專利名稱：生物型人工脊髓的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種供脊髓損傷者用于脊髓重建的醫(yī)療裝置，屬植入類醫(yī)療器械。
背景技術(shù)：
脊髓損傷常引起癱瘓，是嚴(yán)重傷患之一，雖不馬上危及生命，但會令患者終生殘廢，生不如死。至今未找到有效治療方法。以往一直認(rèn)為脊髓神經(jīng)是不能再生的，脊髓損傷是不治之癥。近年來發(fā)現(xiàn)，在適宜條件下，包括脊髓神經(jīng)在內(nèi)的中樞神經(jīng)是可以再生的，關(guān)鍵是要有適于神經(jīng)組織再生和重建的臨時性基質(zhì)和良好的微環(huán)境。這里所謂臨時性基質(zhì)就是供神經(jīng)干細(xì)胞以及其分化形成的神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分裂、增殖、遷移的溫床，它可被降解吸收，為神經(jīng)細(xì)胞提供養(yǎng)分。所謂優(yōu)良微環(huán)境是指有利于誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)這些細(xì)胞分裂、增殖和遷移的物質(zhì)環(huán)境和新組織生長的空間。但現(xiàn)有技術(shù)還沒有這樣的裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生物相容性好、可被降解吸收的生物型人工脊髓及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是生物型人工脊髓，由髓質(zhì)、包裹在髓質(zhì)外的軟脊膜、固定在軟脊膜外的螺旋支架、依次包裹在螺旋支架外的蛛網(wǎng)膜、包裹在蛛網(wǎng)膜外的膠原凝膠層和包裹在膠原凝膠層外的硬脊膜組成，髓質(zhì)、軟脊膜、蛛網(wǎng)膜及硬脊膜分別由通過非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原的動物脊髓、動物膜組織制成。
動物組織易被微生物降解或分解，需用固定劑使之交聯(lián)固定，傳統(tǒng)上使用戊二醛作固定劑，有殘留毒性，我們選用非醛類固定劑，如環(huán)氧化物、二元胺、二異氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亞胺，就沒有這一缺點(diǎn)，以環(huán)氧化物為例，當(dāng)應(yīng)用環(huán)氧化物來代替醛類作固定試劑時，由于環(huán)氧化物很不穩(wěn)定，易發(fā)生開環(huán)交聯(lián)反應(yīng)，控制其反應(yīng)條件可使其與膠原蛋白的交聯(lián)產(chǎn)物很穩(wěn)定，不輕易降解，只有在再生組織生長、增殖需對其蠶蝕時，分泌出激肽釋放酶、纖溶酶、糖皮質(zhì)激素協(xié)同膠原酶作用下，才能將其緩慢分解為多肽及氨基酸，并被吸收利用。這樣一種被動式降解與組織的再生是同步的，是最有利于組織的再生性修復(fù)的，而且無醛類的殘留毒性；根據(jù)現(xiàn)代免疫學(xué)理論，動物組織的抗原性主要是由蛋白質(zhì)中某些特殊位置的活性基團(tuán)及特異構(gòu)象引起的，這些活性基團(tuán)主要是-OH，-NH2，-SH等，而特異構(gòu)象則主要是由于蛋白質(zhì)分子螺旋鏈的某些特殊氫鍵引起，在處理動物組織時，用一種或多種易與這些基團(tuán)起反應(yīng)的活潑試劑(如酸酐、酰氯、酰胺、環(huán)氧化物等)與這些基團(tuán)結(jié)合，將其封閉起來，去除其抗原，同時，還應(yīng)用強(qiáng)氫鍵試劑(如胍類化合物)，置換引起特異構(gòu)象的氫鍵，改變其構(gòu)象，這樣，雙管齊下就能有效的消除其抗原性。本發(fā)明中的髓質(zhì)是用去抗原的異種脊髓基質(zhì)制成，無抗原型，生物相容性好，可以作為神經(jīng)干細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞寄居、分裂、增殖和遷移的優(yōu)良基質(zhì)和載體。軟脊膜、蛛網(wǎng)膜和硬脊膜是用豬、牛、羊、猴等動物的膜組織經(jīng)系列生化處理得到的，具有脊髓軟、硬脊膜相似的組成和特性，生物相容性好。螺旋支架可以由硬、軟脊膜或蛛網(wǎng)膜裁成細(xì)長片條，在軟脊膜外螺旋盤繞粘貼多層而形成，除對管體起到支撐作用外，所形成的螺旋凹坑，還起到臨時性腦脊液通道腔的作用，類似于脊髓蛛網(wǎng)膜下腔的作用那樣。膠原凝膠層在植入初期會溶脹形成軟滑的凝膠，類似潤滑液的作用，植入后較易被降解吸收，既可以為新生組織提供養(yǎng)份，又可為硬膜下腔的形成讓出空間。在膠原凝膠中可以加入多肽、透明質(zhì)酸、硫酸皮質(zhì)素、肝素等活性物質(zhì)，以誘導(dǎo)有關(guān)組織的生長。
所述髓質(zhì)、軟脊膜、蛛網(wǎng)膜和硬脊膜分別由通過偶聯(lián)劑偶合多肽及糖胺聚糖類活性組分的動物脊髓、動物膜組織構(gòu)成。考慮到一些膜組織，力學(xué)強(qiáng)度還不能滿足應(yīng)用要求，而且在生化處理中常會引起力學(xué)性能的損失，所以對用作軟脊膜、硬脊膜及蛛網(wǎng)膜的膜材還設(shè)計了一個增韌改性處理，就是通過對膠原蛋白分子進(jìn)行合理接枝，如在膠原蛋白分子中適當(dāng)接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸、聚羥乙酸等鏈段的方法，來提高基材的力學(xué)強(qiáng)度和韌性，接枝的原料是用它們的預(yù)聚體，方法可以選用縮合、引發(fā)、輻射等高聚物接枝方法。
所述的多肽之一是由16個賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素。這些多肽或糖胺聚糖對生長因子有廣譜粘附和富集作用，能激發(fā)未分化細(xì)胞定向分化，具有誘導(dǎo)機(jī)體組織的再生性修復(fù)的功能。
所述的軟脊膜選用動物的軟脊膜、腸膜或者其它經(jīng)過機(jī)械薄化處理的動物膜組織；所述蛛網(wǎng)膜、硬脊膜選用動物心包膜、膈膜、脂肪網(wǎng)膜、胸膜、腹膜或腸膜按下述步驟制得；所述的螺旋支架材料是由軟脊膜或蛛網(wǎng)膜或硬脊膜按一定寬度裁剪成細(xì)長片條而成。
本發(fā)明的生物型人工脊髓的制備方法包括以下步驟(1)、選料收集新鮮動物的脊髓以及膜組織，對于脊髓剪去全部外膜取髓質(zhì)，并小心剔除血管，對于膜組織小心修剪去除多余雜質(zhì)及不規(guī)整部分，張力定型；(2)、堿處理使用堿溶液浸泡髓質(zhì)和膜組織；(3)、脫脂使用有機(jī)溶劑抽提髓質(zhì)及膜組織中的脂肪及脂溶性雜質(zhì)；
(4)、交聯(lián)固定使用非醛類固定劑交聯(lián)固定髓質(zhì)及膜組織中的膠原蛋白分子；(5)、去除抗原使用活潑試劑封閉髓質(zhì)及膜組織的膠原蛋白中引起抗原的特異活性基團(tuán)-OH，-NH2，-SH，并用強(qiáng)氫鍵試劑置換膜材膠原蛋白分子螺旋鏈中引起特異構(gòu)象的特殊氫鍵。
(6)、整體制備在棒狀模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的軟脊膜粘合成管狀體；另取上述任一膜材裁成規(guī)定寬度的長片條，按一定間距螺旋盤繞粘合在軟脊膜上，形成螺旋支架；再將蛛網(wǎng)膜粘合在螺旋支架的凸梁上形成管狀體；取醫(yī)用膠原溶于水形成的溶膠，涂布于蛛網(wǎng)膜上，真空干燥，如此涂布多次，形成膠原凝膠層；凝膠層外包裹硬脊膜并粘接成管狀體；取出模具，將制好的髓質(zhì)小心填充管心，便得到生物型人工脊髓。
作為一種優(yōu)化方案，就是在制備軟脊膜、蛛網(wǎng)膜及硬脊膜時還經(jīng)過增韌改性的處理步驟，即使用縮合、引發(fā)或輻射接枝的方法，在軟脊膜、蛛網(wǎng)膜及硬脊膜的膠原蛋白分子中適當(dāng)接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羥乙酸鏈段，以增加其強(qiáng)度和韌性。
作為另一優(yōu)化方案，就是對于髓質(zhì)、軟脊膜、蛛網(wǎng)膜及硬脊膜，還增加了一個通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)特定多肽或糖胺聚糖活性組分的處理步驟，即在髓質(zhì)、軟脊膜、蛛網(wǎng)膜及硬脊膜的表面上通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)可粘附生長因子的多肽或糖胺聚糖活性組分。
生物型人工脊髓的制備方法中所使用的堿溶液為NaOH、KOH或Ca(OH)2溶液。
生物型人工脊髓的制備方法中所述的非醛類固定劑為易與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的試劑如環(huán)氧化物、二酰二胺、二異氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亞胺試劑中的一種或兩種，這里的環(huán)氧化物可以是單環(huán)氧化物 也可以是雙環(huán)氧化物 ，這里R＝CnH2n+1-，n＝0-10，還可以是低聚環(huán)氧化物如聚環(huán)氧丙烷。
生物型人工脊髓的制備方法中所述的活潑試劑可以是小分子有機(jī)酸酐、酰氯、酰胺、環(huán)氧化物等；強(qiáng)氫鍵試劑為胍類化合物。
生物型人工脊髓的制備方法中所述的偶聯(lián)劑為二酰二胺、二酸酐、雙環(huán)氧化物或其它能與-NH2，-OH，-COOH等起縮合反應(yīng)的雙官能團(tuán)試劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是仿照人體脊髓的組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計，髓質(zhì)類似于人脊髓的髓質(zhì)(灰質(zhì)和白質(zhì))，它是用去抗原異種脊髓基質(zhì)，引入可粘附神經(jīng)干細(xì)胞及有關(guān)生長因子的活性組分制成，可征集生長因子及神經(jīng)干細(xì)胞，并誘導(dǎo)其定向分化，促進(jìn)脊髓組織的再生。軟脊膜類似于脊髓的軟脊膜，可透過腦脊液中的營養(yǎng)物質(zhì)。螺旋支架除起支撐作用外，所形成的螺旋凹坑起到腦脊液流動腔的作用。蛛網(wǎng)膜與硬脊膜之間留有空間可形成硬脊膜下腔。所有的構(gòu)件都是天然生物材料制成，生物相容性好，無免疫排異原性，可被降解吸收，可誘導(dǎo)組織再生，從而為脊髓損傷的修復(fù)提供良好的基質(zhì)和微環(huán)境。


附圖1為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖；1、髓質(zhì)，2、軟脊膜，3、蛛網(wǎng)膜，4、硬脊膜，5、膠原凝膠層，6、螺旋支架。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例如圖1所示，生物型人工脊髓，由髓質(zhì)1、包裹在髓質(zhì)1外的軟脊膜2、固定在軟脊膜2外的螺旋支架6、依次包裹在螺旋支架6外的蛛網(wǎng)膜3、包裹蛛網(wǎng)膜3的膠原凝膠層5和包裹在凝膠層5外的硬脊膜4組成。髓質(zhì)1、軟脊膜2、蛛網(wǎng)膜3及硬脊膜4分別由通過非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原的動物脊髓、動物膜組織制成。其制備步驟為一、髓質(zhì)1的制備取新鮮的豬脊髓，小心剪除其硬脊膜、蛛網(wǎng)膜及軟脊膜，取髓質(zhì)，小心剔除微血管，放入0.2～2％的NaOH溶液中浸泡2小時，取出，用水漂洗三次。取出瀝干水分，用有機(jī)溶劑抽取其中脂肪。取出，除去溶劑后，用碳鏈環(huán)氧化物與之進(jìn)行交聯(lián)固定反應(yīng)。取出，洗凈，冷凍干燥，用乙酸酐或丁酸酐與之反應(yīng)，封閉抗原基因；再用鹽酸胍的Tris緩沖溶液處理，改變引起抗原的特異構(gòu)象。取出，洗凈，用碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R)作偶聯(lián)劑將由16個賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的多肽偶合到髓質(zhì)1的膠原分子上，洗凈，置于生理鹽水中低溫保存?zhèn)溆谩?br> 二、軟脊膜2、蛛網(wǎng)膜3和硬脊膜4的制備分別取牛心包、豬心包、豬腸膜或豬隔膜，洗凈，小心除去多余組織和雜質(zhì)，取堅(jiān)實(shí)平整的膜體，洗凈，用0.1～2％濃度的KOH溶液浸泡處理2小時。取出，用水漂洗三次以上，取出瀝干水分，用有機(jī)溶劑抽取其中脂肪及脂溶性雜質(zhì)。取出，除去溶劑后，用碳鏈環(huán)氧化物與之進(jìn)行交聯(lián)固定反應(yīng)。取出，洗凈，冷凍干燥，用乙酸酐或丁酸酐與之反應(yīng)，封閉抗原基因；再用鹽酸胍的Tris緩沖溶液處理，改變引起抗原的特異構(gòu)象。取出洗凈，冷凍干燥，用P2O5作脫水縮合劑將聚羥基乙酸的預(yù)聚體接枝到膜材的膠原分子上。用碳化二亞胺(R-N＝C＝N-R)作偶聯(lián)劑將由16個賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的多肽及透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素或硫酸皮膚素或肝素或硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素偶合到上述膜材的膠原分子上，洗凈，置于生理鹽水中低溫保存?zhèn)溆谩＼浖鼓?選用最薄滲透性最好的豬腸膜，蛛網(wǎng)膜3選用豬心包，硬脊膜4選用較厚的牛心包或豬隔膜。
三、生物型人工脊髓的制備在設(shè)定直徑的圓棒模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的軟脊膜2邊邊粘合形成圓管狀體。另取上述任一膜裁成寬度為0.5-2.0mm的長片條，用醫(yī)用膠將長片條按一定間距螺旋盤繞粘合到軟脊膜2的管壁上，繞粘數(shù)層，形成有一定支撐力的螺旋支架6，再用醫(yī)用膠將蛛網(wǎng)膜3粘合到螺旋支架6的凸梁上，自身再邊邊粘合成圓管狀體，即得圓管狀體得蛛網(wǎng)膜3。另用醫(yī)用級膠原，用溫水溶解，攪勻成溶膠，再均勻涂布于蛛網(wǎng)膜3上，真空干燥，如此涂布多次，得膠原凝膠層5，將處理好的牛心包緊緊包裹凝膠層，并邊邊粘合成圓管狀體得到硬脊膜4。脫出圓棒模具，小心將制好的髓質(zhì)1充填管心的圓柱腔，必要時加少量醫(yī)用膠原或醫(yī)用蛋白膠作賦形劑。充填密度不宜太緊，也不宜太松，以適中為好，填好后冷凍干燥以定型。用生理鹽水作保存液密封包裝，用鈷-60輻射滅菌，即得到產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種生物型人工脊髓，其特征在于由髓質(zhì)(1)、包裹在髓質(zhì)(1)外的軟脊膜(2)、固定在軟脊膜(2)外的螺旋支架(6)、依次包裹在螺旋支架(6)外的蛛網(wǎng)膜(3)、包裹在蛛網(wǎng)膜(3)外的膠原凝膠層(5)和包裹在膠原凝膠層(5)外的硬脊膜(4)組成，髓質(zhì)(1)、軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)及硬脊膜(4)分別是由通過非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原處理的動物脊髓、動物膜組織制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物型人工脊髓，其特征在于所述髓質(zhì)(1)、軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)及硬脊膜(4)分別由通過偶聯(lián)劑偶合多肽及糖胺聚糖類活性組分處理的動物脊髓、動物膜組織制成；軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)及硬脊膜(4)還增加了一個增韌改性步驟制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物型人工脊髓，其特征在于所述的多肽之一是由16個賴氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)縮聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角質(zhì)素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的生物型人工脊髓，其特征在于所述的軟脊膜(2)為動物的軟脊膜、腸膜或者其它經(jīng)過機(jī)械薄化處理的動物膜組織制成；所述蛛網(wǎng)膜(3)和硬脊膜(4)為動物心包膜、膈膜、脂肪網(wǎng)膜、胸膜、腹膜或腸膜制成；所述螺旋支架(3)由所述軟脊膜(2)或蛛網(wǎng)膜(3)、硬脊膜(4)的膜材剪裁成長片條盤繞粘合而制成。
5.一種權(quán)利要求1所述的生物型人工脊髓的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、選料收集新鮮動物的脊髓以及膜組織，小心剪去脊髓全部外膜取髓質(zhì)，并小心剔除血管，對于膜組織小心修剪去除多余雜質(zhì)及不規(guī)整部分，張力定型b、堿處理使用堿溶液浸泡髓質(zhì)和膜組織；c、脫脂使用有機(jī)溶劑抽提髓質(zhì)及膜組織中的脂肪及脂溶性雜質(zhì)；d、交聯(lián)固定使用非醛類固定劑交聯(lián)固定髓質(zhì)及膜組織中的膠原蛋白分子；e、去除抗原使用活潑試劑封閉髓質(zhì)及膜組織蛋白質(zhì)中引起抗原的特異活性基團(tuán)-OH，-NH2，-SH，并用強(qiáng)氫鍵試劑置換基材蛋白質(zhì)分子螺旋鏈中引起特異構(gòu)象的特殊氫鍵；f、整體制備在棒狀模具上，用醫(yī)用膠將相應(yīng)尺寸的軟脊膜(2)粘合成管狀體；另取上述任一膜裁成規(guī)定寬度的長片條，按一定間距盤繞粘合在軟脊膜(2)外，形成螺旋支架(6)；再將蛛網(wǎng)膜(3)粘合在螺旋支架(6)的凸梁上形成管狀體；取醫(yī)用膠原溶于水制成溶膠，涂布于蛛網(wǎng)膜(3)外，涂布多層并真空干燥形成膠原凝膠層(5)；膠原凝膠層(5)外包裹硬脊膜(4)并粘接成管狀體；取出模具，小心向空腔填充髓質(zhì)(1)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于它在e和f步驟之間還設(shè)有增韌改性的處理步驟，即使用縮合、引發(fā)或輻射接枝的方法，在所述軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)和硬脊膜(4)的膠原蛋白分子中適當(dāng)接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羥乙酸鏈段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于它在e和f步驟之間還設(shè)有通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)特定多肽或糖胺聚糖活性組分的處理步驟，即在所述髓質(zhì)(1)、軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)和硬脊膜(4)的表面上通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)可粘附生長因子的多肽或糖胺聚糖活性組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的活潑試劑可以是小分子有機(jī)酸酐、酰氯、酰胺、環(huán)氧化物；強(qiáng)氫鍵試劑為胍類化合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的非醛類固定劑為易與蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的試劑，如環(huán)氧化物、二酰二胺、二異氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亞胺試劑中的一種或兩種，這里的環(huán)氧化物可以是單環(huán)氧化物 ，也可以是雙環(huán)氧化物 這里R＝CnH2n+1-，n＝0-10，還可以是低聚環(huán)氧化物，如聚環(huán)氧丙烷。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于所述的偶聯(lián)劑為二酰二胺、二酸酐、雙環(huán)氧化物或其它能與-NH2，-OH，-COOH起縮合反應(yīng)的雙官能團(tuán)試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物型人工脊髓及其制備方法，它由髓質(zhì)(1)、包裹在髓質(zhì)(1)外的軟脊膜(2)、固定在軟脊膜(2)外的螺旋支架(6)、依次包裹在螺旋支架(6)外的蛛網(wǎng)膜(3)、包裹在蛛網(wǎng)膜(3)外的膠原凝膠層(5)和包裹在膠原凝膠層(5)外的硬脊膜(4)組成，髓質(zhì)(1)、軟脊膜(2)、蛛網(wǎng)膜(3)及硬脊膜(4)分別是由通過非醛類固定劑交聯(lián)固定和活潑試劑及強(qiáng)氫鍵試劑去除抗原處理的動物脊髓、動物膜組織制成。本發(fā)明仿照人體脊髓的組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計，所有的構(gòu)件都是天然生物材料制成，生物相容性好，無免疫排異原性，可被降解吸收，可誘導(dǎo)組織再生，從而為脊髓損傷的修復(fù)提供良好的基質(zhì)和微環(huán)境。
文檔編號A61L27/00GK1985777SQ20051012079
公開日2007年6月27日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月20日
發(fā)明者徐國風(fēng) 申請人:廣州知光生物科技有限公司