專利名稱：通過修飾的免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸誘導(dǎo)的有效粘膜免疫應(yīng)答的制作方法
相關(guān)申請本申請要求于2004年11月12日提交的美國臨時申請序列號60/627,263，和于2004年9月28日提交的美國臨時申請序列號60/613,786，和于2004年2月20日提交的美國臨時申請序列號60/546,147的利益，其內(nèi)容全部引入作為參考。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及利用免疫物(immunomer)來誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的應(yīng)用。
相關(guān)技術(shù)的概述近來，幾個科研工作者已經(jīng)證明在免疫療法應(yīng)用中利用寡核苷酸作為免疫刺激性試劑的有效性。觀察到磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸可誘導(dǎo)免疫刺激，這已經(jīng)引起對開發(fā)這些化合物作為治療工具的興趣。這些努力已經(jīng)集中在包含天然二核苷酸CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸。Kuramoto et al.，Jpn.J.Cancer Res.831128-1131(1992)教導(dǎo)了包含包括CpG二核苷酸的回文結(jié)構(gòu)的磷酸二酯寡核苷酸可誘導(dǎo)干擾素-α和γ合成并且增強(qiáng)天然的殺傷活性。Krieg et al.，Nature 371546-549(1995)公開了包含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸是免疫刺激性的。Liang et al.，J.Clin.Invest.981119-1129(1996)公開了這種寡核苷酸活化人B細(xì)胞。Moldoveanu et al.，Vaccine 161216-124(1998)教導(dǎo)包含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增強(qiáng)對于流感病毒的免疫應(yīng)答。McCluskie和Davis，J.Immunol.1614463-4466(1998)教導(dǎo)了包含CpG的寡核苷酸起有效佐劑的作用而增強(qiáng)對于乙型肝炎表面抗原的免疫應(yīng)答。
包含CpG的寡核苷酸可調(diào)節(jié)的一個應(yīng)答是哮喘。過敏性哮喘應(yīng)答的特點在于2型T-輔助(Th2)淋巴細(xì)胞的活化。由Th2淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的應(yīng)答在哮喘的過敏性炎癥的發(fā)病機(jī)理和蔓延中舉足輕重。Th2細(xì)胞因子IL-5增加嗜曙紅細(xì)胞的生成和存活，導(dǎo)致氣道嗜曙紅細(xì)胞增多的增加。其他的Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、和IL-13)也通過誘導(dǎo)過敏原特異性IgE、肥大細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞粘附-分子表達(dá)、和氣道高反應(yīng)性的產(chǎn)生在過敏性炎癥中發(fā)揮決定性的作用。皮質(zhì)甾類是目前最廣泛被用于治療過敏性哮喘的。類固醇治療只在使炎癥表現(xiàn)最小化中是有效的，但并不治愈該疾病。需要連續(xù)的治療以防止過敏性哮喘的進(jìn)展。
這些報道明確了還需要能夠增強(qiáng)和改變由免疫刺激性寡核苷酸所引起的免疫應(yīng)答。然而，利用傳統(tǒng)的包含CpG的DNAs進(jìn)行口服或胃內(nèi)的給藥由于其在胃腸環(huán)境中的快速降解而受限。因此，還需要在胃腸環(huán)境中具有更大穩(wěn)定性的CpG DNAs(或其他的CpG類似物/基序)來誘導(dǎo)粘膜的免疫應(yīng)答。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答的組合物和方法。在第一個方面，本發(fā)明提供用于在脊椎動物中產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，該方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
在第二個方面，本發(fā)明提供用于治療性治療患有疾病或病癥的脊椎動物的方法。在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，該方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
在第三個方面，本發(fā)明提供用于在脊椎動物中調(diào)節(jié)粘膜免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，該方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
附圖簡述

圖1顯示CpG*IMO或CpG DNA胃內(nèi)(i.g.)給藥后4小時，胃提取物中MIP-β(A)、IP-10(B)的生產(chǎn)和腸提取物中IL-12(C)的水平。
圖2顯示在CpG*IMO或CpG DNA i.g給藥后4小時，血清IL-12和MCP-1的水平。
圖3顯示在CpG*IMO或CpG DNA i.g給藥后4小時，血清MIP-β的水平。
圖4顯示在CpG*IMO或CpG DNA i.g給藥后4小時，血清IL-12的水平。
圖5顯示與CpG*IMO或CpG混合的OVA i.g.給藥后，血清OVA特異性IgG1和IgG2a的水平。
圖6顯示i.g給藥后，腸內(nèi)洗滌物中局部IgA的水平。
圖7顯示i.g.給藥后第42天，抗-OVA IgG2a和IgG1的血清水平。
圖8顯示直腸內(nèi)(i.r.)給藥后第35天，抗-OVA IgG2a和IgG1的血清水平。
圖9描繪了IMO介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種和腫瘤激發(fā)的治療方案。
圖10顯示口服接種的小鼠中T-細(xì)胞的IFN-γ分泌。
圖11顯示用作為粘膜佐劑的混合有IMO 2或寡核苷酸17的OVA胃內(nèi)免疫接種后，血清抗-OVA IgG2a和IgG1應(yīng)答。
圖12顯示在腸內(nèi)洗滌物和血清洗滌物中，抗-OVA IgA的水平。
圖13顯示在用與IMO 2或寡核苷酸17混合的OVA i.g免疫的小鼠中針對OVA-陽性腫瘤激發(fā)的誘導(dǎo)的免疫保護(hù)作用。
圖14顯示對粘膜免疫接種的劑量依賴性反應(yīng)。
圖15描繪了粘膜免疫應(yīng)答時間過程研究的OVA-特異性IgG2a和IgG1反應(yīng)。
圖16描繪了IMO激發(fā)的小鼠與用布地奈德(budenoside)激發(fā)的小鼠相比的治療流程。
圖17顯示鼻內(nèi)(i.n.)和s.c.給藥IMO對OVA-敏化的小鼠肺中細(xì)胞因子/趨化因子水平的影響。
圖18顯示i.n.和s.c.給藥IMO對OVA-敏化的小鼠中血清抗體水平的影響。
圖19顯示i.n.和s.c.給藥IMO對OVA-敏化的小鼠中肺部炎癥的影響。
圖20顯示口服給藥IMO對OVA-敏化和激發(fā)的小鼠中血清Ig水平的影響。
圖21顯示口服給藥IMO對OVA-敏化和激發(fā)的小鼠中BALF Ig水平的影響。
圖22顯示口服給藥IMO對OVA-敏化的小鼠中肺部炎癥的影響。
圖23描繪了胃內(nèi)疫苗接種的治療流程。
圖24顯示t-細(xì)胞特異性對收集自腸系膜淋巴結(jié)和脾的OVA257-264應(yīng)答。
圖25顯示與2048混合的OVA誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1型應(yīng)答，顯示更高的血清OVA-特異性IgG2a(A)，和受抑制的(更低的)OVA-特異性IgG1(B)。
圖26顯示IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)OVA疫苗接種誘導(dǎo)腸內(nèi)洗滌物中局部的OVA-特異性分泌的IgA。
圖27描繪了胃內(nèi)疫苗接種的治療流程。
圖28顯示在OVA-2048組中在第42天OVA-特異性IgG2a的水平開始增加。
圖29描繪了胃內(nèi)疫苗接種和OVA-特異性體液應(yīng)答的治療流程。
圖30顯示需要持續(xù)存在OVA-2048來在OVA-2048組中維持Th1占優(yōu)勢狀態(tài)。
圖31描繪了胃內(nèi)疫苗接種和OVA-特異性體液應(yīng)答的治療流程。
圖32顯示OVA-2048誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1-型應(yīng)答。
圖33描繪了胃內(nèi)疫苗接種腫瘤激發(fā)研究的治療流程。
圖34顯示OVA-1182和OVA-2048都引起抗原-特異性腫瘤排斥，然而，2048或1182中的OVA引發(fā)不同的免疫應(yīng)答分布型，并且可能導(dǎo)致相對于OVA陽性EG-7腫瘤細(xì)胞激發(fā)的不同免疫保護(hù)。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明涉及寡核苷酸作為免疫刺激性試劑用于免疫療法應(yīng)用的治療性用途。具體地，本發(fā)明涉及免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物對粘膜先天免疫，以及利用作為通過口服、胃內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)和直腸內(nèi)給藥的抗原的卵清蛋白(OVA)的佐劑活性的治療用途。公布的專利、專利申請、和在此引用的參考文獻(xiàn)由此引入作為參考至與其每個被具體且分別地表明為被引入作為參考相同的程度。萬一在于此引用的任何參考文獻(xiàn)和本說明書的任何教導(dǎo)之間有不一致性，為了本發(fā)明的目的后者將更有說服力。
本發(fā)明提供用于增強(qiáng)和改變由用于免疫療法應(yīng)用的免疫刺激性化合物所引起的免疫應(yīng)答的方法，例如但不限于，成人和小兒科人類以及獸醫(yī)應(yīng)用中癌癥、自身免疫病癥、炎性腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn’s病、哮喘、呼吸性過敏癥、食物過敏癥、和細(xì)菌、寄生蟲、及病毒感染的治療。本發(fā)明進(jìn)一步提供對于免疫療法具有最佳水平的免疫刺激作用的化合物及制備和利用這種化合物的方法。此外，本發(fā)明的免疫物可與DNA疫苗、抗體、抗原、蛋白質(zhì)、肽、過敏原、化療劑、和反義寡核苷酸組合用作佐劑。
在第一個方面，本發(fā)明提供用于在脊椎動物中產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答的方法。在本發(fā)明這方面的一個實施方案中，該方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“CpG DNA”是指包含天然存在的CpG二核苷酸或其免疫刺激性類似物的免疫刺激性寡核苷酸。優(yōu)選的類似物包括但不限于，C*pG、CpG*、和C*pG*，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷、C*是2’-脫氧胸腺嘧啶核苷、阿拉伯糖胞苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基(ribofuranosyl))-2-氧代-7-脫氮雜(deaza)-8-甲基嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的阿拉伯糖胞苷、2’-O-取代的阿拉伯糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其他非天然的嘧啶核苷、G是鳥苷或2′-脫氧鳥苷、G*是2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷、2’-脫氧-6-硫代鳥苷、2′-脫氧肌苷、阿拉伯糖鳥苷、2’-脫氧-2’取代的-阿拉伯糖鳥苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖鳥苷、或其他非天然的嘌呤核苷、并且p是選自磷酸二酯、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯中的一種或多種的核苷間連接。術(shù)語″寡核苷酸″是指由多個連接的核苷單位形成的多核苷。這種寡核苷酸可從已存在的核酸來源獲得，包括基因組或cDNA，但優(yōu)選通過合成方法生產(chǎn)。在優(yōu)選的實施方案中，每個核苷單位包括雜環(huán)的堿基和呋喃戊糖基、核糖、2’-脫氧核糖、海藻糖、阿拉伯糖、2’-脫氧-2’-取代的阿拉伯糖、2’-O-取代的阿拉伯糖、或己糖糖基、或其組合。核苷殘基可通過許多已知的核苷間連接中的任何連接偶連在一起。這種核苷間連接包括但不限于，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸脂、硅氧烷、碳酸酯、碳烷氧基(carboalkoxy)、乙酰胺酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、嗎啉代、borano、硫醚、橋聯(lián)的氨基磷酸脂、橋聯(lián)的亞甲基膦酸酯、橋聯(lián)的硫代磷酸酯、和砜核苷間連接。術(shù)語″寡核苷酸″也包括具有一個或多個立體特異性核苷間連接(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、或磷酸三酯連接)的多核苷。如在此使用的，術(shù)語“寡核苷酸”和“二核苷酸”明確地是指包括具有任何這種核苷間連接的多核苷和二核苷，而不管該連接是否包括磷酸基。在某些優(yōu)選的實施方案中，這些核苷間連接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯連接，或其組合。
在一些實施方案中，寡核苷酸各自具有大約3至大約35個核苷殘基，優(yōu)選大約4至大約30個核苷殘基，更優(yōu)選大約4至大約20個核苷殘基。在一些實施方案中，該寡核苷酸具有大約5至大約18，或大約5至大約14個核苷殘基。如在此使用的，術(shù)語“大約”意指該精確數(shù)目不是重要的。因此，寡核苷酸中核苷殘基的數(shù)目不是重要的，并且具有少了一個或兩個核苷殘基，或一個至幾個附加核苷殘基的寡核苷酸被預(yù)期為如上所述的每一實施方案的等同物。在一些實施方案中，一個或多個寡核苷酸具有11個核苷酸。
本發(fā)明的一些核酸分子的非限制性實例如表1A和1B所示。
表1AOligo或序列(5’-3’)免疫物No.
15’-TCTGTCG1TTCT-X-TCTTG1CTGTCT-5’25’-TCTGACG1TTCT-X-TCTTG1CAGTCT-5’35’-TCTGTCG2TTCT-X-TCTTG2CTGTCT-5’45’-TCTGTC1GTTCT-X-TCTTGC1TGTCT-5’55’-TCTGTC2GTTCT-X-TCTTGC2TGTCT-5’65’-TCTGTC3GTTCT-X-TCTTGC3TGTCT-5’75’-CTGTCG1TTCTC-X-CTCTTG1CTGTC-5’85’-CTGTCG2TTCTC-X-CTCTTG2CTGTC-5’95’-CTGTC1GTTCTC-X-CTCTTGC1TGTC-5’10 5’-CTGTC2GTTCTC-X-CTCTTGC2TGTC-5’11 5’-CTGTC3GTTCTC-X-CTCTTGC3TGTC-5’12 5’-TCG1TCG1TTCTG-X-GTCTTG1CTG1CT-5’13 5’-TCG2TCG2TTCTG-X-GTCTTG2CTG2CT-5’14 5’-TC1GTC1GTTCTG-X-GTCTTGC1TGC1T-5’15 5’-TC2GTC2GTTCTG-X-GTCTTGC2TGC2T-5’16 5’-TC3GTC3GTTCTG-X-GTCTTGC3TGC3T-5’17 5’-CTATCTGACGTTCTCTGT-3’18 5’-TCG1TCG1TTG-X-GTTG1CTG1CT
19 5’-TCG1TCG1TT-YYY-GTCTCGAGAC20 5’-TCG1TCG1TT-YYY-GUCUCGAGAC*G1＝2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷；G2＝阿拉伯糖鳥苷。
C1＝2’-脫氧胞苷，1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮雜-8-甲基嘌呤；C2＝阿拉伯糖胞苷；C3＝2’-脫氧-5-羥基胞苷。
X＝丙三醇接頭。也可以是C2-C18烷基接頭、乙二醇接頭、聚乙二醇接頭、支鏈烷基接頭。
Y＝1，3-丙二醇接頭A/U/C/G＝2’-O-甲基核糖核苷表1BOligo或序列(5’-3’)修飾免疫物No.
165’-NnN1C1G1N1C2G2C1、C2、C3、和C4獨(dú)立地是N1Nn-X-NnN1G3C32’-脫氧胞苷，1-(2’-脫氧-β-D-N1G4C4N1Nn-5’呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮雜-8-甲基嘌呤、阿拉伯糖胞苷；或2’-脫氧-5-羥基胞苷。
G1、G2、G3、和G4獨(dú)立地是2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷；阿拉伯糖鳥苷；2’-脫氧肌苷N1和Nn，各自獨(dú)立存在，優(yōu)選是天然存在的或合成核苷，其中n是0至30的數(shù)目X＝丙三醇接頭。也可以是C2-C18烷基接頭、乙二醇接頭、聚乙二醇接頭、支鏈烷基接頭。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“免疫物”是指任何這樣的化合物，所述化合物包含在其3′末端連接的至少兩個寡核苷酸或核苷間連接，或直接或經(jīng)由非核苷接頭的功能化的核苷堿基(nucleobase)或糖，其中至少一個寡核苷酸(在免疫物的上下文中)是免疫刺激的寡核苷酸而且具有易接近的5′末端，其中當(dāng)被施用于脊椎動物時，該化合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，脊椎動物是哺乳動物，包括人類。
在一些實施方案中，免疫物包括兩個或多個免疫刺激性寡核苷酸，(在免疫物的上下文中)其可能是相同或不同的。優(yōu)選地，各個這種免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個易接近的5′末端。
本發(fā)明的各種實施方案提供包括至少兩個寡核苷酸的免疫刺激的核酸。在這個方面，免疫刺激性核酸包括如公式(I)中詳述的結(jié)構(gòu)。
結(jié)構(gòu)域A-結(jié)構(gòu)域B-結(jié)構(gòu)域C(I)結(jié)構(gòu)域可以是大約2至大約12個核苷酸長度。結(jié)構(gòu)域A可以是具有或不具有回文或自我互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域的5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，其中該回文或自我互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域包含或不包含至少一個選自如上所述的CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種的二核苷酸。
在某些實施方案中，結(jié)構(gòu)域A可具有一個以上位于結(jié)構(gòu)域A寡核苷酸5’-端的選自CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種的二核苷酸。
結(jié)構(gòu)域B是連接結(jié)構(gòu)域A和C的接頭，其可以是3’-5’連接、2’-5’連接、3’-3’連接、磷酸基、核苷、或非核苷接頭，所述非核苷接頭可以是脂肪族、芳香族、芳基、環(huán)狀、手性、非手性的、肽、碳水化合物、脂類、脂肪酸、C2-C18烷基接頭、聚(乙二醇)接頭、乙二醇接頭、支鏈烷基接頭、2′-5′核苷間連接、丙三醇、單-三-或六聚乙二醇、或雜環(huán)部分。
結(jié)構(gòu)域C可以是具有或不具有回文或自我互補(bǔ)序列的5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA多聚I-多聚C，其具有或不具有選自如上所述的CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種的二核苷酸。
在某些實施方案中，本發(fā)明提供包含兩個分離的結(jié)構(gòu)域，即刺激性結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域的“CpG”DNAs，稱為自我穩(wěn)定的CpG DNAs。CpG DNAs的刺激性結(jié)構(gòu)域在5’-末端包含天然存在的CpG二核苷酸或其免疫刺激性類似物。在結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域區(qū)域中，形成7、11、15、或19個堿基對(bp)的發(fā)夾莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)序列被整合鄰近于刺激性結(jié)構(gòu)域的3’-末端。在這些實施方案中，刺激免疫核酸在3’-末端經(jīng)由與互補(bǔ)序列的氫鍵鍵合而具有二級結(jié)構(gòu)。如在此使用的，術(shù)語“二級結(jié)構(gòu)”是指分子內(nèi)和分子間的氫鍵。分子內(nèi)氫鍵導(dǎo)致形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。分子間氫鍵導(dǎo)致形成雙螺旋的核酸分子。設(shè)計這些CpGDNAs以使得該刺激性結(jié)構(gòu)域不包含任何結(jié)構(gòu)基序(堿基配對)并且CpG刺激性基序可能或未必存在于結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域中。結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域內(nèi)的核苷可包含增加發(fā)夾莖-環(huán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的糖、磷酸酯和/或堿基修飾，所述修飾進(jìn)一步增加自我穩(wěn)定的CpG DNAs相對于胃腸環(huán)境中核酸內(nèi)切酶消化的穩(wěn)定性。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″寡核苷酸″是指由多個連接的核苷單位形成的多核苷。這種寡核苷酸可從已存在的核酸來源獲得，包括基因組或cDNA，但優(yōu)選通過合成方法生產(chǎn)。在優(yōu)選的實施方案中，各個核苷單位包括雜環(huán)堿基和呋喃戊糖基、2’-脫氧呋喃戊糖基、海藻糖、阿拉伯糖、2’-脫氧-2’-取代的阿拉伯糖、2’-O-取代的阿拉伯糖、或己糖糖基。核苷殘基可通過許多任何已知的核苷間連接偶連在一起。這種核苷間連接包括但不限于，磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸脂、硅氧烷、碳酸酯、碳烷氧基、乙酰胺酯、嗎啉代、甲硼烷酯、硫醚、橋聯(lián)的磷酰胺脂、橋聯(lián)的亞甲基膦酸酯、橋聯(lián)的硫代磷酸酯、和砜核苷間連接。術(shù)語“寡核苷酸”也包括具有一個或多個立體特異性核苷間連接(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、或磷酸三酯連接)的多核苷酸。如在此使用的，術(shù)語“寡核苷酸”和“二核苷酸”明確地是指包括具有任何這種核苷間連接的多核苷酸和二核苷酸，而不管該連接是否包括磷酸基。在某些優(yōu)選的實施方案中，這些核苷間連接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯、或二硫代磷酸酯連接，或其組合。
術(shù)語“寡核苷酸”也包括具有附加取代的多核苷酸，所述取代包括但不限于蛋白質(zhì)基團(tuán)、親脂性基團(tuán)、插入劑、二胺、葉酸、膽固醇和金剛烷。術(shù)語“寡核苷酸”也包括包含聚合物的任何其他核苷堿基，包括但不限于，肽核酸(PNA)、具有磷酸基的肽核酸(PHONA)、鎖定的核酸(LNA)、嗎啉代-骨架寡核苷酸、和具有烷基接頭或氨基接頭的骨架節(jié)段的寡核苷酸。
本發(fā)明的寡核苷酸可包括天然存在的核苷、修飾的核苷、或其混合物。如在此使用的，術(shù)語″修飾的核苷″是包括修飾的雜環(huán)堿基、修飾的糖部分、或其組合的核苷。在一些實施方案中，修飾的核苷是如在此所描述的非天然的嘧啶或嘌呤核苷。在一些實施方案中，修飾的核苷是2′-取代的核糖核苷、阿拉伯糖核苷或2’-脫氧-2’-取代的-阿拉伯糖苷。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″2′-取代的核糖核苷″或“2’-取代的阿拉伯糖苷”包括核糖核苷或阿拉伯糖核苷，其中在戊糖部分2′位置的羥基被取代以產(chǎn)生2’-取代的或2′-O-取代的核糖核苷。優(yōu)選地，這種取代是用包含1-6個飽和或不飽和的碳原子的低級烷基，或用具有6-10個碳原子的芳基取代，其中這種烷基或芳基基團(tuán)可以是未被取代的或可以是用，例如鹵素、羥基、三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、碳烷氧基、或氨基取代的。2′-O-取代的核糖核苷或2’-O-取代的-阿拉伯糖苷的實例包括但不限于，2′-O-甲基核糖核苷或2’-O-甲基阿拉伯糖苷和2′-O-甲氧基乙基核糖核苷或2’-O-甲氧基乙基阿拉伯糖苷。
術(shù)語″2′-取代的核糖核苷″或“2’-取代的阿拉伯糖苷”也包括核糖核苷或阿拉伯糖核苷，其中2′-羥基替換為包含1-6個飽和或不飽和碳原子的低級烷基或氨基或鹵素基團(tuán)。這種2’-取代的核糖核苷或2’-取代的-阿拉伯糖苷的實例包括但不限于2’-氨基、2’-氟代、2’-烯丙基、和2’-炔丙基核糖核苷或阿拉伯糖苷。
術(shù)語″寡核苷酸″包括雜合和嵌合的寡核苷酸?！迩逗系墓押塑账帷迨蔷哂幸粋€以上類型核苷間連接的寡核苷酸。這種嵌合寡核苷酸的一個優(yōu)選實例是包括硫代磷酸酯、磷酸二酯或二硫代磷酸酯區(qū)和非離子連接，例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯連接的嵌合寡核苷酸(參見例如，Pederson et al.美國專利號5,635,377和5,366,878)。
″雜合的寡核苷酸″是具有一個以上類型核苷的寡核苷酸。這種雜合寡核苷酸的一個優(yōu)選實例包括核糖核苷酸或2′取代的核糖核苷酸區(qū)、和脫氧核糖核苷酸區(qū)(參見例如，Metelev和Agrawal，美國專利號5,652,355、6,346,614和6,143,881)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″免疫刺激性寡核苷酸″是指如上所述當(dāng)施用于脊椎動物，例如魚、鳥、或哺乳動物時，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的寡核苷酸。如在此使用的，術(shù)語″哺乳動物″包括但不限于大鼠、小鼠、貓、狗、馬、牛、奶牛、豬、兔、非人靈長類、和人類。優(yōu)選地，免疫刺激性寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、或二硫代磷酸酯核苷間連接。
用于本發(fā)明所述方法的免疫物包括直接連接或借助于非核苷酸接頭連接的至少兩個寡核苷酸。為了本發(fā)明的目的，″非核苷酸接頭″是可經(jīng)由共價或非共價連接連接至寡核苷酸的任何部分。優(yōu)選地，接頭是C2-C18烷基接頭、聚(乙二醇)接頭、乙二醇接頭、支鏈烷基接頭、2′-5′核苷間連接、或丙三醇或公式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH的丙三醇同系物，其中o和p獨(dú)立地是1至大約6，1至大約4，或1至大約3的整數(shù)。
在本發(fā)明所述的方法中，免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸和/或免疫物的給藥可以是通過任何合適的途徑，包括但不限于口服、胃內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)的。免疫物的治療性組合物的給藥可利用已知的步驟，以有效減弱疾病的癥狀或替代標(biāo)記的劑量和時段來進(jìn)行。當(dāng)全身給藥時，優(yōu)選該治療性組合物以獲得大約0.0001微摩爾至大約10微摩爾血液水平的免疫物的足夠劑量給藥。對于局部給藥，比這個低得多的濃度可以是有效的，而高很多的濃度可以是可耐受的。優(yōu)選地，免疫物的總劑量是每個患者每日大約0.001mg至每kg體重每日大約200mg的范圍。合乎需要的是同時、或順序地將治療有效量的一種或多種本發(fā)明的治療組合物作為單個治療事件施用于個體。
用于本發(fā)明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物可利用自動合成儀和亞磷酰胺方法方便地合成。在一些實施方案中，免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物通過線性合成方法合成。如在此使用的，術(shù)語″線性合成″是指在免疫物的一端開始而線性前進(jìn)至另一個末端的合成。線性合成容許(在長度、堿基組合物和/或摻入的化學(xué)修飾物上)相同或不相同的單體單元整合進(jìn)入免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物。
合成免疫物的備選模式是″平行合成″，其中從中心接頭部分向外進(jìn)行合成。如美國專利號5,912,332中所描述的，附著于固相支持物的接頭可用于平行合成。備選地，可使用通用的固相支持物，例如附著于受控制的有孔玻璃支持物的磷酸酯。
免疫物的平行合成相對于線性合成具有幾個優(yōu)點(1)平行合成容許摻入相同的單體單元；(2)不同于線性合成，兩個(或全部)單體單元同時合成，由此合成步驟的數(shù)目和合成所需要的時間與單體單元相同；以及(3)合成步驟的減少增加了最終免疫物產(chǎn)物的純度和產(chǎn)率。
通過線性合成或平行合成方案合成結(jié)束時，如果摻入修飾的核苷，用于本發(fā)明所述方法的免疫刺激性寡核苷酸或免疫物可用濃縮的氨溶液，或如亞磷酰胺供應(yīng)商所推薦的來方便地去保護(hù)。產(chǎn)物免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物優(yōu)選通過反相HPLC，脫三苯甲基、脫鹽和透析純化。
本發(fā)明進(jìn)一步提供包括單獨(dú)形式或組合形式的在此公開的任何免疫刺激性寡核苷酸、以及生理學(xué)可接受的載體的藥物制劑。如在此使用的，術(shù)語″生理學(xué)可接受的″是指不妨礙免疫刺激性寡核苷酸的有效性，并且與生物系統(tǒng)，例如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、或生物體相容的物質(zhì)。優(yōu)選地，生物系統(tǒng)是活的生物體，例如脊椎動物。
如在此使用的，術(shù)語″載體″包括任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、脂類、或本領(lǐng)域已知用于藥物制劑的其他物質(zhì)。可以理解載體、賦形劑、或稀釋劑的特征取決于特定應(yīng)用的給藥途徑。包含這些材料的藥物學(xué)上可接受制劑的制備在例如，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，ed.A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中有描述。
本發(fā)明提供用于治療性治療患有疾病或病癥的患者的方法，這種方法包括對患者的粘膜內(nèi)層，通過口服、胃內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)的給藥施用本發(fā)明所述的免疫物或免疫物的共軛物。本發(fā)明也提供用于調(diào)節(jié)脊椎動物中免疫應(yīng)答的方法，這種方法包括對脊椎動物的粘膜內(nèi)層，通過口服、胃內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、陰道內(nèi)或直腸內(nèi)的給藥施用本發(fā)明所述的免疫物或免疫物的共軛物。在各種實施方案中，待治療的疾病或病癥是癌癥、自身免疫病癥、炎性腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、克朗氏病(Crohn’sdisease)、氣道炎癥、炎性病癥、過敏癥、哮喘或由病原體引起的疾病。病原體包括細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒、類病毒和朊病毒。
免疫物的共軛物包括如上所述的免疫物、和在除易接近的5′末端外的位置共軛至該免疫物的抗原。在一些實施方案中，非核苷接頭包括共軛至該寡核苷酸的抗原。在一些其它的實施方案中，該抗原在除其3′末端外的位置共軛至寡核苷酸。在一些實施方案中，該抗原產(chǎn)生疫苗效應(yīng)。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語″過敏癥″包括但不限于，食物過敏癥、特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎(亦稱花粉熱)、過敏性結(jié)膜炎、風(fēng)疹(亦稱蕁麻疹)、呼吸性過敏癥和對其他物質(zhì)，例如橡膠、藥物和昆蟲螫刺的過敏性反應(yīng)，或通常由過敏性鼻炎-鼻竇炎和中耳炎引起的問題。術(shù)語″氣道炎癥″包括但不限于哮喘。哮喘的特異實例包括但不限于，過敏性哮喘、非過敏性哮喘、運(yùn)動誘發(fā)的哮喘、職業(yè)性哮喘、和夜間哮喘。
過敏性哮喘的特點在于與過敏性有關(guān)和由稱為過敏原的物質(zhì)觸發(fā)的氣道阻塞。過敏性哮喘的觸發(fā)劑包括但不限于，空中傳播的花粉、霉菌、動物皮屑、室內(nèi)塵螨和蟑螂糞便。非過敏性哮喘起因于病毒感染、某些藥物或存在于空氣中、惡化鼻和氣道的刺激劑。非過敏性哮喘的觸發(fā)劑包括但不限于，空中傳播的顆粒(例如，煤、粉塵)、大氣污染物(例如，煙草煙霧、木材煙霧、)、強(qiáng)烈的氣味或噴霧(例如，香水、家用清潔劑、烹調(diào)油煙、涂料或清漆)、病毒感染(例如，感冒、病毒性肺炎、鼻竇炎、鼻息肉)、阿斯匹林-敏感性、和胃食管返流疾病(GERD)。運(yùn)動誘發(fā)的哮喘(EIA)由劇烈體力活動觸發(fā)。EIA的癥狀在大多數(shù)哮喘患者中以不同程度出現(xiàn)，并且很可能由于在運(yùn)動時呼吸冷的、干燥空氣而觸發(fā)。EIA的觸發(fā)劑包括但不限于，運(yùn)動期間呼吸空中傳播的花粉、運(yùn)動期間呼吸空氣污染物、患病毒性呼吸道感染時運(yùn)動以及在冷的、干燥空氣中運(yùn)動。職業(yè)性哮喘直接與吸入存在于工作場所的刺激劑及其他可能有害的物質(zhì)相關(guān)。職業(yè)性哮喘的觸發(fā)包括但不限于，煙塵、化學(xué)制品、煤氣、樹脂、金屬、塵埃、蒸氣和殺蟲劑。
沒有希望受任何特定的理論的束縛，細(xì)菌暴露的減少可能部分地導(dǎo)致發(fā)達(dá)國家中由于過敏性疾病，例如哮喘、特應(yīng)性皮炎、和鼻炎導(dǎo)致的發(fā)生率、嚴(yán)重度、和死亡率。這一假設(shè)得到如下證據(jù)的支持細(xì)菌感染或產(chǎn)物可抑制實驗動物模型和臨床研究中過敏性病癥進(jìn)展。在某些序列范圍中包含未甲基化的CpG二核苷酸(CpG DNA)的細(xì)菌DNA或合成寡脫氧核苷酸有效刺激先天的免疫應(yīng)答和獲得性免疫。對CpG DNA的免疫應(yīng)答包括先天免疫細(xì)胞的活化、B細(xì)胞的增殖、Th1細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)、和免疫球蛋白(Ig)的產(chǎn)生。CpG DNA對免疫細(xì)胞的活化借助于一種分子模式識別受體，Toll-樣受體9(TLR9)而發(fā)生。CpG DNAs誘導(dǎo)以分泌IL-12和IFN- 為特征的強(qiáng)烈的Th1-占優(yōu)勢的免疫反應(yīng)。單獨(dú)的或作為過敏原共軛物的免疫物(IMO)降低過敏性哮喘的小鼠模型中IL-4．、IL-5、和IgE的產(chǎn)生并降低嗜曙紅細(xì)胞增多。IMO化合物也通過將Th2反應(yīng)轉(zhuǎn)化為Th1反應(yīng)而有效地逆轉(zhuǎn)已建立的特應(yīng)性嗜曙紅氣道疾病。
OVA和明礬一起通常用于在各種小鼠和大鼠模型中建立Th2-占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。Th2免疫應(yīng)答包括IL-4、IL-5、和IL-13生產(chǎn)增加、總的和抗原-特異性IgE、IgG1血清水平提升、和較低的IgG2a水平。IMO化合物阻止和逆轉(zhuǎn)小鼠中已建立的Th2-占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答。IMO化合物與OVA/明礬共同給藥至小鼠減少了IL-4、IL-5、和IL-13生產(chǎn)，并在經(jīng)受抗原再刺激的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IFN-γ生產(chǎn)。此外，IMO化合物在這些小鼠中抑制抗原-特異性和總的IgE并且增強(qiáng)IgG2a生產(chǎn)。
OVA/明礬和IMO化合物的注射誘導(dǎo)小鼠中淋巴細(xì)胞抗原-回憶應(yīng)答(Th1-型)，其特征在于低水平的Th2-相關(guān)細(xì)胞因子、IgE和IgG1，以及高水平的Th1-相關(guān)細(xì)胞因子和IgG2a。IMO化合物與另一種抗原，例如S.masoni卵和雞卵溶菌酶的共同給藥，也在體外和體內(nèi)研究中也導(dǎo)致Th2-應(yīng)答逆轉(zhuǎn)為Th1-占優(yōu)勢的應(yīng)答。如在此描述的，IMO化合物有效阻止Th2免疫應(yīng)答的發(fā)展并導(dǎo)致強(qiáng)烈的Th1反應(yīng)。
Th2細(xì)胞因子觸發(fā)向IgE和IgG1生產(chǎn)的Ig同種型轉(zhuǎn)換，而Th1細(xì)胞因子IFN-γ誘導(dǎo)B-淋巴細(xì)胞生產(chǎn)IgG2a。用OVA/明礬和IMO化合物注射的小鼠比單獨(dú)注射OVA/明礬的小鼠產(chǎn)生較低水平的IL-4、IL-5、和IL-13，以及較高水平的IFN-γ，伴隨有較低的IgE和IgG1，以及較高的IgG2a水平。這暗示了接受抗原和IMO化合物的小鼠中在Th1-細(xì)胞因子誘導(dǎo)和免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換之間存在緊密聯(lián)系。
血清抗原-特異性和總的IgE水平在接受OVA/明礬和IMO化合物的小鼠中比起單獨(dú)接受OVA/明礬的小鼠中顯著更低。相比之下，與單獨(dú)注射OVA/明礬的小鼠相比較，OVA-特異性IgG1水平變化不明顯，而總的IgG1水平只略有降低(數(shù)據(jù)未顯示)。不同的反應(yīng)可能由涉及控制IgE和IgG1種類轉(zhuǎn)換的不同機(jī)制所導(dǎo)致，雖然兩種同型都受IL-4和IL-13的影響。例如，在存在IL-4時，IL-6促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成IgG1。
在根據(jù)本發(fā)明的任何方法中，免疫物或免疫物的共軛物可與用于治療疾病或狀況、不減弱該免疫物的免疫刺激性效應(yīng)的任何其他試劑組合給藥。為了本發(fā)明這方面的目的，術(shù)語″與之組合″是指在治療相同患者的相同疾病期間，包括以任何順序施用該免疫物和試劑，包括同時給藥，以及任何短暫的時間間隔順序，例如從一個接著一個的順次，到中間隔開幾天。這種組合治療也可包括多于一次給藥該免疫物，以及該試劑的獨(dú)立給藥。該免疫物和試劑的給藥可以是通過相同或不同的途徑。
在根據(jù)本發(fā)明的任何方法中，可用于治療疾病或狀況的試劑包括但不限于，抗原、過敏原、或共同刺激性分子，例如細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式活化因子、肽和包括修飾的氨基酸的肽。另外，試劑可包括編碼抗原或過敏原的DNA載體。
包含CpG基序(CpG DNAs)的寡核苷酸通過TLR 9活化先天的免疫系統(tǒng)。如在此證明的，通過3’-3’-連接附著、稱為免疫物(IMO)的CpG寡核苷酸，與傳統(tǒng)的CpG DNAs相比較是TLR 9-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的更有效的誘導(dǎo)物。在IMO的情況下，新結(jié)構(gòu)的存在(缺少游離的3’-末端)導(dǎo)致了胃腸道中更大的穩(wěn)定性，通過施用于粘膜內(nèi)層而使粘膜免疫的誘導(dǎo)增強(qiáng)。
如實施例中所示，單一劑量的IMO局部(胃和/或小腸)或全身(血清)誘導(dǎo)顯著更高水平的趨化因子(MIP1β、MCP1、和IP10)和細(xì)胞因子(IL-12)。相反地，在相同條件和相同劑量下，傳統(tǒng)的CpG DNA寡核苷酸局部和全身產(chǎn)生不明顯的效應(yīng)。用1∶1比率的OVA加IMO胃內(nèi)免疫的小鼠與類似地用OVA加CpG DNA免疫的小鼠相比較，具有顯著較低水平的抗-OVA IgG1。用OVA加IMO免疫的小鼠與用OVA加傳統(tǒng)CpG DNA免疫的小鼠相比較，顯示顯著較高水平的OVA-特異性IgG2a。在相同實驗條件下，非-CpG DNA對局部和全身的趨化因子/細(xì)胞因子分泌和免疫球蛋白生產(chǎn)都沒有影響。這些結(jié)果證明包含新結(jié)構(gòu)的IMO與傳統(tǒng)的CpG DNA相比較，在胃腸道中是穩(wěn)定的，并且誘導(dǎo)有效的粘膜免疫應(yīng)答。這些結(jié)果也證明IMO與疫苗和抗原一起通過施用于粘膜內(nèi)層有粘膜Th1佐劑活性。
本發(fā)明提供包括免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物的試劑盒，后者包括連接在一起的至少兩個寡核苷酸，以使得該免疫物具有一個以上易接近的5’末端，其中至少一個寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。在另一個方面，試劑盒包括根據(jù)本發(fā)明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸的共軛物和/或免疫物或免疫物的共軛物，和生理學(xué)可接受的載體。該試劑盒一般也可包括一套使用說明書。
下列實施例是用來進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，而不是要限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1IMO的合成和純化如先前描述的，合成、純化、和分析CpG*DNA(5’-TCTGACG*TTCT-X-TCTTG*CAGTCT-5’)(其中X和G*分別是丙三醇接頭和2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷)、傳統(tǒng)的CpGDNA(5′-CTATCTGACGTTCTCTGT-3’)和非-CpGDNA(5′-CTATCTCACCTTCTCTGT-3’)。
實施例2小鼠從Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)購買5-8周齡的雌性C57BL/6小鼠。小鼠根據(jù)Hybridon的IACUC批準(zhǔn)的動物方案飼養(yǎng)。
實施例3胃內(nèi)的給藥在IMO給藥前全部的小鼠通過異氟烷吸入而被稍微鎮(zhèn)靜。各組中取3至5只小鼠通過用連接有結(jié)核菌素注射器的18-號喂飼針頭胃內(nèi)(i.g)接受單一的200μl PBS，其含有5mg/kg或15mg/kg IMO、CpG DNA或非-CpG DNA對照的。當(dāng)小鼠被處死后，在4-120hr的不同時間點收集血液、胃和小腸。
對于雞蛋卵清蛋白(OVA，V級，Sigma，St.Louis，MO)免疫接種組，取含有100μg OVA和100μg IMO或CpG DNA的200μl PBS進(jìn)行i.g給藥。對照小組用200μl PBS中的100μg OVA或只用PBS免疫。全部小鼠在第14天i.g加強(qiáng)。在第24至42天收集血液和腸內(nèi)洗滌物用于測定OVA-特異性抗體的水平。
實施例4從組織提取趨化因子。
利用Johansson等描述的方法，加以一些改良來從胃和小腸進(jìn)行趨化因子的提取。簡要地，稱重在各個時間點收集的新鮮器官，切成小塊并立即于-70℃冷凍在含有2mM二苯甲烷磺酰氟化物(Sigma)、0.1mg大豆胰蛋白酶抑制劑(Sigma)每、和0.05M EDTA的PBS溶液中。在室溫下解凍樣品，然后用在PBS中終濃度為2％(wt/vol)的皂角苷(Sigma)于4℃連續(xù)旋轉(zhuǎn)來透化處理。該組織樣品在16,000Xg離心20min，上清液通過ELISA分析。
實施例5趨化因子的定量。
組織提取物和血清樣品中巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)1β(MIP-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白質(zhì)1(MCP-1)和干擾素γ-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)10(IP-10)的濃度根據(jù)制造商的推薦利用DuoSet ELISA發(fā)展系統(tǒng)(R&D，Minneapolis，MN)測定。
實施例6細(xì)胞因子水平的評估來自組織提取物和血清樣品的IL-12水平如先前描述的通過夾層ELISA測定。ELISA平板(Costar，Corning，NY)的孔用特異于小鼠IL-12的抗體包被，其后將100μl連續(xù)稀釋的組織提取物或血清加入各個孔。IL-12含量根據(jù)制造商的指導(dǎo)進(jìn)行測定并表示為pg/ml。全部反應(yīng)劑，包括細(xì)胞因子抗體和標(biāo)準(zhǔn)物從PharMingen.(San Diego，CA)購買。
實施例7抗體測定。
為了分析血清抗體，在室溫下用在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的2μg/mlOVA(V級，Sigma，St.Louis，MO)孵育96孔平板3小時。固相在4℃與腸內(nèi)洗滌物或血清樣品孵育過夜，然后用與辣根過氧化酶(HRP)-共軛的山羊抗-小鼠IgG1、IgG2a或IgA(PharMingen，San Diego，CA).)孵育。該免疫復(fù)合物與ABTS底物(Zymed，San Francisco，CA)反應(yīng)后，抗體結(jié)合被測量為在405nm處的吸光率。
實施例8組織學(xué)。
i.g.給藥后在不同時間點收集的胃、小腸和腸系膜淋巴結(jié)在10％的磷酸鹽-緩沖的福爾馬林(VWR，West chester，PA)中固定，然后包埋在石蠟中。切成5μm厚的切片，并用蘇木精和曙紅染色。
實施例9直腸內(nèi)的免疫接種BALB/c雌性小鼠(n＝5)在第1天和第14天被兩次直腸內(nèi)給藥在50μlPBS中的與100μl IMO混合的100μg OVA蛋白質(zhì)。施用在50μl PBS中的100μg OVA或只施用50μl PBS的小鼠用作對照。在第23天采血清，OVA特異性IgG1、IgG2a、IgA和IgE通過ELISA測試(參見圖8)。
實施例10CpG*IMO和傳統(tǒng)CpG DNA對粘膜和全身先天免疫的影響。
局部(胃和/或腸，圖1)和全身(血清，圖2)i.g給藥單一劑量的5mg/kgCpG*IMO產(chǎn)生更高水平的趨化因子(MIP1β、IP10和MCP-1)和細(xì)胞因子(IL-12)。在相同條件和劑量下，傳統(tǒng)的CpG DNA產(chǎn)生不明顯的效應(yīng)(圖1和2)。與CpG*IMO相比，CpG DNA產(chǎn)生更低水平的血清MIP-β(圖3)和IL-12(圖4)。非-CpG DNA對局部和全身的趨化因子/細(xì)胞因子分泌沒有影響(圖3，4)。
實施例11CpG*IMO作為疫苗佐劑C57BL/6雌性小鼠(n＝5)在第1天和第14天被兩次i.g.給藥在200lPBS中與100μg IMO混合的100μg OVA蛋白質(zhì)。i.g.給藥在200μl PBS中的100μg OVA或只給藥200μl PBS的小鼠用作對照。在第23天采血清，OVA特異性IgG1和IgG2a通過ELISA測定。用OVA加CpG*IMO免疫的小鼠與用OVA加傳統(tǒng)CpG DNA免疫的小鼠相比，顯示顯著更高水平的OVA-特異性IgG2a和OVA-特異性IgG1生產(chǎn)的抑制。
這些結(jié)果清楚表明包含新結(jié)構(gòu)和CpG*基序的IMO由于其在胃腸環(huán)境中的較高穩(wěn)定性而誘導(dǎo)有效的粘膜免疫反應(yīng)。另外，CpG*IMO的口服或胃內(nèi)給藥和傳統(tǒng)的CpG DNA相比，與OVA一起誘導(dǎo)有效的粘膜Th1佐劑活性。
實施例12IMO介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種C57BL/6雌性小鼠(n＝10)在第1天和第14天被胃內(nèi)(i.g)給藥單獨(dú)在400μl PBS中的25mg/kg OVA蛋白質(zhì)或與15mg/kg Oligo 17或IMO 2混合的25mg/kg OVA。在第42天處死來自各個組的3只小鼠。OVA-特異性抗體和T-細(xì)胞應(yīng)答通過ELISA和IFN-ELISPOT評估。來自各個組的7只小鼠用表達(dá)OVA的EG-7腫瘤細(xì)胞激發(fā)來確定IMO的口服給藥是否導(dǎo)致腫瘤排斥(參見圖9)。
實施例13口服接種的小鼠中T-細(xì)胞的IFN-γ分泌在第42天收集來自免疫小鼠(n＝3)的脾和腸系膜淋巴結(jié)(見實施例12)。利用T細(xì)胞富集柱從匯集的脾細(xì)胞和淋巴結(jié)純化T細(xì)胞。2.5×105個T細(xì)胞用2.5×105個絲裂霉素C處理的T細(xì)胞，免疫顯性的OVA257-264或OVA323-337沖擊的同系脾細(xì)胞刺激24小時。對I類限制性MHC和OVA257-264再刺激作出特異性應(yīng)答的T細(xì)胞通過IFN-γELISPOT分析，根據(jù)制造商的指導(dǎo)(R&D Systems)測定。電子計數(shù)斑點(Zellnet，New York，NY)。Oligo 17和IMO 2與單獨(dú)的OVA比較都產(chǎn)生更高水平的IFN-γ分泌。圖10顯示口服給藥IMO 2和OVA，與Oligo 17相比較，在脾細(xì)胞中引發(fā)更強(qiáng)烈的全身性H-2kb限制的，OVA257-264特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
實施例14用與IMO 2或Oligo 17混合的OVA作為粘膜佐劑胃內(nèi)免疫接種后的血清抗-OVA IgG2a和IgG1應(yīng)答。
通過ELISA評估在初始免疫接種后第42天收集的血清樣品(參見實施例12)的OVA-特異性IgG2a(A)和IgG1(B)。與Oligo 17相比較，IMO 2誘導(dǎo)顯著更高的血清OVA-特異性IgG2a和抗-OVA IgG1的抑制。如圖11所示，H-2kb限制的，OVA257-264特異性CTL和OVA-特異性IgG2a的強(qiáng)烈誘導(dǎo)表明IMO 2引發(fā)有效的Th1免疫應(yīng)答。
實施例15腸內(nèi)洗滌物中抗-OVA IgA的水平。
初始免疫接種后第42天收集的腸內(nèi)洗滌物通過ELISA分析OVA-特異性IgA。圖12顯示IMO 2與Oligo 17相比較在腸組織中誘導(dǎo)更高水平的OVA-特異性IgA。
實施例16用與IMO 2或Oligo 17混合的OVA i.g免疫的小鼠誘導(dǎo)針對OVA-陽性腫瘤激發(fā)的免疫保護(hù)作用。
C57BL/6小鼠如實施例12所描述的被i.g免疫接種。免疫的小鼠(n＝7)用1.5×106個表達(dá)OVA的EG-7細(xì)胞激發(fā)。用單獨(dú)的PBS或OVA蛋白質(zhì)i.g給藥的對照組中100％的小鼠死于腫瘤負(fù)載，平均存活時間為26.4天。混合IMO 2或Oligo 17的OVA i.g免疫小鼠中，大約43％的小鼠免于腫瘤超過55天。圖13顯示混合IMO 2或Oligo 17的OVA i.g組中死于腫瘤的小鼠的存活時間分別顯著地延長至43和38.8天。
實施例17對粘膜免疫接種的劑量依賴性反應(yīng)C57BL/6小鼠在第1和14天，被i.g.給藥混合100μg IMO 2或Oligo 17的100μg OVA，或被給藥混合300μg IMO 2或Oligo 17的500μg OVA。在第42天收集血清樣品，通過ELISA分析抗-OVA IgG2a和抗-OVA IgG1。圖14顯示IMO 2在較低和較高劑量的i.g給藥中都誘導(dǎo)更高的抗-OVA IgG2a和更低的IgG1。
實施例18粘膜免疫應(yīng)答的時間過程研究C57BL/c小鼠在第1和第14天用單獨(dú)的100μg OVA、混合100μg IMO2或Oligo 17的100μg OVA i.g接種兩次。在第23、42、60和200天收集血清樣品。通過ELISA測定OVA-特異性IgG1和IgG2a。圖15顯示IMO2/OVA比單獨(dú)的OVA或Oligo 17/OVA產(chǎn)生更高水平的IgG1和IgG2a，第60天達(dá)到頂峰并且在第200天保持升高。
實施例19對治療流程的反應(yīng)參數(shù)。
治療流程如圖16所示。圖17-22顯示結(jié)果。IMO的鼻內(nèi)(i.n.)或皮下(s.c.)給藥在OVA-敏化和激發(fā)的小鼠肺中抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子、IFN-γ產(chǎn)生。IMO，而不是，在OVA-敏化和激發(fā)的小鼠中抑制血清IgE并增加血清IgG2a。IMO，而不是布地奈德，在OVA-敏化和激發(fā)的小鼠肺中減少炎性細(xì)胞浸潤和粘液高分泌。口服給藥IMO，而不是對照的IMO，抑制血清OVA-特異性IgE并誘導(dǎo)OVA-特異性IgG2a，以及減少肺炎癥和粘蛋白高分泌?？傊?，包含合成基序的IMO是有效的Th1免疫刺激劑和Th2細(xì)胞因子生產(chǎn)的抑制劑。鼻內(nèi)或皮下給藥含有CpG*二核苷酸的IMO在使用卵清蛋白(OVA)的過敏性哮喘的鼠模型中逆轉(zhuǎn)Th2應(yīng)答?？诜o藥IMO與對照IMO相比較，有效逆轉(zhuǎn)肺中的Th2應(yīng)答。
實施例20胃內(nèi)的疫苗接種雌性C57BL/6小鼠在oligo給藥前通過異氟烷吸入稍微鎮(zhèn)靜。在400μlPBS中混合25mg/kg雞卵清蛋白(OVA)(V級，Sigma，St.Louis，MO)的15mg/kg IMO 2048或1182或CpG DNA在第1和第14天借助于胃內(nèi)給藥(i.g.)而加以給藥，對照小鼠用在400-μl PBS中的25mg/kg OVA免疫(圖23顯示治療流程)。圖24至26顯示結(jié)果。
為了測定OVA-特異性IFN-γ-分泌的CTL應(yīng)答，在第35至42天處死來自各個組的3只小鼠，利用t-細(xì)胞富集柱(R&D systems，Minneapolis，MN)純化各個組中來自脾細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)的t-細(xì)胞。純化的T細(xì)胞(2.5×105)用2.5×105絲裂霉素C(50μg/ml，Sigma，St.Louis，MO)和用OVA257-264或OVA323-337肽沖擊的失活的APCs刺激24小時。應(yīng)答OVA257-264肽刺激分泌IFN-γ的CTL的數(shù)目通過ELISPOT(R&D System)測定。在第42天取血清樣品(n＝7)，在第42天通過ELISA評估OVA-特異性血清抗體應(yīng)答。圖24顯示如通過IFN-γ ELISPOT所測定的，t-細(xì)胞特異應(yīng)答從腸系膜淋巴結(jié)和脾收集的OVA257-264。
對于OVA-特異性抗體測定，在室溫下以在PBS中的2μg/ml OVA孵育96-孔平板3小時。固相在4℃與第一次免疫接種后在第35至42天收集的腸內(nèi)洗滌物或血清樣品孵育過夜，然后與辣根過氧化酶(HRP)-共軛的山羊抗-小鼠IgG1、IgG2a、或IgA(PharMingen，San Diego，CA)一起孵育。該免疫復(fù)合物與ABTS底物(Zymed，San Francisco，CA)反應(yīng)后，抗體結(jié)合被測量為在450nm處的吸光率。如圖25所示，混合有2048的OVA誘導(dǎo)更強(qiáng)烈的Th1型反應(yīng)，顯示更高的血清OVA-特異性IgG2a(A)，并且顯示抑制的(更低的)OVA-特異性IgG1(B)。另外，如圖26所示，IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)OVA疫苗接種在腸內(nèi)洗滌物中誘導(dǎo)局部的OVA-特異性IgA分泌。
實施例21IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種的時間-過程研究如圖27所示，C57BL/6小鼠在第1和第14天被i.g給藥單獨(dú)的5mg/kgOVA，或混合5mg/kg線性CpG oligo(1182)或IMO 2048的5mg/kg OVA，在第42和第60天通過ELISA評估OVA-特異性血清抗體應(yīng)答。如圖28所示，在第42天OVA-特異性IgG2a水平在OVA-2048組中開始增加。同時，在這個時間點在OVA-2048組中OVA-特異性IgG1被完全抑制。到第60天，OVA-2048組中抗-OVA IgG2a持續(xù)上升，并且OVA-1182組中OVA-特異性IgG2a降低至OVA-2092(非CpG DNA寡核苷酸)對照組水平。同時，抗-OVAIgG1滴度在這個時間點顯著增加，暗示OVA-2048的持續(xù)存在對于在OVA-2048組中保持Th1占優(yōu)勢狀態(tài)是需要的。
實施例22IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種免疫程序研究如圖29所示，C57BL/6小鼠在第1和第14天(組1)或第1、14和42天(組2)被i.g給藥單獨(dú)的5mg/kg OVA或混合5mg/kg 1182或2048的5mg/kg OVA。在第42和第60天通過ELISA評估OVA-特異性血清抗體應(yīng)答。圖30顯示OVA-2048的持續(xù)存在對于在OVA-2048組中維持Th1占優(yōu)勢狀態(tài)是需要的。在兩個免疫接種組中(第1和第14天)，在OVA-2048組的第60天，OVA-特異性IgG2a和IgG1都存在高滴度，暗示免疫反應(yīng)從早期時間點(第42天)的Th1型轉(zhuǎn)移為在晚期時間點(第60天)的Th1和Th2混合型。通過OVA-1182i.g免疫接種引發(fā)的體液答應(yīng)持續(xù)時間顯著縮短，因為IgG2a在第60天減少至對照組水平。在第42天的進(jìn)一步免疫接種可逆轉(zhuǎn)這種應(yīng)答，因為其顯著抑制OVA-2048組中OVA-特異性IgG1。
實施例23IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種劑量-依賴性應(yīng)答如圖31所示，C57BL/6小鼠在第1和第14天，被i.g給藥單獨(dú)的5mg/kg或25mg/kg OVA，或混合5mg/kg或15mg/kg線性CpG oligo(1182)或IMO2048的OVA，在第42天通過ELISA評估OVA-特異性血清抗體應(yīng)答。圖32顯示OVA-2048誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th1-型應(yīng)答。
實施例24IMO-介導(dǎo)的胃內(nèi)疫苗接種腫瘤激發(fā)研究如圖33所示，C57BL/6(n＝10)小鼠在第1和第14天，被i.g給藥在400ml PBS中的混合15mg/kg 2048或1182的25mg/kg OVA，在第42天，免疫的小鼠(n＝7)用1.5×106個OVA-陽性EG-7細(xì)胞i.p激發(fā)。圖34顯示OVA-1182和OVA-2048都引發(fā)抗原-特異性腫瘤排斥，然而2048或1182中的OVA引發(fā)不同的免疫應(yīng)答分布型，并且可能導(dǎo)致針對OVA陽性EG-7腫瘤細(xì)胞激發(fā)的不同免疫保護(hù)。
雖然為了清楚和理解的目的上述發(fā)明已經(jīng)被相當(dāng)詳細(xì)地加以描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到通過閱讀這里所公開的內(nèi)容，可產(chǎn)生各種形式和細(xì)節(jié)的變化而不背離本發(fā)明和附加權(quán)利要求的實際范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于在脊椎動物中產(chǎn)生粘膜免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫物是口服給藥的。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中給藥途徑選自鼻內(nèi)的、氣管內(nèi)的、直腸內(nèi)的、陰道內(nèi)的和胃內(nèi)的給藥中的一種或多種途徑。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脊椎動物選自魚、鳥、和哺乳動物中的一種或多種。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、貓、狗、馬、牛、奶牛、豬、兔、非人靈長類、和人類中的一種或多種。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫物包括通過非核苷酸接頭連接且具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中至少一個寡核苷酸是具有易接近的5′末端、并且包括免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2’-脫氧胸腺嘧啶核苷、阿拉伯糖胞苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮雜-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的-阿拉伯糖胞苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其它非天然的嘧啶核苷，G是鳥苷或2′-脫氧鳥苷、G*是2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷、2’-脫氧-6-硫代鳥苷、阿拉伯糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿拉伯糖鳥苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖鳥苷。
8.一種用于治療性治療患有疾病或病癥的脊椎動物的方法，該方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述免疫物是口服給藥的。
10.權(quán)利要求8所述的方法，其中給藥途徑選自鼻內(nèi)的、氣管內(nèi)的、直腸內(nèi)的、陰道內(nèi)的和胃內(nèi)的給藥中的一種或多種途徑。
11.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述脊椎動物選自魚、鳥、和哺乳動物中的一種或多種。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、貓、狗、馬、牛、奶牛、豬、兔、非人靈長類、和人類中的一種或多種。
13.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述免疫物包括通過非核苷酸接頭連接且具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中至少一個寡核苷酸是具有易接近的5′末端、并且包括免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。
14.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2’-脫氧胸腺嘧啶核苷、阿拉伯糖胞苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮雜-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的-阿拉伯糖胞苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其它非天然的嘧啶核苷，G是鳥苷或2′-脫氧鳥苷、G*是2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷、2’-脫氧-6-硫代鳥苷、阿拉伯糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿拉伯糖鳥苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖鳥苷。
15.權(quán)利要求8所述的方法，其中該疾病或病癥選自癌癥、炎性病癥、炎性腸綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎、克朗氏病、氣道炎癥、哮喘和過敏癥中的一種或多種。
16.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括施用選自疫苗、過敏原、抗原、抗體、單克隆抗體、化療藥物、抗生素、脂類、DNA疫苗及其他佐劑，例如明礬的試劑中的一種或多種。
17.權(quán)利要求16所述的方法，進(jìn)一步包括施用與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述免疫物或抗原，或兩者與免疫原性蛋白質(zhì)或非免疫原性蛋白質(zhì)連接。
19.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括施用佐劑。
20.一種用于在脊椎動物中調(diào)節(jié)粘膜免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將免疫物施用于脊椎動物的粘膜內(nèi)層。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是Th1免疫應(yīng)答。
22.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是Th2免疫應(yīng)答。
23.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述免疫物是口服給藥的。
24.權(quán)利要求20所述的方法，其中給藥途徑選自鼻內(nèi)的、氣管內(nèi)的、直腸內(nèi)的、陰道內(nèi)的和胃內(nèi)的給藥中的一種或多種途徑。
25.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述脊椎動物選自魚、鳥、和哺乳動物中的一種或多種。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、貓、狗、馬、牛、奶牛、豬、兔、非人靈長類、和人類中的一種或多種。
27.權(quán)利要求20所述的方法，其中所述免疫物包括通過非核苷酸接頭連接且具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中至少一個寡核苷酸是具有易接近的5′末端、并且包括免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。
30.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*、和C*pG*中的一種或多種，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2’-脫氧胸腺嘧啶核苷、阿拉伯糖胞苷、1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮雜-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的-阿拉伯糖胞苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其它非天然的嘧啶核苷，G是鳥苷或2′-脫氧鳥苷、G*是2’-脫氧-7-脫氮雜鳥苷、2’-脫氧-6-硫代鳥苷、阿拉伯糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿拉伯糖鳥苷、2’-O-取代的-阿拉伯糖鳥苷。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫物對粘膜先天免疫，以及利用卵清蛋白(OVA)作為通過給藥至粘膜內(nèi)層的抗原的佐劑活性的治療用途。
文檔編號A61K39/00GK1960767SQ200580012573
公開日2007年5月9日 申請日期2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月20日
發(fā)明者王大慶, ?？钒汀た驳像R拉, 薩迪爾·阿格拉瓦爾, 朱富剛 申請人:海布里頓公司