專利名稱：用維生素d化合物治療間質(zhì)性膀胱炎的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及維生素D化合物在制備用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。進一步涉及預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法，該方法施用單獨的或者與其它物質(zhì)組合的預防和/或治療這類疾病有效量的維生素D化合物。
間質(zhì)性膀胱炎在本文中表示為“IC”，是一種慢性炎性膀胱疾病，也被稱為慢性盆腔疼痛綜合征(CPPS)或膀胱疼痛綜合征(PBS)，以盆腔疼痛、尿急和尿頻為特征。這種疾病主要影響女性，不過男性也有被診斷為IC的。與其它膀胱功能障礙的病癥不同，IC以膀胱壁的慢性炎癥為特征，膀胱壁的慢性炎癥是癥狀學的主要原因；換言之，膀胱收縮性異常和慢性盆腔疼痛的原因是慢性炎癥，所以治療應當針對該病因。事實上，用平滑肌松弛劑進行的膀胱功能障礙如膀胱過度活動癥(overactive bladder)的傳統(tǒng)治療對IC患者無效。
目前，有大量療法用于這種疾病，這反映出這是一種沒有真正有效的治療方法的病癥。例如，膀胱內(nèi)二甲基亞砜(DMSO)已經(jīng)成為廣泛臨床研究的對象。但是，其作用機理仍然不明。臨床結(jié)果不能完全令人滿意，施用途徑(膀胱內(nèi))對于IC經(jīng)常需要的長期治療而言并不理想。
一些現(xiàn)有療法以粘膜屏障保護的觀念為基礎，例如肝素類似物戊聚糖多硫酸鈉(PPS)的使用。結(jié)果再次令人失望，在長期的基礎上，不到20％的口服施用PPS的患者顯示有益效果。
其它方法包括使用抗組胺劑、黃酮類化合物和其它可以減少由肥大細胞介導的促炎劑作用的物質(zhì)。這類方法已經(jīng)在多項研究中顯示出不一致的和低限度的有效性。另一種方法、即膀胱內(nèi)BCG(卡介苗)的使用也未在以DMSO為對照的交叉試驗中顯示出癥狀改善。
因此，顯然需要尋找針對與該疾病病因有關的所有不同免疫因素的新的藥理學方法。
正如本文所述，現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，維生素D類似物能夠治療和預防間質(zhì)性膀胱炎。
自從Mellanby于1920年發(fā)現(xiàn)維生素D(膽骨化醇)以來(Mellanby，E.(1921)Spec.Rep.Ser.Med.Res.Council(GB)SRS614)，人們已經(jīng)認識到了它在高級動物生物系統(tǒng)中的重要性。正是在1920-1930年間維生素D被正式歸類為“維生素”，其骨骼的正常發(fā)育和鈣與磷內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持所必需的。
關于維生素D3代謝的研究開始于血漿代謝物25-羥基維生素D3[25(OH)D3](Blunt，J.W.等人.(1968)Biochemistry 63317-3322)和激素活性形式1-α，25(OH)2D3(Myrtle，J.F.等人.(1970)J.Biol.Chem.2451190-1196；Norman，A.W.等人.(1971)Science17351-54；Lawson，D.E.M.等人.(1971)Nature230228-230；Holick，M.F.(1971)Proc.Natl.Acad.Sci.USA68803-804)的發(fā)現(xiàn)和化學表征。維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的概念的表述依賴于腎臟在以謹慎調(diào)節(jié)方式產(chǎn)生1-α，25(OH)2D3中的關鍵作用的認識(Fraser，D.R.和Kodicek，E(1970)Nature 288764-766；Wong，R.G.等人.(1972)J.Clin.Invest.511287-1291)和腸中1-α，25(OH)2D3核受體(VD3R)的發(fā)現(xiàn)(Haussler，M.R.等人.(1969)Exp.Cell Res.58234-242；Tsai，H.C.和Norman，A.W.(1972)J.Biol.Chem.2485967-5975)。
維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的運行依賴于下列因素第一，細胞色素P450酶在肝臟(Bergman，T.和Postlind，H.(1991)Biochem.J.276427-432；Ohyama，Y和Okuda，K.(1991)J.Biol.Chem.2668690-8695)和腎臟(Henry，H.L.和Norman，A.W.(1974)J.Biol.Chem.2497529-7535；Gray，R.W.和Ghazarian，J.G.(1989)Biochem.J.259561-568)中以及在多種其它組織中的存在，以實現(xiàn)維生素D3向生物活性代謝物例如1-α，25(OH)2D3和24R，25(OH)2D3的轉(zhuǎn)化；第二，血漿維生素D結(jié)合蛋白(DBP)的存在，以實現(xiàn)這些疏水性分子向維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)的各種組織的選擇性運輸和遞送(Van Baelen，H.等人.(1988)Ann NY Acad.Sci.53860-68；Cooke，N.E.和Haddad，J.G.(1989)Endocr.Rev.10294-307；Bikle，D.D.等人.(1986)J.Clin.Endocrinol.Metab.63954-959)；第三，立體選擇性受體在多種靶組織中的存在，所述受體與激動劑1-α，25(OH)2D3相互作用以產(chǎn)生必不可少的對該開環(huán)甾類激素的特異性生物學響應(Pike，J.W.(1991)Annu.Rev.Nutr.11189-216)。迄今為止，有證據(jù)表明1-α，25(OH)2D3的核受體(VD3R)存在于30多種組織和癌細胞系中(Reichel，H.和Norman，A.W.(1989)Annu.Rev.Med.4071-78)，包括正常的膀胱。
Vitamin D3及其激素活性形式是眾所周知的鈣和磷內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)劑。已知這些化合物刺激鈣與磷的腸吸收、骨礦物質(zhì)的調(diào)動和鈣在腎中的存留中的至少一種。此外，發(fā)現(xiàn)特異性維生素D受體存在于30多種組織中已經(jīng)導致維生素D3被確定為除其在鈣/骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的經(jīng)典角色以外的多能調(diào)節(jié)劑。能將維生素D3氧化為其活性形式的酶、例如25-OHD-1-α-羥化酶和特異性受體在多種組織例如骨、角質(zhì)形成細胞、胎盤和免疫細胞中的聯(lián)合存在已經(jīng)提示了1-α，25(OH)2D3的旁分泌作用。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)維生素D3激素和活性代謝物能調(diào)節(jié)正常細胞和惡性細胞的細胞增殖和分化(Reichel，H.等人.(1989)Ann.Rev.Med.4071-78)。
由于維生素D3及其代謝物的活性，很多關注已經(jīng)集中于這些化合物的合成類似物的開發(fā)。大量這些類似物牽涉A環(huán)、B環(huán)、C/D環(huán)和主要是側(cè)鏈中的結(jié)構修飾(Bouillon，R.等人.(1995)Endocrine Reviews 16(2)201-204)。盡管大多數(shù)迄今所開發(fā)的維生素D3類似物牽涉?zhèn)孺湹慕Y(jié)構修飾，但是少量研究已經(jīng)報道了A環(huán)非對映體的生物特性(Norman，A.W.等人.(1993)J.Biol.Chem.268(27)20022-20030)。此外，已經(jīng)研究了甾類的生物酯化作用(Hochberg，R.B.，(1998)Endocr Rev.19(3)331-348)，維生素D3的酯是已知的(WO97/11053)。
而且，盡管為開發(fā)合成類似物已付出大量努力，但是維生素D及其結(jié)構類似物的臨床應用被這些化合物施用于受試者用于維生素D化合物的已知適應癥/應用后所引起的不希望的副作用所限制。
維生素D的活化形式、維生素D3和其類似物中的一些已被描述為細胞生長和分化的有力調(diào)節(jié)劑。以前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，維生素D3以及類似物(類似物V)抑制BPH細胞增殖，抵抗BPH細胞的有力生長因子例如角質(zhì)形成細胞生長因子(KGF)和胰島素樣生長因子(IGF1)的促有絲分裂活性。而且，該類似物在未刺激的與KGF-刺激的BPH細胞中誘導bcl-2蛋白表達、細胞內(nèi)鈣調(diào)動和細胞凋亡。
因此，本發(fā)明提供了用于預防或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物和使用這類化合物的新治療方法。
在進一步說明本發(fā)明之前，為了可以更容易地理解本發(fā)明，為方便起見此處首先定義和集中了某些術語。
“間質(zhì)性膀胱炎”(IC)表示膀胱的慢性、炎性障礙，以不定程度的尿急、尿頻和膀胱疼痛為特征。正如本文所述，發(fā)明人已經(jīng)指明，維生素D3類似物可用于治療IC的炎性組分和由此導致的IC特征性的膀胱活動過度，這對IC患者中見到的疼痛、尿急和尿頻癥狀有作用。一些IC患者可能出現(xiàn)疼痛為主要癥狀，伴有輕微的尿頻和尿急，而其它患者可能僅呈現(xiàn)尿頻和尿急癥狀。IC患者可能或者可能不出現(xiàn)另外的夜尿癥狀。疼痛目前被視為IC的最重要的特征性癥狀，而夜尿不被視為IC診斷的重要因素。人們還認為具有正常排尿頻率、但是具有疼痛和尿急的患者也可能患有IC。這表明IC患者可能呈現(xiàn)出各種癥狀組合。所有呈現(xiàn)排尿不適、恥骨上加壓或沉重(suprapubic pressure or heaviness)或者排尿燒灼感(burning micturation)、伴有或沒有疼痛、無細菌感染的患者均應當懷疑為IC。目前，IC是根據(jù)臨床特性進行診斷的。推薦的檢測包括尿分析、尿培養(yǎng)、細胞學、尿流動力學和在麻醉與膀胱擴張下的膀胱鏡檢查。
術語“施用”包括向受試者引入維生素D化合物以發(fā)揮它們預期功能的途徑?？墒褂玫氖┯猛緩降膶嵗ㄗ⑸?皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、腹膜內(nèi))、口服、吸入、直腸、透皮或經(jīng)由膀胱滴注。藥物制劑當然是通過適合于每種施用途徑的形式給予的。例如，通過注射、輸注、吸入、洗劑、軟膏劑、栓劑等、以片劑或膠囊的形式施用這些制劑?？诜┯檬莾?yōu)選的。注射可以是推注或者可以是連續(xù)輸注。根據(jù)施用的途徑，維生素D化合物可以用所選擇的材料包衣或者置于所選擇的材料中，以保護它免受可能對其發(fā)揮預期功能的能力具有有害影響的自然條件。維生素D化合物可以被單獨施用或者與另一種上述物質(zhì)、例如與平滑肌松弛劑(例如α阻滯劑或抗毒蕈堿藥)或與藥學上可接受的載體或此二者聯(lián)合施用。維生素D化合物可以在施用另一種物質(zhì)之前、與該物質(zhì)同時或者在施用該物質(zhì)之后被施用。此外，維生素D化合物也可以以前體形式施用，它在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其活性代謝物或者更大活性的代謝物。
術語“有效量”包括在必要的劑量和時間段下有效達到所需結(jié)果、即足以治療間質(zhì)性膀胱炎的量。維生素D化合物的有效量可以因多種因素而異，所述因素例如疾病狀態(tài)、受試者的年齡與體重和維生素D化合物在受試者中引發(fā)所需響應的能力?？梢哉{(diào)節(jié)給藥方案，以提供最佳的治療響應。有效量還是其中維生素D化合物的治療有益作用比任何毒性和有害作用(例如副作用)重要的量。
維生素D化合物的治療有效量(即有效劑量)可以從約0.001至30μg/kg體重不等，優(yōu)選約0.01至25μg/kg體重，更優(yōu)選約0.1至20μg/kg體重，甚至更優(yōu)選約1至10μg/kg、2至9μg/kg、3至8μg/kg、4至7μg/kg或5至6μg/kg體重。本領域技術人員將認識到，某些因素可能影響有效治療受試者所需的劑量，包括但不限于疾病或障礙的嚴重性、以前的治療、受試者的總體健康狀況和/或年齡以及存在的其它疾病。另外，施用的劑量也將取決于所使用的特定維生素D化合物，每種化合物的有效量可以由本領域已知的滴定法來確定。此外，用治療有效量的維生素D化合物治療受試者可以包括單一治療，或者優(yōu)選地可以包括一系列治療。在一個實例中，用維生素D化合物治療受試者，劑量在約0.1至20μg/kg體重的范圍內(nèi)，每天一次，持續(xù)六個月或更長時間，例如一生，這取決于癥狀的控制和病癥的變化情況。而且，如同其它慢性治療一樣，可以考慮“開關(on-off)”或間歇性治療方案。還應當認識到的是，治療所用的維生素D化合物的有效劑量可以隨著特定治療過程而增加或減少。
術語“烷基”表示飽和脂族基團，包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷基(脂環(huán)族基團)、烷基取代的環(huán)烷基和環(huán)烷基取代的烷基。術語烷基進一步包括這樣的烷基，它們可以進一步包括氧、氮、硫或磷原子以代替烴骨架中的一個或多個碳，例如氧、氮、硫或磷原子。在優(yōu)選的實施方案中，直鏈或支鏈烷基在其骨架中具有30個或30個以下的碳原子(例如對于直鏈，C1-C30，對于支鏈，C3-C30)，優(yōu)選26個或26個以下，更優(yōu)選20個或20個以下。同樣，優(yōu)選的環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構中具有3-10個碳原子，更優(yōu)選地在環(huán)結(jié)構中具有3、4、5、6或7個碳。
此外，整個說明書和權利要求書中所使用的術語烷基旨在包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，后者表示具有取代基以代替烴骨架中的一個或多個碳上的氫的烷基部分。這類取代基可以包括例如鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基(alkylthiocarbonyl)、烷氧基、磷酸根、膦?；?phosphonato)、次膦?；?phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、?；被?包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲?；碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基(sulfonato)、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。本領域技術人員將理解的是，如果適當，在烴鏈上取代的部分本身可以被取代。環(huán)烷基可以被進一步取代，例如被上述取代基進一步取代?！巴榛蓟辈糠质潜环蓟〈耐榛?例如苯甲基(芐基))。術語“烷基”也包括在長度和可能的取代上類似于上述烷基、但是分別含有至少一條雙鍵或叁鍵的不飽和的脂族基團。
除非對碳數(shù)另有規(guī)定，否則本文所用的“低級烷基”表示如上所定義的烷基，但是在其骨架結(jié)構中具有1至10個碳，更優(yōu)選1至6個、最優(yōu)選1至4個碳原子，它可以是直鏈或支鏈的。低級烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、己基、庚基、辛基等。低級烷基的其它實例包括仲丁基、正丁基和戊基。在優(yōu)選的實施方案中，術語“低級烷基”包括在其骨架中具有4個或4個以下碳原子的直鏈烷基，例如C1-C4烷基。
因此，烷基的具體實例包括C1-6烷基或C1-4烷基(例如甲基或乙基)。羥基烷基的具體實例包括C1-6羥基烷基或C1-4羥基烷基(例如羥甲基)。
術語“烷氧基烷基”、“多氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”表示如上所述的烷基，它們進一步包括氧、氮或硫原子代替烴骨架中的一個或多個碳，例如氧、氮或硫原子。
本文所用的術語“芳基”表示芳基原子團，包括5-和6-元單環(huán)芳族基團，它可以包括0至4個雜原子，例如苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、苯并_唑、苯并噻唑、三唑、四唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等。芳基也包括多環(huán)稠合芳族基團，例如萘基、喹啉基、吲哚基等。在環(huán)結(jié)構中具有雜原子的那些芳基也可以稱為“芳基雜環(huán)”、“雜芳基”或“雜芳族基團”。芳族環(huán)可以在一個或多個環(huán)位置上被上述取代基取代，例如鹵素、羥基、烷氧基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、磷酸根、膦?；?、次膦?；⑶杌?、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲酰基和脲基)、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基、氨磺?；?、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。芳基也可以與不是芳族的脂環(huán)族或雜環(huán)的環(huán)稠合或橋連以形成多環(huán)(例如四氫化萘)。
術語“鏈烯基”和“炔基”表示長度和可能的取代類似于上述烷基、但是分別含有至少一條雙鍵或叁鍵的不飽和的脂族基團。例如，本發(fā)明涵蓋氰基和炔丙基。
術語“手性”表示具有鏡像伴侶的不可疊加性質(zhì)的分子，而術語“非手性”表示可疊加于它們鏡像伴侶的分子。
術語“非對映體”表示具有兩個或多個不對稱中心的立體異構體，它們的分子不是彼此的鏡像。
術語“對映體”表示化合物的兩種立體異構體，它們是彼此的不可疊加鏡像。兩種對映體的等摩爾混合物被稱為“外消旋混合物”或“外消旋物”。
本文所用的術語“鹵素”表示-F、-Cl、-Br或-I；術語“巰基”或“硫醇”表示-SH；術語“羥基”表示-OH。
術語“鹵代烷基”旨在包括被鹵素單-、二-或多-取代的以上所定義的烷基，例如C1-6鹵代烷基或C1-4鹵代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
本文所用的術語“雜原子”表示任何除碳或氫以外的元素的原子。優(yōu)選的雜原子是氮、氧、硫和磷。
術語“多環(huán)基”或“多環(huán)原子團”表示兩個或多個環(huán)狀環(huán)的原子團(例如環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基)，其中兩個鄰接的環(huán)共用兩個或多個碳，例如這些環(huán)是“稠合環(huán)”。通過不相鄰原子連接的環(huán)被稱為“橋連”環(huán)。多環(huán)的每個環(huán)可以被上述取代基取代，例如鹵素、羥基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸根、烷基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸根、膦?；?、次膦?；?、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨甲?；碗寤?、脒基、亞氨基、巰基、烷硫基、芳硫基、硫代羧酸根、硫酸根、磺酸基、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、疊氮基、雜環(huán)基、烷基、烷基芳基或者芳族或雜芳族部分。
術語“異構體”或“立體異構體”表示具有相同化學組成、但是在原子或基團的空間排列方面不同的化合物。
術語“分離的”或“基本上純化的”在本文中可互換使用，表示非天然存在狀態(tài)的維生素D3化合物。這些化合物當天然產(chǎn)生時可以基本上不含細胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當化學合成時可以基本上不含化學前體或其它化學物質(zhì)。在某些優(yōu)選的實施方案中，術語“分離”或“基本上純化”也表示基本上沒有對映體之一的手性化合物的制備物；即分子的對映體富集或非外消旋制備物。與之相似，術語“分離的差向異構體”或“分離的非對映體”表示基本上不含其它立體化學形式的手性化合物的制備物。例如，分離的或基本上純化的維生素D3化合物包括富集具有以α-構型連接于A-環(huán)3位手性碳上的取代基的立體異構體的維生素D3的合成或天然制備物，因而基本上沒有其它具有β-構型的異構體。除非另有規(guī)定，否則這類術語表示其中α與β形式的重量比大于1∶1的維生素D3組合物。例如，差向異構體的分離的制備物表示相對于β-立體異構體而言具有大于50重量％、更優(yōu)選至少75重量％、甚至更優(yōu)選至少85重量％的α-差向異構體的制備物。當然，富集作用可以遠大于85％，提供“基本上差向異構體-富集的”制備物，即相對于β-立體異構體而言具有大于90％、甚至更優(yōu)選大于95％的α-差向異構體的化合物制備物。術語“基本上不含β-立體異構體”應理解為具有相似的純度范圍。
本文所用的術語“維生素D化合物”包括任何能夠治療或預防間質(zhì)性膀胱炎的為維生素D類似物的化合物。一般而言，為維生素D受體配體(VDR配體)并且能夠治療或預防間質(zhì)性膀胱炎的化合物被視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。維生素D化合物優(yōu)選地是維生素D受體的激動劑。因此，維生素D化合物旨在包括開環(huán)甾類。適用于本發(fā)明的方法的具體維生素D化合物的實例在本文中有進一步描述。維生素D化合物包括維生素D2化合物、維生素D3化合物、其異構體或者其衍生物/類似物。優(yōu)選的維生素D化合物是維生素D3化合物，它們是維生素D受體的配體(更優(yōu)選地是激動劑)。優(yōu)選地，維生素D化合物(例如維生素D3化合物)是比天然配體(即維生素D，例如維生素D3)更有力的維生素D受體激動劑。維生素D1化合物、維生素D2化合物和維生素D3化合物分別包括維生素D1、D2、D3和其類似物。在某些實施方案中，維生素D化合物可以是甾類，例如開環(huán)甾類，例如骨化醇(calciol)、骨化二醇或骨化三醇。本發(fā)明的維生素D化合物的非限制性實例包括下列文獻所述的那些美國專利No.6,017,908、6,100,294、6,030,962、5,428,029和6,121,312、已公布的國際申請WO98/51633、WO01/40177A3。
術語“開環(huán)甾類”是本領域公認的，包括其中甾環(huán)結(jié)構的環(huán)戊環(huán)多氫菲環(huán)之一斷裂的化合物。例如，1-α，25(OH)2D3及其類似物是有激素活性的開環(huán)甾類。在維生素D3的情況下，B-環(huán)的9-10碳-碳鍵斷裂，生成開環(huán)-B-甾類。維生素D3的正式IUPAC名稱為9，10-開環(huán)膽甾-5，7，10(19)-三烯-3B-醇。為了方便，本文闡述1-α，25(OH)2D3的6-s-反式構象異構體，所有碳原子均用標準甾類表示法進行編號。
在本文所列的結(jié)構式中，環(huán)A上的各種取代基與甾族核的連接用這些表示法之一闡述虛線(----)表示取代基為β-取向(即，在環(huán)平面以上)，楔形實線(_)表示取代基為α-取向(即，在分子平面以下)，或者波浪線 表示取代基可以在環(huán)平面以上或以下。關于環(huán)A，應當理解的是，維生素D領域中的立體化學常規(guī)與一般化學領域相反，其中虛線表示環(huán)A上的取代基為α-取向(即，在分子平面以下)，楔形實線表示環(huán)A上的取代基為β-取向(即，在環(huán)平面以上)。
此外，跨越碳-碳雙鍵的立體化學的表示也與一般化學領域相反，“Z”表示常被稱為“順式”(同側(cè))的構象，而“E”表示常被稱為“反式”(對側(cè))的構象。無論如何，兩種構型順式/反式和/或Z/E都適用于本發(fā)明的化合物。
正如所示的那樣，激素1-α，25(OH)2D3的A環(huán)在碳1和3含有兩個不對稱中心，每個不對稱中心含有構型得到充分表征的羥基，即1-α-和3-β-羥基。換言之，A環(huán)的碳1和3是“手性碳”或“碳中心”。
關于手性中心的命名，術語“d”和“l(fā)”構型是用IUPACRecommendations定義的。至于術語的使用，非對映體、外消旋物、差向異構體和對映體將以它們的通常含義被用來描述制備物的立體化學。
而且，在本專利文獻中，維生素D化合物的A環(huán)在一般結(jié)構式中常被描繪為下列結(jié)構中的任意一種 其中X1和X2被定義為H或＝CH2；或者 其中X1和X2被定義為H2或CH2。
盡管似乎沒有任何既定常規(guī)，但是顯然本領域普通技術人員理解式(A)或(B)代表以下的其中例如X1是＝CH2且X2被定義為H2的A環(huán) 對于本發(fā)明的目的，在所有一般結(jié)構中將使用式(B)。
因此，一方面，本發(fā)明提供了維生素D化合物在預防或治療間質(zhì)性膀胱炎中的用途。也提供了通過施用有效量的維生素D化合物治療患有間質(zhì)性膀胱炎的患者的方法。進一步提供了維生素D化合物在制備用于預防或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。進一步提供了用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。還提供了一種套藥盒，其含有維生素D化合物以及指導將所述化合物施用于需要治療和/或預防間質(zhì)性膀胱炎的患者、從而治療和/或預防所述患者的間質(zhì)性膀胱炎的說明書。間質(zhì)性膀胱炎可以例如以存在膀胱功能障礙和膀胱炎癥癥狀為特征。
在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法和用途可以是治療女性的方法和用途。在另一個實施方案中，它們是治療男性的方法和用途。
在本發(fā)明的一個實施方案中，維生素D化合物是式(I)的化合物 其中X是羥基或氟；Y是H2或CH2；Z1和Z2是H或者式(II)所示的取代基，條件是Z1和Z2是不同的(優(yōu)選地，Z1和Z2不均代表式(II)) 其中Z3代表上述式(I)；A是單鍵或雙鍵；R1、R2和Z4各自獨立地是氫、烷基或者式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈，條件是R1、R2和Z4至少有一個是式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈，并且條件是R1、R2和Z4不都是式(III)所示的飽和或不飽和的碳鏈
其中Z5代表上述式(II)；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R3和R4各自獨立地是氫、烷基、鹵代烷基、羥基烷基；R5是H2或氧。R5也可以代表氫或者可以不存在。
因此，在以上的式(III)結(jié)構(和下列相應的結(jié)構)中，當A2代表叁鍵時，R5不存在。當A2代表雙鍵時，R5代表氫。當A2代表單鍵時，R5代表羰基或兩個氫原子。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，維生素D化合物是式(IV)的化合物 其中X1和X2是H2或CH2，其中X1和X2不同時是CH2；A是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R1和R2是氫、C1-C4烷基或4-羥基-4-甲基戊基，其中R1和R2不都是氫；R5是H2或氧，R5也可以代表氫或者可以不存在；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，維生素D化合物是式(V)的化合物 其中X1和X2是H2或CH2，其中X1和X2不同時是CH2；A是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；A3是單鍵或雙鍵；R1和R2是氫、C1-C4烷基，其中R1和R2不都是氫；R5是H2或氧，R5也可以代表氫或者可以不存在；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基。
以上的式(V)結(jié)構的實例是1，25-二羥基-16-烯-23-炔膽骨化醇。
在另一個實施方案中，維生素D化合物是式(VI)的“孿位(geminal)”化合物
其中X1是H2或CH2；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；R3是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；R4是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；C20的構型是R或S。
由于在C20上存在兩個烷基鏈，這種類型的化合物可以被稱為“孿位”或“偕”維生素D3化合物。
式(VI)的孿位化合物的實例是1，25-二羥基-21-(3-羥基-3-甲基丁基)-19-降(nor)-膽骨化醇，下文稱之為“化合物I” “化合物I”在WO98/49138和US6,030,962中描述了化合物I的合成，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖肌?br> 在另一個實施方案中，維生素D化合物是式(VII)的化合物 其中A是單鍵或雙鍵；R1和R2各自獨立地是氫、烷基(例如甲基)；R3和R4各自獨立地是烷基；X是羥基或氟。
在另一個實施方案中，維生素D化合物是式(VIII)的化合物 其中R1和R2各自獨立地是氫或者烷基，例如甲基；R3是烷基，例如甲基；R4是烷基，例如甲基；且X是羥基或氟。
在本發(fā)明的特定的實施方案中，維生素D化合物選自下組
在本發(fā)明的其它特定的實施方案中，維生素D化合物選自下組
在本發(fā)明的另外的特定的實施方案中，維生素D化合物選自下組的孿位化合物
在本發(fā)明的另外的特定的實施方案中，維生素D化合物是式(IX)的化合物 其中
X1是H2或CH2；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；R1、R2、R3和R4各自獨立地是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；Z是-OH，Z也可以是＝O、-NH2或-SH；且C20的構型是R或S，及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
在進一步的實施方案中，X1是CH2。在另一個實施方案中，A2是單鍵。在另一個實施方案中，R1、R2、R3和R4各自獨立地是甲基或乙基。在進一步的實施方案中，Z是-OH。在另一個實施方案中，X1是CH2；A2是單鍵；R1、R2、R3和R4各自獨立地是甲基或乙基；且Z是-OH。在更進一步的實施方案中，R1、R2、R3和R4各自是甲基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，維生素D化合物是下式的孿位化合物 上述化合物2和3的化學名稱分別是1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇和1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇。
孿位化合物的另外的實施方案包括用于本發(fā)明的下列維生素D化合物
(1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-20S-21-(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-20S-21-(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇)， (1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-19-降-20S-膽骨化醇)和 (1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-20S-膽骨化醇)。
在本發(fā)明的另外的實施方案中，維生素D化合物是式(X)的化合物 其中X1和X1各自獨立地是H2或＝CH2，條件是X1和X1不都是＝CH2；R1和R2各自獨立地是羥基、OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OC(O)氟代烷基；R3和R4各自獨立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R5和R6各自獨立地是C1-C4烷基；及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
適合地，R3和R4各自獨立地是氫、C1-C4烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基。
在一組化合物實例中，R5和R6各自獨立地是C1-C4烷基。
在另一組化合物實例中，R5和R6各自獨立地是鹵代烷基，例如C1-C4氟代烷基。
當R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基時，實例是環(huán)丙基。
在一個實施方案中，X1和X1各自是H2。在另一個實施方案中，R3是氫，R4是C1-C4烷基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R4是甲基。
在另一個實施方案中，R5和R6各自獨立地是甲基、乙基、氟甲基或三氟甲基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R5和R6各自是甲基。
在另一個實施方案中，R1和R1各自獨立地是羥基或OC(O)C1-C4烷基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R1和R1各自是OC(O)C1-C4烷基。在另一個優(yōu)選的實施方案中，R1和R1各自是乙酰氧基。
這類化合物的一個實例是1，3-O-二乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-24-酮基-19-降-膽骨化醇，其具有下列結(jié)構 在本發(fā)明的另一個實施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是2-亞甲基-19-降-20(S)-1-α，25-羥基維生素D3
在WO02/05823和US5,536,713中描述了這種化合物和相關化合物的合成，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖肌?br> 在本發(fā)明的另一個實施方案中，維生素D化合物是式(XII)的化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨立地是OC(O)C1-C4烷基(例如OAc)、OC(O)羥基烷基、OROC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨立地是C1-4烷基或鹵代烷基；R8是H、-COC1-C4烷基(例如Ac)、-CO羥基烷基或-CO鹵代烷基；
及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
當R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基時，實例是環(huán)丙基。
適合地，R6和R7各自獨立地是鹵代烷基。適合地，R8可以代表H或Ac。
在一個實施方案中，A1是單鍵，A2是單鍵，E或Z雙鍵或叁鍵。在另一個實施方案中，A1是雙鍵，A2是單鍵，E或Z雙鍵或叁鍵。本領域普通技術人員將容易認識到，當A2是叁鍵時，R5不存在。
在一個實施方案中，X1和X2各自是H。在另一個實施方案中，X1是CH2，X2是H2。在另一個實施方案中，R3是氫，R4是C1-C4烷基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R4是甲基。
在另一組化合物實例中，R1和R2都代表Oac。
在一組化合物實例中，R6和R7各自獨立地是C1-4烷基。在另一組化合物實例中，R6和R7各自獨立地是鹵代烷基。在另一個實施方案中，R6和R7各自獨立地是甲基、乙基或氟代烷基。在一個優(yōu)選的實施方案中，R6和R8各自是三氟烷基，例如三氟甲基。
適合地，R5代表氫。
因此，在某些實施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物如式(XII)所示 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；
X1和X2各自獨立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨立地是鹵代烷基；R8是H、C(O)C1-C4烷基、C(O)羥基烷基或C(O)鹵代烷基；及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
在本發(fā)明的背景中特別優(yōu)選的上述式(XII)化合物的一個實例是1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(“化合物A”) “化合物A”。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，化合物是式(XIII)的化合物，其中R1和R2各自是OAc；A1是雙鍵；A2是叁鍵；R8是H或Ac 在上列式(XII)的某些實施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XIV)所示的化合物
上述式(XIV)化合物的其它實例包括1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇；1，3-二O-乙酰基-1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R-26-三氟-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇(“化合物C”)；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高(homo)-19-降-膽骨化醇。
在上列式(XII)的某些其它實施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XV)所示的化合物
上述式(XV)化合物的其它實例包括1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇；1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇；1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(“化合物F”)；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇；1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇。
優(yōu)選的式XV化合物是1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(“化合物E”) 化合物E。
在進一步的實施方案中，用于本發(fā)明的維生素D化合物是式(XVI)的化合物 其中X是H2或CH2；R1是氫、羥基或氟；R2是氫或甲基；R3是氫或甲基；當R2或R3是甲基時，R3或R2必須是氫；R4是甲基、乙基或三氟甲基；R5是甲基、乙基或三氟甲基；A是單鍵或雙鍵；B是單鍵、E-雙鍵、Z-雙鍵或叁鍵。
在優(yōu)選的實施方案中，R4和R5各自是甲基或乙基，例如1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇(在實施例中稱為“化合物B”)，其具有下式 “化合物B”。
在US5,939,408和EP808833中描述了這類化合物，將它們?nèi)囊氡疚淖鳛閰⒖肌１景l(fā)明也涵蓋化合物B的酯和鹽的用途。酯包括可以在體內(nèi)水解從而釋放出化合物B的藥學上可接受的不穩(wěn)定酯?；衔顱的鹽包括可以與堿金屬和堿土金屬離子和金屬離子鹽例如鈉、鉀和鈣離子及其鹽例如氯化鈣、丙二酸鈣等形成的加合物和絡合物。然而，盡管化合物B可以以其藥學上可接受的鹽或酯的形式施用，但是優(yōu)選地采用化合物B本身，即，不采用其酯或鹽。
其它優(yōu)選的用于本發(fā)明的維生素D化合物包括具有式(XVII)的那些 其中B是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨立地是H2或CH2，條件是X1和X2不都是CH2；R4和R5各自獨立地是烷基或鹵代烷基。
式(XVII)的化合物包括以下化合物1，25-二羥基-16-烯-23-炔-20-環(huán)丙基-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇
1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23E-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇
1，25-二羥基-16，23E-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氟-膽骨化醇
1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇 1，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(“化合物H”) 本發(fā)明的另一種維生素D化合物是1，25-二羥基-21(3-羥基-3-三氟甲基-4-三氟-丁炔基)-26，27-六氘-19-降-20S-膽骨化醇。
具有上文所給出的結(jié)構的化合物的用途延及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
特別值得關注的維生素D化合物是骨化三醇。
用于本發(fā)明的為維生素D受體激動劑的其它化合物實例包括帕立骨化醇(ZEMPLARTM)(參見美國專利5,587,497)、他卡西妥(BONALFATM)(參見美國專利4,022,891)、度骨化醇(HECTOROLTM)(參見Lam等人.(1974)Science186，1038)、馬沙骨化醇(OXAROLTM)(參見美國專利4,891,364)、鈣泊三醇(DAIVONEXTM)(參見美國專利4,866,048)和氟骨三醇(FULSTANTM)。
其它化合物包括ecalcidene、calcithiazol和tisocalcitate。
其它化合物包括atocalcitol、來沙骨化醇和西奧骨化醇。
另一種可能相關的化合物是司骨化醇(“OSTEO D”)。
可以用于本發(fā)明的其它維生素D化合物的非限制性實例包括在下列已公布的國際申請中描述的那些WO01/40177，WO0010548，WO0061776，WO0064869，WO0064870，WO0066548，WO0104089，WO0116099，WO0130751，WO0140177，WO0151464，WO0156982，WO0162723，WO0174765，WO0174766，WO0179166，WO0190061，WO0192221，WO0196293，WO02066424，WO0212182，WO0214268，WO03004036，WO03027065，WO03055854，WO03088977，WO04037781，WO04067504，WO8000339，WO8500819，WO8505622，WO8602078，WO8604333，WO8700834，WO8910351，WO9009991，WO9009992，WO9010620，WO9100271，WO9100855，WO9109841，WO9112239，WO9112240，WO9115475，WO9203414，WO9309093，WO9319044，WO9401398，WO9407851，WO9407852，WO9408958，WO9410139，WO9414766，WO9502577，WO9503273，WO9512575，WO9527697，WO9616035，WO9616036，WO9622973，WO9711053，WO9720811，WO9737972，WO9746522，WO9818759，WO9824762，WO9828266，WO9841500，WO9841501，WO9849138，WO9851663，WO9851664，WO9851678，WO9903829，WO9912894，WO9915499，WO9918070，WO9943645，WO9952863，在下列美國專利中描述的那些US3856780，US3994878，US4021423，US4026882，US4028349，US4225525，US4613594，US4804502，US4898855，US5039671，US5087619，US5145846，US5247123，US5342833，US5428029，US5451574，US5612328，US5747479，US5804574，US5811414，US5856317，US5872113，US5888994，US5939408，US5962707，US5981780，US6017908，US6030962，US6040461，US6100294，US6121312，US6329538，US6331642，US6392071，US6452028，US6479538，US6492353，US6537981，US6544969，US6559138，US6667298，US6683219，US6696431，US6774251，和在下列已公布的美國專利申請中描述的那些US2001007907，US2003083319，US2003125309，US2003130241，US2003171605，US2004167105。
應當注意的是，一些本發(fā)明的化合物的結(jié)構包括不對稱的碳原子。因此，不言而喻的是，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括從這類不對稱性產(chǎn)生的異構體(例如所有對映體和非對映體)，另有說明者除外。通過經(jīng)典的分離技術和/或通過立體化學控制的合成可以得到基本上純形式的這類異構體。
天然存在的或合成的異構體可以用本領域已知的多種方式加以分離。分離兩種對映體的外消旋混合物的方法包括采用手性固定相的色譜法(例如參見″Chiral Liquid Chromatography，″W.J.Lough編輯.Chapman andHall，New York(1989))。也可以通過經(jīng)典的拆分技術分離對映體。例如，可以利用非對映體鹽的生成和分步結(jié)晶來分離對映體。對于羧酸對映體的分離，可以通過加入對映體純的手性堿例如番木鱉堿、奎寧、麻黃堿、馬錢子堿等生成非對映體鹽。或者，可以與對映體純的手性醇例如薄荷醇生成非對映體酯，然后分離非對映體酯并水解，得到游離的對映體富集的羧酸。對于氨基化合物旋光異構體的分離，加入手性羧酸或磺酸例如樟腦磺酸、酒石酸、扁桃酸或乳酸可以導致非對映體鹽的生成。
本發(fā)明也提供了藥物組合物，其包含有效量的本文所述的維生素D化合物和藥學上可接受的載體。在進一步的實施方案中，有效量是有效治療間質(zhì)性膀胱炎的量，如前文所述。
在一個實施方案中，使用藥學上可接受的制劑將維生素D化合物施用于受試者，例如在施用于受試者后將維生素D化合物持續(xù)遞送至受試者達至少12小時、24小時、36小時、48小時、一周、兩周、三周或四周的藥學上可接受的制劑。
在某些實施方案中，這些藥物組合物適合于局部或口服施用于受試者。在其它實施方案中，正如下文所詳細描述的，本發(fā)明的藥物組合物可以被特殊配制成以固體或液體形式施用，包括適應于以下施用途徑的那些(1)口服施用，例如頓服劑(drench)(水性或非水性的溶液或混懸液)、片劑、大丸劑(bolus)、散劑、顆粒劑、糊劑；(2)腸胃外施用，例如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，例如無菌的溶液或混懸液；(3)局部應用，例如應用于皮膚的乳膏劑、軟膏劑或噴霧劑；(4)陰道內(nèi)或直腸內(nèi)，例如陰道栓、乳膏劑或泡沫劑；或者(5)氣霧劑，例如水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或含有化合物的固體顆粒。
措辭“藥學上可接受的”表示在合理的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)適合于與人類和動物的組織接觸使用、沒有過度的毒性、刺激作用、變態(tài)反應或者其它問題或并發(fā)癥、與合理的利益/風險比相稱的那些本發(fā)明的維生素D化合物、含有這類化合物的組合物和/或劑型。
措辭“藥學上可接受的載體”包括藥學上可接受的材料、組合物或媒介物，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，它們參與將主題化學物質(zhì)從機體的一個器官或一個部分攜帶或運輸?shù)綑C體的另一個器官或另一個部分。每種載體必須是“可接受的”，意義是與制劑其它成分相容并對患者無害。能夠用作藥學上可接受的載體的一些物質(zhì)的實例包括(1)糖類，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉末狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油類，例如花生油、棉子油、葵花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯類，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；和(21)藥物制劑中采用的其它無毒的相容性物質(zhì)。
在組合物中也可以存在濕潤劑、乳化劑和潤滑劑，例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑與芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。
藥學上可接受的抗氧化劑的實例包括(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁羥甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
含有維生素D化合物的組合物包括適合于口服、鼻、局部(包括口腔和舌下)、直腸、陰道、氣霧劑和/或腸胃外施用的那些。組合物可以適宜地為單元劑型，并且可以通過藥學領域眾所周知的任意方法加以制備?？梢耘c載體物質(zhì)組合形成單一劑型的活性成分的量將因所治療的主體、特定的施用方式而異?？梢耘c載體物質(zhì)組合形成單一劑型的活性成分的量一般是該化合物產(chǎn)生治療效果的量。一般而言，以百分之一百計，該量將是約1％至約99％的活性成分，優(yōu)選約5％至約70％，最優(yōu)選約10％至約30％。
制備這些組合物的方法包括使維生素D化合物與載體和任選地一種或多種輔助成分聯(lián)合在一起的步驟。一般而言，制劑通過以下方法制備將維生素D化合物與液體載體或微細粉碎的固體載體或此二者均勻且緊密地聯(lián)合在一起，然后如果必要，使產(chǎn)物成形。
適合于口服施用的本發(fā)明的組合物可以是膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用矯味基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑的形式，或者是在水性或非水性液體中的溶液或混懸液形式，或者是水包油型或油包水型乳劑的形式，或者是酏劑或糖漿劑的形式，或者是軟錠劑(pastille)(使用惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等形式，它們各自含有預定量的維生素D化合物作為活性成分?；衔镆部梢砸源笸鑴⑺幪莿?electuary)或糊劑的形式施用。
在用于口服施用的本發(fā)明的固體劑型(膠囊劑、片劑、丸劑、糖衣丸、散劑、顆粒劑等)中，活性成分與一種或多種藥學上可接受的載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，和/或任意下列成分(1)填充劑或增量劑(extender)，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶解阻滯劑(solution retardingagent)，例如石蠟；(6)吸收加速劑(absorption accelerator)，例如季銨化合物；(7)濕潤劑，例如acetyl alcohol和甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和其混合物；和(10)著色劑。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。也可以采用相似類型的固體組合物作為軟與硬填充明膠膠囊劑中的填充劑，使用賦形劑例如乳糖或奶糖(milk sugars)，以及高分子聚乙二醇等。
片劑可以通過壓制或模制法制備，任選地含有一種或多種輔助成分。壓制片可以使用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉羥乙酸鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑加以制備。模制片可以通過在適合的機器中模制用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末狀活性成分混合物來制備。
本發(fā)明的藥物組合物的片劑和其它固體劑型例如糖衣丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可以任選地具有刻痕或者具有包衣和外殼，例如腸溶衣和藥物制劑領域中眾所周知的其它包衣。也可以使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素(以提供所需的釋放性質(zhì))、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球?qū)λ鼈冞M行配制以提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。它們可以被滅菌，方法是例如通過截留細菌的濾器進行過濾，或者在使用前以無菌固體組合物的形式摻入可溶于無菌水或一些其它無菌可注射溶媒中的滅菌劑。這些組合物還可以任選地含有遮光劑，并且可以是任選地以延遲方式僅僅在胃腸道的某一部分或者優(yōu)先在胃腸道的某一部分釋放活性成分的組合物?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物質(zhì)和蠟類?；钚猿煞忠部梢允俏⒛野獾男问?，如果適當，還有一種或多種上述賦形劑。
維生素D化合物的用于口服施用的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、微乳、溶液、混懸液、糖漿劑和酏劑。除了活性成分以外，液體劑型可以含有本領域常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油類(特別是棉子油、花生油、玉米油、胚油(germ oil)、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇(tetrahydrofuryl alcohol)、聚乙二醇和脫水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。
除了惰性稀釋劑以外，口服組合物還可以包括輔劑，例如濕潤劑、乳化和助懸劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、芳香劑和防腐劑。
除了具有活性的維生素D化合物以外，混懸液還可以含有助懸劑，例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁(aluminum metahydroxide)、膨潤土、瓊脂和西黃蓍膠及其混合物。
用于直腸或陰道施用的本發(fā)明的藥物組合物可以是栓劑的形式，它可以通過將一種或多種維生素D化合物與一種或多種適合的無刺激性的賦形劑或載體(例如包含可可脂、聚乙二醇、栓劑用蠟或水楊酸鹽的賦形劑或載體混合)來制備，其在室溫下是固體，但是在體溫下是液體，因此將在直腸或陰道腔中融化，并釋放出活性成分。
適合于陰道施用的本發(fā)明的組合物也包括陰道栓、衛(wèi)生栓(tampon)、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，它們含有本領域已知的適用的載體。
用于局部或透皮施用維生素D化合物的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑。可以將活性維生素D化合物在無菌條件下與藥學上可接受的載體和可能需要的任意防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。
除了本發(fā)明的維生素D化合物以外，軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑還可以含有賦形劑，例如動物與植物脂肪、油類、蠟類、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石粉和氧化鋅或其混合物。
除了維生素D化合物以外，散劑和噴霧劑還可以含有賦形劑，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣和聚酰胺粉末，或者這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑可以另外含有常用的拋射劑，例如氯氟烴或，和揮發(fā)性的未取代的烴，例如丁烷和丙烷。
作為替代選擇，維生素D化合物可以通過氣霧劑施用。這是通過制備含有該化合物的水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或固體顆粒來實現(xiàn)的。也可能使用非水性(例如碳氟化合物拋射劑)混懸液。聲波噴霧器是優(yōu)選的，因為它們使藥物暴露于剪切最小化，而剪切能夠?qū)е禄衔锏慕到狻?br> 通常，水性氣霧劑是通過配制藥物與常規(guī)藥學上可接受的載體和穩(wěn)定劑的水性溶液或混懸液來制備的。載體和穩(wěn)定劑因特定化合物的需要而異，但是通常包括非離子表面活性劑(吐溫(Tween)、普流羅尼(Pluronic)或聚乙二醇)、無害的蛋白質(zhì)如血清白蛋白、脫水山梨醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、緩沖劑、鹽、糖或糖醇。氣霧劑一般是由等滲溶液制備的。
透皮貼劑具有向機體提供維生素D化合物的控制遞送的附加優(yōu)點。這類劑型可以通過將藥物溶解或分散在恰當?shù)慕橘|(zhì)中來制備。也可以使用吸收促進劑，以增加活性成分跨越皮膚的通量。通過提供速率控制膜或者將活性成分分散在聚合物基質(zhì)或凝膠中可以控制這類通量的速率。
適合于腸胃外施用的本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種維生素D化合物以及一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水性或非水性溶液、分散物、混懸液或乳液或者無菌粉末，所述粉末可以在使用前即刻被重構為無菌可注射的溶液或分散物，它們可以含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與預期接受者的血液等滲的溶質(zhì)或者助懸劑或增稠劑。
在本發(fā)明的藥物組合物中可以采用的適合的水性與非水性載體的實例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其適合的混合物、植物油例如橄欖油和可注射的有機酯例如油酸乙酯。恰當?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^利用包衣材料例如卵磷脂、在分散物的情況下通過維持所需的粒徑以及通過利用表面活性劑來維持。
這些組合物也可以含有輔劑，例如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。通過包含各種抗細菌和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以確保防止微生物的作用。也可能需要在組合物中包括等滲劑(isotonic agent)例如糖、氯化鈉等。另外，通過包含延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁和明膠可以實現(xiàn)可注射藥物形式的延遲吸收。
在一些情況下，為了延長藥物的作用，需要延緩藥物從皮下或肌內(nèi)注射劑中的吸收。利用水溶性差的結(jié)晶性或無定形材料的液體混懸液可以實現(xiàn)這一點。因此藥物的吸收速率依賴于它的溶解速率，后者則可以依賴于晶體大小和結(jié)晶形式?；蛘?，通過將藥物溶解或混懸在油性媒介物中實現(xiàn)腸胃外施用的藥物形式的延遲吸收。
可注射的貯庫形式是通過在生物可降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成維生素D化合物的微囊基質(zhì)來制備的。根據(jù)藥物與聚合物的比例和所采用的特定聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速率。其它生物可降解的聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。貯庫型可注射制劑也通過將藥物包埋在與機體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來制備。
當維生素D化合物作為藥物被施用于人和動物時，它們可以以其本身或者作為藥物組合物被給予，所述組合物含有例如0.1至99.5％(更優(yōu)選0.5至90％)的活性成分以及藥學上可接受的載體。
無論所選擇的施用途徑如何，通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法將本發(fā)明的維生素D化合物(其可以使用適合的水合形式)和/或藥物組合物配制成藥學上可接受的劑型。
可以改變活性成分在本發(fā)明的藥物組合物中的實際劑量水平和施用時間，以獲得就特定患者、組合物和施用方式而言有效達到所需治療響應、對患者沒有毒性的活性成分量。舉例性的劑量范圍是0.1至300μg/天。
本發(fā)明維生素D化合物的優(yōu)選劑量是患者能夠耐受并且不形成高血鈣的最大值。優(yōu)選地，以下列濃度施用本發(fā)明的維生素D化合物約0.001μg至約100μg/千克體重，約0.001-約10μg/kg或約0.001μg-約100μg/kg體重。剛才引用的數(shù)值范圍也旨在構成本發(fā)明的一部分。
維生素D化合物可以與第二種治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物在獨立的或組合的藥物制劑中分別、相繼或同時施用。
本發(fā)明化合物的合成大量本發(fā)明的化合物可以這樣制備，在細胞中溫育維生素D3類似物，例如，在UMR106細胞或Ros17/2.8細胞中溫育維生素D3類似物，導致本發(fā)明維生素D3化合物的生成。例如，在UMR106細胞中溫育1，25-二羥基-16-烯-5，6-反式-骨化三醇，導致生成1，25-二羥基-16-烯-24-氧代-5，6-反式-骨化三醇。
除了本文所述的方法以外，本發(fā)明的化合物可以利用多種合成方法加以制備。例如，本領域技術人員將能夠利用合成現(xiàn)有維生素D3化合物的方法來制備本發(fā)明的化合物(例如參見Bouillon，R.等人.，(1995)EndocrineReviews16(2)201-204；Ikekawa N.(1987)Med.Res.Rev.7333-366；DeLuca H.F.和Ostrem V.K.(1988)Prog.Clin.Biol.Res.25941-55；Ikekawa N.和Ishizuka S.(1992)CRC Press 8293-316；Calverley M.J.和Jones G.(1992)Academic Press193-270；Pardo R.和Santelli M.(1985)Bull.Soc.Chim.Fr98-114；Bythgoe B.(1980)Chem.Soc.Rev.449-475；Quinkert G.(1985)Synform 341-122；Quinkert G.(1986)Synform4131-256；Quinkert G.(1987)Synform 51-85；Mathieu C.等人.(1994)Diabetologia 37552-558；Dai H.和Posner G.H.(1994)Synthesis 1383-1398；DeLuca等人，WO97/11053)。
舉例性的合成方法包括7-脫氫膽固醇的1-羥基化側(cè)鏈修飾衍生物的光化學開環(huán)，該方法首先生成前維生素，前維生素容易以眾所周知的方式熱解為維生素D3(Barton D.H.R.等人.(1973)J.Am.Chem.Soc.952748-2749；Barton D.H.R.(1974)JCS Chem.Comm.203-204)；(Lythgoe等人(1978)JCS Perkin Trans.1590-595)開發(fā)的氧化膦偶聯(lián)法，其包括偶聯(lián)氧化膦與Grundmman酮衍生物，直接生成1-α，25(OH)2D3骨架，如Baggiolini E.G.，等人.(1986)J.Org.Chem.513098-3108；DeSchrijver J.和DeClercq P.J.(1993)Tetrahed Lett344369-4372；Posner G.H和KinterC.M.(1990)J.Org.Chem.553967-3969所述；二烯炔(dienzyne)經(jīng)半氫化作用生成前維生素結(jié)構，前維生素結(jié)構發(fā)生重排，生成相應的維生素D3類似物，如Harrison R.G.等人.(1974)JCS Perkin Trans.12654-2657；Castedo L.等人.(1988)Tetrahed Lett291203-1206；Mascarenas J.S.(1991)Tetrahedron473485-3498；Barrack S.A.等人.(1988)J.Org.Chem.531790-1796)和Okamura W.H.等人.(1989)J.Org.Chem.544072-4083所述；乙烯基丙二烯法，該方法牽涉這樣的中間體，它們隨后利用加熱或者金屬催化異構化、繼之以敏化光異構化的組合進行排列(Okamura W.H.等人.(1989)J.Org.Chem.544072-4083；Van Alstyne E.M.等人.(1994) J.Am.Chem.Soc.1166207-6210)；Trost等人.B.M.等人.J.Am.Chem.Soc.1149836-9845；Nagasawa K.等人.(1991)Tetrahed Lett 324937-4940所述的方法，該方法牽涉無環(huán)的A-環(huán)前體，它與溴代烯炔發(fā)生分子內(nèi)交叉偶聯(lián)，直接導致1，25(OH)2D3骨架的形成；甲苯磺酰化衍生物，其被異構化為i-甾類，i-甾類能夠在碳-1被修飾，隨后在溶劑解條件下反異構化，形成1-α，25(OH)2D2或其類似物(Sheves M.和Mazur Y.(1974)J.Am.Chem.Soc.976249-6250；Paaren H.E.等人.(1980)J.Org.Chem.453253-3258；KabatM.等人.(1991)Tetrahed Lett 322343-2346；Wilson S.R.等人.(1991)Tetrahed Lett 322339-2342)；維生素D衍生物直接修飾為1-氧合5，6-反式維生素D，如Andrews D.R.等人.(1986)J.Org.Chem.511635-1637所述；經(jīng)由熱異構化通過前維生素形式的中間作用可以用前維生素D3的Diels-Alders環(huán)加成法環(huán)恢復(cyclorevert)為1-α，25(OH)2D2(Vanmaele L.等人.(1985)Tetrahedron 41141-144)；最后一種方法需要通過使用適合的保護基團例如過渡金屬衍生物或者通過其它化學轉(zhuǎn)化作用直接修飾1-α，25(OH)2D2或類似物(Okarmura W.H.等人.(1992)J.Cell Biochem.4910-18)。用于合成維生素D2化合物的另外的方法例如如日本專利公報No.62750/73、26858/76、26859/76和71456/77；美國專利No.3,639,596、3,715,374、3,847,955和3,739,001中所述。
具有飽和側(cè)鏈的本發(fā)明的化合物的實例可以按照美國專利No.4,927,815所闡述和描述的一般過程加以制備。具有不飽和側(cè)鏈的本發(fā)明的化合物的實例可以按照美國專利No.4,847,012所闡述和描述的一般過程加以制備。其中R基團一起代表環(huán)烷基的本發(fā)明的化合物的實例可以按照美國專利No.4,851,401所闡述和描述的一般過程加以制備。
在Kutner等人，The Journal of Organic Chemistry，1988，533450-3457中公開了另一種制備1-α，25-二羥基麥角骨化醇的側(cè)鏈修飾類似物的合成策略。另外，在美國專利No.4,717,721中公開了24-高與26-高維生素D類似物的制備。
手性分子的對映選擇性合成是本領域的已知技術。通過對映選擇性合成與純化技術的組合，可以合成很多手性分子的對映體富集制備物。例如，已經(jīng)報道了1-α，25(OH)2D3的A-環(huán)非對映體的對映選擇性合成的方法，如Muralidharan等人.(1993)J.Organic Chem.58(7)1895-1899和Norman等人.(1993)J.Biol.Chem.268(27)20022-30所述。本領域已知的各種化合物的其它對映體合成方法尤其包括環(huán)氧化物(例如參見Johnson，R.A.；Sharlpess，K.B.Catalytic Asymmetric Synthesis；Ojima，I.編輯VCHNewYork，1993；第4.1章.Jacobsen，E.N.Ibid.第4.2章)、二醇(例如Sharpless，J.Org.Chem.(1992)572768的方法)和醇(例如酮的還原，E.J.Corey等人.，J.Am.Chem.Soc.(1987)1095551)。其它可用于生成光學富集產(chǎn)物的反應包括烯烴的氫化(例如M.Kitamura等人.，J.Org.Chem.(1988)53708)、Diels-Alder反應(例如K.Narasaka等人.，J.Am.Chem.Soc.(1989)1115340)、羥醛反應和烯醇化物的烷基化(例如參見D.A.Evans等人.，J.Am.Chem.Soc.(1981)1032127；D.A.Evans等人.，J.Am.Chem.Soc.(1982)1041737)、羰基加成(例如R.Noyori，Angew.Chem.Int.Ed.Eng.(1991)3049)和內(nèi)消旋(meso)環(huán)氧化物的開環(huán)(例如Martinez，L.E.；Leighton J.L.，Carsten，D.H.；Jacobsen，E.N.J.Am.Chem.Soc.(1995)1175897-5898)。利用酶產(chǎn)生光學富集產(chǎn)物也是本領域所眾所周知的(例如M.P.Scheider編輯″Enzymes as Catalysts in Organic Synthesis″，D.Reidel，Dordrecht(1986))。
手性合成能夠?qū)е赂吡Ⅲw異構體純度的產(chǎn)物。然而，在一些情況下，產(chǎn)物的立體異構體純度不是足夠高的。技術人員將認識到，可以利用本文所述的分離方法進一步提高通過手性合成所獲得的維生素D3-差向異構體的立體異構體純度。
式(XVIII)的化合物 其中X1和X1各自獨立地是H2或＝CH2，條件是X1和X1不都是＝CH2；R1和R2各自獨立地是羥基、OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OC(O)氟代烷基，條件是R1和R2不都是羥基；R3和R4各自獨立地是氫、C1-C4烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R5和R6各自獨立地是C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，例如氟代烷基，例如氟甲基和三氟甲基；及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物，可以通過本節(jié)和化學文獻中所述的方法加以合成。具體而言，本發(fā)明的式(XVIII)化合物可以如以下流程

圖1所示進行制備。因此，式(XVIII)化合物是通過以下方法制備的用正丁基鋰作為堿，在四氫呋喃中偶聯(lián)式(XIX)化合物與式(XX)化合物，得到式(XXI)化合物。隨后除去保護性硅烷基(R1＝OSi(CH3)2t.Bu)，得到式(XVIII)的1，3-二羥基維生素D3化合物(R1＝OH，R2＝OH)。1和/或3位的?；抢帽绢I域眾所周知的方法實現(xiàn)的。例如，式IV的1，3-二乙酰氧基化合物(R1＝R2＝OAc)的制備需要用乙酸酐和吡啶進行另外的乙酰化，如流程圖2所示和下天所述。
關于流程圖1，式(XX)的化合物是已知化合物，是從已知的式(XXII)的環(huán)氧-酮開始制備的。通過Wittig反應將式(XXII)的化合物轉(zhuǎn)化為式(XXIII)的環(huán)氧-烯烴。用LiAlH4還原為化合物(XXIV)并保護羥基，得到化合物(XXV)。然后，在路易斯酸(CH3)2AlCl的存在下在四氫呋喃中使式(XXV)的烯與已知的羥基-綴合的酮(XXVI)(R5＝R6＝CH3)反應，得到化合物(XXVII)，其具有目標維生素D類似物的C，D-環(huán)和完整側(cè)鏈。最后，除去硅烷基并氧化，得到關鍵中間體式(XX)的酮。
流程圖1 流程圖2顯示了化合物(XX)與硅烷基化的氧化膦在Wittig偶聯(lián)條件下的偶聯(lián)。除去硅烷基保護基團，得到式(XVIII)的二醇，其中R1和R2都是羥基。
流程圖2 其中X1、X2、R3、R4、R5和R6如上文所定義。
流程圖3顯示了式(P)的維生素D3衍生物的乙?；饔茫墒?Q)的乙酸酯。
流程圖3 1，25-二羥基-16-烯-24-酮基-19-降- 1，3-O-二乙酰基-1，25-二羥基-16-膽骨化醇 烯-24-酮基-19-降-膽骨化醇(P) (Q)
下式的維生素D3化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨立地是H或＝CH2；R1和R2各自獨立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OROC(O)鹵代烷基；R3、R4和R5各自獨立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨立地是鹵代烷基；R8是H或OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基或OROC(O)鹵代烷基；及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物，可以類似于1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(1)(以下實施例中的“化合物A”)的合成加以制備，其在標準的二醇的乙?；瘲l件下進行，得到相應的二乙酸酯
現(xiàn)在將參照以下的非限制性實施例描述本發(fā)明；關于附圖，其中圖1顯示了在用維生素D3類似物“化合物A”處理的大鼠和對照(媒介物處理的)大鼠中記錄到的膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)之間的比較。
圖2顯示了維生素D3類似物化合物A(A-E)與媒介物(miglyol)(F-L)對大鼠膀胱炎癥的組織學跡象的作用的比較?？紤]了五種不同的參數(shù)止血(A，F(xiàn))、水腫(B，G)、浸潤(C，H)、纖維化(D，I)、膀胱上皮損傷(E，L)。箭頭和棒條指示了媒介物處理的動物與化合物A處理的大鼠中存在的炎癥跡象的比較。U＝膀胱上皮。
圖3顯示了總結(jié)每組4只大鼠的每種炎癥跡象的組織學分數(shù)的直方圖。考慮了不同的炎性參數(shù)止血、水腫、炎性細胞浸潤(主要是淋巴細胞和單核細胞)、上皮糜爛、纖維化，如實施例2所述對這些參數(shù)進行評分。用組織學分數(shù)的平均值±標準偏差進行繪圖。
圖4顯示了實施例5的受試者所發(fā)生的非排尿性(non-voiding)膀胱收縮的次數(shù)。顯示了每個處理組(媒介物對照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的平均收縮次數(shù)，誤差棒表示標準偏差。
圖5顯示了實施例5的受試者的膀胱容量。顯示了每個處理組(媒介物對照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的平均膀胱容量(ml)，誤差棒表示標準偏差。
圖6顯示了實施例5的受試者的血清鈣水平。顯示了各處理組(媒介物對照、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B)的每個受試者的血清中的鈣水平(mg/dL)，每個組中的平均水平周水平線表示。
圖7闡述了實施例6的實驗時間表。
圖8顯示了在實施例6的受試者的血清中檢測到的IgE蛋白總量。顯示了每個組(攻擊前、媒介物處理的對照、75μg/kg化合物B處理的組)的平均IgE總量(μg/ml)，誤差棒表示標準偏差。
圖9顯示了在實施例6的受試者的血清中檢測到的卵清蛋白特異性IgE蛋白的量。顯示了每個組(攻擊前、媒介物處理的對照、75μg/kg化合物B處理的組)的血清中的特異性IgE蛋白的平均量(OD450)，誤差棒表示標準偏差。
圖10顯示了實施例6的受試者的血清MMCP1蛋白水平。顯示了每個組(攻擊前、媒介物處理的對照、75μg/kg化合物B處理的組)的血清MMCP1蛋白的平均水平(μg/ml)，誤差棒表示標準偏差。該數(shù)據(jù)被得自每個受試者的個體數(shù)值所覆蓋。
圖11顯示了實施例6的受試者的血清鈣水平。顯示了各處理組(媒介物對照和75μg/kg化合物B)中每個受試者的血清中的鈣水平(mg/dL)，每個組的平均水平用水平線表示。延伸的水平虛線表示鈣毒性開始出現(xiàn)的水平。
圖12顯示了實施例6的受試者的體重變化。顯示了兩個處理組(媒介物對照和75μg/kg化合物B)在每天時間點的平均體重(g)，誤差棒表示標準偏差。
圖13顯示了實施例6的受試者中炎性標志基因IL-13、MCPT2和FcεR1α的mRNA表達水平。數(shù)據(jù)顯示了鹽水攻擊(媒介物處理)的和卵清蛋白攻擊(媒介物、30μg/kg化合物B和75μg/kg化合物B處理)的每種標志相對于管家基因的水平。
圖14顯示了實施例6的受試者中炎性標志基因IL-13、MMCP4和FcεR1α的mRNA表達水平。圖形顯示了卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物或75μg/kg化合物B)的每種標志相對于管家基因的水平。用來自受試者的各個數(shù)據(jù)點繪圖，水平線表示平均水平。
圖15顯示了對實施例6的受試者進行組織學分析(肥大細胞浸潤、水平、嗜酸性粒細胞和淋巴單核-漿細胞)的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個受試者的分數(shù)，每個處理組(媒介物或75μg/kg化合物B)的平均水平用水平線表示。
圖16顯示了媒介物和75μg/kg化合物B處理的動物的代表性膀胱切片(×50放大率)。組織學損傷用箭頭表示。
圖17顯示了實施例7的實驗結(jié)果的總結(jié)。
圖18顯示了實施例7的受試者中炎性標志基因FcεR1α的mRNA表達水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的FcεR1α相對于管家基因的水平。用來自受試者的各個數(shù)據(jù)點繪圖，水平線表示平均水平。
圖19顯示了實施例7的受試者中炎性標志基因IL-13的mRNA表達水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的IL-13相對于管家基因的水平。用來自受試者的各個數(shù)據(jù)點繪圖，水平線表示平均水平。
圖20顯示了實施例7的受試者中炎性標志基因MMCP4的mRNA表達水平。圖形顯示了鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的MMCP4相對于管家基因的水平。用來自受試者的各個數(shù)據(jù)點繪圖，水平線表示平均水平。
圖21顯示了實施例7的受試者的血清MMCP1蛋白水平。圖形顯示了攻擊前、鹽水攻擊的、未處理的和卵清蛋白攻擊的處理組(媒介物、化合物C至化合物I處理)的血清中的MMCP1蛋白水平(ng/ml)。用來自受試者的各個數(shù)據(jù)點繪圖，水平線表示平均水平。
圖22顯示了對實施例7的受試者進行的肥大細胞浸潤的組織學分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個受試者的分數(shù)，每個處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線表示。
圖23顯示了對實施例7的受試者進行的嗜酸性粒細胞的組織學分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個受試者的分數(shù)，每個處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線表示。
圖24顯示了對實施例7的受試者進行的LMPC的組織學分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個受試者的分數(shù)，每個處理組(媒介物、化合物C、化合物E、化合物F、化合物H或化合物I)的平均水平用水平線表示。
圖25顯示了對實施例7的受試者進行的水腫的組織學分析的結(jié)果。圖形顯示了分配給每個受試者的分數(shù)，每個處理組(媒介物、化合物C、化合物E或化合物F)的平均水平用水平線表示。
圖26顯示了實施例7的受試者的血清中的鈣濃度。顯示了各處理組(媒介物對照、化合物C至I)中每個受試者的血清鈣濃度(mg/dL)，每個組的平均水平用水平線表示。
合成實施例所有牽涉維生素D3類似物的操作都是在琥珀色玻璃器皿中、在氮氣氛中進行的。在使用前即刻從鈉-二苯酮羰游基中蒸餾出四氫呋喃，將溶質(zhì)的溶液用硫酸鈉干燥。熔點是在Thomas-Hoover毛細管儀上測定的，未經(jīng)校正。旋光度是在25℃下測量的。1H NMR光譜是在400MHz下、在CDCl3中記錄的，另有說明者除外。TLC是在硅膠板(Merck PF-254)上進行的，在短波長UV光下顯影或者向板噴以10％磷鉬酸的甲醇溶液，然后加熱?？焖偕V是在40-65μm目的硅膠上進行的。制備型HPLC是在5×50cm柱和15-30μm目的硅膠上進行的，流速100ml/min。
合成實施例1-1，3-二-O-乙?；?1，25-二-羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(1)(化合物A)的合成 原料1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇可以如Doran等人的美國專利5,428,029中所述來制備。將3mg 1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8ml吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2ml乙酸酐，在該溫度下維持16h。然后將反應混合物用1ml水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5ml水與20ml乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×5ml水洗滌，用5ml飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3ml鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，經(jīng)過快速色譜處理，使用1∶6、1∶4和1∶2乙酸乙酯-己烷逐步梯度洗脫。用TLC監(jiān)測柱色譜(1∶4乙酸乙酯-己烷，噴以磷鉬酸使斑點顯影)，合并適當?shù)募壏?，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，然后再次蒸發(fā)，得到23.8mg標題化合物(1)，為無色糖漿狀物；400MHz1H NMRδ0.66(3H，s)，0.90(1H，m)，1.06(3H，d，J＝7.2Hz)，1.51(1H，m)，1.72-1.82(3H，m)，1.9-2.1(3H，m)，1.99(3H，s)2.04(3H，s)，2.2-2.3(3 m)，2.44-2.64(6H，m)，2.78(1H，m)，3.01(1H，s)，5.10(2H，m).5.38(1H，m)，5.43(1H，d，J＝12Hz)，5.85(1H，d，J＝11.5Hz)，5.97(1H，dt，J＝12和7.3Hz)，6.25(1H，d，J＝11.5Hz).
合成實施例2-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(2)和1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(3)的合成 原料1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇可以如Baggiolini等人的美國專利5,451,574和5,612,328中所述來制備。將314mg(0.619mmol)1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于1.5ml吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.4ml乙酸酐。將反應混合物在室溫下保持7小時，然后在冰箱中保持23小時。然后用10ml水稀釋，用30ml乙酸乙酯萃取。將有機萃取液用水和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，蒸發(fā)。將殘余物在10×140mm柱上用快速色譜處理，以1∶6和1∶4乙酸乙酯-己烷作為流動相，得到126mg 1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(2)和248mg 1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(3)。
合成實施例3-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇(4)的合成
向10-mL圓底燒瓶裝入40mg 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-膽骨化醇。將該原料溶于1mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.3mL乙酸酐。將溶液攪拌30min，然后冷藏過夜，用水稀釋，借助10mL水和40mL乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。將有機層用4×20mL水和10mL通過硫酸鈉塞的鹽水洗滌，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級分1-5的流動相，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分6-13的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級分14-20的流動相(18mL級分)。級分14-19含有主要的帶，Rf0.15(TLC 1∶4)。合并這些級分，蒸發(fā)，得到無色油狀物0.044g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到無色粘性泡沫狀物，0.0414g標題化合物(4)。
合成實施例4-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇(5)的合成 將0.0468g 1，25-二羥基-16，23E-二烯-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后冷藏過夜，用10mL水稀釋，同時仍然浸在冰浴中，攪拌10min，借助10mL水和40mL乙酸乙酯轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。將有機層用4×20mL水和10mL通過硫酸鈉塞的鹽水洗滌，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級分1-3的流動相(20mL級分)，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分6-8的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級分9-17的流動相(18mL級分)。級分11-14含有主要的帶，Rf0.09(TLC 1∶4)。合并這些級分，蒸發(fā)，得到無色油狀物0.0153g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.014g標題化合物(5)。
合成實施例6-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇(6)的合成 將0.0774g 1，25-二羥基-16-烯-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.3mL乙酸酐。將溶液攪拌，冷藏過夜，然后用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌1h，用30mL乙酸乙酯和15mL水稀釋。將有機層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶9乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為級分1的流動相(20mL級分)，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分2-7的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級分8-13的流動相。級分9-11含有主要的帶，Rf 0.09(TLC 1∶4乙酸乙酯-己烷)。合并這些級分，蒸發(fā)，得到無色油狀物0.0354g。將該物質(zhì)用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)溶液，得到0.027g無色薄膜狀物，即標題化合物(6)。合成實施例7-1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(7)和1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(8)的合成
將0.0291g 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-六氟-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，然后加入0.25mL乙酸酐。將溶液攪拌20min，在冰箱中保存過夜。將冷溶液用15mL水稀釋，攪拌10min，用30mL乙酸乙酯稀釋。將有機層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為流動相。由級分2-3得到72.3461-72-3285＝0.0176g。蒸發(fā)級分6-7，得到0.0055g。將級分2-3的殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0107g標題三乙酸酯(7)。將級分6-7的殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0049g二乙酸酯(8)。
合成實施例8-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R，26-三氟-膽骨化醇(9)的合成 將1.5mL 1，25-二羥基-16，23E-二烯-25R，26-三氟-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.4mL乙酸酐。然后將混合物冷藏。2天后，將混合物用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，然后在10mL水與30mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將淺棕色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在10×130mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為流動相。級分4-6(TLC，1∶4)含有主要的帶(參見TLC)。蒸發(fā)這些級分，得到0.0726g。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0649g無色泡沫狀物，即標題化合物(9)。
合成實施例8-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇(10)(“化合物C”)的合成 將0.0535g 1，25-二羥基-16-烯-19-降-膽骨化醇溶于1.5mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.3mL乙酸酐，將混合物冷藏過夜。將溶液用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，然后在10mL水與30mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用4×15mL水洗滌，用5mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將幾乎無色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-6的流動相，然后使用1∶4乙酸乙酯-己烷。合并級分9-19(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.09，見下)，蒸發(fā)，得到0.0306g，將其用甲酸甲酯吸收，過濾，然后蒸發(fā)。得到0.0376g標題化合物(10)。
合成實施例9-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇(11)的合成
將50mg 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將混合物冷藏3天，然后用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用4×5mL水洗滌，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將幾乎無色的油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-6的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級分9-12的流動相，用1∶3乙酸乙酯-己烷作為級分13-15的流動相，用1∶2乙酸乙酯-己烷作為其余級分的流動相。合并級分11-16(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.09，見下)，蒸發(fā)76.1487-76.1260＝0.0227g，用甲酸甲酯吸收，過濾，然后蒸發(fā)。得到0.0186g標題化合物(11)。合成實施例10-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高-19-降-膽骨化醇(12)的合成 將0.0726g 1，25-二羥基-16-烯-23-炔-26，27-雙高-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液在冰浴中攪拌，然后冷藏過夜。然后將溶液用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在10mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×10mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥和蒸發(fā)，33.5512-33.4654＝0.0858g褐色油性殘余物，將其在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動相。合并級分7-11(各20mL)(TLC 1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf0.14)，蒸發(fā)，67.2834-67.2654＝0.018g。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)。得到0.0211g標題化合物(12)。
合成實施例11-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇(13)的合成 將0.282g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐，將混合物冷藏過夜，然后用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-4的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為級分5-12的流動相，用1∶3乙酸乙酯-己烷作為級分13-15的流動相，用作為其余級分的流動相。合并級分7-12(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf 0.13)，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，然后蒸發(fā)，得到0.023g標題化合物(13)。
合成實施例12-1，3，25-三-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(14)和1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(15)的合成 將0.1503g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將混合物冷藏過夜，然后用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在15×150mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-5的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為其余級分的流動相。合并級分3-4和6-7，蒸發(fā)，然后用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0476g標題三乙酸酯(14)和0.04670g標題二乙酸酯(15)。
合成實施例13-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇(16)的合成 將0.0369g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23-炔-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐，將混合物冷藏過夜，然后用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在13×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-7的流動相，用1∶4乙酸乙酯-己烷作為其余級分的流動相。合并級分9-11(TLC，1∶4乙酸乙酯-己烷)，蒸發(fā)，用甲酸甲酯吸收，過濾，然后蒸發(fā)，得到0.0099g標題化合物(16)。
合成實施例14-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(17)(化合物E)的合成
將0.0328g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過夜。然后將溶液用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在5mL水與20mL乙酸乙酯之間分配(萃取水層沒有得到磷鉬酸可檢測的產(chǎn)物)。將有機層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)，殘余物顯示Rf0.25，為唯一的斑點。將油性殘余物用1∶6乙酸乙酯-己烷吸收，然后在13.5×110mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6乙酸乙酯-己烷作為級分1-10的流動相。合并級分4-9，蒸發(fā)，將殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，然后蒸發(fā)，得到0.0316g標題化合物(17)。
合成實施例15-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(18)的合成 將0.0429g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過夜。然后將溶液用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在7mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×5mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥(硫酸鈉)，TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示幾乎一個斑點，蒸發(fā)，在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動相。合并級分3-6(各20mL)，蒸發(fā)。將殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0411g標題化合物(18)。
合成實施例16-1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(19)(化合物F)的合成 將0.0797g 1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-膽骨化醇溶于0.8mL吡啶，冷卻至冰浴溫度，加入0.2mL乙酸酐。將溶液冷藏過夜。然后將溶液用1mL水稀釋，在冰浴中攪拌10min，在10mL水與25mL乙酸乙酯之間分配。將有機層用3×10mL水洗滌，用5mL飽和碳酸氫鈉洗滌一次，用3mL鹽水洗滌一次，然后干燥，蒸發(fā)，得到0.1061g褐色油性殘余物，將其在15×120mm柱上經(jīng)快速色譜處理，用1∶6作為流動相。合并級分9-16(各20mL)(TLC1∶4乙酸乙酯-己烷，Rf 0.13)，蒸發(fā)。將該殘余物用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0581g標題化合物(19)。
合成實施例17-1，3-二-O-乙?；?1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(20)的合成 在0℃下，向1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(94mg，0.23mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)。將混合物攪拌1h，冷藏15h，然后攪拌另外8h。加入水(10mL)，攪拌15min后，將反應混合物用AcOEt∶己烷1∶1(25mL)萃取，用水(4×25mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(120mg)經(jīng)FC純化(15g，30％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(20)(91mg，0.18mmol，80％)。[α]30D＝+14.4c0.34，EtOH；UVλmax(EtOH)242nm(ε34349)，250nm(ε40458)，260nm(ε27545)；1H NMR(CDCl3)6.25(1H，d，J＝11.1Hz)，5.83(1H，d，J＝11.3Hz)，5.35(1H，m)，5.09(2H，m)，2.82-1.98(7H，m)，2.03(3H，s)，1.98(3H，s)，2.00-1.12(15H，m)，1.18(6H，s)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；13C NMR(CDCl3)170.73(0)，170.65(0)，157.27(0)，142.55(0)，130.01(0)，125.06(1)，123.84(1)，115.71(1)，71.32(0)，70.24(1)，69.99(1)，59.68(1)，50.40(0)，44.08(2)，41.40(2)，38.37(2)，35.96(2)，35.80(2)，32.93(2)，29.48(3)，29.31(2)，28.71(2)，23.71(2)，22.50(2)，21.56(3)，21.51(0)，21.44(3)，18.01(3)，12.93(2)，10.53(2)；C31H46O5的MS HRES計算值M+Na521.3237，觀測值M+Na521.3233合成實施例18-1，3-二-O-乙?；?1-α，25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(21)的合成 在0℃下，向1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(100mg，0.23mmol)在吡啶(3mL)中的溶液中加入乙酸酐(0.5mL，5.3mmol)。將混合物攪拌2h，然后冷藏另外15h。加入水(10mL)，攪拌15min后，將反應混合物用AcOEt∶己烷1∶1(25mL)萃取，用水(4×25mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(150mg)經(jīng)FC純化(15g，30％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(21)(92mg，0.18mmol，78％)。[α]30D＝-14.9c0.37，EtOH；UVλmax(EtOH)208nm(ε15949)，265nm(ε15745)；1HNMR(CDCl3)6.34(1H，d，J＝11.3Hz)，5.99(1H，d，J＝11.3Hz)，，5.47(1H，m)，5.33(1H，m)，5.31(1H，s)，5.18(1H，m)，5.04(1H，s)，2.78(1H，m)，2.64(1H，m)，2.40-1.10(18H，m)，2.05(3H，s)，2.01(3H，s)，1.18(6H，s)，0.76(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)170.76(0)，170.22(0)，157.18(0)，143.02(0)，142.40(0)，131.94(0)，125.31(1)，125.10(1)，117.40(1)，115.22(2)，72.97(1)，71.32(0)，69.65(1)，59.71(1)，50.57(0)，44.07(2)，41.73(2)，38.36(2)，37.10(2)，35.80(2)，29.45(3)，29.35(2)，29.25(3)，28.92(2)，23.80(2)，22.48(2)，21.55(3)，21.50(3)，21.35(0)，17.90(3)，12.92(2)，10.54(2)；C32H46O5的MSHRES計算值M+Na533.3237，觀測值M+Na533.3236合成實施例19-1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇(22)的合成 將0.2007g(0.486mmol)溶于2mL吡啶。將該溶液在冰浴中冷卻，加入0.6mL乙酸酐。將溶液在冰浴中保持45h，然后用10mL水稀釋，攪拌10min，用10mL水和40mL乙酸乙酯平衡。將有機層用4×20mL水和10mL鹽水洗滌，干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)。將棕色的油性殘余物經(jīng)快速色譜處理，用1∶19、1∶9和1∶4乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。蒸發(fā)Rf 0.16(TLC1∶4乙酸乙酯-己烷)的主要的帶，得到1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-23-炔-膽骨化醇(22)，為無色泡沫狀物，0.0939g。
合成實施例20-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成
在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.0g，2.90mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液中加入n-BuLi(2.72mL，4.35mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入丙酮(2.5mL，34.6mmol)，繼續(xù)攪拌2.5h。加入NH4Claq(15mL)，將混合物在室溫下攪拌15min，然后用AcOEt萃取(2×50mL)。合并萃取液，用鹽水(50mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(2.4g)經(jīng)FC純化(50g，10％EtOAc的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-2-甲基-戊-3-炔-2-醇(1.05g，2.61mmol)，用四丁基氟化銨(6mL，6mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌48h。將混合物用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×25mL)和鹽水(25mL)洗滌。合并水洗液，用EtOAc(25mL)萃取，合并有機萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(1.1g)經(jīng)FC純化(50g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(0.75g，2.59mmol，90％)。[α]30D＝+2.7 c 0.75，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，m)，4.18(1H，m)，2.40(2H，s)，2.35-1.16(11H，m)，1.48(6H，s)，1.20(3H，s)，0.76-0.50(4H，m)；13C NMR (CDCl3)156.39，125.26，86.39，80.19，69.21，65.16，55.14，46.94，35.79，33.60，31.67，29.91，27.22，19.32，19.19，17.73，10.94，10.37；C22H28O2的MS HREI計算值M+288.2089，觀測值M+288.2091。
合成實施例21-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成
將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(-4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(0.72g，2.50mmol)、乙酸乙酯(10mL)、己烷(24mL)、無水乙醇(0.9mL)、喹啉(47μL)與Lindlar催化劑(156mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，濾墊用AcOEt洗滌。合并濾液和洗液，用1M HCl、NaHCO3和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，蒸發(fā)溶劑，將殘余物(0.79g)經(jīng)FC純化(45g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(640mg，2.2mmol，88％)。
合成實施例22-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 利用Paar儀器，將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(100mg，0.34mmol)、1，4-雙(二苯基-膦基)丁烷1，5環(huán)辛二烯四氟硼酸銠(25mg，0.034mmol)、二氯甲烷(5mL)與一滴汞的混合物在室溫和50p.s.i.壓力下氫化3h。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，然后用乙酸乙酯洗滌。合并濾液和洗液，蒸發(fā)至干(110mg)，經(jīng)FC純化(10g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(75mg，0.26mmol，75％)。[α]30D＝-8.5 c 0.65，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.37(1H，m，)，4.14(1H，m)，2.37-1.16(17H，m)，1.19(6H，s)，1.18(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；C19H32O2的MS HREI計算值M+H292.2402，觀測值M+H292.2404。
合成實施例23-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(440mg，1.50mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌5h，通過硅膠(10g)過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(426mg，1.47mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(424mg，1.47mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.44mL，3.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過硅膠(10g)過濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(460mg，1.27mmol，86％)。[α]29D＝-9.9 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.33(1H，dd，J＝3.2，1.5Hz)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.2Hz)，2.44(1H，ddd，J＝15.6，10.7，1.5Hz)，2.30-1.15(13H，m)重疊2.03(ddd，J＝15.8，6.4，3.2Hz)，1.18(6H，s)，0.92(3H，s)，0.66-0.28(4H，m)，0.08(9H，s)；13C NMR(CDCl3)211.08(0)，155.32(0)，124.77(1)，73.98(0)，64.32(1)，53.91(0)，44.70(2)，40.45(2)，38.12(2)，34.70(2)，29.86(3)，29.80(3)，26.80(2)，24.07(2)，22.28(2)，21.24(0)，18.35(3)，12.60(2)，10.64(2)，2.63(3)；C22H38O2Si的MS HRES計算值M+362.2641，觀測值M+362.2648。
合成實施例24-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成
在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(381mg，1.32mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.0g，2.65mmol)。將所得混合物攪拌1.5h，通過硅膠(10g)過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(360mg，1.26mmol，95％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(360mg，1.26mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.25mL，1.7mmol)。將所得混合物攪拌0.5h，通過硅膠(10g)過濾，用5％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(382mg，1.07mmol，81％)。
合成實施例25-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(23)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基(phosphinoyl))-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(513mg，0.88mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.55mL，0.88mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(179mg，0.50mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(716mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(324mg，0.45mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-膽骨化醇(322mg，0.45mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌18h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(280mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(23)(172mg，0.41mmol，82％)。[α]31D＝+32.4c0.50，MeOH.UVλmax(EtOH)261nm(ε11930)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.3Hz)，5.45(1H，m)，5.33(1H，m)，5.01(1H，s)，4.45(1H，m)，4.22(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.50-1.10(16H，m)，1.45(6H，s)，0.81(3H，s)，0.72-0.50(4H，m)；C28H38O3的MS HRES計算值M+422.2821，觀測值M+422.2854。
合成實施例26-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(24)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(674mg，1.18mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.74mL，1.18mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(235mg，0.66mmol)在四氫呋喃(3mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(330mg，0.46mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-19-降-膽骨化醇(328mg，0.46mmol)中加入四丁基氟化銨(5mL，5mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌62h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(410mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(24)(183mg，0.45mmol，68％)。[[α]29D＝+72.1 c0.58，MeOH.UVλmax(EtOH)242nm(ε29286)，251nm(ε34518)，260nm(ε23875)；1H NMR(CDCl3)6.30(1H，d，J＝11.3Hz)，5.94(1H，d，J＝11.3Hz)，5.48(1H，m)，4.14(1H，m)，4.07(1H，m)，2.78(2H，m)，2.52-1.10(18H，m)，1.49(6H，s)，0.81(3H，s)，0.72-0.50(4H，m)；C27H38O3的MS HRES計算值M+410.2821，觀測值M+410.2823。
合成實施例27-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.95g，5.66mmol)在四氫呋喃(35mL)中的溶液中加入n-BuLi(4.3mL，6.88mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入六氟丙酮(六滴，來自冷卻管)，繼續(xù)攪拌1h。加入NH4Claq(10mL)，使混合物升溫至室溫。將反應混合物用鹽水(100mL)稀釋，用己烷萃取(2×125mL)。合并萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(8.2g)經(jīng)FC純化(150g，10％EtOAc的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-1，1，1-三氟-2-三氟甲基-戊-3-炔-2-醇(2.73g，5.35mmol)，用四丁基氟化銨(20mL，20mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌30h。將混合物用AcOEt(150mL)稀釋，用水(5×150mL)和鹽水(150mL)洗滌。合并水性洗液，用AcOEt(150mL)萃取，合并有機萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(3.2g)經(jīng)FC純化(150g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(2.05g，5.17mmol，97％)。[α]28D＝+6.0 c 0.47，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，br.s)，4.16(1H，br.s)，3.91(1H，s)，2.48(1H，AB四重蜂的A部分，J＝17.5Hz)，2.43(1H，AB四重蜂的B部分，J＝17.5Hz)，2.27(1H，m)，2.00-1.40(9H，m)，1.18(3H，s)，0.8-0.5(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.26(0)，126.68(1)，121.32(0，q，J＝284Hz)，90.24(0)，71.44(0，七重峰J＝34Hz)，70.54(0)，69.57(1)，55.17(1)，47.17(0)，36.05(2)，33.63(2)，30.10(2)，27.94(2)，19.50(3)，19.27(0)，17.90(2)，11.56(2)，11.21(2)；C19H22O2F6的MS HREI計算值M+396.1524，觀測值M+396.1513。
合成實施例28-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(504mg，1.27mmol)與硅藻土(1.5g)在二氯甲烷(12mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(0.98g，2.6mmol)。將所得混合物攪拌2.5h，通過硅膠(5g)過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(424mg，1.08mmol，85％)。[α]28D＝+3.1 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.46(1H，br.s)，3.537(1H，s)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.5Hz)，2.49-1.76(10H，m)，0.90(3H，s)，0.77-0.53(4H，m)；C19H20O2F6的MS HREI計算值M+H395.1440，觀測值M+H395.1443。
合成實施例29-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(25)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(900mg，1.58mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(1.0mL，1.6mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.51mmol)在四氫呋喃(3mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(20g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(327mg，0.44mmol，86％)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(327mg，0.44mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌24h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(250mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(25)(183mg，0.45mmol，68％)。[α]30D＝+73.3 c 0.51，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε29384)，251nm(ε34973)，260nm(ε23924)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝11.1Hz)，5.93(1H，d，J＝11.1Hz)，5.50(1H，m)，4.12(1H，m)，4.05(1H，m)，2.76(2H，m)，2.55-1.52(18H，m)，0.80(3H，s)，0.80-0.49(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.24(0)，141.78(0)，131.28(0)，126.23(1)，123.65(1)，121.09(0，q，J＝285Hz)，115.67(1)，89.63(0)，70.42(0)，67.48(1)，67.29(1)，59.19(1)，49.87(0)，44.49(2)，41.98(2)，37.14(2)，35.76(2)，29.22(2)，28.47(2)，27.57(2)，23.46(2)，19.32(0)，17.97(3)，11.89(2)，10.18(2)；C27H32O3F6的MS HRES計算值M+H519.2329，觀測值M+H 519.2325。
合成實施例30-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(26)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(921mg，1.58mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(1.0mL，1.6mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-羥基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(197mg，0.50mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(25mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(876mg)經(jīng)FC純化(20g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(356mg，0.47mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-炔-26，27-六氟-膽骨化醇(356mg，0.47mmol)中加入四丁基氟化銨(5mL，5mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(270mg)經(jīng)FC純化(20g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(26)(216mg，0.41mmol，87％)。[α]30D＝+40.0 c 0.53，EtOH.UVλmax(EtOH)262nm(ε12919)；1H NMR(CDCl3)6.38(1H，d，J＝11.5Hz)，6.10(1H，d，J＝11.1Hz)，5.49(1H，m)，5.35(1H，s)，5.02(1H，s)，4.45(1H，m)，4.25(1H，m)，3.57(1H，s)，2.83-1.45(18H，m)，0.82(3H，s)，0.80-0.51(4H，m)；C28H32O3F6的MS HRES計算值M+H531.2329，觀測值M+H531.2337。
合成實施例31-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 在5℃下，向氫化鋁鋰(4.5mL，4.5mmol，1.0M THF溶液)中首先加入固體甲醇鈉(245mg，4.6mmol)，然后滴加(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(360mg，0.91mmol)在四氫呋喃(5mL)中的溶液。加入完成后，將混合物在回流下攪拌2.5h。然后在冰浴中冷卻，用水(2.0mL)和氫氧化鈉(2.0mL，2.0M水溶液)淬滅；用乙醚(50mL)稀釋，攪拌30min，然后加入MgSO4(5g)，繼續(xù)攪拌30min。蒸發(fā)濾液后，將殘余物(0.42g)經(jīng)FC純化(20g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(315mg，0.79mmol，87％)。[α]28D＝+2.0 c 0.41，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.24(1H，dt，J＝15.7，6.7Hz)，5.60(1H，d，J＝15.7Hz)，5.38(1H，br.s)，4.13(1H，br.s)，3.27(1H，s)，2.32-1.34(12H，m)，1.15(3H，s)，0.80-0.45(4H，m)；13C NMR(CDCl3)155.89(0)，138.10(1)，126.21(1)，122.50(0，q，J＝287Hz)，119.15(1)，76.09(0，sep.J＝31Hz)，69.57(1)，55.33(1)，47.30(0)，40.31(2)，36.05(2)，33.71(2)，30.10(2)，20.36(0)，19.46(3)，17.94(2)，11.96(2)，11.46(2)；C19H24O2F6的MS REI計算值M+398.1680，觀測值M+398.1675。
合成實施例32-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(600mg，1.51mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌3.5h，通過硅膠(10g)過濾，然后用25％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(550mg，1.39mmol，92％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(550mg，1.39mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(1.76mL，12.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過硅膠(10g)過濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(623mg，1.33mmol，88％)。[α]28D＝-1.6 c 0.51，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.14(1H，dt，J＝15.5，6.7Hz)，5.55(1H，d，J＝15.5Hz)，5.35(1H，m)，2.80(1H，dd，J＝10.7，6.4Hz)，2.47-1.74(10H，m)，0.90(3H，s)，0.76-0.40(4H，m)，0.2(9H，s)；13C NMR(CDCl3)210.99(0)，154.28(0)，137.41(1)，126.26(1)，122.59(0，q，J＝289Hz)，120.89(1)，64.31(1)，53.96(0)，40.60(2)，40.13(2)，35.00(2)，27.03(2)，24.21(2)，20.57(0)，18.53(3)，12.41(2)，10.79(2)，1.65(3)；C22H30O2F6Si的MS HRES計算值M+H469.1992，觀測值M+H469.1995。
合成實施例33-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(27)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(514mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(750mg)經(jīng)FC純化(15g，5％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(250mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(250mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌24h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(270mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(27)(157mg，0.30mmol，70％)。[α]30D＝+63.3 c 0.45，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε30821)，251nm(ε36064)，260nm(ε24678)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝11.3Hz)，6.24(1H，dt，J＝15.9，6.4Hz)，5.92(1H，d，J＝11.1Hz)，5.61(1H，d，J＝15.7Hz)，5.38(1H，m)，4.13(1H，m)，4.05(1H，m)，2.88(1H，s)，2.82-1.34(19H，m)，0.770(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C27H34O3F6的MS HRES計算值M+H521.2485，觀測值M+H521.2489。
合成實施例34-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇(28)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(525mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2E-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌2.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(760mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(274mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-E-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(274mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(280mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(28)(167mg，0.31mmol，73％)。[α]30D＝+18.3 c 0.41，EtOH.UVλmax(EtOH)207nm(ε17778)，264nm(ε15767)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.1Hz)，6.24(1H，dt，J＝15.7，6.7Hz)，6.07(1H，d，J＝11.3Hz)，5.60(1H，d，J＝15.5Hz)，5.35(1H，m)，5.33(1H，s)，5.00(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，3.14(1H，s)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.40-1.40(15H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C28H34O3F6的MS HRES計算值M+H533.2485，觀測值M+H533.2483。
合成實施例35-(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇的合成 將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(300mg，0.76mmol)、乙酸乙酯(5mL)、己烷(12mL)、無水乙醇(0.5mL)、喹啉(30μL)與Lindlar催化劑(75mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，用AcOEt洗滌濾墊。蒸發(fā)溶劑，得到標題化合物(257mg，0.65mmol，87％)。[α]28D＝+1.8 c 0.61，CHCl3.1H NMR(CDCl3)6.08(1H，dt，J＝12.3，6.7Hz)，5.47(1H，m，)，5.39(1H，d，J＝12.1Hz)，4.15(1H，br.s)，3.28(1H，s)，2.52-1.34(12H，m)，1.16(3H，s)，0.78-0.36(4H，m)；13C NMR(CDCl3)156.66(0)，141.77(1)，126.51(1)，122.79(0，q，J＝285Hz)，115.77(1)，69.59(1)，55.41(1)，47.28(0)，36.44(2)，35.90(2)，33.75(2)，30.22(2)，20.89(0)，19.41(3)，17.94(2)，12.05(2)，11.11(2)；C19H24O2F6的MS HRES計算值M+H399.1753，觀測值M+H 399.1757。
合成實施例36-(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮的合成 在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(617mg，1.55mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.17g，3.1mmol)。將所得混合物攪拌2.5h，通過硅膠(5g)過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(600mg，1.51mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-羥基-4-三氟甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(600mg，1.51mmol)在二氯甲烷(15mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(1.76mL，12.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過硅膠(10g)過濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(640mg，1.37mmol，88％)。[α]28D＝-0.2 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.97(1H，dt，J＝12.2，6.2Hz)，5.40(1H，m)，5.38(1H，d，J＝12.2Hz)，2.82(1H，dd，J＝10.7，6.6Hz)，2.60-1.74(10H，m)，0.89(3H，s)，0.75-0.36(4H，m)，0.21(9H，s)；13C NMR(CDCl3)210.56(0)，154.30(0)，139.28(1)，125.81(1)，122.52(0，q，J＝289Hz)，118.17(1)，64.11(1)，53.69(0)，40.43(2)，35.51(2)，34.85(2)，26.94(2)，24.07(2)，20.89(0)，18.39(3)，12.26(2)，10.61(2)，1.43(3)；C22H30O2F6Si的MS HRES計算值M+H469.1992，觀測值M+H469.1992。
合成實施例37-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇(29)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(514mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(194mg，0.41mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.0h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(750mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(230mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇的混合物(230mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌40h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，周Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(260mg)經(jīng)FC純化(10g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(29)(1327mg，0.25mmol，62％)。[α]28D＝+53.6 c 0.33，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε26982).251nm(ε32081)，260nm(ε21689)；1H NMR(CDCl3)6.29(1H，d，J＝10.7Hz)，6.08(1H，dt，J＝12.5，6.7Hz)，5.93(1H，d，J＝11.1Hz)，5.46(1H，m，)，5.40(1H，d，J＝12.7Hz))，4.12(1H，m)，4.05(1H，m)，3.14(1H，s)，2.80-1.40(19H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.36(4H，m)；C27H34O3F6的MS HRES計算值M+H521.2485，觀測值M+H521.2487。
合成實施例38-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇(30)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(525mg，0.90mmol)在四氫呋喃(6mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.57mL，0.91mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(5，5，5-三氟-4-三氟甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(200mg，0.43mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌2.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(680mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(310mg)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇與1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-23，24-Z-烯-26，27-六氟-膽骨化醇的混合物(310mg)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(370mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(30)(195mg，0.37mmol，85％)。[α]30D＝+9.4 c 0.49，EtOH.UVλmax(EtOH)262nm(∈11846)；1H NMR(CDCl3)6.36(1H，d，J＝11.1Hz)，6.08(2H，m)，5.44(1H，m)，5.40(1H，d，J＝12.3Hz)，5.32(1H，s)，5.00(1H，s)，4.43(1H，m)，4.23(1H，m)，3.08(1H，s)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.55-1.40(15H，m)，0.77(3H，s)，0.80-0.34(4H，m)；C28H34O3F6的MS HRES計算值M+H533.2485，觀測值M+H533.2502。
合成實施例39-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(31)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1R，3R)-1，3-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-5-[2-(二苯基氧膦基)亞乙基]-環(huán)己烷(697mg，1.22mmol)在四氫呋喃(9mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.77mL，1.23mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(220mg，0.61mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(900mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-19-降-膽骨化醇(421mg，0.59mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-26，27-六氘代-19-降-膽骨化醇(421mg，0.59mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌40h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(450mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(31)(225mg，0.54mmol，89％)。[α]29D＝+69.5 c 0.37，EtOH.UVλmax(EtOH)243nm(ε27946)，251nm(ε33039)，261nm(ε22701)；1H NMR(CDCl3)6.30(1H，d，J＝11.3Hz)，5.93(1H，d，J＝11.3Hz)，，5.36(1H，m)，4.12(1H，m)，4.04(1H，m)，2.75(2H，m)，2.52-1.04(22H，m)，1.18(6H，s)，0.79(3H，s)，0.65-0.26(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.16(0)，142.33(0)，131.25(0)，124.73(1)，123.76(1)，115.50(1)，71.10(0)，67.39(1)，67.19(1)，59.47(1)，50.12(0)，44.60(2)，43.84(2)，42.15(2)，38.12(2)，37.18(2)，35.57(2)，29.26(3)，29.11(2)，29.08(3)，28.48(2)，23.46(2)，22.26(2)，21.27(0)，17.94(3)，12.70(2)，10.27(2)；C27H42O3的MS HRES計算值M+H415.3207，觀測值M+H415.3207。
合成實施例40-1-α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(32)的合成 在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(675mg，1.16mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.73mL，1.17mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(210mg，0.58mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(32)(204mg，0.48mmol，83％)。[α]29D＝+16.1 c 0.36，EtOH.UVλmax(EtOH)208nm(ε17024)，264nm(ε16028)；1H NMR(CDCl3)6.37(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.1Hz)，5.33(2H，m)，5.01(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.38-1.08(20H，m)，1.19(6H，s)，0.79(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.07(0)，147.62(0)，142.49(0)，133.00(0)，124.90(1)，124.73(1)，117.19(1)，111.64(2)，71.10(1)，70.70(0)，66.88(1)，59.53(1)，50.28(0)，45.19(2)，43.85(2)，42.86(2)，38.13(2)，35.59(2)，29.27(2)，29.14(3)，28.65(2)，23.57(2)，22.62(2)，21.29(0)，17.84(3)，12.74(2)，10.30(2)；C28H42O3的MS HRES計算值M+Na449.3026，觀測值M+Na449.3023。
合成實施例41-1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇(33)的合成 [1R，3aR，4S，7aR]-2(R)-[4-(1，1-二甲基乙基)二甲基-硅烷氧基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-6-甲基-庚烷-1，6-二醇(34)和[1R，3aR，4S，7aR]-2(S)-[4-(1，1-二甲基乙基)二甲基-硅烷氧基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-6-甲基-庚烷-1，6-二醇(35) 將烯醇(alkenol)的四氫呋喃溶液(9mL)在冰浴中冷卻，在原來泡騰的反應中滴加1M硼烷-THF的四氫呋喃溶液(17mL)。將溶液在室溫下攪拌過夜，在冰浴中重新冷卻，滴加水(17mL)，然后加入過碳酸鈉(7.10g，68mmol)。將混合物浸在50℃浴中，攪拌70min，生成溶液。使兩相系統(tǒng)冷卻，然后用1∶1乙酸乙酯-己烷(170mL)平衡。將有機層用水(2×25mL)、然后用鹽水(20mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，留下無色油狀物(2.76g)。使該物質(zhì)通過短的快速柱，使用1∶1乙酸乙酯-己烷和硅膠G。將徹底洗脫后所得的流出物蒸發(fā)，用乙酸乙酯吸收，過濾，在2×18”15-20μ二氧化硅YMC HPLC柱上進行色譜處理，用2∶1乙酸乙酯-己烷作為流動相，流速100mL/min。異構體34出現(xiàn)在流出物最多2.9L時，為無色油狀物，1.3114g，[α]D+45.2°(甲醇，c0.58；1H NMR δ-0.002(3H，s)，0.011(3H，s)，0.89(9H，s)，0.93(3H，s)，1.17(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25-1.6(16H，m)，1.68(1H，m)，1.80(2H，m)，1.89(1H，m)，3.66(1H，dd，J＝4.8和11Hz)，3.72(1H，dd，J＝3.3和11Hz)，4.00(1H，m)；LR-ES(-)m/z412(M)，411(M-H)；HR-ES(+)計算值(M+Na)435.3265，實測值435.3269。
異構體35出現(xiàn)在流出物最多4.9L時，為無色油狀物，0.8562g，長時間放置后結(jié)晶mp102-3°，[α]D+25.2°(甲醇，c0.49)；1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.009(3H，s)，0.89(9H，s)，0.93(3H，s)，1.16(1H，m)，1.22(6H，s)，1.3-1.5，(14H，m)，1.57(2H，m)，1.67(1H，m)，1.80(2H，m)，1.91(1H，m)，3.54(1H，dd，J＝4.8和11Hz)，3.72(1H，dd，J＝2.9和11Hz)，4.00(1H，m)；)；LR-ES(-)m/z412(M)，411(M-H)。C24H48O3Si的分析計算值C，69.84，H，11.72；實測值C，69.91；H，11.76。-6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-7-碘-2-甲基-庚-2-醇(36) 將攪拌著的三苯膦(0.333g，1.27mmol)與咪唑(0.255g，3mmol)在二氯甲烷(3mL)中的混合物在冰浴中冷卻，加入碘(0.305g，1.20mmol)。將該混合物攪拌10min，然后歷經(jīng)10min滴加34(0.4537g，1.10mmol)在二氯甲烷(3mL)中的溶液。將混合物在冰浴中攪拌30min，然后在環(huán)境溫度下攪拌23/4h。TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)確認沒有反應物(educt)存在。加入硫代硫酸鈉(0.1g)在水(5mL)中的溶液，使混合物平衡，將有機相用含有幾滴鹽水的0.1N硫酸(10mL)洗滌，然后用1∶1水-鹽水洗滌(2×10mL)，用鹽水(10mL)洗滌一次，然后干燥和蒸發(fā)。將殘余物用快速色譜純化，用1∶9乙酸乙酯-己烷作為流動相，得到36，為無色糖漿狀物，0.5637g，98％1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.010(3H，s)，0.89(9H，s)，0.92(3H，s)，1.23(6H，s)，1.1-1.6(16H，m)，1.68(1H，m)，1.79(2H，m)，1.84(1H，m)，3.37(1H，dd，J＝4和10Hz)，3.47(1H，dd，J＝3和10Hz)，4.00(1H，m)；LR-EI(+)m/z522(M)，465(M-C4H9)，477(M-C4H9-H2O)；HR-EI(+)C24H47IO2Si的計算值522.2390，實測值522.2394。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-壬-8-炔-2-醇(37) 將乙炔化鋰DMA絡合物(0.110g，1.19mmol)加入到36(0.2018g，0.386mmol)在二甲基亞砜(1.5mL)與四氫呋喃(0.15mL)中的溶液中。將混合物攪拌過夜。TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示是兩個移動得非常接近的斑點(Rf 0.52和0.46)的混合物。在洗脫帶開始時的級分含有純的烯醇，它是36的消除產(chǎn)物，是作為主要產(chǎn)物生成的。然而，在洗脫帶結(jié)束時的級分也是均勻的，蒸發(fā)后得到所需的炔37。以前報道過37及其6-差向異構體的NMR光譜用于鑒別。-7-苯磺?；?6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(38) 將37b(0.94g，1.8mmol)、苯亞磺酸鈉(2.18g，13mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(31.8g)的混合物在室溫下攪拌12h，然后在40℃浴中攪拌約6h，直至TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)顯示全部反應物被轉(zhuǎn)化。將溶液用1∶1乙酸乙酯-己烷(120mL)和1∶1鹽水-水(45mL)平衡。將有機層用水(4×25mL)和鹽水(10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)，留下無色油狀物，1.0317g。將該物質(zhì)用快速色譜處理，使用逐步梯度(1∶9，1∶6，1∶3乙酸乙酯-己烷)，得到無色油狀物，0.930g，96％300MHz1H NMRδ-0.02(3H，s)，0.00(3H，s)，0.87(9H，s)，0.88(3H，s)，1.12(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.8(18H，m)，1.81(1H，m)，3.09(2H，m)，3.97(1H，brs)，7.59(3H，m)，7.91(2H，m)。-1-(1(S)-苯磺?；谆?5-甲基-5-三甲基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(39) 將1-(三甲基硅烷基)咪唑(1mL)加入到38(0.8g)在環(huán)己烷(10mL)中的溶液中，攪拌過夜，然后用快速色譜處理，使用己烷、1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷的逐步梯度。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測洗脫，得到39，為無色糖漿狀物，0.7915g300 MHz1H NMRδ0.00(3H，s)，0.02(3H，s)，0.12(9H，s)，0.90(12H，s，t-丁基+7a-Me)，1.16(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.6(15H，m)，1.66-1.86(3H，m)，3.10(2H，m)，4.00(1H，brs)，7.56-7.70(3H，m)，7.93(2H，m)。-6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(40) 將39(0.7513g，1.23mmol)與二醇(0.508g，1.85mmol)在四氫呋喃(28mL)中的溶液冷卻至-35℃，然后滴加2.5M丁基鋰的己烷溶液(2.75mL)。使溫度上升至-20℃，在該溫度下維持6h或者直至反應物被消耗。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測反應進程，顯示有反應物(Rf0.71)和兩個差向異構的二醇(Rf 0.09和0.12)。接近反應結(jié)束時，將溫度短暫增加至0℃，再次降低至-10℃，然后加入飽和氯化銨(25mL)，然后加入乙酸乙酯(50mL)和足量的水，以溶解沉淀的鹽。將所得的水相用乙酸乙酯(15mL)萃取。合并萃取液，用鹽水(15mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將所得糖漿狀物用快速色譜處理，使用1∶9、1∶6、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到39a，為無色糖漿狀物，0.8586g。將該物質(zhì)溶于四氫呋喃(30mL)與甲醇(18mL)的混合物，然后加入5％鈉汞齊(20g)。將混合物攪拌14h后，還原性去磺?；饔檬峭耆摹Ｓ肨LC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測反應進程，顯示差向異構的二醇(Rf 0.63和0.74)消失，40a(Rf 0.79)與部分去硅烷基化類似物40(Rf 0.16)生成。將混合物用甲醇(20mL)稀釋，攪拌3min，然后加入冰(20g)，攪拌2min，將上清液潷析到含有飽和氯化銨(50mL)的混合物中。將殘余物反復用少量四氫呋喃洗滌，也加入到鹽溶液中，然后用乙酸乙酯(80mL)平衡。水層用乙酸乙酯(20mL)反萃取一次，合并萃取液，用鹽水(10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將所得的含有40a和40的無色油狀物溶于10mL 1N草酸的甲醇溶液(從二水合物制備)，在數(shù)分鐘內(nèi)發(fā)生三甲基硅烷基醚的選擇性水解。加入碳酸鈣(1g)，將混懸液攪拌過夜，然后過濾。蒸發(fā)溶液，將所得殘余物用快速色譜處理，使用1∶4、1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到三醇40的殘余物，從乙腈中結(jié)晶出非常微細的分支針狀結(jié)晶，0.45gmp94-95℃，[α]D+44.1°(甲醇，c0.37)；400MHz1H NMRδ-0.005(3H，s)，0.007(3H，s)，0.89(9H，s)，0.92(3H，s)，1.15(1H，m)，1.16(3H，s)，1.21(9H，s)，1.2-1.6(19H，m)，1.67(1H，m)，1.79(2H，m)，1.90(2H，m)，2.06(1H，m)，3.31(1H，brd，J＝10Hz)，4.00(1H，brs)，LR-ES(-)m/z533(M+Cl)，497(M-H)；HR-ES(+)C29H58O4Si+Na計算值521.3996，實測值521.4003。C29H58O4Si的分析計算值C，69.82，H，11.72；實測值C，69.97；H，11.65。-6(R)-(4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(41) 將攪拌著的三醇40(0.4626g，0.927mmol)在乙腈(10mL)與二_烷(0.7mL)中的溶液冷卻至10℃，滴加氟硅酸溶液(2mL)。除去冷卻浴，將兩相系統(tǒng)進一步用乙腈(2mL)稀釋，然后在室溫下攪拌3_h。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測反應物的消失。將混合物用水(10mL)和乙酸乙酯(30mL)平衡。水相用乙酸乙酯反萃取(2×20mL)，合并萃取液，用水(5mL)和鹽水(10mL)洗滌，然后用1∶1鹽水-飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶1至2∶1乙酸乙酯-己烷和純乙酸乙酯的逐步梯度，得到殘余物，將其用1∶1二氯甲烷-己烷吸收，過濾，蒸發(fā)，得到無定形固體，0.3039g(85％)[α]D+42.6°(甲醇，c0.48)；1H NMR(DMSO-d6)δ0.87(3H，s)，0.97(3H，s)，1.02(3H，s)，1.04(6H，s)，1.1-1.4(18H，m)，1.5-1.8(4H，m)，1.84(1H，m)，2.99(1H，dd，J＝6和10Hz)，3.87(1H，brs)，4.02(1H，s，OH)，4.05(1H，s，OH)，4.16(1H，d，OH，J＝3.6Hz)，4.20(1H，d，OH，J＝6.4Hz)；LR-ES(+)m/z384(M)，383(M-H)；HR-ES(+)計算值(M+Na)407.3132，實測值407.3134。-1-{5-羥基-5-甲基-1(R)-[2-(2，2，5，5-四甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基)-乙基]-己基}-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(42) 將四醇40(0.2966g，0.771mmol)與甲苯磺酸吡啶_(100mg)在丙酮(8mL)與2，2-二甲氧基丙烷(8mL)中的溶液在室溫下保持12h。TLC分析(乙酸乙酯)顯示沒有反應物(Rf0.21)存在，有兩個新的斑點Rf 0.82和0.71，前者是預期的42，后者被認為是醋酮(methylacetal)。將反應混合物用水(5mL)稀釋，攪拌10min。此時僅觀察到Rf值較高的斑點。將混合物用碳酸氫鈉(0.5g)中和，然后用乙酸乙酯(50mL)和鹽水(5mL)平衡。將有機層用水(5mL)和鹽水(5mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)，留下粘性殘余物(0.324g)，將其直接用于下一步300MHz1H NMRδ0.94(3H，s)，1.10(3H，s)，1.20(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25(3H，s)，1.34(3H，s)，1.41(3H，s)，1.2-1.65(20H，m)，1.78-1.86(3H，m)，1.93(1H，m)，3.62(1H，dd，J＝4.6和8.3Hz)，4.08(1H，brs)。-乙酸1-{5-羥基-5-甲基-1(R)-[2-(2，2，5，5-四甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基)-乙基]-己基}-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(43) 將以上所得的殘余物溶于吡啶(6.9g)，進一步用乙酸酐(3.41g)稀釋。將混合物在室溫下放置24h，然后在35℃浴中放置約10h，直至不再能檢測到反應物(TLC，乙酸乙酯)。將混合物用甲苯稀釋，蒸發(fā)。經(jīng)殘余物經(jīng)快速色譜純化(1∶4乙酸乙酯-己烷)，得到43，為無色糖漿狀物，0.3452g，97％1HNMRδ0.89(3H，s)，1.10(3H，s)，1.20(1H，m)，1.22(6H，s)，1.25(3H，s)，1.33(3H，s)，1.41(3H，s)，1.25-1.6(19H，m)，1.72(1H，m)，1.82(2H，m)，1.95(1H，m)，2.05(3H，s)，3.63(1H，dd，J＝4.4和8.4Hz)，5.15(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z467(M+H)，465(M-H)，451(M-Me)。-乙酸1-[4(R)，5-二羥基-1(R)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(44) 使43(0.334g，0.716mmol)在80％乙酸(2mL)中的溶液保持在68℃浴中。用TLC(乙酸乙酯，Rf0.33)監(jiān)測水解的進程。2.5h后不再能檢測到反應物。將混合物蒸發(fā)，然后與少量甲苯共蒸發(fā)，留下無色薄膜狀物(0.303g)，直接用于下一步300MHz 1H NMRδ0.89(3H，s)，1.17(3H，s)，1.22(6H，s)，1.56(3H，s)，1.1-1.6(21H，m)，1.6-2.0(5H，m)，2.04(3H，s)，3.32(1H，brd，J＝10Hz)，5.15(1H，brs)。-乙酸1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-羥基-1(R)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(45) 使三醇44(0.30g)、咪唑(0.68g，10mmol)與二甲基thexyl硅烷基氯(1.34g，7.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(6g)中的溶液保持在室溫下。48h后，加入4-(N，N-二甲氨基)吡啶(15mg)，將混合物攪拌另外24h。用TLC(乙酸乙酯；24，Rf 0.83；25a，Rf 0.38)監(jiān)測反應進程。將混合物用水(2mL)稀釋，攪拌10min，然后在乙酸乙酯(45mL)與水(20mL)之間分配。水層用乙酸乙酯(10mL)萃取一次。合并有機相，用水(4×12mL)和鹽水(8mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余的油狀物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶9和1∶4乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到45，為無色糖漿狀物。少量未反應的反應物(80mg)用乙酸乙酯洗脫。將糖漿狀物45直接用于下一步400MHz1H NMRδ0.13(3H，s)，0.14(3H，s)，0.87(6H，s)，0.91(9H，m)，1.10(1H，m)，1.14(3H，s)，1.15(3H，s)，1.21(6H，s)，1.1-1.6(19H，m)，1.6-1.9(5H，m)，1.94(1H，brd，J＝12.8Hz)，2.05(3H，s)，3.38(1H，brs)，5.15(1H，brs)。-乙酸1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-基酯(46) 將1-(三甲基硅烷基)咪唑(0.90mL，6.1mmol)加入到45(0.2929mg)在環(huán)己烷(6mL)中的溶液中，攪拌12h，然后經(jīng)快速色譜處理(1∶79乙酸乙酯-己烷)，得到46，為無色糖漿狀物(0.3372g)。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測洗脫，得到46，為無色糖漿狀物，0.7915g1H NMR δ0.074(3H，s)，0.096(3H，s)，0.103(9H，s)，0.106(9H，s)，0.82(1H，m)，0.83(6H，s)，0.88(9H，m)，1.32(3H，s)，1.20(9H，s)，1.15-1.6(17H，m)，1.6-1.9(5H，m)，1.97(1H，brd，J＝12.8Hz)，2.05(3H，s)，3.27(1H，m)，5.15(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z712(M)，711(M-H)，697(M-Me)，653(M-AcO)，627(M-C6H13)。-1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(47)
將攪拌著的46(0.335mg，0.47mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液在冰浴中冷卻，滴加1M氫化鋁鋰的四氫呋喃溶液(2mL)。TLC(1∶9乙酸乙酯-己烷)顯示1.5h后25b(Rf 0.61)完全轉(zhuǎn)化為26(Rf 0.29)。加入2M氫氧化鈉溶液(14滴)，然后加入水(0.5mL)和乙酸乙酯(30mL)。加入少量硅藻土，攪拌15min后，濾出液體層。將固體殘余物反復用乙酸乙酯沖洗，合并液體相，蒸發(fā)，留下無色糖漿狀物，將其用己烷吸收，過濾，蒸發(fā)，得到26(0.335g)，其無需進一步純化即可使用1H NMRδ0.075(3H，s)，0.10(21H，brs)，0.82(1H，m)，0.84(6H，s)，0.89(6H，m)，0.93(3H，s)，1.13(3H，s)，1.20(9H，s)，1.2-1.6(16H，m)，1.6-1.7(2H，m)，1.82(3H，m)，1.95(1H，brd，J＝12.4Hz)，3.27(1H，m)，4.08(1H，brs)；LR-FAB(+)m/z585(M-C6H13)，481(M-TMSO)；HR-ES(+)m/zC37H78O4Si3+Na的計算值693.5100實測值693.5100。-1-[4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-5-三甲基硅烷氧基-己基]-7a-甲基-八氫-茚4-酮(48) 將硅藻土(0.6g)加入到攪拌著的47(0.310g，0.462mmol)在二氯甲烷(14mL)中的溶液中，然后加入重鉻酸吡啶_(0.700g，1.86mmol)。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)跟蹤47(Rf0.54)向酮27(Rf0.76)的轉(zhuǎn)化。4.5h后，將混合物用環(huán)己烷稀釋，然后通過一層硅膠過濾。合并濾液和乙醚洗液，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理(1∶39乙酸乙酯-己烷)，得到27，為無色糖漿狀物，0.2988g，96.6％1H NMRδ0.078(3H，s)，0.097(3H，s)，0.107(18H，s)，0.64(3H，s)，0.81(1H，m)，0.84(6H，s)，0.89(6H，m)，1.134(3H，s)，1.201(3H，s)，1.207(3H，s)，1.211(3H，s)，1.3-1.6(14H，m)，1.6-1.7(3H，m)，1.88(1H，m)，2.04(2H，m)，2.2-2.32(2H，m)，2.46(1H，dd，J＝7.5和11.5Hz)，3.28(1H，m)；LR-FAB(+)m/z583(M-C6H13)，479(M-OTMS)；HR-ES(+)m/zC37H76O4Si3+Na的計算值691.4943，實測值691.4949。-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(R)-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-4(R)-[二甲基-(1，1，2-三甲基-丙基)-硅烷氧基]-5-三甲基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(49) 在-70℃下，將2.5M丁基鋰的己烷溶液(0.17mL)加入到28的四氫呋喃溶液(2mL)中，產(chǎn)生深櫻桃紅色。10min后，歷經(jīng)15min滴加酮27(0.1415g，0.211mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。4h后，加入pH7磷酸鹽緩沖液(2mL)淬滅反應。使溫度增加至0℃，然后加入己烷(30mL)。水層用己烷(15mL)反萃取。合并萃取液，用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無色油狀物，經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)，得到49，為無色糖漿狀物，0.155g，71％1H NMRδ0.068(15H，m)，0.103(12H，s)，0.107(9H，s)，0.53(3H，s)，0.82(1H，m)，0.84(6H，s)，0.88(18H，m)，0.89(6H，m)，1.14(3H，m)，1.20(9H，s)，12-1.9(22H，m)，1.97(2H，m)，2.22(1H，dd，J＝7.5和13Hz)，2.45(1H，brd，J＝13Hz)，2.83(1H，brd，J＝13Hz)，3.28(1H，m)，4.20(1H，m)，4.38(1H，m)，4.87(1H，d，J＝2Hz)，5.18(1H，d，J＝2Hz)，6.02(1H，d，J＝11.4Hz)，6.24(1H，d，J＝11.4Hz)；LR-FAB(+)m/z1033(M+H)，1032(M)，1031(M-H)，901(M-TBDMS)。
1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20R-膽骨化醇(33)的合成 將前文實驗中所獲得的49的殘余物(0.153g，0.148mmol)溶于1M四丁基氟化銨溶液(3.5mL)。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測反應進程。因而，24h后將溶液用鹽水(5mL)稀釋，攪拌5min，然后用乙酸乙酯(35mL)和水(15mL)平衡。水層用乙酸乙酯(15mL)反萃取一次。合并有機層，用水洗滌(5×10mL)，用鹽水(5mL)洗滌一次，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用乙酸乙酯和1∶100甲醇-乙酸乙酯的逐步梯度，從甲酸甲酯-戊烷中得到33，為無色微晶性物質(zhì)，70mg，91％[α]D+34.3°(甲醇，c0.51)；1HNMR(DMSO-d6)δ0.051(3H，s)，0.98(3H，s)，1.03(3H，s)，1.05(6H，s)，1.0-1.6(17H，m)，1.64(3H，m)，1.80(2H，m)，1.90(1H，d，J＝11.7Hz)，1.97(1H，dd，J＝J＝9.8Hz)，2.16(1H，dd，J＝5.9和J＝13.7Hz)，2.36(1H，brd)，2.79(1H，brd)，3.00(1H，dd，J＝5和10Hz)，3.99(1H，brs)，4.01(1H，s，OH)，4.04(1H，s，OH)，4.54(1H，OH，d，J＝3.9Hz)，4.76(1H，brs)，4.87(1H，OH，d，J＝4.9Hz)，5.22(1H，brs)，5.99(1H，d，J＝10.7Hz)，6.19(1H，d，J＝10.7Hz)；LR-ES(+)m/z519(M+H)，518(M)，517(M-H)，501(M-OH)；HR-ES(+)C32H54O5+Na的計算值541.3863；實測值541.3870；UVmax(ε)213(13554)，241sh(12801)，265(16029)nm。
合成實施例42-1，25-二羥基-21(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇(50)的合成 [1R，3aR，4S，7aR]-7-苯磺?；?6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(51) 將36與苯亞磺酸鈉(0.263g，1.6mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5mL)中的溶液在77℃浴中攪拌3h。將溶液用1∶1乙酸乙酯-己烷(25mL)平衡，將有機層用水洗滌(5×10mL)，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶9、1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到砜，為無色糖漿狀物1HNMRδ-0.02(3H，s)，0.005(3H，s)，0.79(3H，s)，0.87(9H，s)，1.12(1H，m)，1.19(6H，s)，1.12(1H，m)，1.20(6H，s)，1.2-1.8(18H，m)，2.08(1H，m)，3.09(1H，dd，J＝9.3和14.5Hz)，3.31(1H，dd，J＝3和14.5Hz)，3.97(1H，brs)，7.58(3H，m)，7.66(1H，m)，7.91(2H，m)；LR-ES(+)m/z600(M+Na+MeCN)，559(M+Na)；LR-ES(-)m/z536(M)，535(M-H)；HR-ES(+)C30H52O4SSi+Na的計算值559.3248；實測值559.3253。-1-(1(R)-苯磺酰基甲基-5-甲基-5-三甲基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(52)
將1-(三甲基硅烷基)咪唑(0.146mL)加入到51(0.145g，0.27mmol)在環(huán)己烷(2mL)中的溶液中。17h后，將產(chǎn)物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶79和1∶39乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到52，為無色殘余物，0.157g 0.258mmol，TLC(1∶9乙酸乙酯-己烷)Rf 0.14。300MHz1H NMRδ-0.02(3H，s)，0.00(3H，s)，0.87(12H，s)，1.12(1H，m)，1.17(6H，s)，1.2-1.6(15H，m)，1.6-1.9(3H，m)，3.08(2H，m)，3.97(1H，brs)，7.53-7.70(3H，m)，7.90(2H，d，J＝7Hz)。-5(R，S)-苯磺?；?6(R)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-10-三甲基硅烷氧基-十一烷-2，3(R)-二醇(53) 將152(0.2589g，0.425mmol)與二醇(0.176g，0.638mmol)在四氫呋喃(9mL)中的溶液冷卻至-25℃，加入1.6M丁基鋰的己烷溶液(1.4mL)。使溫度上升至-20℃，維持3h，然后在-10℃下維持2.5h，在0℃下維持10min。將混合物再次冷卻至-10℃，加入飽和氯化銨溶液(5mL)，然后用乙酸乙酯(50mL)和足量的水平衡，以溶解沉淀的鹽。水層周乙酸乙酯(15mL)反萃取，合并萃取液，干燥，蒸發(fā)，將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶6、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到53，為無色糖漿狀物，0.212g，70％300MHz1H NMRδ0.00(3H，s)，0.017(3H，s)，0.12(9H，s)，0.81(3H，s)，0.89(9H，s)，1.16(1H，m)，1.19(12H，m)，1.1-1.6(20H，m)，1.6-1.8(2H，m)，3.10(1H，dd，J＝8.4和14.7Hz)，3.30(1H，m)，3.99(1H，brs)，7.61(2H，m)，7.67(1H，m)，7.93(2H，m)。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-10-三甲基硅烷氧基-十一烷-2，3(R)-二醇(54)
將化合物53(0.186mg，0.262mmol)溶于0.5M草酸二水合物的甲醇溶液(2.5mL)。將溶液攪拌15min，然后加入碳酸鈣(0.5g)，將混懸液攪拌過夜，然后過濾。蒸發(fā)濾液，得到54，為白色泡沫狀物，0.188g，98％TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)Rf 0.06。該產(chǎn)物無需進一步純化即可用于下一步。-6(S)-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(三醇55) 將鈉汞齊(5％鈉，10.8g)加入到劇烈攪拌著的54(0.426g，0.667mmol)在四氫呋喃(15mL)與甲醇(9mL)混合物中的溶液中。將混懸液攪拌24h，用TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測反應，觀察到55(Rf0.17)的生成。將混合物用甲醇(3mL)稀釋，攪拌5min，然后進一步用水(10mL)稀釋，攪拌2min，潷析到飽和氯化銨溶液(25mL)中。水層用乙酸乙酯萃取(2×20mL)。合并萃取液，用pH7磷酸鹽緩沖液(5mL)、然后用鹽水(10mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜純化，使用1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到55，為無色糖漿狀物，0.244g，73％1H NMRδ-0.006(3H，s)，0.006(3H，s)，0.86(9H，s)，0.92(3H，s)，1.11(1H，m)，1.15(3H，s)，1.21(9H，s)，1.2-1.75(21H，m)，1.7-1.85(3H，m)，1.90(1H，m)，3.29(1H，brd)，3.99(1H，brs)；LR-ES(+)m/z521(M+Na)，481(M-OH)；LR-ES(-)m/z544(M+CH2O2)，543(M-H+CH2O2)，533(M-Cl)；HR-ES(+)m/zC29H58O4Si+Na的計算值521.3996，實測值521.3999。-6(S)-(4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-2，3(R)，10-三醇(56) 將氟硅酸水溶液(3mL)加入到攪拌著的55(0.240g，0.481mmol)在乙腈(12mL)中的溶液中。用TLC(乙酸乙酯)監(jiān)測反應。2.5h后，化合物56(Rf0.37)是占優(yōu)勢的物質(zhì)，其通過消耗極性較小的55而產(chǎn)生。將混合物用乙酸乙酯和水(10mL)平衡，水層用水反萃取(2×10mL)，合并萃取液，用水(6mL)和鹽水(2×10mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將無色殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷的逐步梯度洗脫一些未反應的55，然后洗脫56，為無色糖漿狀物，0.147g，79％1H NMR0.94(3H，s)，1.12(1H，m)，1.15(3H，s)，1.21(9H，s)，1.15-1.7(20H，m)，1.7-1.9(5H，m)，1.96(1H，brd)，3.29(1H，d，J＝9.6Hz)，4.08(1H，brs)；LR-ES(+)m/z448(M+Na+MeCN)，407(M+Na)；LR-ES(-)m/z419(M+Cl)；HR-ES(+)m/zC23H44O4+Na的計算值407.3132，實測值407.3135。-1-(5-羥基-1(S)-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-5，5-二甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基]-乙基}-5-甲基-己基)-7a-甲基-八氫-茚-4-醇(57) 將4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛(60μL，0.35mmol)加入到56(81.2mg，0.211mmol)在二氯甲烷(2mL)中的溶液中，然后加入在二氯甲烷(10mL)中含有甲苯磺酸吡啶_(200mg)的溶液(0.2mL)。用TLC(1∶2乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測反應進程，顯示有4-甲氧基苯甲醛二甲縮醛(Rf 0.80)、4-甲氧基苯甲醛(Rf 0.65)、反應物56(Rf 0.42)和產(chǎn)物57(Rf 0.26)。53/4h后，將混合物與飽和碳酸氫鈉溶液(5mL)一起攪拌15min，然后用乙酸乙酯(25mL)平衡。將有機層用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶3和1∶2乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到57，為無色糖漿狀物，0.106mg(100％)1H NMR0.94(3H，s)，1.19，1.21(6H，各為單峰，Me2COH)，1.23，1.35和1.24，1.37(6H，各為單峰，主要和次要的5，5-二甲基氧雜環(huán)戊烷非對映體)，1.1-1.7(18H，m)，1.7-1.9(5H，m)，1.9-2.0(2H，m)，3.65(1H，m)，3.81(3H，s)，4.08(1H，brs)，5.78和5.96(1H，各為單峰，主要和次要的縮醛非對映體)，6.89(2H，m)，7.41(2H，m)。-1-(5-羥基-1(S)-{2-[2-(4-甲氧基-苯基)-5，5-二甲基-[1，3]二氧戊環(huán)-4(R)-基]-乙基}-5-甲基-己基)-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(58) 將重鉻酸吡啶_(230mg，0.61mmol)加入到攪拌著的含有57(0.0838，0.167mmol)、硅藻土(185mg)和二氯甲烷(4mL)的混合物中。用TLC(1∶25甲醇-氯仿)監(jiān)測57(Rf0.31)向58(Rf0.42)的轉(zhuǎn)化。2.5h后，將混合物用二氯甲烷(10mL)稀釋，然后通過一層硅膠過濾。蒸發(fā)濾液和洗液(1∶1二氯甲烷-乙酸乙酯)，將殘余物經(jīng)色譜處理(1∶4乙酸乙酯-己烷)，得到酮58，0.0763g，91％1H NMR0.63(3H，s)，1.19，1.21和1.23(6H，各為單峰，Me2COH)，1.25，1.36，1.38(6H，m，s，s，5，5-二甲基氧雜環(huán)戊烷非對映體)，1.1-1.9(18H，m)，1.9-2.1(3H，m)，2.1-2.4(2H，m)，2.45(1H，m)，3.66(1H，m)，3.802和3.805(3H，各為單峰)，5.78和5.95(1H，各為單峰，主要和次要的縮醛非對映體)，6.89(2H，m)，7.39(2H，m)。-1-[4(R)，5-二羥基-1(S)-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(59)
將酮58在1N草酸的90％甲醇溶液中攪拌。幾分鐘后混合物變得均勻。75min后TLC(乙酸乙酯)提示反應完全(59的Rf0.24)。因而，加入碳酸鈣(0.60g)，將混懸液攪拌過夜，然后過濾。蒸發(fā)濾液，經(jīng)快速色譜處理，使用4∶1∶5二氯甲烷-乙酸乙酯-己烷、1∶1乙酸乙酯-己烷和純乙酸乙酯的逐步梯度，得到59，為無色殘余物，0.060mg，94％1H NMR0.5(3H，s)，1.17(3H，s)，1.22(6H，s)，1.23(3H，s)，1.2-1.21(23H，m)，2.15-2.35(2H，m)，2.45(1H，dd，J＝7和11Hz)，3.30，1H，brd)。-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚-4-酮(60) 將59(0.055g，0.143mmol)、咪唑(14.9mg，1.69mmol)、N，N-二甲基吡啶(6mg)、三乙基氯硅烷(0.168mL，1mmol)與N，N-二甲基甲酰胺(1.5mL)的混合物攪拌17h。用TLC(1∶4乙酸乙酯-己烷)跟蹤反應，顯示迅速轉(zhuǎn)化為二硅烷基中間體(Rf 0.47)。進一步的反應順利地進行過夜，得到完全硅烷基化的60(Rf 0.90)。將溶液用水(3mL)平衡，用乙酸乙酯(20mL)平衡，將乙酸乙酯層用水洗滌(3×4mL)，干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用己烷和1∶100乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到60，為無色糖漿狀物，0.0813g，78.4％1H NMRδ0.55-0.64(2IH，m)，0.92-0.97(27H，m)，1.12(3H，s)，1.18(3H，s)，1.19(3H，s)，1.21(3H，s)，1.1-1.7(18H，m)，1.9-2.15(2H，m)，2.15-2.35(2H，m)，2.43(1H，dd，J＝7.7和11Hz)，3.30(1H，dd，J＝3和8.4Hz)。-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(61) 在-70℃下，將1.6M丁基鋰的己烷溶液(0.14mL)加入到膦(0.1308g，0.224mmol)在四氫呋喃(1.5mL)中的溶液中。10min后，歷經(jīng)15min滴加酮60(0.0813g，0.112mmol)在四氫呋喃(1.5mL)中的溶液。3h后，內(nèi)_鹽的顏色褪去，加入pH7磷酸鹽緩沖液(2mL)，使溫度增加至0℃。將混合物用己烷(30mL)平衡，將有機層用鹽水(5mL)洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無色油狀物，將其經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)。僅收集Rf0.33的帶(TLC，1∶39乙酸乙酯-己烷)。蒸發(fā)這些級分，得到61，為無色糖漿狀物，0.070g，57％1H NMRδ0.06(12H，brs)，0.53-0.64(21H，m)，0.88(18H，s)，0.92-0.97(27H，m)，1.11(3H，s)，1.177(3H，s)，1.184(3H，s)，1.195(3H，s)，1-1.9(22H，m)，1.98(2H，m)，2.22(1H，m)，2.45(1H，m)，2.83(1H，brd，J＝13Hz)，3.27(1H，d，J＝6Hz)，4.19(1H，m)，4.38(1H，m)，4.87(1H，brs)，5.18(1H，brs)，6.02(1H，d，J＝11Hz)，6.24(1H，d，J＝11Hz)。
1，25-二羥基-21(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-膽骨化醇(50)的合成
用TLC(乙酸乙酯)跟蹤61(0.068g，0.06238mmol)在1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液中的去保護反應，逐漸進行得到50(Rf 0.19)。25h后，將混合物用鹽水(5mL)稀釋，攪拌5min，用乙酸乙酯(35mL)和水(15mL)平衡。水層用乙酸乙酯(35mL)反萃取一次，合并萃取液，用水(5×10mL)和鹽水(5mL)洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，使用1∶1與2∶1乙酸乙酯-己烷和2∶98甲醇-乙酸乙酯的線性梯度，得到殘余物，將其用甲酸甲酯吸收，蒸發(fā)，得到白色泡沫狀物，30mg，93％[α]D+29.3°(甲醇，c0.34)；MHz1H NMRδ0.55(3H，s)，1.16(3H，s)，1.21(9H，s)，1.1-1.75(22H，m)，1.80(2H，m)，1.9-2.1(5H，m)，2.31(1H，dd，J＝7和13Hz)，2.60(1H，brd)，284(1H，m)，3.29(1H，d，J＝9.5Hz)，4.22(1H，m)，4.43(1H，m)，5.00(1H，s)，5.33(1H，s)，6.02(1H，d，J＝11Hz)，6.02(1H，d，J＝11Hz)；LR-ES(-)m/z564(M+H2CO2)，563M-H+H2CO2)；HR-ES(+)C32H54O5+Na的計算值541.3863；實測值541.3854；UVmax(ε)211(15017)，265(15850)，204sh(14127)，245sh(13747)nm。
合成實施例43-1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇(62)的合成 [1R，3aR，7aR，4E]-4-{2(Z)-[3(S)，5(R)-雙-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基-1-[5-甲基-1(S)-(4-甲基-4-三乙基硅烷氧基-戊基)-4(R)，5-雙-三乙基硅烷氧基-己基]-八氫-茚(63)
在-70℃下，將1.6M丁基鋰的己烷溶液加入到膦的四氫呋喃溶液中。10min后，歷經(jīng)15min滴加來自實施例2的酮60的四氫呋喃溶液。內(nèi)_鹽的顏色褪去后，加入pH7磷酸鹽緩沖液，使溫度增加至0℃。將混合物用己烷平衡，將有機層用鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無色油狀物，將其經(jīng)快速色譜純化(1∶100乙酸乙酯-己烷)，得到63。
1，25-二羥基-21-(2R，3-二羥基-3-甲基-丁基)-20S-19-降-膽骨化醇(62) 在1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液中進行63的去保護反應，得到62。25h后，將混合物用鹽水稀釋，攪拌5min，然后用乙酸乙酯和水平衡。水層用乙酸乙酯反萃取一次，合并萃取液，用水和鹽水洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將殘余物經(jīng)快速色譜處理，得到殘余物，將其用甲酸甲酯吸收，蒸發(fā)，得到62。
合成實施例44-1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇(64)的合成
(R)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-7-苯硫基-庚-2-醇(65) 以上反應如Tet. Lett.1975，171409-12所述進行。具體而言，向50mL的圓底燒瓶中裝入1.54g(3.73mmol)(R)-2-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-7a-甲基八氫茚-1-基]-6-甲基庚烷-1，6-二醇(1)(Eur.J.Org.Chem.2004，1703-1713)和2.45g(11.2mmol)二苯硫。將混合物溶于5mL吡啶，加入2.27g(11.2mmol，2.80mL)三丁基膦。將混合物攪拌過夜，然后用20mL甲苯稀釋，蒸發(fā)。將殘余物再次用甲苯吸收，蒸發(fā)，其余液體在硅膠上經(jīng)色譜處理，使用己烷、1∶39、1∶19和1∶9乙酸乙酯-己烷的逐步梯度，得到標題化合物65，為糖漿狀物，1.95g。
(R)-7-苯磺酰基-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2-甲基-庚-2-醇(67)和(1R，3aR，4S，7aR)-1-((R)-1-苯磺酰基甲基-5-甲基-5-三乙基硅烷氧基-己基)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚(68)
向含有1.95g(3.9mmol)粗品硫化物65的500mL圓底燒瓶中混入84g二氯甲烷(63mL)。將溶液在冰浴中攪拌，然后一次性加入2.77g(11mmol)間氯過苯甲酸。將混懸液在冰浴中攪拌40min，然后在室溫下攪拌2h。用TLC(1∶19甲醇-二氯甲烷)監(jiān)測反應。在反應結(jié)束時，觀察到僅有一個斑點Rf 0.45。然后，向混懸液中加入1.68g(20mmol)固體碳酸氫鈉，將混懸液攪拌10min，然后分批加入30mL水，繼續(xù)劇烈攪拌5min，以溶解全部固體。將混合物進一步用40mL己烷稀釋，攪拌30min，用41.6g己烷轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。棄去下層，將上層用25mL飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(硫酸鈉)，蒸發(fā)，得到3.48g 67。將該物質(zhì)用己烷研制，過濾，蒸發(fā)，留下67，為渾濁的糖漿狀物(2.81g)，將其直接用于下一步。
向含有2.81g以上獲得的67的100mL圓底燒瓶中裝入30mL N，N-二甲基甲酰胺、1.43g(21mmol)咪唑和1.75mL(10mmol)三乙基硅烷基氯。將混合物攪拌17h，然后用50g冰水稀釋，攪拌10min，進一步用5mL鹽水和60mL己烷稀釋。水層用20mL己烷反萃取，合并兩次萃取液，用2×30mL水洗滌，干燥，蒸發(fā)。該物質(zhì)含有主要的斑點Rf 0.12(1∶39乙酸乙酯-己烷)和次要的斑點Rf 0.06。將該物質(zhì)在硅膠上進行色譜處理，使用己烷、1∶100、1∶79、1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶39和1∶19乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.83g 68。
(R)-5-苯磺?；?6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-10-甲基-2-(R)-甲基-10-三乙基硅烷氧基-十一烷-2，3-二醇(69)
向配有磁攪拌器、溫度計和具有橡膠隔板和氮氣掃(nitrogen sweep)的克萊森接頭的100mL 3頸圓底燒瓶中裝入1.7636g(2.708mmol)砜68、1.114g(4.062mmol)甲苯磺酸鹽和50mL從二苯酮羰游基新鮮蒸餾的四氫呋喃。將該溶液冷卻至-20℃，在≤-20℃下滴加9.31mL 1.6M丁基鋰的己烷溶液。維持溫度范圍在-10與-20℃之間達5h。除去冷卻浴，加入50mL飽和氯化銨溶液，然后加入75mL乙酸乙酯和足量的水，以溶解所有鹽。將有機層用15mL鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)，得到無色油狀物。將該殘余物在硅膠上進行色譜處理，使用己烷、1∶9、1∶6、1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶4和1∶3乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.6872g化合物69，為無色糖漿狀物。
(S)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-10-甲基-2-(R)-甲基-10-三乙基硅烷氧基-十一烷-2，3-二醇(70) 向配有磁攪拌器、溫度計和具有橡膠隔板和氮氣掃的克萊森接頭的25mL 2頸圓底燒瓶中裝入1.6872g(2.238mmol)砜69和40mL甲醇。然后向攪拌著的溶液中分兩等份加入1.25g(51.4mmol)鎂，間隔30min。將混懸液攪拌70min，然后加入另外0.17g鎂和約5mL甲醇，繼續(xù)攪拌1h。然后將混合物用100mL己烷稀釋，滴加50mL 1M硫酸，得到兩個液體相。水層是中性的。水層用25mL 1∶1二氯甲烷-己烷反萃取一次。合并有機層，然后用15mL鹽水洗滌一次，干燥，蒸發(fā)。將所得物質(zhì)在硅膠上進行色譜處理，使用己烷、1∶39、1∶19和1∶9乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶9乙酸乙酯-己烷洗脫，得到1.2611g 70，為無色糖漿狀物。
(S)-6-[(1R，3aR，4S，7aR)-4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-八氫-茚-1-基]-2，10-二羥基-2，10-二甲基-十一烷-3-酮(71) 向配有磁攪拌器、溫度計、具有氮氣掃和橡膠隔板的克萊森接頭的25mL圓底燒瓶中裝入518mg(3.88mmol)N-氯琥珀酰亞胺和11mL甲苯。攪拌5min(沒有全部溶解)，然后冷卻至0℃，加入2.4mL(4.8mmol)2M二甲硫的甲苯溶液。將混合物攪拌5min，然后冷卻至-30℃，在-30℃下滴加0.7143g(1.165mmol)二醇70在4×1.5mL甲苯中的溶液。繼續(xù)在該溫度下攪拌1h。然后使混合物在2h期間升溫至-10℃，然后冷卻至-17℃，滴加3.20mL(6.4mmol)2M三乙胺的甲苯溶液。將混合物在-17至-20℃下攪拌10min，然后緩慢升溫至室溫。將混合物在硅膠柱上進行色譜處理，使用己烷、1∶79、1∶39、1∶19、1∶9、1∶4和1∶1乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度。主要的帶用1∶1乙酸乙酯-己烷洗脫，得到0.3428g化合物71，為固體。
(S)-2，10-二羥基-6-((1R，3aR，4S，7aR)-4-羥基-7a-甲基-八氫-茚-1-基)-2，10-二甲基-十一烷-3-酮(72) 向配有磁攪拌器的25mL圓底燒瓶中裝入0.3428g(0.69mmol)二醇71，溶于5mL乙腈，然后加入1.25mL氟硅酸溶液。3h后，將混合物在35mL乙酸乙酯與10mL水之間分配，水層用10mL乙酸乙酯反萃取，合并有機層，用2×5mL水洗滌，用5mL 1∶1鹽水-飽和碳酸氫鈉溶液洗滌一次，干燥，蒸發(fā)。將該物質(zhì)在硅膠上進行色譜處理，使用1∶4、1∶3、1∶2和1∶1作為逐步梯度，得到0.2085g標題化合物72。
(1R，3aR，7aR)-1-[(S)-5-羥基-1-(4-羥基-4-甲基-戊基)-5-甲基-4-氧代-己基]-7a-甲基-八氫-茚-4-酮(73) 向25mL圓底燒瓶中裝入0.2153g(0.56mmol)72、5mL二氯甲烷和0.20g硅藻土。向該攪拌著的混懸液中一次性加入1.00g(2.66mmol)重鉻酸吡啶_。將反應攪拌3h，用TLC(1∶1乙酸乙酯-己烷)監(jiān)測進程。將反應混合物用5mL環(huán)己烷稀釋，然后通過硅膠G過濾。用二氯甲烷、然后用1∶1乙酸乙酯-己烷對柱進行洗脫，直至在流出物中檢測不到溶質(zhì)。蒸發(fā)流出物，得到無色油狀物。然后將該油狀物在硅膠上進行色譜處理，使用1∶4、1∶3、1∶2、1∶1和2∶1乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.2077g二酮73。
(1R，3aR，7aR)-7a-甲基-1-[(S)-5-甲基-1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-4-氧代-5-三甲基硅烷氧基-己基]-八氫-茚-4-酮(74) 向25mL圓底燒瓶中裝入0.2077g(0.545mmol)二酮73。將該物質(zhì)溶于0.5mL四氫呋喃與3mL環(huán)己烷的混合物。向所得混合物中加入0.30mL(2.0mmol)TMS-咪唑。10h后，將反應混合物用3mL己烷稀釋，然后濃縮，在硅膠上進行色譜處理，使用己烷、1∶79、1∶39、1∶19乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.2381g 74，為無色油狀物。
(S)-6-((1R，3aS，7aR)-4-{2-[(R)-3-((R)-叔丁基二甲基硅烷氧基)-5-(叔丁基二甲基硅烷氧基)-亞環(huán)己基]-亞乙基}-7a-甲基八氫茚-1-基)-2，10-二甲基-2，10-雙-三甲基硅烷氧基十一烷-3-酮(75)
向配有磁攪拌器、溫度計和含有氮氣掃與橡膠隔板的克萊森接頭的15mL 3頸梨形燒瓶中裝入0.2722g(0.4768mmol)[2-[(3R，5R)-3，5-雙，(叔丁基二甲基硅烷氧基)亞環(huán)己基]乙基]二苯基氧化膦和2mL四氫呋喃。將溶液冷卻至-70℃，加入0.30mL 1.6M丁基鋰的己烷溶液。將深紅色溶液在該溫度下攪拌10min，然后歷經(jīng)10min經(jīng)由注射器滴加溶于2mL四氫呋喃的0.1261g(0.240mmol)二酮74。3h又15min后，在-65℃下加入5mL飽和氯化銨溶液，使混合物升溫至10℃，然后在35mL己烷與10mL水之間分配。水層用10mL己烷反萃取一次，合并各層，用含有2mL pH7緩沖液的5mL鹽水洗滌，然后干燥，蒸發(fā)。將該物質(zhì)在15×150mm快速柱上進行色譜處理，使用己烷和1∶100乙酸乙酯-己烷作為逐步梯度，得到0.1572g標題化合物75，為無色糖漿狀物。
1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-19-降-膽骨化醇(64) 向配有磁攪拌器的15mL 3頸圓底燒瓶中裝入155mg(0.17mmol)四硅烷基醚75。將該無色殘余物溶于2mL 1M四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液。43h后，加入另外0.5mL 1M四丁基氟化銨溶液，繼續(xù)攪拌5h。將淺褐色溶液用5mL鹽水稀釋，攪拌5min，用50mL乙酸乙酯和5mL水轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，然后用5mL乙酸乙酯反萃取。合并有機層，用5×10mL水、10mL鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)。將所得殘余物在15×123mm柱上進行色譜處理，使用2∶3、1∶1、2∶1乙酸乙酯-己烷和乙酸乙酯作為逐步梯度，得到64，為白色固體(TLC，乙酸乙酯，Rf0.23)，將其用甲酸甲酯吸收，過濾，蒸發(fā)，得到0.0753g標題化合物64，為固體物質(zhì)。
合成實施例45-1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇(76)的合成 (S)-6-{(1R，3aS，7aR)-4-[2-[(R)-3-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-5-((S)-叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-2-亞甲基-亞環(huán)己基]-亞乙-(E)-基]-7a-甲基-八氫-茚-1-基}-2，10-二甲基-2，10-雙-三甲基硅烷氧基-十一烷-3-酮(77)如實施例4關于75所述制備化合物77，但是使74與[(2Z)-2-[(3S，5R)-3，5-雙(叔丁基二甲基硅烷氧基)亞甲基亞環(huán)己基]-乙基]二苯基氧化膦反應。
1，25-二羥基-20S-21(3-羥基-3-甲基-丁基)-24-酮基-膽骨化醇(76)如實施例44關于64所述，通過將77去保護從77制備化合物76。
合成實施例46-1α，25-二羥基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(78)(化合物H)的合成按照下列合成工藝合成化合物(78)。
在-78℃下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-1-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]}-環(huán)丙基}-乙炔基(1.0g，2.90mmol)在四氫呋喃(15mL)中的溶液中加入n-BuLi(2.72mL，4.35mmol，1.6M己烷溶液)。在-78℃下攪拌1h后，加入丙酮(2.5mL，34.6mmol)，繼續(xù)攪拌2.5h。加入NH4Claq(15mL)，將混合物在室溫下攪拌15min，然后用AcOEt萃取(2×50mL)。合并萃取液，用鹽水(50mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(2.4g)經(jīng)FC純化(50g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到(3aR，4S，7aR)-5-{1-[4-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-1-基]-環(huán)丙基}-2-甲基-戊-3-炔-2-醇(1.05g，2.61mmol)，將其用四丁基氟化銨(6mL，6mmol，1.0M THF溶液)處理，在65-75℃下攪拌48h。將混合物用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×25mL)和鹽水(25mL)洗滌。合并水性洗液，用AcOEt(25mL)萃取，合并有機萃取液，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(1.1g)經(jīng)FC純化(50g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(0.75g，2.59mmol，90％)。[α]30D＝+2.7c 0.75，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.50(1H，m)，4.18(1H，m)，2.40(2H，s)，2.35-1.16(11H，m)，1.48(6H，s)，1.20(3H，s)，0.76-0.50(4H，m)；13C NMR(CDCl3)156.39，125.26，86.39，80.19，69.21，65.16，55.14，46.94，35.79，33.60，31.67，29.91，27.22，19.32，19.19，17.73，10.94，10.37；C22H28O2的MS HREI計算值M+288.2089觀測值M+288.2091。
將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(-4-羥基-4-甲基-戊-2-炔基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(0.72g，2.50mmol)、乙酸乙酯(10mL)、己烷(24mL)、無水乙醇(0.9mL)、喹啉(47μL)與Lindlar催化劑(156mg，5％Pd/CaCO3)的混合物在室溫下氫化2h。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，用AcOEt洗滌濾墊。合并濾液和洗液，用1M HCl、NaHCO3和鹽水洗滌。用Na2SO4干燥后，蒸發(fā)溶劑，將殘余物(0.79g)經(jīng)FC純化(45g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(640mg，2.2mmol，88％)。
利用Paar儀器，將(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊-2Z-烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(100mg，0.34mmol)、1，4-雙(二苯基-膦基)丁烷1，5環(huán)辛二烯四氟硼酸銠(25mg，0.034mmol)、二氯甲烷(5mL)與一滴汞的混合物在室溫和50p.s.i.壓力下氫化3h。將反應混合物通過硅藻土墊過濾，然后用乙酸乙酯洗滌濾墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)至干(110mg)，經(jīng)FC純化(10g，20％AcOEt的己烷溶液)，得到標題化合物(75mg，0.26mmol，75％)。[α]3D＝-8.5 c 0.65，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.37(1H，m，)，4.14(1H，m)，2.37-1.16(17H，m)，1.19(6H，s)，1.18(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；C19H32O2的MS HREI計算值M+H 292.2402，觀測值M+H 292.2404。
在室溫下，向攪拌著的(3aR，4S，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇(440mg，1.50mmol)與硅藻土(2.0g)在二氯甲烷(10mL)中的混懸液中加入重鉻酸吡啶_(1.13g，3.0mmol)。將所得混合物攪拌5h，通過硅膠(10g)過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮粗品(426mg，1.47mmol，98％)。在室溫下，向攪拌著的(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-羥基-4-甲基-戊烯基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(424mg，1.47mmol)在二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑(0.44mL，3.0mmol)。將所得混合物攪拌1.0h，通過硅膠(10g)過濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物(460mg，1.27mmol，86％)。[α]29D＝-9.9 c 0.55，CHCl3.1H NMR(CDCl3)5.33(1H，dd，J＝3.2，1.5Hz)，2.81(1H，dd，J＝10.7，6.2Hz)，2.44(1H，ddd，J＝15.6，10.7，1.5Hz)，2.30-1.15(13H，m)重疊2.03(ddd，J＝15.8，6.4，3.2Hz)，1.18(6H，s)，0.92(3H，s)，0.66-0.28(4H，m)，0.08(9H，s)；13C NMR(CDCl3)211.08(0)，155.32(0)，124.77(1)，73.98(0)，64.32(1)，53.91(0)，44.70(2)，40.45(2)，38.12(2)，34.70(2)，29.86(3)，29.80(3)，26.80(2)，24.07(2)，22.28(2)，21.24(0)，18.35(3)，12.60(2)，10.64(2)，2.63(3)；C22H38O2Si的MSHRES計算值M+362.2641，觀測值M+362.2648。
在-78℃下，向攪拌著的(1S，5R)-1，5-雙-((叔丁基二甲基)硅烷氧基)-3-[2-(二苯基氧膦基)-亞乙-(Z)-基]-2-亞甲基-環(huán)己烷(675mg，1.16mmol)在四氫呋喃(8mL)中的溶液中加入n-BuLi(0.73mL，1.17mmol)。將所得混合物攪拌15min，滴加(3aR，7aR)-7a-甲基-1-[1-(4-甲基-4-三甲基硅烷氧基-戊基)-環(huán)丙基]-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-酮(210mg，0.58mmol)在四氫呋喃(2mL)中的溶液。將反應混合物在-72℃下攪拌3.5h，用己烷(35mL)稀釋，用鹽水(30mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(850mg)經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)。在室溫下，向1-α，3-β-二(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-25-三甲基硅烷氧基-16-烯-20-環(huán)丙基-膽骨化醇(382mg，0.53mmol)中加入四丁基氟化銨(4mL，4mmol，1M THF溶液)。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(78)(204mg，0.48mmol，83％)。[α]29D＝+16.1 c 0.36，EtOH.UVλmax(EtOH)208nm(ε17024)，264nm(ε16028)；1H NMR(CDCl3)6.37(1H，d，J＝11.3Hz)，6.09(1H，d，J＝11.1Hz)，5.33(2H，m)，5.01(1H，s)，4.44(1H，m)，4.23(1H，m)，2.80(1H，m)，2.60(1H，m)，2.38-1.08(20H，m)，1.19(6H，s)，0.79(3H，s)，0.66-0.24(4H，m)；13C NMR(CDCl3)157.07(0)，147.62(0)，142.49(0)，133.00(0)，124.90(1)，124.73(1)，117.19(1)，111.64(2)，71.10(1)，70.70(0)，66.88(1)，59.53(1)，50.28(0)，45.19(2)，43.85(2)，42.86(2)，38.13(2)，35.59(2)，29.27(2)，29.14(3)，28.65(2)，23.57(2)，22.62(2)，21.29(0)，17.84(3)，12.74(2)，10.30(2)；C28H42O3的MS HRES計算值M+Na449.3026，觀測值M+Na 449.3023。
合成實施例47-1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇(79)(化合物B)的合成按照下列合成工藝合成化合物(79)。
在室溫下，向攪拌著的11-(5-羥基-1，5-二甲基-己-3-烯基)-7a-甲基-3a，4，5，6，7，7a-六氫-3H-茚-4-醇與硅藻土在二氯甲烷中的混懸液(10mL)中加入重鉻酸吡啶_。將所得混合物攪拌5h，通過硅膠過濾，然后用20％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到酮。在室溫下，向攪拌著的酮的二氯甲烷溶液中加入三甲基硅烷基-咪唑。將所得混合物攪拌1.0h，通過硅膠過濾，用10％AcOEt的己烷溶液洗滌硅膠墊。合并濾液和洗液，蒸發(fā)，得到標題化合物。
在-78℃下，向攪拌著的叔丁基-{3-[2-(二苯基-氧膦基)-亞乙基]-5-氟-4-亞甲基-環(huán)己氧基}-二甲基-硅烷的四氫呋喃溶液中加入n-BuLi。將所得混合物攪拌15min，滴加1-(5-乙基-1-甲基-5-三甲基硅烷氧基-庚-3-烯基)-7a-甲基-3，3a，5，6，7，7a-六氫-茚-4-酮的四氫呋喃溶液。將反應混合物在-78℃下攪拌3.5h，用己烷稀釋，用鹽水洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物經(jīng)FC純化(15g，10％AcOEt的己烷溶液)，得到硅烷基化的化合物。在室溫下，向硅烷基化的化合物中加入四丁基氟化銨。將混合物攪拌15h，用AcOEt(25mL)稀釋，用水(5×20mL)和鹽水(20mL)洗滌，用Na2SO4干燥。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物(380mg)經(jīng)FC純化(15g，50％AcOEt的己烷溶液和AcOEt)，得到標題化合物(79)。
生物學實施例生物學實施例1在體內(nèi)模型-環(huán)磷酰胺(CYP)誘發(fā)的大鼠慢性IC中評價維生素D3類似物(化合物A)由腹膜內(nèi)注射CYP誘發(fā)的化學性膀胱鹽的大鼠模型已經(jīng)獲得充分的認可。CYP在臨床實踐中用于治療多種惡性腫瘤。其代謝物之一丙烯醛在尿中以高濃度排泄，導致出血性膀胱炎，伴有尿頻、尿急和盆腔疼痛的癥狀。該炎性過程以膀胱總體組織學的改變、炎性細胞浸潤(肥大細胞、巨噬細胞、PMN)的數(shù)量與分布增加、環(huán)加氧酶-2表達與前列腺素產(chǎn)生、生長因子和細胞因子產(chǎn)生為特征?；瘜W性膀胱炎的大鼠模型非常類似于間質(zhì)性膀胱炎—一種慢性疼痛的膀胱綜合征，并且過去已經(jīng)用于測試治療劑。
這種模型用于測試口服施用1，25-二羥基維生素D3類似物對患有CYP-誘發(fā)的膀胱炎的大鼠的作用。監(jiān)測治療對清醒的自由活動的患有CYP-誘發(fā)的膀胱炎的大鼠的膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)的影響。記錄每只動物的下列膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)·膀胱容量·充盈壓(膀胱充盈開始時的壓力)·閾值壓(排尿前即刻的膀胱壓力)·排尿壓(排尿期間的最大膀胱壓力)·非排尿性膀胱收縮的有無(膀胱壓力增加至少10cm H2O，沒有尿排出)·非排尿性膀胱收縮的幅度。
動物使用8周齡、體重125-175g的Wistar雌性大鼠。向兩組動物的膀胱內(nèi)植入管以記錄膀胱內(nèi)壓力?；謴秃?，所有動物接受三次CYP腹膜內(nèi)注射，隨后分為治療組和假對照組。
治療組大鼠用口服1，25-二羥基維生素D3類似物(1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇)“化合物A”處理14天(日劑量0.1μg/kg)。
對照組大鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
在給予最后一個劑量的藥物或媒介物后24小時，對清醒的自由活動的動物進行膀胱內(nèi)壓測量。
每組的動物數(shù)假對照動物 4治療動物3方法向膀胱植入聚乙烯管在全身吸入麻醉(異氟烷與O2)的情況下進行下部中線腹部切開，向膀胱頂部插入末端經(jīng)過加熱而張開的聚乙烯管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)，用6-0prolene荷包縫合(purse string suture)原位固定。將管的遠端加熱密封，皮下埋植，在頸部背部露出外表，使動物無法觸及。用4-0尼龍縫合線閉合腹部和頸部切口。
腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺恢復(5天)后，受試動物經(jīng)歷三次CYP腹膜內(nèi)注射(Sigma Chemical，St.Luis，MO；75mg/kg每次，腹膜內(nèi))，歷經(jīng)九天。在第一次CPY注射后的第十天，假對照動物僅接受媒介物，而實驗組用1，25-二羥基維生素D3類似物1，3-二-O-乙?；?1，25二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇“化合物A”處理(利用管飼法口服遞送)。處理開始后兩周，將動物在清醒下測定膀胱內(nèi)壓測量圖，以評估膀胱的功能。
膀胱內(nèi)壓測量圖將動物不受限制地放置在籠中，將導管經(jīng)由T-管與壓力傳感器(Grass_ Model PT300，West Warwick，RI)和微量注射泵(HarvardApparatus22，South Natick，MA)連接。在室溫下向膀胱輸注0.9％鹽水溶液，速率10ml/小、時。利用Neurodata Acquisition System (Grass_Model 15，Astro-Med，Inc，West Warwick，RI)連續(xù)記錄膀胱內(nèi)壓力。在25-30分鐘的初始穩(wěn)定期后，記錄至少三個可再現(xiàn)的排尿周期。
實驗時間表程序 天數(shù)適應期1-5管植入+恢復期 6-10CYP處理(三劑75mg/kg i.p.，每三天一劑) 11-17處理(假對照或活性)18-31膀胱內(nèi)壓測量評價 32結(jié)果數(shù)據(jù)分析總結(jié)在表1與2和圖1中，其中Bl.Cap＝膀胱容量(ml)FP＝充盈壓(cmH2O)TP＝閾值壓(cmH2O)MP＝排尿壓(cmH2O)#of NVBC＝非排尿性膀胱收縮的次數(shù)
NVBC的幅度＝非排尿性膀胱收縮的幅度表1對照組的膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)
表2處理組的膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)
注意到很多膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)都有改變。在藥物處理的動物中觀察到非排尿性膀胱收縮的次數(shù)和幅度都大大減少。也記錄到充盈壓和閾值壓有不太明顯但在統(tǒng)計學上仍顯著的減少。處理沒有導致膀胱容量的改變。
與慢性膀胱炎有關的膀胱活動過度本身表現(xiàn)為頻繁的膀胱壁收縮，伴有刺激性、經(jīng)常是疼痛性的泌尿癥狀。非排尿性膀胱收縮的頻率和幅度均減少這一事實有力地表明如果對患有間質(zhì)性膀胱炎的患者的膀胱功能的影響將是相似的，則用維生素D3類似物進行的口服治療就具有緩解這些不利癥狀的潛力。從臨床觀點來看，充盈壓和閾值壓降低是有意義的，因為與間質(zhì)性膀胱炎有關的膀胱內(nèi)壓力增加是潛在危害尿道上部的情況。
生物學實施例2大鼠膀胱的組織學分析通過本領域已知的方法，將來自實施例1的實驗的大鼠膀胱在福爾馬林中固定，包埋在石蠟中，用蘇木精和曙紅染色。
對每只膀胱的至少10個切片進行組織病理學檢查?？紤]不同的炎性參數(shù)·止血·水腫·炎性細胞(主要是淋巴細胞和單核細胞)浸潤·上皮糜爛·纖維化并如下進行評分0＝正常，沒有任何炎癥跡象，1＝輕度，2＝中度，3＝重度，4＝擴散全部切片的嚴重跡象。
結(jié)果以下的表3和4顯示了化合物A對組織學分數(shù)的影響。表3表示媒介物處理的動物，表4表示“化合物A”處理的動物。每種炎性參數(shù)都評為0至4分，其中0是正常，4是最嚴重的癥狀。
表3
表4
圖2顯示了化合物A對大鼠膀胱炎癥的組織學跡象的作用，而圖3顯示了總結(jié)每種炎癥跡象的組織學分數(shù)的直方圖。
實施例1和2的數(shù)據(jù)清楚地證明維生素D3類似物用于治療間質(zhì)性膀胱炎的炎性組分以及間質(zhì)性膀胱炎特征性的膀胱活動過度的效用。
生物學實施例3在體內(nèi)模型-環(huán)磷酰胺(CYP)誘發(fā)的大鼠慢性IC中評價維生素D3類似物(化合物B)方法向膀胱植入聚乙烯管使用Wistar大鼠(250gr雌性，體重125-175g，8周齡)。在用2％異氟烷全身吸入麻醉的情況下，向膀胱頂部插入末端經(jīng)過加熱而張開的聚乙烯管(PE-50，Clay Adams，Parsippany，NJ)，用6-0尼龍荷包縫合原位固定。將管的遠端密封，皮下埋植，通過小切口在頸部背部露出外表。然后將管盤繞并皮下埋藏。
腹膜內(nèi)注射環(huán)磷酰胺恢復(5天)后，受試動物經(jīng)歷三次CYP腹膜內(nèi)注射(Sigma Chemical，St.Luis，MO；75mg/kg每次，腹膜內(nèi))，歷經(jīng)九天。在第一次CPY注射后的第十天，假對照動物僅接受媒介物，而實驗組用1，25-二羥基維生素D3類似物1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇“化合物A”處理(利用管飼法口服遞送)。處理開始后兩周，將動物在清醒下測定膀胱內(nèi)壓測量圖，以評估膀胱的功能。
處理治療組將4-6只大鼠用口服維生素D3類似物(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇)化合物“B”連續(xù)處理14天(日劑量30或75μg/kg)。
對照組將4只大鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
將化合物B的乙醇儲備液(1mg/ml)以適當?shù)臐舛热苡贛iglyol媒介物中。對照動物接受含有等量乙醇的媒介物。在對動物稱重后，通過每日管飼法進行藥物(或媒介物)處理。計算100μl/10克體重的最終體積，制備藥物溶液。
膀胱內(nèi)壓測量圖處理兩周后，將動物不受限制地放置在籠中，將導管的遠端從皮下袋中抽出，經(jīng)由T-管與壓力傳感器(Grass_ Model PT300，West Warwick，RI)和微量注射泵(Harvard Apparatus22，South Natick，MA)連接。向膀胱輸注鹽水溶液(0.9％，室溫)，速率10ml/小時。利用NeurodataAcquisition System(Grass_，Astro-Med，West Warwick，RI)連續(xù)記錄膀胱內(nèi)壓力。至少記錄三個可再現(xiàn)的排尿周期。對每只動物記錄下列膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)充盈壓(FP膀胱充盈開始時的壓力)、閾值壓(TP排尿前即刻的膀胱壓力)、排尿壓(MP排尿期間的最大膀胱壓力)、非排尿性膀胱收縮的有無(NVBC膀胱壓力增加至少10cm H2O，沒有尿排出)。在最后一次排尿或者借助重力排空膀胱之后，通過抽吸膀胱中剩余的殘余尿液測量排泄后殘留(PVR)。計算膀胱容量(BC)，為排泄體積與PVR之和。在安樂死后，收獲膀胱，記錄它的重量。
血鈣(calcemia)評估通過可商購獲得的比色測定法(Calcium Dry-Fast，Sentinel CH.意大利)評價血清鈣。簡言之，在96孔板中，將10μl血清加入到100μl按照生產(chǎn)商的工藝制備的反應溶液中。在RT下溫育5min后，利用分光光度計在570nm下對樣品進行讀數(shù)，使用所指示的參照標準一式三份地計算鈣水平。
結(jié)果表5膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)(括號內(nèi)顯示的是標準誤差值)
再次注意到作為用維生素D化合物(在這種情況下為化合物B)處理的結(jié)果，很多膀胱內(nèi)壓測量參數(shù)都有改變。
非排尿性膀胱收縮的頻率在兩種劑量水平下都顯著地減少了(30ug/kg，p＜0.01；75ug/kg，p＜0.005)，參見圖4。用化合物B處理導致膀胱容量在兩種劑量水平下都增加了(30ug/kg，p＜0.01；75ug/kg，p＜0.01)，如圖5所示。
作為用化合物B處理的結(jié)果，充盈壓和閾值壓有微小增加(在統(tǒng)計學上不顯著)。在較高的劑量水平下用化合物B處理減少了非排尿性膀胱收縮的幅度(在統(tǒng)計學上不顯著)。
在化合物B的兩種劑量水平下，平均血清鈣水平僅有微小的而非顯著的升高，參見圖6(虛線表示在大鼠10.7mg/dl的正常范圍限)。
生物學實施例4在體內(nèi)模型-小鼠變應性IC中評價維生素D3類似物(化合物B)方法一般說明通過腹膜內(nèi)注射，在4mg明礬(SERVA，德國)存在下，注射10μg/小鼠的來自Sigma的雞卵清蛋白(OVA，V級)，使小鼠(BALB/c，雌性8周齡，體重18-20g，Charles River，Calco ITA)致敏化，每周一次，持續(xù)4周。這會誘導血清中可檢測的持續(xù)性IgE水平。
在最后一次免疫接種激發(fā)(immunization boost)之后一周或兩周，將敏化小鼠麻醉(1.5％異氟烷)，然后沿尿道插入導管(24 gauge，3/4 in.；Angiocath，Becton-Dickson)。向下腹部施加微小指壓，以排放尿液。
向膀胱滴注150μl單獨的鹽水或OVA(1mg/150μl)，以緩慢速率輸注以避免創(chuàng)傷和膀胱-輸尿管回流，在30min間隔內(nèi)重復兩次，使用固定在導管上的注射器進行，持續(xù)至少30min。在第一次膀胱攻擊之后7-10天，利用相同的方法重復進行膀胱攻擊。
治療組將10只小鼠用口服維生素D3類似物(1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇)化合物“B”處理14天(日劑量30或75μg/kg)。
對照組將10只小鼠用口服媒介物(miglyol)處理，劑量等于治療組。
將化合物B的乙醇儲備液(1mg/ml)以適當?shù)臐舛热苡贛iglyol媒介物中。對照動物接受含有等量乙醇的媒介物。在對動物稱重后，通過每日管飼法進行藥物(或媒介物)處理。計算100μl/10克體重的最終體積，制備藥物溶液，處理開始于第一次膀胱內(nèi)卵清蛋白攻擊當天，每日維持，但是跨越周末時中斷，總計處理12天。圖7闡述了實驗的時間表。
ELISA利用可商購獲得的試劑盒(BD Opteia，Mouse IgE ELISA Set Cat.No.555248)并且按照生產(chǎn)商的指導測定血清總IgE水平。簡言之，用50μL/孔的捕獲抗體包被微孔，所述抗體被稀釋在包被緩沖液(0.1M碳酸鈉，pH9.58.40g NaHCO3，3.56g Na2CO3；適量至1.0L；pH至9.5；新鮮制備或者在制備7天內(nèi)使用，貯存在2-8℃下)中。根據(jù)批次-特異性指導/分析證書，推薦的抗體包被稀釋比例為1∶250。將板密封，在4℃下溫育過夜。洗滌(6×PBS/吐溫0.1％)后，將板用≥200μL/孔PBS/10％FBS封閉，在室溫(RT)下溫育1小時。將各為100μL的標準、樣品和對照吸移至適當?shù)目字?，將板在RT下溫育2小時。6次洗滌后，向每個孔中加入100μL所制備的檢測抗體+抗生物素蛋白-HRP(1∶250)試劑，在RT下放置1小時。如上洗滌后，向板中加入0.1ml底物溶液，進一步在RT下于暗處溫育30分鐘(沒有板密封器)。反應停止(H2SO41M，50μl/孔)后，在30分鐘內(nèi)記錄450nm下的吸光度。
按照下列工藝測定OVA-特異性IgE。在碳酸鹽緩沖液中包被抗小鼠IgE抗體(1ug/ml Pharmingen，cat.)，將板在4℃下進行溫育。封閉(＞200ulPBS/10％FBS，1hr37℃)后，將板用在4℃下適當稀釋的血清樣品進一步溫育。充分洗滌后，向每個孔中加入PBS/含有生物素化的卵清蛋白(最終濃度10ug/ml)的5％FBS，將板在RT下溫育2hr。加入鏈霉抗生物素蛋白-HRP(1∶5000，Pharmingen，45min RT)和特異性底物顯露OVA-特異性IgE。最后，在反應終止后記錄450nm的吸光度。
組織學和免疫組織化學從動物中移出膀胱，縱向分為兩部分，一半立即在福爾馬林(10％緩沖的)中固定至少3hr，或者在OCT冷凍介質(zhì)(Tissue-Tek Sakura)中切開后在液氮中迅速冷凍。對于組織學分析，將固定的膀胱進行進一步加工，最后用石蠟包埋。連續(xù)切制5μm的切片，然后用GIEMSA染色(BDH，20％溶液，3hr RT)，然后在0.1％乙酸中去染色10秒。在二甲苯中經(jīng)過澄清步驟后，將載玻片用Eukitt培養(yǎng)基永久封固，由病理學家以盲法方式進行分析，以便評價炎性細胞浸潤、肥大細胞數(shù)量和間質(zhì)水腫的存在。采用半定量的組織學評分1為輕微浸潤，沒有水腫；2為中等浸潤，微小水腫；3為嚴重浸潤，水腫。
在所選擇的膀胱組織中，通過對冷凍切片進行免疫組織化學染色，檢查維生素D3受體(VDR)的表達。在RT下將切片在丙酮中固定10min。5次PBS洗滌后，將載玻片與含有0.3％ H2O2的甲醇一起在RT下溫育30min，目的是淬滅內(nèi)源性過氧化物酶，然后用5％正常兔血清預溫育1hr。然后向載玻片加入抗VDR抗體(Affinity Bio Reagents克隆9A7同種型IgG2b)(最終濃度5ug/ml)，在4℃下延長溫育。
徹底洗滌后，將切片與兔抗大鼠IgG(10ug/ml)一起在RT下溫育1hr，再次洗滌，進一步與鏈霉抗生物素蛋白-HRP(Vector Labs)一起在RT下溫育30min。加入特異性色原(Vector Labs)使載玻片顯色，直至達到良好的視覺染色，用蘇木精復染色，最后用Eukitt培養(yǎng)基(Bio-optica)永久封固。
Taq-man分析利用RNeasy Mini試劑盒(Qiagen)從一半膀胱中提取總RNA，用脫氧核糖核酸酶1(Qiagen)處理，利用具有隨機六聚體的逆轉(zhuǎn)錄試劑(AppliedBiosystems)進行逆轉(zhuǎn)錄(按照生產(chǎn)商的說明)。從1ug RNA合成cDNA。在96孔光學反應板(Applied Biosystems)中進行實時PCR。對于每種樣品，我們在不同的孔(singleplex)中一式兩份地擴增靶基因和管家基因(HPRT)。按照下列方案制備擴增主控混合物(Master Mix)(體積表示單個孔，最終體積為40ul/孔)2X TaqMan_ Universal PCR主控混合物(Applied Biosystems，4304437)20ul；20X測定靶基因2ul；H2O8ul；cDNA10ul。在SDS 7000(Applied Biosystems)儀器上進行反應，利用下列擴增程序2’，50℃；10’，95℃；15”，95℃；1’，60℃，40個周期。將周期閾(Ct)值輸出到Excel工作表中進行分析，利用ΔCt法進行相對定量。所使用的所有引物都攜帶FAM報道基因。
血鈣評估通過可商購獲得的比色測定法(Calcium Dry-Fast，Sentinel CH.意大利)評價血清鈣。簡言之，在96孔板中，將10μl血清加入到100μl按照生產(chǎn)商的方法制備的反應溶液中。在RT下溫育5min后，利用分光光度計在570nm下對樣品進行讀數(shù)，使用所指示的參照標準一式三份地計算鈣水平。
結(jié)果ELISA圖8顯示了IgE的總量，圖9顯示了抗原特異性IgE的量。數(shù)據(jù)代表重復至少三次的單一實驗，8-10只受試動物/組(治療、對照和血清水平預攻擊)。僅顯示了一種劑量75ug/kg的結(jié)果，利用30ug/kg的劑量獲得了相似的結(jié)果(沒有顯示)。
數(shù)據(jù)表明，該方法非常有效地誘導免疫應答，卵清蛋白/明礬處理的動物中的抗原特異性血清IgE與相同動物的攻擊前的血清相比增加8倍。然而，在媒介物與化合物B處理的動物之間在IgE總量或卵清蛋白特異性IgE的水平方面沒有檢測到顯著改變。這一發(fā)現(xiàn)正如所預期的那樣。
肥大細胞衍生的糜蛋白酶(chymase)MMCP1蛋白的血清水平如圖10所示。一旦暴露于抗原，膀胱粘膜通過觸發(fā)駐留肥大細胞的脫粒和導致多種炎性介質(zhì)的釋放而發(fā)生反應。糜蛋白酶MMCP1蛋白的血清水平在用化合物B(75ug/kg)處理的小鼠中顯著(p＜0.05)低于用媒介物處理的那些，這提示了對肥大細胞誘導的炎性應答的抑制作用。
血鈣用化合物B(75ug/kg)處理沒有導致血鈣水平上升至毒性閾值以上，如圖11所示(虛線表示在小鼠中10.7mg/dl的毒性閾)。在化合物B處理的組中注意到血清鈣水平有小的但是在統(tǒng)計學上顯著的增加(p＜0.05)。在用較低劑量(30mg/kg)化合物B處理的小鼠中沒有檢測到血清鈣水平的顯著改變(沒有顯示)。
體重圖12闡述了(化合物B，75ug/kg)處理的動物和對照動物的體重差異。數(shù)據(jù)以平均值和標準偏差值表示。每組8-10只受試動物。兩組的數(shù)據(jù)點顯示沒有顯著性差異。因為體重是毒性的良好指征，這一發(fā)現(xiàn)為用化合物B治療不會導致副作用提供了證據(jù)。
Taq-man分析各種炎性標志物的水平如圖13所示給出了鹽水攻擊(媒介物處理)的和卵清蛋白攻擊(媒介物、化合物B30ug/kg和化合物B75ug/kg處理)的IL-13、MCPT2和FcεR1α。通過合并從受試者回收的等量血清得到這些結(jié)果。用化合物B進行口服處理在兩種劑量水平下(以劑量依賴性方式)顯著減少所有三種炎性標志物的表達。用鹽水攻擊沒有顯示Th2/肥大細胞特異性標志物有任何增加。
圖14闡述了關于卵清蛋白攻擊(媒介物和化合物B處理75ug/kg)的小鼠的炎性標志物IL-13、MMCP4和FcεR1α存在的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示了單個動物的各個數(shù)值。在對照組內(nèi)觀察到標志物有不同程度的增量調(diào)節(jié)，提示動物可以以不同速率從攻擊中恢復。但是，用維生素D3類似物口服處理減量調(diào)節(jié)炎性標志物的表達，這一發(fā)現(xiàn)提示本發(fā)明的化合物可以調(diào)控膀胱中的Th2型炎性應答。
組織學媒介物和化合物B處理(75ug/kg)的動物的膀胱切片的盲法組織學分析數(shù)據(jù)列在圖15中。觀察到肥大細胞(p＜0.05)、嗜酸性粒細胞(p＜0.01)和淋巴細胞(p＜0.01)有顯著的減少，水腫似乎完全消散了(p＜0.001)。
用化合物B處理的效果在圖16所示的代表性切片中也是顯而易見的，其中在化合物B處理的動物(75ug/kg)中沒有水腫的跡象，但是在對照動物(媒介物處理的)中有大量用箭頭指示的損傷。
討論本實施例所給出的數(shù)據(jù)支持了這樣一種假說，維生素D3類似物化合物B通過減量調(diào)節(jié)典型標志物例如IL-13或FcεR1α的表達而有效調(diào)控膀胱中的Th2型炎性應答。另外，在藥物處理后在卵清蛋白攻擊的膀胱內(nèi)也可檢測到炎性細胞浸潤減少，這表明炎性細胞的遷移可能被減少了，原因可能是細胞因子/趨化因子環(huán)境減少和骨髓中細胞成熟受損?；衔顱處理也抑制血清中MMCP1蛋白的釋放，提示了對肥大細胞活化的直接作用。但是，尚不清楚這種所觀察到的作用是由肥大細胞遷移至膀胱粘膜內(nèi)的數(shù)量減少還是由維生素D3類似物對肥大細胞脫粒的直接作用所產(chǎn)生的。
可以得出結(jié)論用維生素D3類似物化合物B口服處理在變應原誘發(fā)的慢性膀胱炎癥模型中對膀胱發(fā)揮抗炎作用，表明維生素D化合物代表間質(zhì)性膀胱鹽的一種新的治療選擇。
生物實施例5在體內(nèi)模型-小鼠變應性IC中評價維生素D3類似物(化合物C-I)方法按照前文實施例6所述的一般方法進行實施例7中的實驗。將小鼠用鹽水(未處理)或卵清蛋白(用媒介物或者化合物C-I之一處理，劑量如表6所示，以ug/kg計)攻擊。
表6實施例7中所用的化合物A-I的化學名稱和劑量
結(jié)果實施例7的實驗結(jié)果總結(jié)在圖17中。數(shù)據(jù)以圖形方式闡述在圖18至26中。
FcεR1α炎性標志物的表達如圖18所示。用化合物E(p＜0.05)、化合物H(p＜0.05)、特別是化合物F(p＜0.001)處理引起FcεR1α基因的mRNA表達水平的統(tǒng)計學上顯著的降低。
IL-13炎性標志物的表達如圖19所示。用化合物H(p＜0.05)、化合物I(p＜0.05)、特別是化合物E(p＜0.001)和化合物F(p＜0.001)處理引起IL-13基因的mRNA表達水平的統(tǒng)計學上顯著的降低。
MMCP4炎性標志物的表達如圖20所示。用化合物H(p＜0.05)、化合物I(p＜0.05)、特別是化合物E(p＜0.001)和化合物F(p＜0.001)處理引起MMCP4基因的mRNA表達水平的統(tǒng)計學上顯著的降低。
圖21顯示了MMCP1的血清水平。用化合物F(p＜0.05)、特別是化合物A(p＜0.001)和化合物E(p＜0.001)處理引起MMCP1蛋白的血清水平的統(tǒng)計學上顯著的降低。
盲法組織學分析的數(shù)據(jù)如圖22至25所示。注意到用一些供試化合物處理的數(shù)據(jù)此時沒有。用維生素D3類似物化合物C處理導致膀胱壁中肥大細胞的數(shù)量相對于對照(媒介物處理)動物而言有顯著減少(p＜0.05)，如圖22所示。用化合物A處理導致膀胱壁中嗜酸性粒細胞的數(shù)量顯著減少(p＜0.05)，如圖23所示。圖24顯示用化合物E和化合物I處理都引起膀胱壁中LMPC的數(shù)量顯著減少(對于這兩種處理，p＜0.05)。水腫評價如圖25所示。
與媒介物處理的對照組相比，用化合物C、化合物E、化合物F、化合物H和化合物I處理引起血清鈣水平輕微升高(在所有情況下p＜0.001)，血清鈣升高的程度因治療組而異。用化合物A或化合物G處理顯示血清鈣水平?jīng)]有顯著增加。
總結(jié)實施例7中所有上述結(jié)果，我們可以得出結(jié)論這些化合物可以根據(jù)它們在間質(zhì)性膀胱炎的變應原誘發(fā)的慢性膀胱炎癥模型中減少若干測量膀胱炎癥的參數(shù)的功效進行排序。功效排序如下化合物E＞化合物F＞化合物B＞化合物H＞化合物I＞化合物A＞化合物A＝化合物G?？傊?，這些數(shù)據(jù)證實維生素D化合物代表間質(zhì)性膀胱炎的一種新的治療選擇。
制劑實施例制劑實施例1A軟明膠膠囊劑I項目 成分 mg/粒膠囊1 化合物A 10.001-0.022 丁羥甲苯(BHT) 0.0163 丁基化羥基苯甲醚(BHA) 0.0164 Miglyol 812適量至 160.0制造工藝1.將BHT和BHA混懸在Miglyol 812中，升溫至約50℃，同時進行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來自步驟1的溶液。
3.將來自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
注所有制造步驟都是在氮氣氛下、避光進行的。
制劑實施例1B軟明膠膠囊劑II
制造工藝1.將二-α-生育酚混懸在Miglyol 812中，升溫至約50℃，同時進行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來自步驟1的溶液。
3.將來自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
制劑實施例2A口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，由在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(例如Miglyol 812)中的0.01至25.0mg化合物B配制口服施用的膠囊，填充在軟明膠膠囊中。
通過以下方法制備膠囊1.將BHT和BHA混懸在分餾椰子油(例如Miglyol 812)中，升溫至約50℃，同時進行攪拌，直至溶解。
2.在50℃下，將化合物A溶于來自步驟1的溶液。
3.將來自步驟2的溶液在室溫下冷卻。
4.將來自步驟3的溶液填充至軟明膠膠囊中。
所有制造步驟都是在氮氣氛下、避自然光進行的。
制劑實施例2B口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，配制口服施用的膠囊在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(Miglyol 812)中的150μg化合物B，填充在軟明膠膠囊中。
制劑實施例2C口服劑型軟明膠膠囊在氮下、在琥珀色光中，配制口服施用的膠囊在含有0.015mg丁羥甲苯(BHT)和0.015mg丁基化羥基苯甲醚(BHA)的150mg分餾椰子油(Miglyol 812)中的75μg化合物B，填充在軟明膠膠囊中。
在整個說明書和以下的權利要求書中，除非上下文另有需要，否則詞語“包含”應理解為意指包括所述整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但是不排除任意其它整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組。
參考文獻的引用在本說明書全文中引用的所有參考文獻(包括參考文件、已頒布的專利、已公布的專利申請和未決專利申請)的內(nèi)容在此均明確全文引入本文作為參考。
等價方式本領域技術人員將認識到或者能夠確定利用不超出慣用的實驗方法，可以獲得本文所述發(fā)明的具體實施方案的很多等價方式。這類等價方式也被以下的權利要求所涵蓋。
權利要求
1.維生素D化合物在預防或治療間質(zhì)性膀胱炎中的用途。
2.權利要求1所述的維生素D化合物在制備用于預防或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物中的用途。
3.通過施用有效量的維生素D化合物而預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法。
4.權利要求1至3中任意一項的用途或方法，其中所述的間質(zhì)性膀胱炎以存在膀胱功能障礙和膀胱炎癥的癥狀為特征。
5.權利要求1至4中任意一項的用途或方法，其中維生素D化合物是與第二種用于治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物在獨立或組合的藥物制劑中分別、相繼或同時施用的。
6.用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的藥物制劑，其包含維生素D化合物和藥學上可接受的載體。
7.藥物制劑，其包含維生素D化合物和藥學上可接受的載體，包裝有用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的說明書。
8.用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。
9.套藥盒，其含有維生素D化合物以及指導將所述化合物施用于需要治療和/或預防間質(zhì)性膀胱炎的患者、從而治療和/或預防所述患者的間質(zhì)性膀胱炎的說明書。
10.權利要求1至9中任意一項的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是下式的化合物 其中A1是單鍵或雙鍵；A2是單鍵、雙鍵或叁鍵；X1和X2各自獨立地是H或＝CH2，條件是X1和X2不都是＝CH2；R1和R2各自獨立地是OC(O)C1-C4烷基、OC(O)羥基烷基、OROC(O)鹵代烷基、OAc；R3、R4和R5各自獨立地是氫、C1-C4烷基、羥基烷基或鹵代烷基，或者R3和R4與C20一起構成C3-C6環(huán)烷基；R6和R7各自獨立地是C1-4烷基或鹵代烷基；R8是H、-COC1-C4烷基、-CO羥基烷基或-CO鹵代烷基；及其藥學上可接受的酯、鹽和前體藥物。
11.權利要求1至9中任意一項的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是下式的化合物 其中X是H2或CH2；R1是氫、羥基或氟；R2是氫或甲基；R3是氫或甲基，條件是當R2或R3是甲基時，R3或R2必須是氫；R4是甲基、乙基或三氟甲基；R5是甲基、乙基或三氟甲基；A是單鍵或雙鍵；B是單鍵、E-雙鍵、Z-雙鍵或叁鍵。
12.權利要求11的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中R4和R5各自是甲基或乙基。
13.權利要求1至9中任意一項的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是1，3-二-O-乙?；?1，25-二羥基-16，23Z-二烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇，其具有下式
14.權利要求1至9中任意一項的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的維生素D化合物是1-α-氟-25-羥基-16，23E-二烯-26，27-雙高-20-表-膽骨化醇，其具有下式
15.權利要求1至9中任意一項的用途、方法、制劑、化合物或套藥盒，其中所述的化合物是1，3-二-O-乙酰基-1，25-二羥基-20-環(huán)丙基-23E-烯-26，27-六氟-19-降-膽骨化醇，其具有下式
全文摘要
本發(fā)明提供了用于預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的維生素D化合物。也提供了預防和/或治療間質(zhì)性膀胱炎的方法，該方法施用有效量的維生素D化合物。
文檔編號A61P13/10GK1953752SQ200580013744
公開日2007年4月25日 申請日期2005年3月1日 優(yōu)先權日2004年3月1日
發(fā)明者E·科利 申請人:拜奧克塞爾有限公司