專利名稱：一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑。
背景技術：
股骨頭缺血性壞死是臨床多發(fā)病和常見病，致殘率高。它可引起股骨頭塌陷、變形，最終導致髖關節(jié)功能障礙，本病為一不可逆過程。股骨頭壞死的根本原因是血供障礙，并且病程的發(fā)展會造成進一步的血供障礙，引發(fā)股骨頭壞死的加重，是一個惡性循環(huán)的發(fā)病過程，在股骨頭壞死中，血管損傷、炎癥導致的血管栓塞和骨內(nèi)壓升高是造成上述惡性循環(huán)的重要原因，這是股骨頭壞死治療中的難點。
股骨頭壞死的治療方法有手術治療和非手術治療，手術治療主要是人工關節(jié)置換術，該方法只適合老年人，不適合從事重體力勞動的年輕人。非手術治療主要是采取血管生成及擴血管的藥物改善血供，但是，由于股骨頭骨內(nèi)壓高，單純應用血管生成因子很難誘導新血管生成。征對股骨頭壞死的病理特征，本發(fā)明研制一種復合制劑，采用抗炎因子使壞死股骨頭消炎減壓，同時，應用促進血管生成的細胞因子誘導新的血管生成，變股骨頭壞死惡性循環(huán)為良性循環(huán)，達到治療股骨頭壞死的目的。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效治療股骨頭壞死的復合制劑，。
本發(fā)明的目的可通過以下的技術措施來實現(xiàn)由具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑復合而成。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑復合的重量份比為5～8∶8～12。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑重量份比為7∶10。
本發(fā)明所述具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑中細胞因子的含量為100～200μg/ml，其中脂質體由膽固醇與卵磷脂組成，膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
本發(fā)明所述具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑中的細胞因子含量為100～200μg/ml，其中脂質體由膽固醇與卵磷脂組成，膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
本發(fā)明具有促血管生成的細胞因子為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)。
本發(fā)明具有抗炎作用的細胞因子為腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)、白細胞介素10(IL-10)或轉化生長因子(TGF-β)。
由于細胞因子在體內(nèi)的半衰期短，采用脂質體緩釋技術，制備基因重組VEGF121及基因重組TNFRII-FC脂質體，用于股骨頭壞死及骨創(chuàng)傷修復的治療，取得明顯的療效。
采用新西蘭兔，耳緣靜脈注射馬血清，臀肌注射醋酸潑尼松龍，制造激素性股骨頭壞死動物模型，模型建立后，動物隨機分為2組A組VEGF/TNFRII脂質體治療組，B組未治療對照組。骨穿刺針行經(jīng)皮注射藥物至股骨頭。A組每只兔子左側股骨頭內(nèi)分別注入VEGF/TNFRII脂質體，B組以同樣方法經(jīng)骨穿針注射同等量生理鹽水作為對照組。于治療后4周后，采用影像學方法觀察股骨頭結構變化，病理組織學觀察骨組織、骨髓組織變化、骨組織內(nèi)血管的變化。
普通X線檢查顯示VEGF/TNFRII治療組左側股骨頭形態(tài)較右側有顯著改善，左側股骨頭關節(jié)面基本完整，無明顯缺損區(qū)域(見圖1)。
CT檢查顯示VEGF/TNFRII組左側關節(jié)面較右側清晰，骨密度較均一(見圖2)。
墨汁灌注血管造影結果顯示VEGF/TNFRII組可見血管網(wǎng)形成，潮線下、細小血管清淅可見。骺下血管分布及血管網(wǎng)的形成基本正常(見圖3)。未治療組墨汁灌注血管造影顯示股骨頭血管顯著減少，灌注不全面，血管出現(xiàn)明顯栓塞。(見圖4)HE染色結果顯示VEGF/TNFRII治療組軟骨細胞增生明顯，骨小梁邊有骨母細胞出現(xiàn)，骨髓腔造血組織增生，空骨陷窩減少，栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管，血管內(nèi)皮細胞增生(見圖5，6)。未治療對照組股骨頭壞死模型組HE染色顯示骨膜不完整，軟骨部分脫落，骨小梁稀疏變細，結構紊亂，有碎片出現(xiàn)，骨小梁骨細胞陷窩空疏，骨細胞核固縮；部分血管栓塞；骨髓腔內(nèi)造血組織明顯減少，脂肪細胞體積增大，有的融合成泡狀(見圖7，8)。
上述的動物實驗結果顯示VEGF/TNFRII脂質體經(jīng)直接穿刺介入治療股骨頭壞死，股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少，骨髓腔內(nèi)脂肪細胞數(shù)量減少、體積明顯縮小，軟骨下區(qū)血管數(shù)目增多，血管內(nèi)脂肪栓子消失。VEGF/TNFRII的治療效果明顯。
圖1治療組普通X線檢查圖片，顯示股骨頭關節(jié)面趨于完整缺損區(qū)基本消失；圖2治療組CT檢查圖片，顯示左側股骨頭關節(jié)面較右側完整，骨質結構清晰；圖3治療組墨汁灌注血管造影圖片(×10)，顯示股骨頭血管墨汁染色顯示血管增生，部分血管有再通；圖4未治療組墨汁灌注血管造影圖片(×10)，顯示股骨頭血管墨汁染色顯示血管閉塞，血管稀少，股骨頭淺層血管幾乎消失；圖5治療組HE染色結果圖片(HE×200)，顯示骨小梁中骨細胞數(shù)目增多，小梁周邊骨母細胞增生，骨髓腔中造血組織明顯增生；圖6治療組HE染色結果圖片(HE×400)，顯示骨小梁內(nèi)見骨細胞增生，小梁周邊出現(xiàn)較多的骨母細胞，空骨陷窩減少，骨小管及骨髓腔內(nèi)血管增生，其中栓塞的血管旁邊出現(xiàn)新生的血管。
圖7未治療組HE染色結果圖片(HE×200)，顯示骨小梁中出現(xiàn)新生骨細胞，骨髓腔中造血組織增生，但是數(shù)量明顯少于A組。
圖8未治療組HE染色結果圖片(HE×400)，顯示血管出現(xiàn)栓塞，空骨陷窩較多。
具體實施例方式
上述血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質體緩釋劑按以下步驟制備(1)VEGF121基因克隆、表達(VEGF121基因序列參見GenBank AF214570)從HL60細胞中提取總RNA，設計上下游引物，RT-PCR擴增VEGF121基因，克隆到pET-24a表達載體中，將pET-24a/VEGF121重組子轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，通過表達篩選，得到VEGF121工程菌，通過細菌培養(yǎng)，IPTG誘導表達，得到重組VEGF121。
(2)重組VEGF121的復性與純化將高效表達的菌體用TE緩沖液懸浮，4℃預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質機高壓破菌，離心，得到包涵體，包涵體用洗滌液洗滌，再用7mol/L鹽酸胍溶解，溶解液透析于10mmol/L HCl中，加入固體尿素至其濃度為8mol/L，調(diào)節(jié)蛋白質濃度至0.2mg/mL，用5倍體積的復性液等容超濾，復性后蛋白質上弱陰離子交換(DEAE-Sepharose fast flow)柱，NaCl濃度線性梯度洗脫，收集目的蛋白洗脫峰，透析去鹽、濃縮，上Sephacryl S-100凝膠過濾色譜，收集目的蛋白洗脫峰。
(3)VEGF121脂質體的制備用二次乳化法制備VEGF121脂質體，具體操作如下取35mg VEGF121蛋白，濃縮至30ml，按1∶4取膽固醇200mg，卵磷脂800mg，用100ml二氯四甲烷溶解，將水相和有機相混合乳化，于旋轉薄膜蒸發(fā)儀(轉速80r/min)上減壓蒸發(fā)至圓底燒瓶內(nèi)，乳化液變成凝膠狀黏稠液體時，再加入100ml PBS溶液繼續(xù)減壓蒸發(fā)，使緩沖液100ml中總脂質體含量1％，除去有機溶劑，將制備的混懸液再超聲30min，即得試驗用的VEGF脂質體緩釋劑，取上述制備的液體加入甘露醇5g，10mg人血清白蛋白，分裝于青霉素瓶中冷凍干燥。
上述腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)受體脂質體緩釋劑按以下制備采用上海復旦張江生物有限公司購買的TNFRII-FC蛋白質純品，用二次乳化法制備TNFRII-FC脂質體，具體操作如下取35mg TNFRII-FC蛋白(凍干粉)，按1∶4取膽固醇200mg，卵磷脂800mg，用100ml二氯四甲烷溶解，將水相和有機相混合乳化，于旋轉薄膜蒸發(fā)儀(轉速80r/min)上減壓蒸發(fā)至圓底燒瓶內(nèi)，乳化液變成凝膠狀黏稠液體時，再加入100ml PBS溶液繼續(xù)減壓蒸發(fā)，使緩沖液100ml中總脂質體含量1％，除去有機溶劑，將制備的混懸液再超聲30min，即得試驗用的VEGF脂質體緩釋劑，取上述制備的液體加入甘露醇5g，10mg人血清白蛋白，分裝于青霉素瓶中冷凍干燥。
根據(jù)實驗動物的大小，取上述制得的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質體緩釋劑和腫瘤壞死因子受體(TNFRII-FC)脂質體緩釋劑，或取兩種脂質體凍干粉，VEGF121與TNFRII-FC以重量份7∶10的比例溶于生理鹽水，用于注射。也可取上述兩種緩釋劑以重量份5∶8或8∶12的比例溶于生理鹽水，用于注射。
上述血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)也可用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)替代，同樣能起到治療效果。
上述腫瘤壞死因子(TNFRII-FC)也可用白細胞介素10(IL-10)或轉化生長因子(TGF-β)替代，同樣能起到治療效果。
權利要求
1.一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑，其特征在于由具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑復合而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑，其特征在于具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑復合的重量份比為5～8∶8～12。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑，其特征在于具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑重量份比為7∶10。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑，其特征在于所述具有促血管生成的細胞因子脂質體緩釋劑中細胞因子的含量為100～200μg/ml，其中脂質體由膽固醇與卵磷脂組成，膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的用于治療股骨頭壞死的藥物，其特征在于所述具有抗炎作用的細胞因子受體脂質體緩釋劑中的細胞因子含量為100～200μg/ml，其中脂質體由膽固醇與卵磷脂組成，膽固醇與卵磷酯的比值為1∶4。
6.根據(jù)權利要求1、2、3或4所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑，其特征在于具有促血管生成的細胞因子為血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、或血小板樣生長因子(PDGF)。
7.根據(jù)權利要求1、2、3或5所述的用于治療股骨頭壞死復合制劑，其特征在于具有抗炎作用的細胞因子為腫瘤壞死因子(TNFR-FC)、白細胞介素10(IL-10)或轉化生長因子(TGF-β)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療股骨頭壞死的復合制劑，由具有促進血管生成作用的血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)脂質體緩釋劑和具有抗炎作用的腫瘤壞死因子受體(TNFR－FC)脂質體緩釋劑復合而成，其中VEGF121脂質體緩釋劑與TNFR－FC脂質體緩釋劑復合的重量份比為5～8∶8～12。本發(fā)明VEGF/TNFR脂質體緩釋劑經(jīng)直接穿刺介入治療激素誘導的兔股骨頭壞死，股骨頭的空缺骨陷窩數(shù)明顯減少，骨髓腔內(nèi)脂肪細胞數(shù)量減少、體積明顯縮小，軟骨下區(qū)血管數(shù)目增多，血管內(nèi)脂肪栓子消失；顯示VEGF/TNFR的治療效果明顯。
文檔編號A61K9/127GK1824298SQ20051012073
公開日2006年8月30日 申請日期2005年12月19日 優(yōu)先權日2005年12月19日
發(fā)明者王小寧, 胡志明, 馬驪 申請人:南方醫(yī)科大學