專利名稱：一種可視化鼻咽癌模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及腫瘤模型的制備方法，特別是鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型的制備方法。
背景技術(shù)：
認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移的規(guī)律，最重要的是在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)它，若能在單細(xì)胞水平或者微小腫瘤細(xì)胞團(tuán)時(shí)能觀察、檢測(cè)得到，對(duì)于認(rèn)識(shí)腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其演進(jìn)的規(guī)律將具有重要意義。所以，研究腫瘤特別是微小腫瘤，對(duì)于懂得和控制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是非常必要的。而單純依賴顯微鏡和普通病理檢測(cè)方法往往是很難發(fā)現(xiàn)早期原發(fā)微小腫瘤的(這也是臨床上腫瘤病人手術(shù)治療效果躑躅不前的“瓶頸”)，更不用說發(fā)現(xiàn)早期轉(zhuǎn)移的單個(gè)腫瘤細(xì)胞或者微小腫瘤細(xì)胞團(tuán)。
從生物發(fā)光的一種水母Aequorea victoria克隆出來的綠色熒光蛋白(greenfluorescent protein GFP)編碼283個(gè)氨基酸殘基，分子量27kDa，不需要其它Aequorea蛋白輔助、不需要底物、也不需要其它因子輔佐就能發(fā)出綠色熒光。通過定點(diǎn)突變等技術(shù)已獲得多種GFP突變體，并進(jìn)行了人源化處理，且突變體表達(dá)更高，發(fā)出信號(hào)更強(qiáng)。采用GFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞用來示蹤腫瘤形成及演進(jìn)的過程，極大地改善和提高了腫瘤特別是微腫瘤在新鮮組織的可視化狀況，并取得了許多令人鼓舞的成績(jī)。腫瘤的GFP或其衍生物標(biāo)記極大地改善了顯示腫瘤在新鮮軟組織器官和骨轉(zhuǎn)移的能力，這種方法已在黑色素瘤、大腸癌、前列腺癌、胰腺癌等多種腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的研究中得到了成功應(yīng)用(Yang M，Jiang P，Sun FX，et al.A fluorescent orthotopic bone metastasis model of human prostate cancer.Cancer Res，1999；59(4)781-786；Maeda H，Segawa T，Kamoto T，et al.Rapid detection ofcandidate metastatic foci in the orthotopic inoculation model of androgen-sensitiveprostate cancer cells introduced with green fluorescent protein.Prostate.2000；45(4)335-340；Bouvet M，Wang J，Nardin SR，et al.Real-time optical imaging of primary tumor growthand multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.Cancer Res.2002；62(5)1534-1540；Yang M，Baranov E，Jiang P，et al.Whole-body optical imaging ofgreen fluorescent protein-expressing tumors and metastases.Proc Natl Acad Sci USA，2000；97(3)1206-1211)。中國專利CN98804513.3中提及使用GFP轉(zhuǎn)染肺腫瘤細(xì)胞和卵巢腫瘤細(xì)胞。
鼻咽癌是居住在臺(tái)灣、香港、新加坡和我國南方的中國人群中最常見的一種腫瘤。我國南方幾省是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率居世界首位，嚴(yán)重威脅著我國人們的健康。由于動(dòng)物特別是小動(dòng)物如裸鼠，鼻咽部對(duì)比肺、卵巢等大器官，具有極其狹小的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此，在裸鼠鼻咽部進(jìn)行原位接種一直是本領(lǐng)域渴望解決的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是提供一種可視化鼻咽癌模型的制備方法。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，包括以下步驟第一步用熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；第二步用與鼻咽癌細(xì)胞大小相適應(yīng)的針頭取活細(xì)胞數(shù)為105～106的上述轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞懸液，經(jīng)口腔、穿過軟腭粘膜至裸鼠鼻咽處鼻咽原位接種。
本發(fā)明所述的熒光蛋白受激發(fā)光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下可見明亮的熒光。常用的熒光蛋白有增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)。本發(fā)明最好用增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)。
本發(fā)明所述的編碼綠色熒光蛋白(EGFP)的基因序列由Clontech公司的質(zhì)粒pEGFP-N1得到，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，鼻咽癌細(xì)胞是低分化鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、低分化鼻咽癌細(xì)胞株6-10B、低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE2其中一種。其中鼻咽癌細(xì)胞株5-8F是高成瘤、高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株，由中山大學(xué)引進(jìn)；鼻咽癌細(xì)胞株6-10B是成瘤但不轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株，由中山大學(xué)引進(jìn)；鼻咽癌細(xì)胞株CNE2是高成瘤但不轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所建立。
本發(fā)明可視化鼻咽癌模型的制備方法，第一步中，熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞的方法可以是如陽離子脂質(zhì)體法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法和使用基因槍轉(zhuǎn)染。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)染最好是陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。
本發(fā)明所述的陽離子脂質(zhì)體法，是本領(lǐng)域常用的陽離子轉(zhuǎn)染方法，可以參考(ChishimaT，Miyagi Y，Wang X，et al.Visualization of the metastatic process by greenfluorescent protein expression.Anticancer Res，1997；17(4A)2377-2384)。本發(fā)明所使用的陽離子脂質(zhì)體是LipofectamineTM2000。還可以使用本領(lǐng)域已知其他的陽離子脂質(zhì)體。可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法得到陽離子脂質(zhì)體優(yōu)選的使用用量和形式。
本發(fā)明所述的陽離子轉(zhuǎn)染法，具體含有以下步驟在微量離心管中準(zhǔn)備溶液A、B，其中A液組成為50μl OPTI-MEM和5μl lipofectamine2000，B液組成為50μl OPTI-MEM和3μg質(zhì)粒。將A、B兩液混合后室溫放置半小時(shí)，然后將混合液滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，放置在37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染液，換不含抗生素的1640完全培養(yǎng)液；然后0.25％胰蛋白酶消化，稀釋培養(yǎng)，加入G418篩選，亞克隆獲得EGFP轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞。
本發(fā)明所述的OPTI-MEM購自Invitrogen life technology公司；lipofectamine2000購自Invitrogen life technology公司；本發(fā)明所述的G418為新霉素，購買于sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶，購自Sigma公司。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法的一個(gè)較佳技術(shù)方案是采用陽離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞，接著加G418篩選，獲得EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞并離心富集，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為0.05ml含有105～106個(gè)活細(xì)胞，用4號(hào)針頭取0.05ml細(xì)胞溶液經(jīng)口腔、穿過軟腭粘膜裸鼠鼻咽原位接種。由于裸鼠的鼻咽結(jié)構(gòu)極其狹小，因此所述針頭的孔徑選擇原則是，能吸入細(xì)胞懸液的前提下盡量選小，以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)傷，提高接種效率；活細(xì)胞數(shù)量太少難以形成實(shí)體瘤，太多局部瘤體生長(zhǎng)太快，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物過早死亡，無法看到轉(zhuǎn)移腫瘤的形成。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，第二步中，可視化鼻咽癌模型的熒光檢測(cè)是借助本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的儀器和方法。動(dòng)物整體熒光檢測(cè)是借助整體熒光成像系統(tǒng)I.T-9MACIMSYSPLUS(購自美國Lighttools research公司，北京創(chuàng)美偉業(yè)科技有限公司代理)，也可以用倒置熒光顯微鏡觀察切片中的熒光鼻咽癌細(xì)胞。
本發(fā)明所述的熒光檢測(cè)可以通過將動(dòng)物開膛用整體熒光成像系統(tǒng)或熒光顯微鏡直接觀察器官、對(duì)脊椎動(dòng)物的全身進(jìn)行監(jiān)測(cè)，或者切取組織進(jìn)行顯微鏡檢。
本發(fā)明上述的組織樣品被適當(dāng)加工成大小合適的新鮮樣品切片，通常5μm，然后置于顯微鏡下接受檢查。
本發(fā)明所述的原位接種的可視化人鼻咽癌模型，通過熒光檢測(cè)極大地提高了觀察鼻咽癌細(xì)胞的及其微小轉(zhuǎn)移灶的靈敏度。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型可方便地觀察上行的鼻咽癌顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和下行的鼻咽癌頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及肺轉(zhuǎn)移，極其逼真地再現(xiàn)了臨床鼻咽癌病人的特點(diǎn)；EGFP表達(dá)極大地提高了對(duì)體內(nèi)微小腫瘤和腫瘤微轉(zhuǎn)移灶檢測(cè)的靈敏度，使我們對(duì)鼻咽癌發(fā)展、演進(jìn)的機(jī)理及其他相關(guān)研究成為可能，并可最終用于評(píng)價(jià)和篩選抗鼻咽癌的藥物。


圖1質(zhì)粒pEGFP-N1結(jié)構(gòu)圖。
圖2裸鼠鼻咽原位表達(dá)EGFP鼻咽癌整體熒光系統(tǒng)采集的圖片。
圖3淋巴結(jié)和肺部轉(zhuǎn)移腫瘤整體熒光系統(tǒng)采集的圖片。
圖4裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤活體熒光整體熒光系統(tǒng)采集的圖片。
圖5顱內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤熒光解剖整體熒光系統(tǒng)采集的圖片。
圖6裸鼠鼻咽原位移植人鼻咽癌HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖7淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(輸入淋巴管中有癌栓)HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖8原位鼻咽癌移植瘤侵犯顱骨HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖9原位人鼻咽癌移植瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖10鼻咽癌移植瘤顱內(nèi)血管浸潤(rùn)HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖11移植瘤顱內(nèi)淋巴管內(nèi)癌栓HE驗(yàn)證，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖12裸鼠腦室中的人鼻咽癌組織HE驗(yàn)證結(jié)果，用普通顯微鏡采集的圖片(放大100倍)。
圖13A鼻咽癌肺轉(zhuǎn)移瘤熒光顯微鏡采集的圖片(放大200倍)。
圖13B鼻咽癌肺轉(zhuǎn)移瘤HE染色采集的圖片(放大200倍)。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，但不限于所述實(shí)施例。
實(shí)施例1一、EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞裸鼠原位接種鼻咽癌模型的制備。
第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將鼻咽癌細(xì)胞株CNE2按2×105接種于24孔板中，含15％小牛血清、無抗生素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合度時(shí)棄培養(yǎng)基，用不含血清的1640液洗滌細(xì)胞2次，再加1ml不含血清的1640繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90％以上融合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在微量離心管中準(zhǔn)備溶液A、B。A液50μl OPTI-MEM+5μllipofectamine2000；B液50μl OPTI-MEM+3μg質(zhì)粒pEGFP-N1。將A、B兩液混合后室溫放置半小時(shí)，然后將混合液均勻滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，混合均勻，放置37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染液，換不含抗生素的1640完全培養(yǎng)液；24小時(shí)后，倒置熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
24小時(shí)后，將24孔板中的細(xì)胞用0.25％胰酶消化后，按1∶5轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)，24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，當(dāng)100倍放大時(shí)，每個(gè)視野中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)不少于5個(gè)時(shí)，進(jìn)行G418抗性篩選，逐步提高G418濃度500-2000μg/ml，10-15天后，停止用藥；待G418抗性克隆長(zhǎng)至肉眼可見大小時(shí)，挑選表達(dá)GFP的陽性克隆于24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡觀察其是否繼續(xù)發(fā)出綠色熒光，對(duì)表達(dá)GFP的人鼻咽癌細(xì)胞株陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)倒置熒光顯微鏡觀察熒光，獲得非G418依賴的EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2。
第二步轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞接種在裸鼠鼻咽原位建立鼻咽癌模型。
EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)至90％左右時(shí)，0.25％胰酶消化，血球記數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，500rpm離心3分鐘濃縮細(xì)胞，加適量預(yù)冷的無血清1640原液調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，30分鐘內(nèi)完成裸鼠鼻咽原位接種；接種方法是用4號(hào)針頭取0.05ml EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞溶液(含105～106個(gè)活細(xì)胞)經(jīng)口腔穿過軟腭粘膜至裸鼠鼻咽處鼻咽原位接種，如此接種20只裸鼠。
二、EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞裸鼠原位接種鼻咽癌模型的觀察結(jié)果。
定期仔細(xì)觀察裸鼠的飲食情況和活動(dòng)狀況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)變緩，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，身體消瘦等瀕死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一方面借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS對(duì)裸鼠成瘤進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，同時(shí)，對(duì)瀕死的實(shí)驗(yàn)裸鼠性10％的戊巴比妥鈉麻醉處死。
體外觀察發(fā)現(xiàn)，裸鼠鼻咽原位接種EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞5天后，觀察到成瘤裸鼠出現(xiàn)呼吸急促，活動(dòng)變差，反應(yīng)遲鈍，部分實(shí)驗(yàn)裸鼠不能度過此時(shí)期，接著就身體迅速消瘦，6～8天就出現(xiàn)明顯的腫瘤惡病質(zhì)，對(duì)于頻死的實(shí)驗(yàn)裸鼠行10％戊巴比妥納麻醉處死；部分實(shí)驗(yàn)裸鼠能度過此呼吸急促時(shí)期，但都在10～14天后消瘦、出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)，對(duì)于頻死的實(shí)驗(yàn)裸鼠要及時(shí)行10％戊巴比妥納麻醉處死。所有處死的實(shí)驗(yàn)裸鼠立即進(jìn)行解剖，利用整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS仔細(xì)觀察裸鼠鼻咽原位成瘤情況，以及觀察裸鼠頸部有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和內(nèi)臟肺、肝等有無發(fā)綠色熒光的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。
結(jié)果顯示EGFP轉(zhuǎn)染CNE2鼻咽癌細(xì)胞裸鼠鼻咽原位接種的20只裸鼠，全部成活，且都在裸鼠鼻咽原位有GFP熒光腫瘤，熒光結(jié)果如圖2所示，原位成瘤率100％(20/20)；沒有裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移等；成瘤裸鼠存活時(shí)間6～14天，中位存活時(shí)間為9.6天。
實(shí)施例2一、EGFP轉(zhuǎn)染6-10B鼻咽癌細(xì)胞裸鼠原位接種鼻咽癌模型的制備。
第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例1，用采用陽離子脂質(zhì)體法用EGFP轉(zhuǎn)染6-10B細(xì)胞。獲得非G418依賴的、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP基因的6-10B鼻咽癌細(xì)胞。
第二步轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞接種在裸鼠鼻咽原位建立鼻咽癌模型。
EGFP轉(zhuǎn)染6-10B鼻咽癌細(xì)胞接種在小鼠的方法同實(shí)施例1。EGFP轉(zhuǎn)染6-10B鼻咽癌細(xì)胞接種25只裸鼠。
二、鼻咽癌模型觀察結(jié)果。
定期仔細(xì)觀察裸鼠的飲食情況和活動(dòng)狀況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)變緩，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，身體消瘦等瀕死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一方面借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS對(duì)裸鼠成瘤進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，同時(shí)，對(duì)瀕死的實(shí)驗(yàn)裸鼠性10％的戊巴比妥鈉麻醉處死。
大體觀察結(jié)果描述體外觀察發(fā)現(xiàn)，裸鼠鼻咽原位接種EGFP轉(zhuǎn)染6-10B鼻咽癌細(xì)胞后，到鼻咽癌后期，裸鼠出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)，萎靡、消瘦；荷瘤時(shí)間為17～77天。對(duì)于頻死的實(shí)驗(yàn)裸鼠及時(shí)行10％戊巴比妥納麻醉處死，所有處死的實(shí)驗(yàn)裸鼠立即進(jìn)行解剖，借助于GFP表達(dá)，利用整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS仔細(xì)觀察裸鼠鼻咽原位成瘤情況，以及觀察裸鼠頸部有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和內(nèi)臟肺、肝等有無發(fā)綠色熒光的腫瘤轉(zhuǎn)移。
觀察結(jié)果EGFP轉(zhuǎn)染6-10B鼻咽癌細(xì)胞裸鼠鼻咽原位接種的25只裸鼠，接種后即死去5只，成活20只，且都在裸鼠鼻咽原位有GFP熒光腫瘤，熒光結(jié)果如圖2所示，原位成瘤率100％(20/20)；沒有裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有兩只實(shí)驗(yàn)裸鼠有肺轉(zhuǎn)移；成瘤裸鼠荷瘤存活時(shí)間17-77天，中位存活時(shí)間為53.2天。
實(shí)施例3一、EGFP轉(zhuǎn)染5-8F鼻咽癌細(xì)胞裸鼠原位接種鼻咽癌模型。
第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例1，用采用陽離子脂質(zhì)體法用EGFP轉(zhuǎn)染5-8F細(xì)胞。獲得非G418依賴的、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染EGFP基因的5-8F鼻咽癌細(xì)胞。
第二步轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞接種在裸鼠鼻咽原位建立鼻咽癌模型。
EGFP轉(zhuǎn)染5-8F鼻咽癌細(xì)胞接種在小鼠的方法同實(shí)施例1。EGFP轉(zhuǎn)染5-8F鼻咽癌細(xì)胞原位接種23只裸鼠。
二、鼻咽癌模型觀察結(jié)果。
定期仔細(xì)觀察裸鼠的飲食情況和活動(dòng)狀況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)活動(dòng)變緩，反應(yīng)遲鈍，呼吸急促，身體消瘦等瀕死的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。一方面借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS對(duì)裸鼠成瘤進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，同時(shí)，對(duì)瀕死的實(shí)驗(yàn)裸鼠性10％的戊巴比妥鈉麻醉處死。
EGFP轉(zhuǎn)染5-8F鼻咽癌細(xì)胞裸鼠鼻咽原位接種后，一般于7天后出現(xiàn)程度不一的呼吸急促現(xiàn)象，到鼻咽癌后期，裸鼠出現(xiàn)腫瘤惡病質(zhì)，萎靡、消瘦；荷瘤時(shí)間一般為17～50天。整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS觀察結(jié)果顯示EGFP轉(zhuǎn)染5-8F鼻咽癌細(xì)胞裸鼠鼻咽原位接種的23只裸鼠，接種后即死去3只，成活20只，其中在裸鼠鼻咽原位成瘤的有18只，原位成瘤率90％(18/20)；18只成瘤裸鼠中，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的有5只，顱內(nèi)轉(zhuǎn)移率為22.2％(5/18)；腫瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的有17只，腫瘤肺轉(zhuǎn)移率為94.4％(17/18)；腫瘤頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有15只，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.3％(15/18)；裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移的5只，合并轉(zhuǎn)移率為22.2％(5/18)；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移合并肺轉(zhuǎn)移的14只，合并轉(zhuǎn)移率為77.8％(14/18)；裸鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的3只，合并轉(zhuǎn)移率為16.7％(3/18)；裸鼠顱內(nèi)、頸部淋巴結(jié)和肺同時(shí)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的有3只，轉(zhuǎn)移率為16.7％(3/18)；成瘤裸鼠荷瘤存活時(shí)間一般為17～50天，中位存活時(shí)間為33.6天。結(jié)果如圖所示裸鼠鼻咽原位鼻咽癌整體熒光觀察結(jié)果如圖2；淋巴結(jié)和肺部轉(zhuǎn)移腫瘤整體熒光觀察結(jié)果如圖3所示；裸鼠顱內(nèi)活體熒光整體觀察結(jié)果如圖4所示；顱內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤熒光解剖整體熒光觀察結(jié)果如圖5所示；裸鼠鼻咽原位移植人鼻咽癌HE結(jié)果如圖6所示；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(輸入淋巴管中有癌栓)HE結(jié)果如圖7所示；原位鼻咽癌移植瘤侵犯顱骨HE結(jié)果如圖8所示；原位人鼻咽癌移植瘤顱內(nèi)轉(zhuǎn)移HE結(jié)果如圖9所示；鼻咽癌移植瘤顱內(nèi)血管浸潤(rùn)HE結(jié)果如圖10所示；移植瘤顱內(nèi)淋巴管內(nèi)癌栓HE結(jié)果如圖11所示；裸鼠腦室中的人鼻咽癌組織HE驗(yàn)證結(jié)果如圖12所示；鼻咽癌肺部轉(zhuǎn)移癌組織冰凍切片和HE對(duì)照，如圖13A倒置熒光顯微鏡直接觀察 B同一切片HE染色的結(jié)果200×。
權(quán)利要求
1.一種可視化鼻咽癌模型的制備方法，包括以下步驟首先用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；然后用與鼻咽癌細(xì)胞大小相適應(yīng)的針頭取活細(xì)胞數(shù)為105～106的上述轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞懸液，經(jīng)口腔、穿過軟腭粘膜至裸鼠鼻咽處鼻咽原位接種，建立可視化原位鼻咽癌模型及其轉(zhuǎn)移模型。
2.權(quán)利要求1所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，其特征是所用的鼻咽癌細(xì)胞是6-10B、CNE2、5-8F其中一種。
3.權(quán)利要求1所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，其特征是綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞，方法是陽離子脂質(zhì)體法。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，含有以下步驟采用陽離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞，接著加G418篩選，獲得EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞并離心富集，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為0.05ml含有105～106個(gè)活細(xì)胞，用4號(hào)針頭取0.05ml細(xì)胞溶液經(jīng)口腔、穿過軟腭粘膜至裸鼠鼻咽處鼻咽原位接種。
全文摘要
本發(fā)明為一種可視化鼻咽癌模型的制備方法，涉及醫(yī)學(xué)模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及腫瘤模型的制備方法，特別是鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型的制備方法，該制備方法，首先用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；然后用與鼻咽癌細(xì)胞大小相適應(yīng)的針頭取活細(xì)胞數(shù)為10
文檔編號(hào)A61K49/00GK1824329SQ200510120869
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者姚開泰, 丁彥青, 劉騰飛, 任彩萍 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)