NO親核復合體處理的C6細胞或A23187處理的CS-54細胞時，亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度顯著增加，CS-54細胞中具有比C6細胞中更大的效應(圖5E)。因此，兩種細胞類型中的鈷啉醇酰胺誘導的VASP磷酸化降低通過亞硝酸鹽和硝酸鹽的降低表現(xiàn)，這提供了鈷啉醇酰胺在降低VASP磷酸化中作為NO清除劑作用的進一步的證據(jù)。鈷啉醇酰胺細胞毒性的研究。作為鈷胺素類似物，鈷啉醇酰胺通過干擾鈷胺素代謝或功能，可具有細胞毒性。此外，作為一種NO清除劑，鈷啉醇酰胺可干擾一些細胞類型中NO的前增殖(pro-proliferative)和抗凋亡作用(Morbidelli等人，Am.J.Physiol.270H411-415，1996；Ha等人，F(xiàn)ASEBJ.171036-1047，2003)。為研究鈷啉醇酰胺在哺乳動物細胞中的潛在毒性，進行了幾組實驗。鈷啉醇酰胺對BHK、C6，及CS-54細胞，以及兩種原發(fā)的人類細胞系，即包皮成纖維細胞和HUVECs的生長的影響；包括后面的細胞以確定是否鈷啉醇酰胺對原發(fā)的細胞比被評估的已建立的細胞系有選擇毒性。在1和50μM之間的濃度，鈷啉醇酰胺對細胞生長沒有影響，但在50μM的濃度，雖然用50μM的最小量，鈷啉醇酰胺抑制全部五種細胞類型的生長(圖6，顯示了在BHK細胞，及C6和CS-54細胞(插入)中，濃度為50、100及200μM的鈷啉醇酰胺的數(shù)據(jù)；在兩組原發(fā)的細胞系中發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果)。在所有5種細胞類型的全部三個鈷啉醇酰胺濃度用等摩爾濃度鈷胺素完全逆轉(zhuǎn)了生長抑制(圖6；顯示了在BHK細胞中200μM鈷啉醇酰胺/鈷胺素的數(shù)據(jù)(主要數(shù)據(jù))。這些后面的數(shù)據(jù)提示了毒性機理是通過鈷胺素代謝或功能的競爭干擾，而不是通過NO清除。因此，鈷啉醇酰胺僅在比較高的濃度對細胞是有毒的，且其毒性可被鈷胺素完全逆轉(zhuǎn)。下組實驗涉及確定鈷啉醇酰胺是否抑制兩種在哺乳動物細胞中的維生素B12依賴的酶——甲硫氨酸合酶或甲基丙二酰輔酶A變位酶的活性。在高達200μM的濃度，如在BHK細胞提取物中測量的，沒有發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺對任一種酶活性的影響。甲硫氨酸合酶被假定為以全酶形式(Oltean與Banerjee，J.Biol.Chem.27820778-20784，2003)，且如典型實施方案中描述的，甲基丙二酰輔酶A變位酶脫輔酶通過用5μM的脫氧腺苷鈷胺素溫育，之后用10倍稀釋提取物溫育，被轉(zhuǎn)化為全酶。因此，在被試驗的鈷啉醇酰胺的最高濃度，所述鈷啉醇酰胺的濃度為脫氧腺苷鈷胺素濃度的400倍。鈷啉醇酰胺對任一種酶沒有抑制與其他人所報道的關于不同鈷胺素類似物包括鈷啉醇酰胺的研究相符合(Kolhouse等人，J.Biol.Chem.26623010-23015，1991；Stabler等人，J.Clin.Invest.871422-1430，1991)。在最后一組實驗中，評估了在[14C]-甲酸鹽摻入嘌呤核苷酸及[14C]-丙酸摻入蛋白質(zhì)后鈷啉醇酰胺對甲硫氨酸合酶和甲基丙二酰輔酶A變位酶的體內(nèi)活性的影響；前者的測定是通過葉酸鹽途徑的碳流量的測量并依賴甲硫氨酸合酶活性，而后者的測定依賴甲基丙二酰輔酶A變位酶活性。在兩種測定中，100μM鈷啉醇酰胺降低了約50％的放射性標記的摻入(圖7；實心柱是對于[14C]-甲酸鹽摻入的數(shù)據(jù)，且空心柱是對于[14C]-丙酸摻入的數(shù)據(jù))。酶活性的抑制是時間依賴的，且在甲硫氨酸合酶的情況中，在90分鐘的鈷啉醇酰胺暴露后觀察到最小抑制，可測量最短的時間點；抑制隨時間累進地增加，且圖7中的數(shù)據(jù)是針對總共8小時的鈷啉醇酰胺暴露。對于甲基丙二酰輔酶A變位酶，觀察到了酶抑制的類似的時間依從性，但經(jīng)過更長的時間標度。如在生長研究中的，鈷啉醇酰胺的毒性效應被通過等摩爾濃度的鈷胺素完全阻止(圖7)。這些后面的數(shù)據(jù)顯示鈷啉醇酰胺毒性的機理可能是通過干擾鈷胺素代謝的某些方面(如還在討論中考慮的)。此外，因為甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶是僅有的兩種哺乳動物依賴鈷胺素的酶，鈷胺素逆轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)顯示[14C]-甲酸鹽和[14C]-丙酸摻入法準確地反映了這兩種酶的體內(nèi)活性。鈷啉醇酰胺在存在鈷胺素時作為NO清除劑的效能。盡管可能以無毒的濃度使用鈷啉醇酰胺，然而了解是否當清除NO時可共同使用鈷啉醇酰胺和鈷胺素是有用的。鈷胺素本身是一種弱NO清除劑(Greenberg等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.273257-265，1995)，且預期不會干擾鈷啉醇酰胺的NO清除。OH-Cbl對鈷啉醇酰胺的NO清除沒有影響，對果蠅馬爾皮吉安氏小管中的小管液分泌(圖3，組A和B，比較單獨鈷啉醇酰胺的實心圈與鈷啉醇酰胺加鈷胺素的實心三角)或?qū)Σ溉閯游锛毎械腣ASP磷酸化(圖5，組B，比較僅鈷啉醇酰胺的泳道4與鈷啉醇酰胺加鈷胺素的泳道5)均無影響。鈷啉醇酰胺加鈷胺素的組合，類似于僅用鈷啉醇酰胺，對通過8-pCPT-cGMP誘導的VASP磷酸化沒有影響(圖5，組C，比較泳道3和4)。3.討論從1978年NO最初被描述為內(nèi)皮源性舒張因子，已清楚的是NO具有許多生理作用(Lloyd-Jones與Bloch，Annu.Rev.Med.47365-375，1996；Ignarro與Murad，(1995)Nitricoxide.Biochemistry，molecularbiologyandtherapeuticimplications，AcademicPress，SanDiego；Hlsher，TrendsNeurosci.20298-303，1997)。還已清楚的是NO促成包括敗血癥性休克和出血性休克、肝性腦病、肝腎綜合征、血液透析相關的低血壓及缺血-再灌注損傷的一些疾病狀態(tài)的病理生理學(Shah等人，Gastroenterology126903-913，2004；Komeno等人，J.Vet.Med.Sci.6653-57，2004；Pfeilschifter等人，PflugersArch.442479-486，2001)。在這些疾病的大部分中，異常高的NO產(chǎn)生誘導嚴重的血管舒張和血管加壓藥難治性低血壓。iNOS的顯著增加成為敗血癥中NO產(chǎn)生提高的基礎(Moncada與Higgs，NewEng.J.Med.3292002-2012，1993)，且非選擇性NOS抑制劑增加了敗血癥的動物模型的血壓，但已具有對動物和人類中的敗血癥相關的死亡率的混合的影響(Kim與Greenburg，Shock17423-426，2002；Vincent等人，Am.J.Respir.Crit.CareMed.1611781-1785，2000)；這可部分地涉及導致微血管的血管收縮及組織和器官灌注減少的eNOS抑制(Spain等人，J.Trauma36720-725，1994；Wright等人，Cardiovasc.Res.2648-57，1992；Shultz與Raij，J.Clin.Inves901718-1725，1992；Harbrecht等人，J.Leukoc.Biol.52390-394，1992；Tribl等人，Am.J.Physiol286H340-H345，2004)。選擇性iNOS抑制劑應避免非選擇性抑制劑遇到的一些問題，但在一些組織中iNOS表達可為功能上重要的，如已對于肌細胞iNOS發(fā)現(xiàn)的(Poon等人，Circulation1081107-1112，2003；Ichinose等人，Am.J.Physiol.285H2524-H2530，2003；Szabo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A9112472-12476，1994；Liaudet等人，J.Infect.Dis.177127-132，1998；Price等人，Eur.J.Pharmacol.472111-118，2003)。因此，甚至選擇性的iNOS抑制劑也可導致細胞和器官中的機能障礙變化，且一些小組的工作人員已力勸在敗血癥中小心使用任何類型的NOS抑制劑(Vincent等人，Am.J.Respir.Crit.CareMed.1611781-1785，2000，Hotchkiss等人，Lancet339434-435，1992；Cobb，Crit.CareMed.27855-856，1999)。因此，明確需要可降低NO水平而不具有NOS抑制劑伴隨的毒性的藥劑。NO清除劑具有下述理論上的優(yōu)勢即僅中和部分與所述藥劑接觸的合成前NO，而不直接地干擾NOS功能(Kim與Greenburg，Shock17423-426，2002；Heneka等人，J.Clin.Invest9947-54)。已鑒定了一些NO清除劑，但不是所有都被細胞吸收，且有些，特別是游離血紅蛋白，顯示出不能接受的毒性(Braun等人，J.Exp.Med.131443-460，1970)。因此，看來似乎將需要非毒性的NO清除劑，其在臨床上及實驗室中均可被使用。在果蠅小管分泌模型及兩種類型的培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺是一種有效的NO清除劑。在兩種系統(tǒng)中，每個鈷啉醇酰胺分子看來似乎中和超過一個的NO分子，其符合我們先前的體外工作(Sharma等人，Biochemistry428900-8908，2003)。而所述先前的工作是在含水緩沖液中進行的，當前工作是在含血清的培養(yǎng)基中進行，并發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺牢固地結(jié)合牛和人類的血清清蛋白。因此，鈷啉醇酰胺對血清清蛋白的結(jié)合看來似乎不妨礙其清除NO的能力。在鈷胺素的細菌生物合成期間，二甲基苯并咪唑核苷酸末端被最后加入，且因此在鈷胺素生物合成中，鈷啉醇酰胺為次末級前體。因為其在鈷胺素合成中的位置，鈷啉醇酰胺已顯示污染細菌維生素B12制品，并在動物組織和人類血清中存在(Kondo等人，J.Clin.Invest70889-898，1982；Kondo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A77817-821，1980；Kolhouse等人，N.Engl.J.Med.299785-792，1978)。在人類的類咕啉肝腸循環(huán)研究中，發(fā)現(xiàn)鈷胺素類似物，其主要是鈷啉醇酰胺，構(gòu)成總的膽汁類咕啉的45％(ElKholty等人，Gastroenterology1011399-1408，1991)。在向家兔進行腸胃外給藥后，鈷啉醇酰胺和鈷胺素的藥代動力學的詳細研究顯示通過肝臟保留的鈷啉醇酰胺比鈷胺素多，但這兩種類咕啉的尿和糞排泄是相似的(Kolhouse與Allen，J.Clin.Invest601381-1392，1977)。鈷啉醇酰胺與血液中的主要的鈷胺素結(jié)合蛋白——鈷胺素傳遞蛋白II弱結(jié)合，但其與先前提到作為R粘合劑的另一重要的鈷胺素結(jié)合蛋白——結(jié)合咕啉牢固結(jié)合(Fedosov等人，Biochemistry3416082-16087，1995；Kanazawa等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.183333-338，1986；Fedosov等人，J.Biol.Chem.2779989-9996，2002)。因此，在血清和組織中鈷啉醇酰胺的存在，及其藥代動力學類型，可能可歸因于其對于結(jié)合咕啉以及還可能清蛋白的高度的結(jié)合親和力。先前的研究已發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺對哺乳動物細胞具有很小的毒性或無毒性，但這些研究是在藥物的低的微摩爾或亞微摩爾的濃度進行的(Stabler等人，J.Clin.Invest.871422-1430，1991；Kondo等人，Int.J.Hematol.56167-177，1992；Weinberg等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.246393-397，1998)。類似地，未發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺在低的微摩爾濃度對哺乳動物細胞的毒性，但在約50μM的濃度開始觀察到毒性。因為每個鈷啉醇酰胺分子可潛在地中和兩個NO分子(Sharma等人，Biochemistry428900-8908，2003)，因此鈷啉醇酰胺在顯示出明顯的毒性前可能能夠中和上至100μM的NO濃度。除了在NO的藥理學給藥期間，而在生理條件下，任何時候NO的濃度都不可能超過10μM(Pfeilschifter等人，PflugersArch.442479-486，2001；Clancy與Abramson，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.21093-101，1995；Poon等人，Circulation1081107-1112，2003)。此外，鈷胺素被發(fā)現(xiàn)完全阻止鈷啉醇酰胺毒性，且在果蠅馬爾皮吉安氏小管分泌模型中或在哺乳動物細胞中，鈷胺素不通過鈷啉醇酰胺干擾NO清除，如前所述，鈷胺素本身是一種NO清除劑(Greenberg等人.，J.Pharmacol.Exp.Ther.273257-265，1995)。在鈷啉醇酰胺開始顯示毒性的比較高的濃度，其看來似乎干擾鈷胺素代謝或功能。這個結(jié)論是基于下述發(fā)現(xiàn)即鈷啉醇酰胺對哺乳動物依賴鈷胺素的兩種酶——甲硫氨酸合酶與甲基丙二酰輔酶A變位酶的體外活性沒有影響，而其在所述酶的體內(nèi)分析中以時間依賴與鈷胺素可逆轉(zhuǎn)的方式進行抑制。在體外分析中，所述酶為含鈷胺素的全酶形式，表明鈷啉醇酰胺不能與結(jié)合的輔因子競爭。其他工作人員也發(fā)現(xiàn)在體外鈷胺素類似物對甲硫氨酸合酶全酶形式?jīng)]有抑制，且事實上，鈷啉醇酰胺可恢復甲硫氨酸合酶全酶至完全活性，但不知道這是否在體內(nèi)發(fā)生(Kolhouse等人，J.Biol.Chem.26623010-23015，1991)。鈷胺素類似物對甲基丙二酰輔酶A變位酶的活性影響似乎未被研究，但5’-輔酶鈷啉醇酰胺在恢復至甲基丙二酰輔酶A變位酶的全酶功能中是無活性的(Chowdhury與Banerjee，Biochemistry3815287-15294，1999)。在體內(nèi)分析中，酶活性的時間依賴的抑制發(fā)生在幾小時期間，提示新合成的酶是被抑制的；甲硫氨酸合酶的半衰期為約12小時且甲基丙二酰輔酶A變位酶的半衰期看來似乎為約30小時(Oltean與Banerjee，J.Biol.Chem.27820778-20784，2003；Riedel等人，Biochem.J.341133-138，1999)。因此，鈷啉醇酰胺可干擾甲基鈷胺素或脫氧腺苷鈷胺素分別摻入新合成的甲硫氨酸合酶及甲基丙二酰輔酶A變位酶，或也許更可能，干擾羥鈷胺素的細胞轉(zhuǎn)運或其轉(zhuǎn)化為兩種輔酶形式。關于鈷胺素類似物的毒性機理的類似的結(jié)論被先前得出(Kolhouse等人.，J.Biol.Chem.26623010-23015，1991)。不論鈷啉醇酰胺細胞毒性的明確機理是什么，其可通過鈷胺素的同時給藥被完全阻止。因為其對氰化物的高結(jié)合親和力，鈷啉醇酰胺也可預期成為極好的氰化物清除劑，且可用于氰化物中毒的臨床狀態(tài)中，如煙吸入及硝普鹽中毒。鈷胺素對氰化物的結(jié)合親和力比鈷啉醇酰胺小幾個數(shù)量級，且已顯示在氰化物中毒中有效，并在法國被用于這一目的(Forsyth，J.Toxicol.Clin.Toxicol.31277-294，1993；Hall與Rumack，J.Emerg.Med.5115-121，1987；Zerbe與Wagner，Crit.CareMed.21465-467，1993)。在果蠅馬爾皮吉安氏小管及培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，鈷啉醇酰胺可為一種有效的NO清除劑，并被用于動物研究中。其還可在過量NO的臨床狀態(tài)中及在氰化物中毒中有益，并可在多種治療方案中與鈷胺素組合。B.氰化物毒性與鈷啉醇酰胺1.材料與方法鈷啉醇酰胺的生產(chǎn)。如上所述，通過酸水解鈷胺素(Sigma)生成鈷啉醇酰胺(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)；在典型的實施方案各處及此處公開的，“鈷啉醇酰胺”及“鈷胺素”指的是它們的羥基衍生物。鈷啉醇酰胺的純度通過分光光度計測量進行評估，且通過在反相柱上的高效液相色譜，經(jīng)由洗脫液的洗脫，通過在348nm的紫外吸收監(jiān)測為一單峰(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。在10mMNaOH中溶解氰化鉀(FisherScientific)，且如圖9C中所示的實驗，在使用前稀釋進pH9.5、10mM的Na2CO3中。如上所述，室溫使用來自布盧明頓品系中心(BloomingtonStockCenter)的野生型OregonR果蠅(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。如前所述，從美國模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanTypeCultureCollection)(CCL16)得到的中國倉鼠肺成纖維細胞(中國倉鼠細胞)在37℃培養(yǎng)(Yadava等人，J.Biol.Chem.27721221-21230，2002)。斜角的33號計量注射針和2.5μl注射器來自哈密爾頓公司(HamiltonCompany)。中國倉鼠細胞的呼吸活性的測量。如前所述，中國倉鼠細胞線粒體的呼吸活性通過測量氧消耗進行評估(Yadava等人，J.Biol.Chem.27721221-21230，2002)。簡言之，細胞通過胰蛋白酶消化進行采集，再懸浮于pH7.1的20mMHepes-250mM蔗糖-10mMMgCl2中，并用100mg/ml洋地黃皂甙透化處理。相當于～0.5mg的蛋白質(zhì)的透化處理的細胞的量被轉(zhuǎn)至控溫在37℃的代謝腔；該腔被Hepes-蔗糖-MgCl2緩沖液完全充滿，且小心確保沒有氣泡存在。細胞的氧消耗用Clark氧電極在基礎條件下進行極譜描記測量，在用5mM琥珀酸鈉和3-磷酸甘油進行刺激，且在加入250μMKCN后，繼之以等摩爾量的鈷啉醇酰胺和鈷胺素氰化物處理的中國倉鼠細胞的生長的測量。如前所述，細胞在添加25mM半乳糖和10％胎牛血清的無葡萄糖的Dulbecco改進的Eagle(DME)培養(yǎng)基中生長(Soderberg等人，Somat.CellGenet.5225-240，1979)。在培養(yǎng)基中平衡24小時后，加入100μMKCN(稱為零時間)；在8和24小時再加入KCN，且在48小時使用ModelZMCoulterCounter(庫爾特粒度儀)計數(shù)。對于一些培養(yǎng)物，在零時間加入10μM鈷啉醇酰胺和鈷胺素。鈷啉醇酰胺與鈷胺素向果蠅的遞送。鈷啉醇酰胺與鈷胺素的攝取。如前所述，果蠅在含100μM鈷啉醇酰胺或100μM鈷胺素的飼料上生長(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。簡言之，通過加熱至40℃使標準果蠅飼料糊液化，且在加入鈷啉醇酰胺或鈷胺素達最終濃度為100μM后，冷卻所述飼料至室溫。在實驗中，在使用前，果蠅從第一幼蟲期在添加鈷啉醇酰胺或添加鈷胺素的培養(yǎng)基上生長。未從任一藥劑觀察到毒性，甚至當果蠅在添加的飼料上生長超過10代時。鈷啉醇酰胺與鈷胺素的注射。使用33號計量注射針和2.5μl注射器，向在冰上麻醉的果蠅的胸腔中注射1μl的水，或溶解在水中的1μl的500μM的鈷啉醇酰胺或鈷胺素。允許它們蘇醒10分鐘，并接著如下所述使它們暴露于HCN。在一些實驗中，它們首先暴露于HCN，并接著在暴露于HCN的1分鐘內(nèi)進行注射。鈷啉醇酰胺與鈷胺素的吸入。將市售可得的噴霧器(EasyMist，PrestigeMedical)的接嘴與1×3cm(w×1)的塑料管構(gòu)成的腔室連接；在腔室的近端用帶有藥棉的紗布降低空氣流率并使擾動最小化。果蠅被轉(zhuǎn)至所述腔室中，并在10分鐘的平衡期后，含有100μM的鈷啉醇酰胺或100μM的鈷胺素的噴霧器被啟動。在2分鐘噴霧之后，允許果蠅蘇醒2分鐘，并接著將其轉(zhuǎn)移至新的管形瓶中。果蠅暴露于HCN及KCN。暴露于HCN。將果蠅轉(zhuǎn)移至10ml塑料管形瓶中，且在10分鐘的平衡期后，在管形瓶中通過在0.5×0.5平方厘米的華特門(Whatman)#1濾紙上加樣1ml的1mM或10mMKCN溶液，生成HCN，果蠅被立刻置于管形瓶中。輕輕振搖該管形瓶20秒以迫使所述昆蟲飛行并打開它們的呼吸氣孔，且在完全的HCN暴露1分鐘后，除去該正方形紙。HCN引起所有的果蠅，包括那些先前用鈷啉醇酰胺或鈷胺素處理過的，跌落到管形瓶的底部，失去知覺。監(jiān)測果蠅的活動，且那些在1小時之內(nèi)能走或飛的被認為蘇醒了。對照實驗顯示點在華特門紙上的水，對果蠅沒有影響，且用10mMNaOH預先處理紙完全防止了任何隨后的KCN毒性，表明紙被充分酸化而產(chǎn)生HCN。與后者的點相一致，在對照實驗中顯示，通過在底部有4MNaOH的管形瓶中放置濾紙持續(xù)1小時，點在該紙上(該濾紙被懸吊在管形瓶中且不接觸NaOH)的KCN，可在數(shù)量上恢復。因為不是所有的KCN必需如HCN在所述果蠅的1分鐘暴露期間被釋放，且因為一些生成的HCN氣體可在室溫冷凝成液體，HCN氣體的所述濃度代表果蠅被暴露的最大濃度。用KCN注射。對于注射鈷啉醇酰胺或鈷胺素，如前所述，麻醉的果蠅被注射1μlpH9.5的10mMNa2CO3，或溶解在所述Na2CO3溶液中的1μl100μMKCN。HCN的測量。通過在管形瓶底部0.2ml的100mMNaOH中收集HCN，測量管形瓶中生成的氰化物氣體，當心不要讓含有KCN的紙接觸NaOH。通過在500μl100mM的NaOH中提取果蠅來測量果蠅中的氰化物。在兩種情況中，如最初由Guilbault與Kramer所述，并由Gewitz等人修改的對得到的NaCN進行測量，即用對硝基苯甲醛和鄰二硝基苯溫育NaCN，且在578nm測量有色產(chǎn)物(Guilbault與Kramer，Anal.Chem.28834-836，1966；Gewitz等人，Planta(Berl.)131145-148，1976)。該分析在1和15μMNaCN之間是線性的。KCN對果蠅中的馬爾皮吉安氏小管分泌的影響。果蠅的馬爾皮吉安氏小管是該昆蟲的流體轉(zhuǎn)運和調(diào)節(jié)滲透的器官，相當于脊椎動物的腎。如前所述，測量小管分泌率(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。簡言之，從已在標準飼料或含100μM鈷啉醇酰胺或鈷胺素的飼料上生長的10只成年果蠅中切除每只果蠅的兩對馬爾皮吉安氏小管。將帶有附隨的輸尿管的各小管對懸浮在礦物油中，將一小管的非輸尿管末端浸在10μl微滴的Schneider′s昆蟲培養(yǎng)基中，且將其他小管的相應末端固定在解剖針上。通過在室溫每10分鐘測量在輸尿管末端形成的液滴大小來確定經(jīng)由浸在Schneider′s培養(yǎng)基中的小管轉(zhuǎn)運的流體的量。在經(jīng)過3個10分鐘間隔測量基礎流體分泌率后，向Schneider′s培養(yǎng)基的小滴中以100μM的最終濃度加入KCN，并測量另外3個10分鐘間隔的流體分泌率。在一些實驗中，在加入KCN10分鐘后以100μM的最終濃度加入鈷啉醇酰胺。2.結(jié)果鈷啉醇酰胺恢復氰化物處理的中國倉鼠細胞中的呼吸活性。先前已顯示在用琥珀酸鹽和3-磷酸甘油透化處理的中國倉鼠細胞中，測量呼吸活性準確的反映了細胞色素C氧化酶即線粒體的電子傳遞鏈的絡合物IV的活性(Way，Annu.Rev.Phannacol.Toxicol.24451-481，1984)。氰化物是細胞色素C氧化酶的有效抑制劑，且發(fā)現(xiàn)250μM的KCN幾乎完全抑制中國倉鼠細胞的呼吸活性(圖8a)。在生理pH值，KCN將被轉(zhuǎn)化為HCN，這是因為后者的pKa為9.3；盡管HCN的沸點是25.7℃且實驗在37℃進行，但不可能任何生成的HCN都從緩沖液中逃逸出，這是因為在開始該實驗前溫育腔被緩沖液完全充滿。以與KCN等摩爾濃度加入鈷啉醇酰胺，誘導呼吸快速恢復至大約為對照的未經(jīng)KCN處理的細胞的75％(圖8a，上圖，及圖8b，有交叉影線的柱)。以等摩爾為基礎，鈷胺素遠不如鈷啉醇酰胺有效，誘導呼吸的42％的恢復(圖8a，下圖，及圖8b，左斜紋柱)。鈷啉醇酰胺或鈷胺素獨自都不對氧消耗有任何影響。鈷啉醇酰胺恢復氰化物處理的中國倉鼠細胞的生長。培養(yǎng)的哺乳細胞從糖酵解得到許多它們的ATP，且如果氧化磷酸化被抑制，所述細胞將轉(zhuǎn)變成無氧代謝(Scheffler，I.1986.CarbohydrateMetabolisminCulturedCells(在培養(yǎng)細胞中的碳水化合物代謝).PlenumPress，NewYork.77-109pp)。因此，為研究氰化物對細胞生長的影響，含半乳糖的無葡萄糖培養(yǎng)基被作為糖源(Soderberg等人，Somat.CellGenet.5225-240，1979)。因為在生理條件下，KCN將被轉(zhuǎn)變?yōu)镠CN，且HCN是揮發(fā)性的，所以需要將KCN連續(xù)加入培養(yǎng)細胞中以觀察生長抑制。在零時間、8小時及24小時用100μMKCN處理中國倉鼠細胞，在48小時抑制的生長為31±5％(三次獨立實驗的平均值±S.D.)。在零時間向KCN處理的細胞加入10μM鈷啉醇酰胺，恢復它們的生長率至正常。推測這樣低量的鈷啉醇酰胺有效的原因是大部分產(chǎn)生的HCN從培養(yǎng)基中蒸發(fā)。對于10μM鈷胺素，發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。鈷啉醇酰胺對果蠅中的氰化物氣體的解毒。經(jīng)由攝食的鈷啉醇酰胺的遞送。果蠅目前被認為是人類疾病的出色模型，且在藥物開發(fā)中的使用漸增(Tickoo與Russell，Curr.Opin.Pharmacol.2555-560，2002)。果蠅作為一種飛行昆蟲，具有比較高的代謝率；因此，預期其將對HCN高度敏感，HCN可在幾秒鐘內(nèi)通過果蠅的螺旋紋氣管的呼吸系統(tǒng)進入果蠅，且較緩慢地歷經(jīng)幾分鐘通過跨角質(zhì)層的轉(zhuǎn)運(BiologyofDrosophila(果蠅的生物學)，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，1950)。暴露于濃度低至2.2ppm的HCN1分鐘誘發(fā)了80％的果蠅死亡，且在22ppm，所有的果蠅死亡(圖9a，對于在正常飼料上生長的果蠅，分別為空心柱、在y軸零值上的實線)。以在果蠅中約10μl的總的水體積為基礎，在低和高暴露水平，果蠅中的HCN濃度被發(fā)現(xiàn)分別為大約1和10μM(BiologyofDrosophila(果蠅的生物學)，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork，1950)。當果蠅在含100μM鈷啉醇酰胺的飼料上生長若干天并接著暴露于2.2和22ppm的HCN，約90％的果蠅在該氣體暴露中存活(圖9a，交叉影線柱)。鈷啉醇酰胺喂養(yǎng)的果蠅的存活率類似于未暴露于HCN對照的果蠅的存活率，而以類似于暴露于氰化物的果蠅的方式處理(圖9a，實心柱)。因此，與適當?shù)膶φ展壪啾龋掃减０氛T導了暴露于氰化物的果蠅的完全恢復。這將被與100μM鈷胺素喂養(yǎng)的果蠅相比，100μM鈷胺素喂養(yǎng)的果蠅顯示在2.2ppmHCN恢復80％，而在22ppm僅恢復20％(圖9a，左邊的斜條紋柱)。因此，在對果蠅的氰化物解毒上，鈷啉醇酰胺比鈷胺素有效得多。不能確定在果蠅中取得的鈷啉醇酰胺和鈷胺素的濃度，這是因為它在描述于“方法”中的高效液相色譜系統(tǒng)的檢測限之下(100pmol)。鈷啉醇酰胺喂養(yǎng)的果蠅可暴露于22ppmHCN高達15分鐘而沒有死亡率的任何顯著增加，但暴露時間＞30分鐘導致了所有果蠅死亡。這提示除通過呼吸系統(tǒng)進入外，HCN能在更加延長的暴露期間，通過其他機理進入果蠅，例如跨角質(zhì)層的機理，從而獲得更高的生物體內(nèi)的水平。作為暴露于氰化物的果蠅的另一方法，給果蠅注射溶解在10mMNa2CO3(pH9.5)中的1μl的100μMKCN。假設KCN被均勻分布在果蠅中，應獲得約10μM的細胞內(nèi)的KCN濃度，其與暴露于22ppmHCN的果蠅中獲得的濃度非常相似。僅注射Na2CO3對果蠅沒有影響(圖9b，實心柱)，而注射KCN導致100％的死亡率(圖9b，在y軸零值上的實線)?？?00μM鈷啉醇酰胺生長的果蠅對KCN相對耐受，顯示65％的存活率(圖9b，交叉影線柱)，而靠100μM鈷胺素生長的果蠅顯示38％的存活率(圖9b，左斜紋柱)。鈷啉醇酰胺和鈷胺素間的差別是統(tǒng)計學上顯著的(p＜0.01)。鈷啉醇酰胺經(jīng)由注射的遞送。因為在攝食研究中不能測量果蠅獲得的鈷啉醇酰胺和鈷胺素的濃度，所以給果蠅注入1μl的500μM鈷啉醇酰胺與鈷胺素，得到果蠅中約50μM的濃度，并接著使所述果蠅暴露于22ppm的HCN。類似于我們先前的發(fā)現(xiàn)，該濃度的HCN殺死幾乎全部用水注射的果蠅(圖10a，空心柱)。這將被與注射了鈷啉醇酰胺及鈷胺素的果蠅相比較，注射了鈷啉醇酰胺及鈷胺素的果蠅分別有65％和44％存活(圖10a，分別為在左側(cè)的交叉影線柱和左斜紋柱)；鈷啉醇酰胺和鈷胺素間的差別是統(tǒng)計學上顯著的(p＜0.05)。在HCN暴露的治療中，將最有用的是具有一種解毒劑，其可被用于暴露后，而不是暴露前，從而，實驗設計被修改并首先使果蠅暴露于HCN，繼之給它們注射水、鈷啉醇酰胺，或鈷胺素。鈷啉醇酰胺救起94％暴露于HCN的果蠅，鈷胺素救起62％暴露于HCN的果蠅，而注射水的果蠅均死亡(圖10a，與y軸零值上的實線相比，分別為在右側(cè)的交叉影線柱和左斜紋柱)。再次，鈷啉醇酰胺和鈷胺素間的差別是統(tǒng)計學上顯著的(p＜0.05)。與HCN暴露前相比，當在HCN暴露后進行鈷啉醇酰胺和鈷胺素的給藥時，更高的存活率的原因可反映程序上的差別在HCN暴露前的實驗中，在注射鈷啉醇酰胺/鈷胺素前須在冰上麻醉果蠅，并接著使其蘇醒10分鐘，而在HCN暴露后的實驗中，果蠅在HCN暴露后被立即注射鈷啉醇酰胺/鈷胺素，這是因為它們已經(jīng)失去知覺了。在HCN暴露前實驗中的麻醉操作可降低隨后的存活率，或鈷啉醇酰胺/鈷胺素在10分鐘的蘇醒期間可能已被部分排泄。在HCN暴露后鈷啉醇酰胺和鈷胺素給藥的高存活率將是臨床上有益的。鈷啉醇酰胺經(jīng)由吸入的遞送。在急性氰化物氣體暴露中，經(jīng)由胃腸途徑進行鈷啉醇酰胺的給藥將不太可能導致充分快速吸收有效，且經(jīng)由注射進行鈷啉醇酰胺給藥將需要有受過訓練的衛(wèi)生人員。對鈷啉醇酰胺進行了試驗，當經(jīng)由吸入提供時，其可降低氰化物毒性，這是因為這種方式的遞送是簡單且快速的。開發(fā)出使用手持式噴霧器向果蠅經(jīng)由吸入進行遞送藥物的系統(tǒng)，并顯示使用紅色染料莧菜紅使該染料經(jīng)由果蠅的螺旋紋氣管系統(tǒng)被遞送至內(nèi)臟。據(jù)我們所知，過去沒有工作人員經(jīng)由噴霧法向果蠅給藥。即使在低流率，水噴霧法殺死約20％對照的未暴露于氰化物的果蠅，推測是因為紊亂的空氣流及剪力(圖10b，實心柱)。當在水噴霧法后，果蠅暴露于2.2ppm的HCN，80％的果蠅死亡(圖10b，在左側(cè)的每個柱)，類似于先前在該HCN濃度發(fā)現(xiàn)的死亡率(圖9a)。這將被與果蠅的僅18％的死亡率比較，其在HCN暴露前通過噴霧法接收鈷啉醇酰胺(圖10b，在左側(cè)的交叉影線柱)。因為后者的存活率類似于接收噴霧水未暴露于氰化物的對照果蠅的存活率，所以該數(shù)據(jù)提示鈷啉醇酰胺完全避免了死亡。通過噴霧接受鈷胺素的果蠅顯示了免受HCN(傷害)的一些保護，具有55％的死亡率(圖10b，在左側(cè)的左傾斜紋柱)。如上所述，如果鈷啉醇酰胺可在氰化物氣體暴露后，而不是暴露前被給藥，鈷啉醇酰胺將是在氰化物氣體暴露的情況中最有用的。所以，改變實驗設計且將果蠅暴露于2.2ppmHCN，并接著使它們經(jīng)受水、鈷胺素，或鈷啉醇酰胺的噴霧。發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺在這些條件下如其在當在氰化物暴露之前給藥一樣有效防止死亡(圖10b，在右側(cè)的交叉影線柱)。鈷胺素也顯示出類似的如當其在氰化物暴露之前被給藥時的結(jié)果，但用水噴霧的果蠅顯示較低的存活率，推測是因為在噴霧時它們已經(jīng)被氰化物損傷了(圖10b，分別為在右側(cè)的空心的及左斜紋柱)。鈷啉醇酰胺減少氰化物對馬爾皮吉安氏小管分泌的抑制。昆蟲的馬爾皮吉安氏小管的分泌是一個依賴ATP的過程，且因此，預期其可被氰化物抑制(Dow與Davies，PhysiolRev.83687-729，2003)。100μM的KCN快速減少了果蠅馬爾皮吉安氏小管的小管分泌率(圖11a，實心圈)。已被在時間零點用100μM鈷啉醇酰胺或100μM鈷胺素處理的小管顯示了對KCN的抑制效應的顯著抵抗(圖11a，分別為空心圈和三角)。鈷啉醇酰胺與鈷胺素對如可在零至30分鐘間隔觀察的基礎分泌率沒有影響。當相同的實驗在被除去馬爾皮吉安氏小管并測量小管分泌率之前已靠鈷啉醇酰胺生長的果蠅上進行時，發(fā)現(xiàn)KCN的毒性效應幾乎完全逆轉(zhuǎn)(圖11b，比較空心圈——喂養(yǎng)鈷啉醇酰胺的果蠅與實心圈——對照的果蠅)。在喂養(yǎng)鈷啉醇酰胺的果蠅中的KCN毒性的更完全的逆轉(zhuǎn)可能源于在后種條件下鈷啉醇酰胺的緩慢的細胞攝??；更長時間小管的鈷啉醇酰胺預溫育可能不能完成，這是因為所述小管具有有限的實驗時間。已靠鈷胺素生長的果蠅顯示了中等程度的對KCN的抵抗(圖11b，三角)。為確定是否鈷啉醇酰胺能逆轉(zhuǎn)氰化物對小管分泌的抑制效應，在向小管加入100μMKCN后，加入鈷啉醇酰胺10分鐘，并發(fā)現(xiàn)小管分泌率顯著提高(圖11c，空心圈是鈷啉醇酰胺處理的小管)。甚至在僅10分鐘的氰化物暴露后，觀察到小管細胞的形態(tài)學變化，且這可以解釋鈷啉醇酰胺未回復小管分泌至正常的原因。3.討論過去的工作人員已指出HCN——在生理pH下氰化物存在的形式，與純化的細胞色素C氧化酶按兩步進行反應比較快速的形成一種酶-HCN中間體，繼之該中間體緩慢轉(zhuǎn)化為一種穩(wěn)定產(chǎn)物，可能是一種酶-氰化物離子絡合物(vanBuuren等人，Biochim.Biophys.Acta256258-276，1972；Panda與Robinson，Biochemistry3410009-10018，1995)。第一步反應的速率常數(shù)為0.03/秒，得到半衰期為23秒的中間體(vanBuuren等人，Biochim.Biophys.Acta256258-276，1972；Panda與Robinson，Biochemistry3410009-10018，1995)。氰化物從最終產(chǎn)物的離解估計非常緩慢，≈10-6/秒，且因此氰化物與細胞色素C氧化酶的總反應已被認為是不可逆的或“半可逆的”(vanBuuren等人，Biochim.Biophys.Acta256258-276，1972；Panda與Robinson，Biochemistry3410009-10018，1995)。使用鈷啉醇酰胺與鈷胺素(其都具有對氰化物相對高的親和力)，發(fā)現(xiàn)氰化物與細胞色素C氧化酶的反應是可逆的，如通過測量在透化處理的中國倉鼠細胞中的酶活性所表明的。此外，鈷啉醇酰胺與鈷胺素逆轉(zhuǎn)了氰化物在中國倉鼠細胞與果蠅中的致死效應，且鈷啉醇酰胺很大程度地逆轉(zhuǎn)了馬爾皮吉安氏小管轉(zhuǎn)運-一種依賴ATP的過程。假設氰化物的這些后面的效應來自細胞色素C氧化酶的抑制，這些數(shù)據(jù)提供了當在未受損的生物體或器官系統(tǒng)評估時氰化物與細胞色素C氧化酶的反應可逆的證據(jù)。類似的結(jié)論已從過去的工作人員得出，他們在氰化物中毒的其他動物模型以及遭受煙吸入的患者的治療中使用了鈷胺素(Fortin等人，JEMS29suppl-21，2004；Hall與Rumack，J.Emerg.Med.5115-121，1987；Posner等人，Anesthesiology44157-160，1976；Mushett等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.81234-237，1952)。作為一級近似(firstapproximation)，通過鈷啉醇酰胺與鈷胺素的氰化物解毒應遵循它們針對氰化物的相對親和力常數(shù)，指示對氰化物的親和力比鈷胺素高1010倍的鈷啉醇酰胺應是一種比鈷胺素更有效的氰化物解毒劑。然而，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)能不同程度結(jié)合鈷啉醇酰胺和鈷胺素并妨礙得出結(jié)合常數(shù)與解毒效應之間的明確關系。然而，在幾乎所有進行的實驗中，鈷啉醇酰胺比鈷胺素更有效地進行氰化物解毒，提示了在結(jié)合親和力和效能間的直接關系。在煙吸入受害者中的血液氰化物水平從2-250μM的范圍變動，對于高于40μM的水平與高死亡率有關(Baud等人.，N.Engl.J.Med.3251761-1766，1991)。這些數(shù)據(jù)與動物研究良好相關，根據(jù)動物種類，其已顯示了血液氰化物在20-100μM范圍的LD50(Salkowski與Penney，Vet.Hum.Toxicol.36455-466，1994)。因為發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺比鈷胺素更加有效地進行氰化物解毒，人們預期較低量的鈷啉醇酰胺可用于治療煙吸入受害者。當開發(fā)響應大規(guī)模毀滅性武器時，其將有助于具有可在暴露于毒劑后進行給藥的藥物，這是因為通常預防療法或許是不可能的。因此，發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺可在氰化物暴露后向果蠅施用且至少和氰化物暴露前施用同樣有效是有益的?？赡苌踔粮又匾氖牵掃减０房赏ㄟ^注射或吸入進行給藥，其將允許快速藥物遞送。新近的數(shù)據(jù)提示氰化物可在一些疾病的發(fā)展中起作用。吸煙者具有高水平的血和尿的氰化物及硫氰酸根水平，血液透析患者也是如此(Abou-Seif，J.Biochem.Toxicol.11133-138，1996；Hasuike等人，191474-1479，2004)。在兩種情況中，高的硫氰酸根水平可促成脂質(zhì)氧化，并因此促成動脈硬化，因為硫氰酸根是過氧化物酶的優(yōu)選底物(Zhang等人，Blood991802-1810，2002；vanDalen與Kettle，Biochem.J.358233-239，2001；Scanlon等人.，Atherosclerosis12123-33，1996；Exner等人，F(xiàn)reeRadic.Biol.Med.37146-155，2004)。粘液型銅綠假單胞菌(MucoidPseduomonasaeruginosa)是產(chǎn)生氰的，且從囊性纖維病患者的唾液中分離出的細菌已顯示產(chǎn)生氰化物(Carterson等人，J.Bacteriol.1866837-6844，2004)。因此，可能是氰化物促成了被銅綠假單胞菌感染的囊性纖維病患者的肺破壞(Carterson等人，J.Bacteriol.1866837-6844，2004)。對于這些臨床情況，具有一種可進行氰化物解毒，特別是一種在囊性纖維病的情況中可通過吸入進行給藥的藥物將是有用的。作為鈷胺素的生物合成中的前體，鈷啉醇酰胺是多種維生素制劑的污染物，且至少在豬中，鈷啉醇酰胺可不依賴于內(nèi)因子被吸收穿過回腸(Kondo等人，J.Clin.Invest70889-898，1982；Kanazawa等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.183333-338，1986)。一旦被吸收，鈷啉醇酰胺牢固地與結(jié)合咕啉結(jié)合(先前指的是R蛋白質(zhì)以及鈷胺素傳遞蛋白I和III)，但與鈷胺素傳遞蛋白II弱結(jié)合(Fedosov等人，J.Biol.Chem.2779989-9996，2002；Ermens等人，Clin.Mochem.36585-590，2003；Fedosov等人，Biochemistry3416082-16087，1995)。因為結(jié)合咕啉和鈷胺素傳遞蛋白II的血清水平是類似的，顯著量的鈷啉醇酰胺可在血清中存在，且鈷胺素類似物包括鈷啉醇酰胺已在動物及人類的血清、膽汁和組織中被檢出，占總的類咕啉的5-50％(Ermens等人，Clin.Biochem.36585-590，2003；Kolhouse等人，N.Engl.J.Med.299785-792，1978；elKholty等人，Gastroenterology1011399-1408，1991；Kondo等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A77817-821，1980；Baker等人，J.Am.Coll.Nutr.5467-475，1986)。靜脈注射示蹤量的放射性的鈷啉醇酰胺至家兔中，顯示鈷啉醇酰胺，與鈷胺素相似，在幾分鐘內(nèi)被肝吸收，但不同于鈷胺素的是，鈷啉醇酰胺從肝釋放得較慢，用150小時；一旦從肝釋放，鈷啉醇酰胺與鈷胺素的組織分布是相似的，且它們都在尿和糞便中排泄(Kolhouse與Allen，J.Clin.Invest601381-1392，1977)。因此，雖有少數(shù)值得注意的例外，鈷啉醇酰胺與鈷胺素看來似乎在哺乳動物系統(tǒng)中被類似地處理。在3.7nM和200μM的濃度，鈷啉醇酰胺分別對鼠白血病細胞、人類單核細胞及淋巴細胞沒有生長抑制效應(Kondo等人，Int.J.Hematol.56167-177，1992；Weinberg等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.246393-397，1998)。在整體動物中，當進行腸胃外給藥時，鈷胺素劑量40倍的鈷啉醇酰胺對童子雞(babychick)的生長沒有影響；當經(jīng)口施用時，它抑制小雞生長，提示其干擾鈷胺素的吸收(Coates等人，Biochem.J.64682-686，1956)。類似地，當鈷啉醇酰胺以4μg/h、持續(xù)14天的連續(xù)速率向鼠進行皮下給藥時，沒有明顯的毒性效應，鈷啉醇酰胺也不抑制兩種哺乳動物鈷胺素依賴酶甲硫氨酸合酶或甲基丙二酰輔酶A變位酶(Stabler等人，J.Clin.Invest.871422-1430，1991)。對于培養(yǎng)的哺乳動物細胞，高達至少50μM的鈷啉醇酰胺是無毒的，且其毒性可被鈷胺素完全逆轉(zhuǎn)(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。發(fā)現(xiàn)鈷啉醇酰胺對甲硫氨酸合酶或甲基丙二酰輔酶A變位酶的活性沒有影響，提示了鈷啉醇酰胺在干擾鈷胺素代謝(Broderick等人，J.Biol.Chem.2808678-8685，2005)。進行鈷胺素和鈷啉醇酰胺的給藥應防止任何毒性，且向鈷啉醇酰胺加入鈷胺素在氰化物解毒中應是有益的。鈷啉醇酰胺是一種對于氰化物解毒高度有效的藥劑。其可能能夠在多種臨床狀態(tài)中使用，且可特別用作大規(guī)模氰化物中毒(即工業(yè)事故或使用WMD攻擊而導致)的一種解毒劑。權利要求1.一種用于治療受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺或其生物活性衍生物或類似物的給藥。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)為敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。5.一種用于緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的所述受治療者疾病狀態(tài)的癥狀的方法，其包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受治療者被診斷為遭受發(fā)展疾病狀態(tài)的痛苦或處于發(fā)展疾病狀態(tài)的危險，所述疾病狀態(tài)由過量NO的存在引起或加重。6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)為敗血癥、慢性肝衰竭、肝硬化、肝性腦病、肝腎綜合征、肝肺綜合征、肝硬化性心肌病、血液透析相關的低血壓、心源性休克、缺血-再灌注損傷、缺氧，及創(chuàng)傷。7.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。8.一種用于治療受治療者敗血癥的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。10.根據(jù)權利要求5所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。11.一種用于治療受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺或其生物活性衍生物或類似物的給藥。12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述受治療者為吸煙者或血液透析患者。13.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)為囊性纖維病。14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述過量氰化物由大規(guī)模毀滅性武器產(chǎn)生。15.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以1至500mg的劑量進行給藥。16.根據(jù)權利要求11所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。17.一種用于緩解受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的所述受治療者疾病狀態(tài)的癥狀的方法，其包括進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥，其中所述受治療者被診斷為遭受發(fā)展疾病狀態(tài)的痛苦或處于發(fā)展疾病狀態(tài)的危險，所述疾病狀態(tài)由過量氰化物的存在引起或加重。18.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述受治療者為吸煙者或血液透析患者。19.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述疾病狀態(tài)為囊性纖維病。20.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述過量氰化物由大規(guī)模毀滅性武器產(chǎn)生。21.根據(jù)權利要求17所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。22.根據(jù)權利要求17所述的方法，還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。23.一種用于治療受治療者氰化物中毒的方法，包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。24.根據(jù)權利要求23所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。25.根據(jù)權利要求23所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。26.一種用于治療受治療者煙吸入的方法，包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以500mg至5g的劑量進行給藥。28.根據(jù)權利要求26所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。29.一種用于治療對哺乳動物受治療者進行硝普鹽給藥有關的副作用的方法，其包括對所述受治療者進行藥學有效量的鈷啉醇酰胺的給藥。30.根據(jù)權利要求29所述的方法，其中所述鈷啉醇酰胺以100mg至1g的劑量進行給藥。31.根據(jù)權利要求29所述的方法，其還包括進行藥學有效量的鈷胺素或其生物活性衍生物或類似物的給藥。32.一種藥物組合物，其包括權利要求1所述的鈷啉醇酰胺與藥學上可接受的載體。33.根據(jù)權利要求32所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素與藥學上可接受的載體。34.一種藥物組合物，其包括權利要求5所述的鈷啉醇酰胺與藥學上可接受的載體。35.根據(jù)權利要求34所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素與藥學上可接受的載體。36.一種藥物組合物，其包括權利要求11所述的鈷啉醇酰胺與藥學上可接受的載體。37.根據(jù)權利要求36所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素與藥學上可接受的載體。38.一種藥物組合物，其包括權利要求17所述的鈷啉醇酰胺與藥學上可接受的載體。39.根據(jù)權利要求38所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物，及藥學上可接受的載體。40.一種藥物組合物，其包括一或多種鈷啉醇酰胺化合物或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送，其中所述組合物有效用于治療受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)。41.根據(jù)權利要求40所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送。42.一種藥物組合物，其包括一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送，其中所述組合物有效緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)的一或多種癥狀。43.根據(jù)權利要求42所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送。44.一種藥物組合物，其包括一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送，其中所述組合物有效用于治療受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)。45.根據(jù)權利要求44所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送。46.一種藥物組合物，其包括一或多種鈷啉醇酰胺化合物，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送，其中所述組合物有效緩解受治療者由過量氰化物的存在而引起或加重的所述受治療者的疾病狀態(tài)的一或多種癥狀。47.根據(jù)權利要求46所述的藥物組合物，其還包括鈷胺素，或其生物活性衍生物或類似物，被配制成向受治療者遞送。全文摘要本發(fā)明提供了治療受治療者由過量一氧化氮(NO)或過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的方法。也提供了緩解受治療者由過量一氧化氮(NO)或過量氰化物的存在而引起或加重的疾病狀態(tài)的方法。還提供了包含鈷啉醇酰胺與藥學上可接受的載體的藥物組合物。文檔編號A61K31/70GK101035544SQ200580027058公開日2007年9月12日申請日期2005年6月17日優(yōu)先權日2004年6月18日發(fā)明者格里·鮑思,維賈伊·沙爾瑪,凱特·E·布羅德里克申請人:加利福尼亞大學董事會