專利名稱：化學(xué)修飾的阿德福韋和泰諾福韋的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對藥物分子進(jìn)行化學(xué)修飾以改善現(xiàn)有藥物的不足，具體來說是阿德福韋(Adefovir，PMEA)或泰諾福韋(tenofovir，PMPA)與聚乙二醇的結(jié)合物，阿德福韋或泰諾福韋和糖基化聚乙二醇結(jié)合的結(jié)合物，還涉及它們的制備方法和在抗病毒方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
阿德福韋和泰諾福韋是結(jié)構(gòu)相近的核苷類似物，具有廣譜的抗病毒活性，其結(jié)構(gòu)式為 其中A可選擇H或CH3，當(dāng)A代表H時(shí)，即為阿德福韋；當(dāng)A代表CH3時(shí)，即為泰諾福韋。
臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿德福韋和泰諾福韋都具有較好的抗艾滋病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)阿德福韋和泰諾福韋對體外培養(yǎng)的鴨肝細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系中乙型肝炎病毒的復(fù)制和表達(dá)具有顯著的抑制作用。動物試驗(yàn)研究表明，阿德福韋和泰諾福韋對于體內(nèi)的肝炎病毒的復(fù)制和表達(dá)也具有顯著的抑制作用。在長期應(yīng)用核苷類似物如拉咪夫定等治療過程中，容易發(fā)生病毒基因的突變，從而發(fā)生抗藥性。研究表明，阿德福韋和泰諾福韋不僅對于野生株具有顯著的抑制作用，而且對于拉咪夫定等的耐藥病毒株也具有顯著的抑制作用(國外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊，2001，3/8，85-90；Hepatology 2004，401421-25)。
但在生理pH情況下，分子中直接暴露的膦酸根限制了阿德福韋和泰諾福韋對腸道的穿透力，使得它們在動物和人體中的生物利用度降低，限制了其對疾病的治療作用。通過對阿德福韋上膦酸官能團(tuán)的修飾，已經(jīng)合成出阿德福韋酯(Adefovir dipivoxil)和泰諾福韋酯(tenofovir disoproxil)，結(jié)構(gòu)式如下 阿德福韋酯 泰諾福韋酯阿德福韋酯和泰諾福韋酯的抗病毒部分分別是PMEA和PMPA，進(jìn)入體內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為PMEA和PMPA而發(fā)揮作用。作為阿德福韋和泰諾福韋的前體藥物，阿德福韋酯和泰諾福韋酯中膦酸鹽上的電荷得到了屏蔽，增加了母體的脂溶性，提高了對腸道細(xì)胞膜的穿透力，其口服生物利用度也得到相應(yīng)的增加。
但是，阿得福韋酯在人體內(nèi)主要集中分布在腎、肝和肺，臨床研究發(fā)現(xiàn)阿得福韋酯具有較大的腎毒性，因此只能采用10mg/天的非優(yōu)化的治療劑量，這在一定程度上限制了其對疾病的治療效果。泰諾福韋酯的腎毒性比阿得福韋酯小，但口服劑量需要150-300mg，生物利用度較低，因此，目前仍在尋找更好的前體藥物。
目前，臨床得以應(yīng)用的抗乙肝病毒(HBV)藥物種類十分有限，已上市藥物包括拉咪夫定、阿得福韋酯、恩地卡韋，這些藥物的水溶性很差，難以制成注射途徑給藥的劑型，只有口服給藥，臨床特別缺乏注射給藥途徑的抗HBV藥物，未滿足臨床上急重病人的需要。
當(dāng)前，利用聚乙二醇修飾藥物已是一種成熟的技術(shù)，藥物經(jīng)聚乙二醇修飾后，一方面分子量顯著增加，另一方面聚乙二醇對藥物形成屏障，可減少藥物的腎清除。藥物動力學(xué)性質(zhì)也因而發(fā)生較大變化，吸收遲緩、分布容積減小、血漿半衰期延長。因此血藥濃度能夠長時(shí)間維持在較平穩(wěn)的水平，從而使療效增強(qiáng)，特別是在抗病毒治療中，因?yàn)槌掷m(xù)的抗病毒壓力可防止病毒復(fù)制，從而抑制耐藥變異株的產(chǎn)生。此外，給藥間隔延長可提高患者對治療的依從性，改善患者生活質(zhì)量，這也有助于改善臨床療效。血藥濃度的平穩(wěn)化還有另外一個益處，即減少血漿藥物濃度峰谷波動所引起的不良反應(yīng)，提高了安全性。我們將阿德福韋和泰諾福韋與聚乙二醇結(jié)合可改善它們的藥動學(xué)性質(zhì)，以期得到長效低毒的抗病毒藥物。
肝細(xì)胞半乳糖受體(hepatocyte galactose receptor，H-Gal-R)存在于哺乳動物的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞膜上，能特異地識別和結(jié)合非還原半乳糖或N-乙酰半乳糖為末端的糖蛋白，通過胞吞作用將其轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)溶酶體進(jìn)行代謝，利用H-Gal-R介導(dǎo)的各種藥物可定向轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，H-Gal-R介導(dǎo)系統(tǒng)對肝有較高的親和性，且肝吸收迅速。由于乙型肝炎病毒核心抗原存在于肝細(xì)胞內(nèi)，核苷類藥物需進(jìn)入肝細(xì)胞，并經(jīng)胸腺嘧啶核苷激酶催化磷酸化后方顯效，而核苷類藥物不易透過肝細(xì)胞，且乙肝病毒感染的細(xì)胞缺少胸腺嘧啶核苷激酶，宿主細(xì)胞磷酸化作用緩慢，達(dá)不到抑制病毒復(fù)制的有效濃度，大劑量給藥可提高血藥濃度，但在血中未被磷酸化的藥物可迅速經(jīng)腎排泄而出現(xiàn)血尿和腎功能障礙等毒副作用(World Chin J Digestol 2003 June；11(6)799-802)。本發(fā)明將糖基化聚乙二醇結(jié)合到阿德福韋和泰諾福韋上，將藥物定向轉(zhuǎn)移到肝細(xì)胞內(nèi)，從而提高了阿德福韋和泰諾福韋的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是對具有廣譜抗病毒活性的核苷類似物阿德福韋和泰諾福韋進(jìn)行化學(xué)修飾以提供一種新的長效低毒的抗病毒藥物，以及一種具有高度肝細(xì)胞靶向性的阿德福韋和泰諾福韋前藥。
本發(fā)明的另一個目的是提供對阿德福韋和泰諾福韋進(jìn)行化學(xué)修飾的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供上述阿德福韋和泰諾福韋前藥在抗病毒領(lǐng)域、特別是抗乙肝病毒領(lǐng)域的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的阿德福韋和泰諾福韋與聚乙二醇或末端糖基化的聚乙二醇結(jié)合物，具有如下通式 其中，A為H或CH3；R為形式如X-Y的結(jié)構(gòu)，即基團(tuán)X和Y的組合，其中Y為H、C1-6的直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基、乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物，其中X為O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-W、NH-W、O-CO-W、CO-O-W、O-W-O、O-W-NH、O-W-CO-O、NH-W-NH、NH-W-O、NH-W-CO-O、CO-O-W-O、CO-O-W-NH或CO-O-W-CO-O，其中W為低級烷基或芳基，X的作用是連接聚乙二醇的末端基團(tuán)，特別是與乳糖或半乳糖的連接，乳糖、半乳糖與聚乙二醇的連接一般是以酯鍵和甙鍵、肽鍵、亞胺酯鍵偶連；R’為CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2，n＝11-450；R”為O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-Z、NH-Z、O-CO-Z、CO-O-Z、O-Z-O、O-Z-NH、O-Z-CO-O、NH-Z-NH、NH-Z-O、NH-Z-CO-O、CO-O-Z-O、CO-O-Z-NH或CO-O-Z-CO-O，其中Z為低級烷烴或芳烴，R”是用于連接聚乙二醇長鏈R’和阿德福韋或泰諾福韋中磷酸酯的基團(tuán)，以上基團(tuán)自左到右分別與R’和磷酸酯鏈接；上述的低級烷基為C1-6直鏈、支鏈或環(huán)狀的亞烴基，芳烴為苯或其衍生物或芳香雜環(huán)化合物或其衍生物的亞基。
當(dāng)A為H時(shí)為阿德福韋衍生物，當(dāng)A為CH3時(shí)為泰諾福韋衍生物；當(dāng)Y為C1-6直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基，可以為-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH(CH3)3、-CH2CH2CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH2CH2CH3、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)2CH2CH3、-CH(CH3)CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH2CH3、-CH2C(CH3)3、-CH2CH2CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)CH2CH2CH3、-CH2CH2CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH(CH3)2、-CH2C(CH3)2CH2CH3、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)、-CH(CH2CH3)CH(CH3)2、-C(CH3)(CH2CH3)2、-C(CH3)2CH2CH2CH3、-C(CH3)2CH(CH3)2、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)丙基甲基、環(huán)戊烷、環(huán)丁基甲基、1-環(huán)丙基-1-乙基、2-環(huán)丙基-1-乙基、環(huán)己基、環(huán)戊基甲基、1-環(huán)丁基-1-乙基、2-環(huán)丁基-1-乙基、1-環(huán)丙基-1-丙基、2-環(huán)丙基-1-丙基、3-環(huán)丙基-1-丙基、2-環(huán)丙基-2-丙基和1-環(huán)丙基-2-丙基；乳糖基和/或其衍生物、半乳糖基和/或其衍生物可以為硫代半乳糖、2-亞氨基-2-甲氧基-1-硫代-β-D-半乳糖吡糖苷、對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷、D(+)-半乳糖胺；當(dāng)Y為H、直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基時(shí)，提供的是一種聚乙二醇化的阿德福韋和泰諾福韋，Y優(yōu)選為甲基，即單甲氧基聚乙二醇與阿德福韋和泰諾福韋的結(jié)合物；當(dāng)Y為乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物時(shí)，提供的是一種末端糖基化的聚乙二醇化阿德福韋和泰諾福韋，Y優(yōu)選半乳糖基或硫代半乳糖基；低級烷烴可以為亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基，芳香雜環(huán)化合物或其衍生物包括但不限于吡啶基、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基、吲哚基、亞吲哚基(indolenyl)，喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、三嗪基、噻蒽基、吡喃基、異苯并呋喃基、吩噁噻嗯基(phenoxathinyl)、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、嘌啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、1，2-二氮雜萘基、4aH-卡唑基、卡唑基、β-咔啉基、菲啶基、丫啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、趺咱基、吩噁嗪基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、奎寧環(huán)基、嗎啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基。
所述n的數(shù)值意義是使聚乙二醇的分子量達(dá)到500-20000。
式(II)是指聚乙二醇兩端均結(jié)合了阿德福韋或泰諾福韋的化合物，提供的也是一種具有緩釋作用和良好安全性能的抗病毒前藥。
本發(fā)明提供的是一種阿德福韋或泰諾福韋與聚乙二醇的結(jié)合物和它們與具有肝細(xì)胞定向作用的糖基化聚乙二醇結(jié)合的新化合物，它們能夠用于治療病毒性疾病，特別是治療乙型肝炎，是一種高效、低毒且具有高度肝細(xì)胞靶向作用的抗病毒藥物。
本發(fā)明化合物作為活性成分，可以加有或不加藥用載體，按藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的生產(chǎn)方法制成不同給藥途徑的制劑。這些制劑可通過口服、直腸或腸胃外給藥方式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑等，還可制成液體制劑如糖漿、口服液等。
由于本發(fā)明衍生物有良好的水溶性，可以加或不加藥物載體制成注射劑、口服液等液體制劑。所述的注射劑包括注射液、注射用無菌粉針和注射用濃溶液。
注射液的制備方法為，將上述化合物加入注射用水中，攪拌至全溶，加入等滲調(diào)節(jié)劑攪拌至全溶，調(diào)節(jié)酸堿度，如果需要，還可以包括加入穩(wěn)定劑、增溶劑，然后依次經(jīng)過脫炭、粗濾、定容、精濾、灌封、滅菌即可。
口服液的制備方法為，直接將上述化合物加入到純水中，根據(jù)情況可以加入甜味劑和/或防腐劑。
式(I)或式(II)所示的化合物可按如下方法制備阿德福韋(或泰諾福韋)聚乙二醇結(jié)合物的制備方法。
將單甲氧基聚乙二醇或其衍生物和阿德福韋(或泰諾福韋)加入有機(jī)溶劑中，在吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的存在下，20～120℃加熱反應(yīng)0.5～24小時(shí)，得到式(I)所示化合物。
將聚乙二醇或其衍生物和阿德福韋(或泰諾福韋)加入有機(jī)溶劑中，在吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的存在下，40～120℃加熱反應(yīng)0.5～10小時(shí)，得到式(II)所示化合物。
阿德福韋(或泰諾福韋)與末端糖基化的聚乙二醇結(jié)合物的制備方法一將由上述方法制得的阿德福韋(或泰諾福韋)與單甲氧基聚乙二醇的結(jié)合物用三甲基碘硅烷將甲氧基轉(zhuǎn)化為醇羥基，再與琥珀酸酐反應(yīng)，制得阿德福韋(或泰諾福韋)-聚乙二醇-丁二酸單酯，然后與對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷反應(yīng)制得目標(biāo)產(chǎn)品。
方法二將阿德福韋(或泰諾福韋)與單甲氧基聚乙二醇(mPEG)的結(jié)合物用三甲基碘硅烷將甲氧基轉(zhuǎn)化為醇羥基后，在堿性條件下，與1，2-二溴乙烷發(fā)生烴化反應(yīng)，然后與2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-異硫脲氫溴酸鹽，在碳酸鉀和亞硫酸氫鈉存在下反應(yīng)，最后在甲醇中，用甲醇鈉還原糖基上的乙酰保護(hù)基，即得目標(biāo)產(chǎn)品。
阿德福韋和泰諾福韋在經(jīng)過聚乙二醇修飾之后，PEG對原藥形成屏障，分子量顯著增加，減少了藥物的腎清除，降低了藥物的腎毒性；另一方面藥物動力學(xué)性質(zhì)也發(fā)生較大變化，主要表現(xiàn)為吸收遲緩、分布容積減小、血漿半衰期延長等。由于藥物半衰期延長，血藥濃度能夠長時(shí)間維持在較平穩(wěn)、有效的水平，從而提高了藥物的生物利用度，使療效增強(qiáng)，特別是在抗病毒治療中，持續(xù)的抗病毒壓力可防止病毒復(fù)制，抑制耐藥變異株的產(chǎn)生。此外，給藥間隔延長可提高患者對治療的依從性，改善患者生活質(zhì)量，血藥濃度的平穩(wěn)化還有另外一個益處，即減少血漿藥物濃度峰谷波動所引起的不良反應(yīng)，提高了安全性。我們通過動物實(shí)驗(yàn)也證明了以上的這些結(jié)論。因此，與現(xiàn)有的阿德福韋和泰諾福韋的前體藥物阿德福韋酯和泰諾福韋酯藥物相比，本發(fā)明化合物具有顯著進(jìn)步。
我們將阿德福韋和泰諾福韋與末端連接乳糖或半乳糖的聚乙二醇結(jié)合，不僅具有聚乙二醇修飾的優(yōu)點(diǎn)，而且可以利用肝細(xì)胞的胞吞作用，使藥物容易透過肝細(xì)胞發(fā)揮抗病毒作用，使藥物具有高度的靶向性，以降低藥物的腎毒性等副作用，提高其抗病毒的能力。
本發(fā)明還解決了現(xiàn)有藥物難以制成液體制劑的不足。阿德福韋和泰諾福韋原藥以及現(xiàn)有的前藥阿德福韋酯和泰諾福韋酯均難熔于水，難以制成液體制劑。但本衍生物有良好的水溶性，可以加或不加藥物載體制成注射劑、口服液等液體制劑。目前，臨床得以應(yīng)用的抗乙肝病毒(HBV)藥物只有口服給藥，缺乏注射給藥途徑的抗HBV藥物，不能滿足臨床上急重病人的需要。本發(fā)明的阿德福韋和泰諾福韋聚乙二醇化前藥克服了現(xiàn)有技術(shù)的這一缺陷。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的舉例說明，而非對本發(fā)明的限制。
本發(fā)明所使用的原料阿德福韋由文獻(xiàn)Holy A，Roseenberg I，Dvorakova H.Synthesis of N-(2-phosphonylmethoxyethyl)derivatives of heterocyclic base[J].Collect Czech Chem Commun，1989，52190～2195方法合成。泰諾福韋按專利US4808716、WO9804569所描述的方法合成。
實(shí)施例1阿德福韋-甲氧基聚乙二醇2000的制備將140g(0.07mol)的單甲氧基聚乙二醇2000(mPEG2000)加入500ml甲苯中，加熱熔解，蒸出甲苯約400ml，加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺、70ml吡啶、9.6g(0.035mol)阿德福韋和27g二環(huán)己基碳二亞胺，加熱升溫至100℃，并在此溫度下反應(yīng)120分鐘，冷卻至室溫，加入1000ml乙酸乙酯，攪拌2小時(shí)，過濾，母液回收溶劑，向殘余物中加入500ml無水乙醇溶解，然后緩慢加入劇烈攪拌的2000ml無水乙醚中，冷卻，過濾，濾餅室溫減壓干燥24小時(shí)，得130g。熔點(diǎn)49～52℃，含阿德福韋6.8％。
實(shí)施例2阿德福韋-甲氧基聚乙二醇胺2000的制備將140g(0.07mol)除水后的聚乙二醇胺2000(mPEG-NH2)加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入9.6g(0.035mol)阿德福韋和21g DCM，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，加入1000ml乙酸乙酯，攪拌2小時(shí)，過濾，母液回收溶劑，向殘余物中加入500ml無水乙醇溶解，然后緩慢加入劇烈攪拌的2000ml無水乙醚中，冷卻，過濾，濾餅室溫減壓干燥24小時(shí)，得126g產(chǎn)品。熔點(diǎn)49～53℃，含阿德福韋6.8％。
實(shí)施例3阿德福韋-甲氧基聚乙二醇1000的制備按照實(shí)施例1方法制備，單甲氧基聚乙二醇1000和阿德福韋投料摩爾比為2∶1，得阿德福韋聚乙二醇1000，熔點(diǎn)為34～38℃，含阿德福韋13.6％。
實(shí)施例4阿德福韋-甲氧基聚乙二醇5000的制備按照實(shí)施例1方法制備，單甲氧基聚乙二醇5000和阿德福韋投料摩爾比為2∶1，得阿德福韋聚乙二醇5000，熔點(diǎn)為50～55℃，含阿德福韋2.7％。
實(shí)施例5阿德福韋-甲氧基聚乙二醇10000的制備按照實(shí)施例1方法制備，單甲氧基聚乙二醇10000和阿德福韋投料摩爾比為2∶1，得阿德福韋聚乙二醇10000，熔點(diǎn)為56～60℃，含阿德福韋1.3％。
實(shí)施例6阿德福韋-甲氧基聚乙二醇20000的制備按照實(shí)施例1方法制備，單甲氧基聚乙二醇20000和阿德福韋投料摩爾比為2∶1，得阿德福韋聚乙二醇20000，熔點(diǎn)為58～64℃，含阿德福韋0.6％。
實(shí)施例7二阿德福韋-聚乙二醇2000的制備將140g(0.07mol)的PEG2000(聚乙二醇2000)加入500ml甲苯中，加熱熔解，蒸出甲苯約400ml，加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺、70ml吡啶、19.2g(0.07mol)阿德福韋和54g二環(huán)己基碳二亞胺，加熱升溫至100℃，保溫反應(yīng)120分鐘，冷卻至室溫，加入1000ml乙酸乙酯，攪拌2小時(shí)，過濾，母液回收溶劑，向殘余物中加入500ml無水乙醇溶解，然后緩慢加入劇烈攪拌的2000ml無水乙醚中，冷卻，過濾，濾餅室溫減壓干燥24小時(shí)，得132g產(chǎn)品。熔點(diǎn)48～52℃，含阿德福韋13.6％。
實(shí)施例8二阿德福韋-聚乙二醇10000的制備按照實(shí)施例6方法制備，聚乙二醇10000和阿德福韋投料摩爾比為1∶1，得二阿德福韋聚乙二醇10000，熔點(diǎn)為56～60℃，含阿德福韋2.6％。
實(shí)施例9泰諾福韋-聚乙二醇的制備按實(shí)施例1到6同樣的方法制備泰諾福韋聚乙二醇，制得的聚乙二醇化泰諾福韋性狀如表1。
表1聚乙二醇化泰諾福韋的件狀

實(shí)施例10阿德福韋-聚乙二醇2000-乳糖1、阿德福韋-聚乙二醇2000-丁二酸單酯將149g(0.035mol)阿德福韋-甲氧基聚乙二醇2000加入450ml氯仿中，加入7.0g三甲基碘硅烷，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入25ml水，攪拌10分鐘，靜置分層，取氯仿層，無水硫酸鈉干燥過夜，過濾，加入35.0g(0.35mol)丁二酸酐和20ml的吡啶，60℃左右回流反應(yīng)48小時(shí)，減壓蒸干，向殘余物中加入150ml的0.1M的碳酸氫鈉水溶液，抽濾，濾液用150ml的0.1M的鹽酸酸化，并調(diào)節(jié)pH值至3-4，而后用乙酸乙酯150ml×3萃取，合并乙酸乙酯溶液，用飽和氯化鈉溶液100ml×2洗滌，加入無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，殘余物加入30ml乙酸乙酯溶解，然后在劇烈攪拌下加入大量的無水乙醚中，冷卻攪拌半小時(shí)，過濾，真空干燥至恒重，得120g阿德福韋-聚乙二醇2000-丁二酸單酯。熔點(diǎn)46-1-47.8℃。
2、阿德福韋-聚乙二醇2000-乳糖取5g(0-001mol)阿德福韋-聚乙二醇2000-丁二酸單酯，加入20ml無水N，N-二甲基甲酰胺中，加入2ml三乙胺，在冰水浴中逐滴加入溶于2ml干燥N，N-二甲基甲酰胺的2g氯甲酸異丙酯的溶液中，攪拌混合物10分鐘，然后加入0.002mol的對-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷(Sigma)，冰浴下攪拌30分鐘，再在室溫下攪拌3小時(shí)，然后加入大量的無水乙醚中，沉淀產(chǎn)物。最后過ConA-Sepharose柱(Sigma)純化，得阿德福韋-聚乙二醇2000-乳糖，收率73％。
實(shí)施例11阿德福韋-聚乙二醇2000-半乳糖1、阿德福韋-聚乙二醇2000-乙酰化半乳糖取149g(0.035mol)阿德福韋-甲氧基聚乙二醇2000，按上述方法用三甲基碘硅烷將聚乙二醇上的甲氧基轉(zhuǎn)化為醇，水洗、干燥后蒸去溶劑氯仿，加入450ml乙酸乙酯溶解，加入15g無水碳酸鉀，加熱回流，滴加16g 1，2-二溴乙烷，回流反應(yīng)4小時(shí)，冷至室溫，過濾，減壓蒸干，加入400ml丙酮和150ml水溶解，加入67g(0.14mol)2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-異硫脲氫溴酸鹽，和碳酸鉀23g(0.167mol)，室溫?cái)嚢?0分鐘，加入亞硫酸氫鈉14.6g(0.14mol)，避光室溫?cái)嚢?4小時(shí)，減壓蒸干，用500ml氯仿溶解，用飽和食鹽水100ml×1洗滌，減壓濃縮，所得殘余物溶于水中，用柱色譜純化(樹脂HPD-300，洗脫劑水/乙醇＝95/5)，洗脫液濃縮，用200ml乙酸乙酯溶解，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮乙酸乙酯至50ml，加入劇烈攪拌的大量無水乙醚中，冷卻，過濾，真空干燥，得白色粉末狀固體，熔點(diǎn)42-44℃，收率32％。
2、阿德福韋-聚乙二醇2000-半乳糖取上述方法制得的阿德福韋-聚乙二醇2000-乙?；肴樘?0g溶于100ml無水甲醇中，加入0.1N的甲醇鈉的甲醇溶液20ml，室溫?cái)嚢?小時(shí)，減壓濃縮，加入氯仿200ml溶解，用飽和氯化鈉水溶液100ml×3洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，用20ml乙酸乙酯溶解，加入劇烈攪拌的大量無水乙醚中，冷卻，過濾，真空干燥，得白色粉末狀固體，熔點(diǎn)40-42℃，收率82％。
實(shí)施例12泰諾福韋mPEG2000和二泰諾福韋PEG2000在鴨體內(nèi)對乙型肝炎病毒感染的治療效果將感染陽性鴨隨機(jī)分組，每組6只，分設(shè)為1.病毒對照組，用生理鹽水。2.泰諾福韋mPEG2000小劑量組(50mg/kg)。3.泰諾福韋mPEG2000中劑量組(100mg/kg)。4.泰諾福韋mPEG2000大劑量組(200mg/kg)。5.二泰諾德福韋PEG2000小劑量組(50mg/kg)，6.二泰諾福韋PEG2000中劑量組(100mg/kg)。7.二泰諾福韋PEG2000大劑量組(200mg/kg)。每天口腔灌喂2次。實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間為10天，停藥觀察3天。觀察指標(biāo)用藥前(T0)、用藥5天(T5)、用藥10天(T10)、停藥3天(P3)分別頸外靜脈抽血，分離血清于-20℃保存待檢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、3。
表2泰諾福韋單甲氧基聚乙二醇2000和二泰諾福韋聚乙二醇2000治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBA-DNA OD值比較(x±S)

統(tǒng)計(jì)方法為，進(jìn)行治療前后自身配對t檢驗(yàn)。將用藥組不同時(shí)間DNA水平與同組用藥前的DNA水平進(jìn)行比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表3泰諾福韋單甲氧基聚乙二醇2000和二泰諾福韋聚乙二醇2000治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBA-DNA水平抑制率的比較

生理鹽水組用藥后血清DHBA-DNA水平無明顯變化，泰諾福韋mPEG2000小劑量用藥10天血清DHBV-DNA水平顯著降低(P＜0.05)，停藥后第3天血清DHBV-DNA水平有所升高，泰諾福韋mPEG2000中、大劑量用藥10天和停藥后第3天均有血清DHBV DNA水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01；二泰諾福韋PEG2000小劑量用藥10天血清DHBV-DNA水平顯著降低(P＜0.05)，停藥后第3天血清DHBV-DNA水平有所升高，二泰諾福韋PEG2000中、大劑量用藥10天和停藥后第3天均有血清DHBV DNA水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
結(jié)果顯示泰諾福韋mPEG2000和二泰諾福韋PEG2000有明顯抑制肝內(nèi)DHBV-DNA復(fù)制的作用，并且在100mg/kg、200mg/kg劑量下未出現(xiàn)停藥后的“反跳”現(xiàn)象。
實(shí)施例13藥效試驗(yàn)阿德福韋mPEG2000和二阿德福韋PEG2000在鴨體內(nèi)對乙型肝炎病毒感染的治療效果將感染陽性鴨隨機(jī)分組，每組6只，分設(shè)為1.病毒對照組，用生理鹽水。2.阿德福韋mPEG2000小劑量組，劑量為50mg/kg。3.阿德福韋mPEG2000中劑量組，劑量為100mg/kg。4.阿德福韋mPEG2000大劑量組，劑量為200mg/kg。5.二阿德福韋PEG2000小劑量組，劑量為50mg/kg，6.二阿德福韋PEG2000中劑量組，劑量為100mg/kg，7.二阿德福韋PEG2000大劑量組，劑量為200mg/kg。每天口腔灌喂2次。實(shí)驗(yàn)用藥時(shí)間為10天，停藥觀察3天。觀察指標(biāo)用藥前(T0)、用藥5天(T5)、用藥10天(T10)、停藥3天(P3)分別頸外靜脈抽血，分離血清于-20℃保存待檢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4、5。
表4阿德福韋單甲氧基聚乙二醇2000和二阿德福韋聚乙二醇2000治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBA-DNA OD值比較(x±S)

統(tǒng)計(jì)方法為進(jìn)行治療前后自身配對t檢驗(yàn)。將用藥組不同時(shí)間DNA水平與同組用藥前DNA水平進(jìn)行比較*P＜0.05，**P＜0.01。
表5阿德福韋單甲氧基聚乙二醇2000和二阿德福韋聚乙二醇2000治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBA-DNA水平抑制率的比較

生理鹽水組用藥后血清DHBA-DNA水平無明顯變化，阿德福韋mPEG2000小劑量用藥10天和停藥后第3天均有血清DHBV-DNA水平顯著降低(P＜0.05)，阿德福韋mPEG2000中、大劑量用藥5天、10天和停藥后第3天均有血清DHBVDNA水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，二阿德福韋EG2000中、大劑量用藥10天和停藥后第3天均有血清DHBV DNA水平顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
結(jié)果提示阿德福韋mPEG2000和二阿德福韋PEG2000有明顯抑制肝內(nèi)DHBV-DNA復(fù)制的作用，并且未出現(xiàn)停藥后“反跳”的現(xiàn)象。
實(shí)施例14急毒試驗(yàn)對阿德福韋單甲氧基聚乙二醇2000進(jìn)行安全性試驗(yàn)，一次靜脈給與小鼠5g/kg(相當(dāng)于阿德福韋0.3g/kg)劑量，沒有出現(xiàn)小鼠死亡現(xiàn)象，表明聚乙二醇化阿德福韋安全性良好。
權(quán)利要求
1.阿德福韋和泰諾福韋的聚乙二醇化衍生物，其通式為 其中，A為H或CH3；R為形式如X-Y的結(jié)構(gòu)，其中Y為H、C1-6的直鏈、支鏈或環(huán)狀的烷基、乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物，其中X為O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-W、NH-W、O-CO-W、CO-O-W、O-W-O、O-W-NH、O-W-CO-O、NH-W-NH、NH-W-O、NH-W-CO-O、CO-O-W-O、CO-O-W-NH或CO-O-W-CO-O，其中W為低級烷基或芳基；R’為CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2，n＝11-450；R”為O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-Z、NH-Z、O-CO-Z、CO-O-Z、O-Z-O、O-Z-NH、O-Z-CO-O、NH-Z-NH、NH-Z-O、NH-Z-CO-O、CO-O-Z-O、CO-O-Z-NH或CO-O-Z-CO-O，其中Z為低級烷基或芳基，以上基團(tuán)自左到右分別與R’和磷酸酯鏈接；上述的低級烷烴為C1-6直鏈、支鏈或環(huán)狀的亞烴基，芳烴為苯或其衍生物或芳香雜環(huán)化合物或其衍生物的亞基。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于X為O，Y為甲基、乳糖或半乳糖。
3.權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于X為O，Y為甲基。
4.權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于X為O，Y為半乳糖。
5.權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于X為O，Y為乳糖。
6.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于R”為O。
7.權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗病毒藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7所述的用途為在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。
9.一種藥物組合物，含有權(quán)利要求1所述的化合物作為活性成分。
10.權(quán)利要求9的組合物，為口服劑型或注射劑型。
11.權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于口服劑型為片劑，膠囊劑、顆粒劑或口服液；注射劑包括注射液、注射用無菌粉針和注射用濃溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及對藥物分子進(jìn)行化學(xué)修飾以改善現(xiàn)有藥物的不足，具體來說是阿德福韋(Adefovir，PMEA)和泰諾福韋(tenofovir，PMPA)與聚乙二醇的結(jié)合物，阿德福韋和泰諾福韋和糖基化聚乙二醇結(jié)合的結(jié)合物，還涉及它們的制備方法和在抗病毒方面的應(yīng)用。
文檔編號A61P31/20GK1947796SQ20051009475
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月13日
發(fā)明者張愛明, 張喜全, 徐宏江, 楊玲 申請人:江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司