專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療或預(yù)防尼古丁成癮的半抗原－載體偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療和預(yù)防尼古丁成癮。具體說(shuō)，本發(fā)明涉及新穎的半抗原-載體偶聯(lián)物，它能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。這些抗體能特異性結(jié)合尼古丁。另外，本發(fā)明涉及通過(guò)給予藥學(xué)上可接受的半抗原-載體偶聯(lián)物制劑，預(yù)防或治療尼古丁成癮。本發(fā)明還考慮用對(duì)該半抗原-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)生的抗體來(lái)預(yù)防和治療尼古丁成癮。
背景技術(shù)：
在美國(guó)和世界范圍吸煙、吸雪茄和煙斗是普遍存在的問(wèn)題。發(fā)煙的煙草和無(wú)煙的煙草都富含尼古丁，尼古丁是一種已知的成癮物質(zhì)。尼古丁是從煙草植物所衍生的生物堿，引起吸煙者的精神和成癮作用。尼古丁是由以下兩個(gè)環(huán)通過(guò)一單鍵連接而形成的芳族六元環(huán)(吡啶)和脂族五元環(huán)(吡咯烷)。吡咯烷是N-甲基化的，通過(guò)它的-2碳連接于吡啶的-3碳。所以，-2碳是手性碳，且假設(shè)可環(huán)繞連接兩個(gè)環(huán)的單鍵自由旋轉(zhuǎn)。已確定-2碳的絕對(duì)構(gòu)型為S型。所以，尼古丁的天然構(gòu)型是(S)-(-)-尼古丁。
由于不難得到香煙、雪茄、煙斗、和無(wú)煙煙草所以尼古丁得到廣泛使用。按照美國(guó)衛(wèi)生和個(gè)人服務(wù)部的報(bào)道，吸煙是導(dǎo)致美國(guó)可預(yù)防死亡的唯一首要原因。同樣可見(jiàn)McGinnis等人，J.Am.Med.Assoc.270，2207-2211(1993)。還已報(bào)道，暴露于二次吸煙會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的有害的健康影響，包括哮喘加劇。
雖然眾所周知尼古丁的天然上癮性，但吸煙依舊流行。吸一支煙10-15分鐘內(nèi)血液中尼古丁的最高水平將到達(dá)約25-50毫微克/ml。對(duì)人而言，吸一支煙將導(dǎo)致動(dòng)脈尼古丁的含量比靜脈尼古丁的含量高10倍，因?yàn)槟峁哦⊙杆俚赜煞蝹鬟f到心臟(見(jiàn)Henningfield(1993)，藥物酒精的依賴(lài)，3323-29)。這將導(dǎo)致高動(dòng)脈濃度的尼古丁被迅速送遞到腦。一旦尼古丁穿過(guò)血-腦屏障，有證據(jù)表明尼古丁能結(jié)合膽堿能受體，而這通常是由神經(jīng)傳遞介質(zhì)乙酰膽堿完成的，乙酰膽堿參與呼吸、心率的維持、記憶、警覺(jué)和肌肉運(yùn)動(dòng)。當(dāng)尼古丁結(jié)合這些受體后，通過(guò)引發(fā)其他神經(jīng)傳遞介質(zhì)(如多巴胺)的釋放，將影響腦的正常功能。多巴胺見(jiàn)于腦中參與情緒、促動(dòng)和快感的區(qū)域。神經(jīng)傳遞介質(zhì)的釋放，尤其是多巴胺，造成吸煙者對(duì)尼古丁成癮或其他攝取尼古丁。
由于吸煙對(duì)健康有明顯的不良作用，吸煙者常常試圖戒煙。但尼古丁的天然成癮性和香煙的易得，增加繼續(xù)對(duì)尼古丁的依賴(lài)和嘗試戒煙人的高失敗率。戒煙的癥狀令人不快，吸煙可減輕。
已開(kāi)發(fā)了許多治療尼古丁成癮的方法，但大部分都無(wú)效。兩種最流行的治療方法仍然是尼古丁透皮貼片和將尼古丁摻入咀嚼口香糖中。這些治療方法(稱(chēng)為“尼古丁代替療法”)替代了使用者原先從吸煙中接受的尼古丁的量，起到讓使用者戒斷尼古丁的作用。但這種類(lèi)型的治療存在一些缺點(diǎn)。具體地說(shuō)，依舊有低濃度的尼古丁滲入血流，從而增加對(duì)吸煙的渴望。諸如口腔刺激、頜部潰瘍、惡心等問(wèn)題一直與使用尼古丁咀嚼口香糖相關(guān)。諸如皮膚刺激、干擾睡眠和神經(jīng)過(guò)敏等問(wèn)題一直與使用尼古丁透皮貼片相關(guān)。
所以，需要另外的方法來(lái)治療尼古丁成癮。文獻(xiàn)已認(rèn)識(shí)到這種需要，且已有許多嘗試來(lái)提供治療尼古丁成癮的方法。其中一種方法涉及給予對(duì)尼古丁應(yīng)答而產(chǎn)生的抗體。然而已知低分子量物質(zhì)(稱(chēng)為半抗原)不能觸發(fā)宿主動(dòng)物的免疫應(yīng)答。尼古丁也不例外，作為小分子它沒(méi)有免疫原性。為了引發(fā)對(duì)半抗原的抗體，通常將半抗原共價(jià)結(jié)合于一載體蛋白質(zhì)，這種復(fù)合物會(huì)引發(fā)識(shí)別半抗原的抗體產(chǎn)生。
例如4’-羧酸可替寧，當(dāng)共價(jià)結(jié)合于匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)時(shí)，可用于產(chǎn)生抗尼古丁代謝物可替寧的抗體。這些抗體可用于測(cè)定生理性液體中可替寧的存在。見(jiàn)Bjerke等人，J.Immunol.Methods，96239-246(1987)。
Castro等人(Eur.J.Biochem.，104，331-340，(1980))制備了其他尼古丁抗體。Castro等人制備了通過(guò)尼古丁6-位外的接頭偶聯(lián)載體蛋白質(zhì)的尼古丁半抗原(偶聯(lián)于牛血清白蛋白(BSA))。Castro等人制備了其他尼古丁BSA偶聯(lián)物，將它們注射入哺乳動(dòng)物產(chǎn)生了抗體。在其他出版物中，Castro等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.67，583-589(1975)公開(kāi)了兩種尼古丁白蛋白偶聯(lián)物N-琥珀酰-6-氨基-(±)-尼古丁-BSA和6-(σ-氨基癸酰胺)-(±)-尼古丁-BSA。在該1975出版物中，Castro等人還使用尼古丁載體偶聯(lián)物(6-(σ-氨基癸酰胺)-(±)-尼古丁-BSA)的抗體來(lái)測(cè)定血液和尿中尼古丁的水平，見(jiàn)Res.Commun Chem.Path.Pharm.51，393-404(1986)。
Swain等人(WO98/14216)公開(kāi)了尼古丁載體偶聯(lián)物，其中半抗原偶聯(lián)于尼古丁的1、2、4、5、6、或1’位。Hieda等人顯示了用連接于匙孔血藍(lán)蛋白的6-(羧甲基脲基)-(±)-尼古丁免疫接種動(dòng)物，能產(chǎn)生尼古丁特異性抗體。J.Pharm.andExper.Thera.283，1076-1081(1997)。Langone等人制備了半抗原衍生物，O-琥珀?；?3’-羥甲基-尼古丁，見(jiàn)Biochemistry，12，5025-5030，在放射免疫試驗(yàn)中使用了此半抗原載體偶聯(lián)物的抗體。見(jiàn)“酶學(xué)方法”，84，628-635(1982)。Langone產(chǎn)生的偶聯(lián)物易水解。另外，Abad等人，Anal.Chem.，65，3227-3231(1993)描述了在ELISA試驗(yàn)中將半琥珀酸3’-(羥甲基)尼古丁偶聯(lián)于牛血清白蛋白，產(chǎn)生針對(duì)尼古丁的抗體，以能夠測(cè)量香煙的煙凝結(jié)物中的尼古丁含量。
所以本領(lǐng)域先前未說(shuō)明一種穩(wěn)定的保存尼古丁半抗原手性特性的尼古丁-載體偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物以保留尼古丁表位特性的方式將半抗原連接于載體。另外，本領(lǐng)域尚未說(shuō)明或提議用這種偶聯(lián)物預(yù)防和治療尼古丁成癮的方法。Seeman，Heterocycles，22，165-193(1984)公開(kāi)了尼古丁的構(gòu)型分析和化學(xué)反應(yīng)性研究的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
為了回答對(duì)更有效地治療尼古丁成癮的方法的需求，本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定的新穎尼古丁-載體偶聯(lián)物，其含有天然(s)-(-)形式的尼古丁，并用尼古丁-載體連接保留尼古丁表位的特性和尼古丁分子兩個(gè)環(huán)的相對(duì)取向。認(rèn)為尼古丁的兩個(gè)環(huán)和它們的相對(duì)取向是在溶液中被尼古丁抗體識(shí)別的基礎(chǔ)。這種偶聯(lián)物能刺激抗體(能特異性結(jié)合尼古丁)的產(chǎn)生。用本發(fā)明的偶聯(lián)物，發(fā)明者提高了哺乳動(dòng)物血清中尼古丁的水平，降低了腦中尼古丁的水平。另外，用本發(fā)明的偶聯(lián)物，發(fā)明者還預(yù)防了尼古丁引起的血壓變化和運(yùn)動(dòng)影響。
本發(fā)明的另一目的是通過(guò)給予尼古丁成癮患者本發(fā)明的偶聯(lián)物，在患者體中產(chǎn)生抗尼古丁的抗體，來(lái)治療尼古丁成癮。從而當(dāng)患者吸煙(或咀嚼煙草)時(shí)，這些產(chǎn)品中的尼古丁將與血流中的抗尼古丁抗體結(jié)合，從而防止尼古丁穿過(guò)血-腦屏障，而消除尼古丁引起的腦化學(xué)成分的變化(尼古丁成癮的原因)。從這點(diǎn)來(lái)看，尼古丁-載體偶聯(lián)物引發(fā)抗體的產(chǎn)生是非常重要的，該抗體能識(shí)別天然尼古丁分子。如上所述，本發(fā)明的新穎尼古丁-載體偶聯(lián)物保留了天然尼古丁的手性和表位。
關(guān)于尼古丁偶聯(lián)物和對(duì)這種偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體如何抑制被哺乳動(dòng)物吸收的尼古丁的作用，本發(fā)明并不受任何具體理論的限制。另外，除了防止尼古丁透過(guò)血腦屏障，通過(guò)簡(jiǎn)單的立體封阻，抗體還可防止尼古丁與周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的其他受體結(jié)合。
通過(guò)提供下式(I)半抗原-載體偶聯(lián)物實(shí)現(xiàn)這些目的 式中m是1-2500，n是0-12，y為1-12，X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S，且-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接于3’、4’或5’位。在半抗原-載體偶聯(lián)物的一優(yōu)選實(shí)施例中，m是11-17，n是1，y為2，X是NH-CO，Y是CO-NH，載體蛋白質(zhì)是外蛋白質(zhì)(exoprotein)A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分結(jié)合于3’位。在半抗原-載體偶聯(lián)物的另一優(yōu)選實(shí)施例中，m是11-17，n是1，y是2，X為NH-CO，Y是CO-NH，載體蛋白質(zhì)是外蛋白質(zhì)A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接于4’位。在半抗原-載體偶聯(lián)物的另一優(yōu)選實(shí)施例中，m為11-17，n為1，y是2，X是NH-CO、Y是CO-NH，載體蛋白質(zhì)是外蛋白質(zhì)A，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接于5’位。在另一優(yōu)選的實(shí)例中，m選自1-20和1-200。
上述目的可通過(guò)提供式(III)的半抗原-載體偶聯(lián)物實(shí)現(xiàn) 式中n為0-12，j為1-1000，k是1-20，E是含氨基酸的基質(zhì)(matrix)。在一優(yōu)選實(shí)例中，基質(zhì)是聚-L-谷氨酸。
這些目的還可通過(guò)提供對(duì)式(I)半抗原-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。在其他實(shí)施例中，抗體是功能片段。在一優(yōu)選實(shí)例中，抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)例中，抗體是多克隆的。
這些目的還可通過(guò)提供對(duì)式(III)半抗原-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。在另一實(shí)施例中，抗體是功能片段。在一優(yōu)選實(shí)例中，抗體是單克隆抗體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)例中，抗體是多克隆的。
這些目的可通過(guò)提供治療或預(yù)防尼古丁成癮的方法而實(shí)現(xiàn)，包括對(duì)需要這種治療的患者給予治療有效劑量的式(I)或(III)的半抗原-載體偶聯(lián)物?；蛘?，這些目的可通過(guò)提供治療或預(yù)防尼古丁成癮的方法而實(shí)現(xiàn)，包括對(duì)需要這種治療的患者給予治療有效劑量的對(duì)式(I)或(III)半抗原-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體。
另外，通過(guò)提供含有式(I)或式(III)的半抗原載體偶聯(lián)物的疫苗組合物可實(shí)現(xiàn)這些目的。這種疫苗還可含有其他治療尼古丁成癮的治療性化合物。
這些目的還可通過(guò)提供產(chǎn)生抗體的方法而實(shí)現(xiàn)，包括用式(I)或(III)的半抗原-載體偶聯(lián)物免疫接種宿主哺乳動(dòng)物。在一優(yōu)選實(shí)施例中，產(chǎn)生的抗體是單克隆抗體。在另一實(shí)施例中，抗體是多克隆的。
另外，這些目的的實(shí)現(xiàn)還通過(guò)提供一種測(cè)定樣品中是否存在尼古丁的試劑盒，所述的試劑盒包括對(duì)式(I)或式(III)半抗原-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體。
這些目的和其他方面通過(guò)本發(fā)明下面的詳細(xì)描述和權(quán)利要求書(shū)的描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的可實(shí)現(xiàn)的。


圖1的圖表顯示了用3’AMNic-Suc-rEPA偶聯(lián)疫苗主動(dòng)免疫，在單劑量注射尼古丁后，對(duì)大鼠尼古丁血清水平的影響。顯示了注射尼古丁后3和10分鐘，尼古丁血清水平。
圖2顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫對(duì)大鼠血流和腦尼古丁水平的影響。用12.5、25和50mg抗體處理大鼠。
圖3顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫對(duì)大鼠血流和腦尼古丁水平的影響。在給予抗體后30分鐘和1天以及注射尼古丁后3分鐘測(cè)定尼古丁水平。
圖4顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫對(duì)接受多個(gè)劑量尼古丁大鼠的血清尼古丁水平的影響。
圖5顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫對(duì)接受多個(gè)劑量尼古丁大鼠的腦尼古丁水平的影響。
圖6顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫對(duì)大鼠中尼古丁引起的運(yùn)動(dòng)的影響。
圖7顯示了用抗3’-AMNic-Suc-rEPA抗體被動(dòng)免疫，對(duì)尼古丁引起的收縮期血壓增加的影響。該圖顯示隨著抗體量的增加，將提高抗體減少尼古丁增加血壓的效果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供用于治療尼古丁成癮的尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物。該尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物為式(I) 式中m是1-2,500；n是0-12；y為1-12；X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；Y選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH、CO-NH-NH-CO、和S-S；載體蛋白質(zhì)是適當(dāng)?shù)拿庖咴缘鞍踪|(zhì)或多肽。優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)可含有T-細(xì)胞表位，-(CH2)m-X-(CH2)y-Y-部分連接于尼古丁分子的3’、4’或5’位。
在式(I)中，m較佳地為1-200。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，m是1-20。在一優(yōu)選實(shí)施例中，m是11-17。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，X選自NH-CO、CO-NH、CO-NH-NH、NH-NH-CO、NH-CO-NH和CO-NH-NH-CO。
如果m大于1，則方框中的部分以m次附著于載體蛋白質(zhì)中的不同附著點(diǎn)。例如，若m＝2，則式(I)將是
因?yàn)閷?duì)尼古丁本身的應(yīng)答反應(yīng)中不能產(chǎn)生抗體，本發(fā)明已開(kāi)發(fā)了自尼古丁3’、4’或5’位衍生的尼古丁半抗原。將該分子結(jié)合于載體蛋白質(zhì)，得到半抗原載體偶聯(lián)物，當(dāng)把它注射入適合的宿主哺乳動(dòng)物時(shí)，能產(chǎn)生抗尼古丁分子的抗體。就此而言，當(dāng)給予哺乳動(dòng)物時(shí)，為了含有半抗原載體偶聯(lián)物的藥物組合物能引發(fā)抗體的產(chǎn)生，載體蛋白質(zhì)必需是免疫原性的。較佳地，它含有T-細(xì)胞表位。所以，當(dāng)載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)于尼古丁半抗原，隨后給予哺乳動(dòng)物時(shí)，哺乳動(dòng)物在對(duì)尼古丁半抗原的應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生或“引發(fā)(raise)”了抗體。
半抗原和衍生化本發(fā)明所用的術(shù)語(yǔ)“半抗原”指一類(lèi)低分子量化合物，它們本身不能引發(fā)免疫應(yīng)答，但一旦附著于載體分子就能引發(fā)免疫應(yīng)答。在一優(yōu)選實(shí)例中，半抗原通過(guò)接頭附著于載體。本發(fā)明的半抗原是尼古丁衍生物。此尼古丁半抗原含有反應(yīng)性官能基團(tuán)，載體可直接或通過(guò)接頭或通過(guò)基質(zhì)或通過(guò)接頭和基質(zhì)連接于此官能團(tuán)。較佳地，此尼古丁半抗原通過(guò)酰胺鍵或二硫鍵連接于載體蛋白質(zhì)。酰胺鍵和二硫鍵具有理想的穩(wěn)定性。因?yàn)楸景l(fā)明的半抗原-載體偶聯(lián)物要作為疫苗使用，所以重要的是該偶聯(lián)物必需是穩(wěn)定的，以延長(zhǎng)疫苗的保質(zhì)期。
在本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，以下式(II)表示尼古丁半抗原 式中n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)m-Z連接于3’、4’或5’位。Z部分能直接或通過(guò)接頭連接于載體。一旦將其引入患者或動(dòng)物的體內(nèi)，載體-半抗原偶聯(lián)物可誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。
在一優(yōu)選實(shí)例中，尼古丁半抗原為下式(3’-氨甲基尼古丁) 1.直接偶聯(lián)物為了產(chǎn)生“直接偶聯(lián)物”，用或不用接頭直接將單個(gè)尼古丁半抗原附著于載體。例如，可將單個(gè)尼古丁半抗原連接于載體上的各個(gè)可用的胺基。用同型功能交聯(lián)劑或異型雙功能交聯(lián)劑，直接將半抗原偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)的通用方法的描述見(jiàn)，如G.T.Hermanson，“生物偶聯(lián)技術(shù)”，Academic Press(1996)，和Dick和Beurret，“偶聯(lián)疫苗”，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karger，Basal(1989)第10卷，48-114。使用雙功能交聯(lián)劑的直接偶聯(lián)，半抗原與蛋白質(zhì)的摩爾比受到蛋白質(zhì)上具有的特異性偶聯(lián)化學(xué)結(jié)構(gòu)的官能團(tuán)數(shù)量的限制。例如，含有n個(gè)賴(lài)氨酸的載體蛋白質(zhì)，理論上講，有n+1個(gè)伯胺(包括末端氨基)可用于與接頭的羧基反應(yīng)。因此，采用這種直接偶聯(lián)方法產(chǎn)生的產(chǎn)物限于形成n+1個(gè)酰胺鍵，即最多可附著n+1個(gè)半抗原。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，取決于將尼古丁半抗原偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)所用的試劑的濃度和載體蛋白質(zhì)的性質(zhì)，半抗原與載體的比例可變化。同樣，在確定的尼古丁-載體偶聯(lián)物制備中，各個(gè)偶聯(lián)物的半抗原/載體的比例也可變。例如，理論上外蛋白質(zhì)A具有15個(gè)可偶聯(lián)于半抗原的胺。但發(fā)明者測(cè)定到當(dāng)將3’氨甲基-琥珀?；?尼古丁偶聯(lián)于此蛋白質(zhì)時(shí)，在每次制備偶聯(lián)物時(shí)，范圍為11-17個(gè)尼古丁半抗原結(jié)合于每個(gè)外蛋白質(zhì)A載體。這個(gè)范圍是用氣相過(guò)濾層析試驗(yàn)測(cè)定的，且測(cè)到260nmUV吸光度增加。17個(gè)尼古丁結(jié)合于一些載體，因?yàn)槟峁哦“肟乖芘c載體上的非胺基部分結(jié)合。半抗原可結(jié)合的非胺基基團(tuán)例子包括(但不限制于)-SH和-OH。但這些副反應(yīng)的發(fā)生率是低的。
2.基質(zhì)偶聯(lián)物為了回避使用直接偶聯(lián)法對(duì)可結(jié)合于載體的半抗原數(shù)量的限制，可使用氨基酸“基質(zhì)”。術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”指氨基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚多肽和聚多肽?；|(zhì)也可以是線(xiàn)性或分支多肽?？捎糜谛纬苫|(zhì)的氨基酸例子包括(但不限制于)天冬氨酸、賴(lài)氨酸、半胱氨酸和L-谷氨酸?？蓪⑦@些氨基酸制成聚合物，如聚-L-谷氨酸。當(dāng)使用氨基酸(如半胱氨酸)時(shí)，硫羥基被保護(hù)，從而使半抗原能結(jié)合于氨基酸的羧基。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉保護(hù)基團(tuán)的類(lèi)型和使保護(hù)基團(tuán)結(jié)合于氨基酸官能團(tuán)的方法。為討論起見(jiàn)，見(jiàn)Green，“有機(jī)化學(xué)物中的保護(hù)基團(tuán)”，John Wiley &Sons，New York，1991。
適合的基質(zhì)含有合適的官能團(tuán)，載有兩個(gè)或多個(gè)半抗原。因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例中，將尼古丁-取代的基質(zhì)偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)，以增加半抗原-載體偶聯(lián)物中半抗原與載體的摩爾比?；|(zhì)起雙重作用，首先作為大量半抗原的支持物，其次作為交聯(lián)接頭。偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)的尼古丁取代的基質(zhì)可以式(III)表示 式中n是0-12，j是1-1000，k是1-20，E是可結(jié)合半抗原的含氨基酸的基質(zhì)，載體蛋白質(zhì)是任何合適的含有T-細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)或多肽。含氨基酸的基質(zhì)E可以是氨基酸、肽、二肽或多肽，包括寡聚或多聚多肽?；|(zhì)可含有一種或多種氨基酸，包括(但不限制于)天冬氨酸、賴(lài)氨酸、半胱氨酸和聚-L-谷氨酸。在一優(yōu)選實(shí)施例中，j是1-200，在另一優(yōu)選實(shí)施例中，j是1-4。
基質(zhì)-載體偶聯(lián)物能形成多聚體“網(wǎng)格”。這種網(wǎng)格以下圖表示。術(shù)語(yǔ)“網(wǎng)格”用于指共價(jià)連接的復(fù)合物，它含有多個(gè)基質(zhì)、半抗原、接頭和載體蛋白質(zhì)，它們都是共價(jià)連接在一起的。因?yàn)槟峁哦?取代的基質(zhì)含有多個(gè)可與載體偶聯(lián)的尼古丁部分，可形成含有多個(gè)載體和多個(gè)尼古丁取代的基質(zhì)的網(wǎng)格。如下簡(jiǎn)單地表示了這種網(wǎng)格的一部分
尼古半抗原接頭 基質(zhì) 載體蛋白質(zhì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的網(wǎng)格含有式(III)的半抗原載體偶聯(lián)物。
不論蛋白質(zhì)上可偶聯(lián)的官能團(tuán)的數(shù)量多少，用基質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)的方法具有靈活性可控制半抗原與蛋白質(zhì)的摩爾比。當(dāng)使用特定的載體蛋白質(zhì)時(shí)和當(dāng)需要得到最佳比例以實(shí)現(xiàn)較高免疫原性的偶聯(lián)物時(shí)，這特別有用。雖然當(dāng)使用的一種基質(zhì)不一定必需使用時(shí)，可使用這種接頭。為了使用本實(shí)施例的接頭，使尼古丁取代的基質(zhì)與一活性接頭化合物反應(yīng)。例如，ADH、己二酸二酰肼可用作基質(zhì)偶聯(lián)物的接頭。
載體蛋白質(zhì)一旦制備了尼古丁半抗原，即可將其偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)，從而可用于引發(fā)抗尼古丁載體偶聯(lián)物的抗體。用于本發(fā)明尼古丁載體偶聯(lián)物的載體蛋白質(zhì)在式(I)和(III)中以 表示，包括任何合適的免疫原性蛋白質(zhì)或多肽?！懊庖咴浴狈肿邮悄芤l(fā)免疫應(yīng)答的分子。較佳地，載體蛋白質(zhì)含有T-細(xì)胞表位。同樣，“載體蛋白質(zhì)”包括MAPs或多-抗原性肽(分支肽)。由于有多個(gè)支鏈氨基酸殘基，使用MAP可將半抗原的密度和化合價(jià)最大化?？捎糜谛纬蒑AP的氨基酸例子包括(但不限制于)賴(lài)氨酸。
本發(fā)明的載體蛋白質(zhì)包括含有至少一個(gè)T細(xì)胞表位(能刺激對(duì)象的T細(xì)胞)的分子，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生抗整個(gè)半抗原-載體偶聯(lián)物分子的抗體。本發(fā)明描述中所用的術(shù)語(yǔ)“表位”包括抗原上任何負(fù)責(zé)該抗原與抗體分子反應(yīng)的決定簇。表位決定簇通常由分子(如氨基酸)的化學(xué)表面活性基團(tuán)或糖側(cè)鏈構(gòu)成，且具有特異性三維結(jié)構(gòu)特征以及特異性帶電特征。為了具有免疫原性，認(rèn)為蛋白質(zhì)或多肽必需能刺激T-細(xì)胞。然而無(wú)T-細(xì)胞表位的載體蛋白質(zhì)也可能具有免疫原性。
通過(guò)選擇已知能刺激強(qiáng)免疫應(yīng)答的載體蛋白質(zhì)，可用本發(fā)明的半抗原-載體偶聯(lián)物來(lái)治療多種類(lèi)型的患者。載體蛋白質(zhì)必須有足夠的外源性以引發(fā)對(duì)疫苗的強(qiáng)免疫應(yīng)答。通常所用的載體蛋白質(zhì)宜為大分子，能賦予共價(jià)連接的半抗原以免疫原性。特別優(yōu)選的載體蛋白質(zhì)是天生就有高度免疫原性的蛋白質(zhì)。所以，具有高度免疫原性且能使對(duì)半抗原的抗體產(chǎn)量最大化的載體蛋白質(zhì)是很理想的。
在用動(dòng)物作試驗(yàn)來(lái)開(kāi)發(fā)偶聯(lián)疫苗時(shí)，牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)常常被用作載體。但這些蛋白質(zhì)可能不適合用于人。已被用于制備治療性偶聯(lián)疫苗的蛋白質(zhì)包括(但不限制于)病原菌的許多毒素及其類(lèi)毒素。其他候選物是與細(xì)菌毒素的抗原性類(lèi)似的蛋白質(zhì)，即指交叉反應(yīng)物質(zhì)(CRMs)。
在制備尼古丁偶聯(lián)物藥物組合物時(shí)，重組銅綠假單胞菌蛋白質(zhì)A(rEPA)可作為載體蛋白質(zhì)，因?yàn)閷?duì)這種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物活性有很好的了解。另外，國(guó)家衛(wèi)生研究院和本發(fā)明的發(fā)明者已在金黃色葡萄球菌莢膜多糖偶聯(lián)疫苗中將這種重組蛋白質(zhì)成功地且安全地用于人。Fattom等人，感染免疫，611023-1032(1993)。已鑒定出這種蛋白質(zhì)是一種合適的蛋白質(zhì)載體，因?yàn)橛捎?53位氨基酸的缺失，已消除了這種天然外毒素的固有酶促活性。因此，rEPA具有與天然外毒素A(ETA)相同的免疫特征，但不具有天然ETA的肝毒性。在本申請(qǐng)中，“外蛋白質(zhì)A”指修飾過(guò)的、非-肝毒性ETA。這種外蛋白質(zhì)A的一個(gè)實(shí)例含有553位的氨基酸缺失。
將半抗原偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)有大量的官能團(tuán)可采用以便于載體與小分子(如半抗原)連接或偶聯(lián)。這些官能團(tuán)包括羧酸、酸酐、混合酸酐、?；u、疊氮?；?、烷基鹵、N-馬來(lái)酰亞胺、亞氨酸脂、異氰酸脂、胺、硫醇和異硫氰酸脂，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他物質(zhì)。這些基團(tuán)能與蛋白質(zhì)分子的反應(yīng)基團(tuán)形成共價(jià)鍵。取決于所用的官能團(tuán)，反應(yīng)基團(tuán)可以是載體蛋白質(zhì)上或修飾的載體蛋白質(zhì)分子上賴(lài)氨酸殘基或硫羥基的ε氨基，當(dāng)與這種ε氨基反應(yīng)時(shí)將形成酰胺、胺、硫醚、脒脲或硫脲鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道還可使用其他合適的活性基團(tuán)和偶聯(lián)方法。如見(jiàn)Wong，“蛋白質(zhì)偶聯(lián)和交聯(lián)化學(xué)”，CRC Press，Inc，(1991)。也可見(jiàn)Hermanson，“生物偶聯(lián)方法”，Academic Press1996，以及Dick和Beurret，“偶聯(lián)疫苗”，Contribu.Microbiol.Immunol.，Karge，Basal(1989)第10卷，48-114。
對(duì)將半抗原偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)而言，與環(huán)狀或分支接頭相比線(xiàn)性接頭分子是優(yōu)選的。一種優(yōu)選的接頭是琥珀?；宇^。但接頭除線(xiàn)性分子外也可以是環(huán)狀結(jié)構(gòu)。接頭的另一實(shí)例是ADH。
所以，本發(fā)明尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物的制備，是通過(guò)將一種或多種半抗原與載體蛋白質(zhì)反應(yīng)，產(chǎn)生能刺激T細(xì)胞的半抗原載體偶聯(lián)物，從而使T細(xì)胞增殖并釋放介質(zhì)，在對(duì)免疫原性半抗原-載體偶聯(lián)物的應(yīng)答反應(yīng)中，這些介質(zhì)活化特異性B細(xì)胞刺激抗體產(chǎn)生。在對(duì)半抗原載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的一些抗體對(duì)半抗原-載體偶聯(lián)物中的半抗原部分是特異性的。本發(fā)明期待將各種合適的半抗原與載體蛋白質(zhì)組合一起用于治療尼古丁成癮。
單克隆和多克隆抗體產(chǎn)生單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。可將含有尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物的組合物注射入小鼠，然后取出血清樣品驗(yàn)證是否產(chǎn)生抗體，取出脾臟以得到B-淋巴細(xì)胞，將B-淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤，克隆這種雜交瘤，選出產(chǎn)生抗半抗原-載體偶聯(lián)物抗體的陽(yáng)性集落，培養(yǎng)這些產(chǎn)生抗原抗體的集落，從雜交瘤培養(yǎng)物中分離抗體，得到單克隆抗體。
可用各種已知的方法從雜交瘤培養(yǎng)物分離和純化單克隆抗體。這些分離方法包括用蛋白質(zhì)A-瓊脂糖作親和層析、大小排阻層析和離子交換層析。如見(jiàn)Coligan第2.7.1-2.7.12和第2.9.1-2.9.3。也可見(jiàn)Baines等人，分子生物學(xué)方法中的“免疫球蛋白G(IgG)的純化”，第10卷，第79-104頁(yè)(The HumanaPress，Inc，1992)。
制備多克隆抗體的方法也是本領(lǐng)域熟知的。按本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法制備多克隆抗體。為制備多克隆抗體，用免疫原性物質(zhì)注射動(dòng)物，收集富含抗體的血清，血清中含有抗體混合物，這些抗體針對(duì)注射的免疫原的多個(gè)表位。用于產(chǎn)生抗體的適合的宿主哺乳動(dòng)物包括(但不限制于)人、大鼠、小鼠、兔和山羊。
對(duì)本發(fā)明而言，也可用功能性抗體片段。產(chǎn)生這種片段的方法包括用酶(如胃蛋白酶或木瓜酶)消化和/或用化學(xué)還原法切斷二硫鍵。另外，本發(fā)明的抗體片段還可用自動(dòng)肽合成儀(如可從Applied Biosystems，Multiple PeptideSystems和其他公司購(gòu)得的合成儀)，或可用本領(lǐng)域熟知的方法手工合成。見(jiàn)Geysen等人，免疫學(xué)方法雜志102259(1978)?？捎贸Ｒ?guī)方法對(duì)本發(fā)明的單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行直接測(cè)定。
本發(fā)明的片段可以是Fv片段?？贵w的Fv片段是由抗體重鏈的可變區(qū)(Vh)和抗體輕鏈的可變區(qū)(V1)構(gòu)成的。蛋白酶切割抗體能產(chǎn)生雙鏈Fv片段，其中Vh和Vl結(jié)構(gòu)域依舊非共價(jià)結(jié)合且保留了結(jié)合抗原的能力。Fv片段還包括重組單鏈抗體分子，其中輕鏈和重鏈的可變區(qū)通過(guò)一肽接頭相連。見(jiàn)Skerra等人，科學(xué)，240，1038-41(1988)。本發(fā)明的抗體片段還包括Fab、Fab’、F(ab)2、和F(ab’)2，它們都不含有完整抗體的Fc片段。
治療方法由于當(dāng)尼古丁通過(guò)血-腦屏障后，尼古丁就有許多明顯作用，所以本發(fā)明的治療方法在于防止尼古丁穿過(guò)血-腦屏障。具體地說(shuō)，給予患者尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物，能在患者的血流中產(chǎn)生抗尼古丁抗體。另外，可將在待治療的患者體外(如在合適的宿主哺乳動(dòng)物中)產(chǎn)生的抗尼古丁抗體給予患者。如果患者吸煙，在他血流中的尼古丁將被循環(huán)性抗尼古丁抗體結(jié)合，從而防止尼古丁到達(dá)腦。所以，該抗體能防止尼古丁在腦部引起的精神和心理作用。由于吸煙者將經(jīng)歷這些作用的減輕或消除，他/她將失去吸煙的愿望。如果患者使用無(wú)煙煙草，用本發(fā)明的尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物免疫接種后，預(yù)計(jì)會(huì)得到同樣的治療效果。另外，通過(guò)影響尼古丁刺激周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的能力，本發(fā)明的偶聯(lián)物和抗體可發(fā)揮其作用。
如上所述，本發(fā)明的新穎尼古丁-載體偶聯(lián)物保留了尼古丁分子的天然手性和結(jié)構(gòu)。具體說(shuō)，這些偶聯(lián)物的尼古丁部分具有(S)-(-)構(gòu)型。所以，在對(duì)這種偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體對(duì)天然形式的尼古丁是特異性的，且在特異性結(jié)合吸煙吸入的或從無(wú)煙煙草吸收的尼古丁和抑制這種攝取的尼古丁的作用上是最有效的。另外，本發(fā)明的偶聯(lián)物是化學(xué)穩(wěn)定的，這種穩(wěn)定性對(duì)生產(chǎn)長(zhǎng)保質(zhì)期的疫苗是關(guān)鍵性的。
本發(fā)明的組合物可與用于治療成癮的化合物或其他治療劑聯(lián)合使用。這包括給予化合物(但不限制于)抗抑郁藥，如Zyban和Prozac等化合物。
1.給予尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物本發(fā)明的偶聯(lián)物適用于治療和預(yù)防尼古丁成癮。對(duì)于治療尼古丁成癮而言，將本發(fā)明的尼古丁-載體偶聯(lián)物給予患尼古丁成癮的患者。對(duì)于預(yù)防尼古丁成癮而言，用本發(fā)明的偶聯(lián)物來(lái)治療有發(fā)展成尼古丁成癮危險(xiǎn)的患者(如青少年)。直接將該偶聯(lián)物給予患者稱(chēng)為“主動(dòng)免疫”。
本發(fā)明的疫苗組合物含有至少一種尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物，其量足以引發(fā)對(duì)它的免疫應(yīng)答。這種尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物能在體內(nèi)保存一定的濃度，足以主動(dòng)抵抗隨后攝取的尼古丁。
用本發(fā)明尼古丁半抗原載體偶聯(lián)物的初次疫苗接種產(chǎn)生高滴度的尼古丁特異性抗體。技術(shù)人員不難確定給予需要治療尼古丁成癮患者的偶聯(lián)物的治療有效劑量。合適的劑量范圍為1-1000μg/劑。通常患者需要一周到幾周來(lái)產(chǎn)生抗上述抗原的抗體。可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，如ELISA、放射免疫試驗(yàn)和Western印跡分析，來(lái)監(jiān)測(cè)患者血流中抗體的產(chǎn)生情況。也可通過(guò)評(píng)估尼古丁的各種生理作用，如血壓，來(lái)監(jiān)視治療效果。
如下詳述，可將本發(fā)明的尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物加工成易于給予患者的組合物。給藥的優(yōu)選方式包括(但不限制于)鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、口腔、皮膚、透粘膜皮下注射和靜脈注射。技術(shù)人員將懂得首次注射后還可給予一次或多次“加強(qiáng)劑量的”偶聯(lián)物。這種加強(qiáng)劑量將增加抗本發(fā)明尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物的抗體的產(chǎn)量。
本發(fā)明的疫苗組合物可含有至少一種佐劑。選擇的用于本發(fā)明的佐劑應(yīng)不會(huì)抑制載體蛋白質(zhì)的作用。用于本發(fā)明的佐劑是那些人生理上可接受的佐劑，包括(但不限制于)明礬、QS-21、皂苷和MPLA(單磷脂A)。
本發(fā)明的疫苗組合物任選地含有一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。適用于本發(fā)明的賦形劑包括無(wú)菌水，鹽溶液，如鹽水，磷酸鈉、氯化鈉，醇，阿拉伯樹(shù)膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明膠，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸鎂、粘性石蠟、脂肪酸脂、羥甲基纖維素和緩沖液。當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他賦形劑也可用于本發(fā)明。
為了給予需要治療或防止尼古丁成癮的患者，可將本發(fā)明的半抗原-載體偶聯(lián)物摻入藥物組合物中。當(dāng)含有半抗原-載體偶聯(lián)物的該組合物用于注射時(shí)，較佳地將半抗原-載體偶聯(lián)物溶解在鹽水溶液(具有藥物學(xué)上可接受的pH)中。但也可使用可注射的半抗原-載體偶聯(lián)物懸浮液。除常用的藥物學(xué)可接受的賦形劑外，該組合物可含有任選成分以確保純度、提高生物可利用性和/或增加滲透性。
另外，此疫苗組合物可任選地含有至少一種輔助劑，如分散劑、包裹劑、微球、脂質(zhì)體、微膠囊、酯類(lèi)、表面活性劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑和穩(wěn)定劑。當(dāng)然，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他輔助劑也可用于本發(fā)明。同樣任何能與本發(fā)明疫苗組合物起協(xié)同作用的試劑也是有用的。
本發(fā)明的藥物組合物是無(wú)菌的，且足夠穩(wěn)定能耐受保存、分配和使用。另外，此組合物還可含有其他成分以保護(hù)組合物不受微生物的感染、抑制微生物的生長(zhǎng)。較佳地，將此組合物制成凍干粉末形式，在給藥前用藥學(xué)上可接受的稀釋劑重建。制備無(wú)菌注射用溶液的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括(但不限制于)真空干燥、冷凍干燥和旋轉(zhuǎn)干燥。這些方法產(chǎn)生了一種帶有摻入預(yù)混合物中的賦形劑的活性成分粉末。
2.給予對(duì)尼古丁-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體被動(dòng)免疫包括給予或使抗體接觸對(duì)本發(fā)明的尼古丁半抗原載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的多克隆抗體或單克隆抗體。可在動(dòng)物或人中產(chǎn)生這些抗體。給予對(duì)本發(fā)明尼古丁偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體來(lái)預(yù)防尼古丁成癮。例如，可將這種抗體給予有發(fā)展成尼古丁成癮危險(xiǎn)的患者，如青少年。這種抗體也適用于治療尼古丁成癮的患者。如上所述，該抗體將結(jié)合血流中的尼古丁，并防止尼古丁穿過(guò)血腦屏障。給予本發(fā)明半抗原-載體偶聯(lián)物所產(chǎn)生的抗體的分子量范圍約為150kDa-1,000kDa。
本領(lǐng)域技術(shù)人員不難確定給予患者(需要治療尼古丁成癮的)本發(fā)明治療性抗體的治療有效劑量。合適的劑量范圍為1-1000μg/劑。
本發(fā)明治療用組合物含有至少一種對(duì)本發(fā)明尼古丁-載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的這種組合物可任選地含有一種或多種藥學(xué)上接受的賦形劑。適用于本發(fā)明的賦形劑包括無(wú)菌水，鹽溶液，如鹽水，磷酸鈉、氯化鈉，醇，阿拉伯樹(shù)膠，植物油，苯甲醇，聚乙二醇，明膠，甘露醇、碳水化合物、硬脂酸鎂、粘性石蠟、脂肪酸脂、羥甲基纖維素和緩沖液。當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他賦形劑也可用于本發(fā)明。
為了給予需要治療或防止尼古丁成癮的患者，可將本發(fā)明的抗體摻入藥物組合物中。當(dāng)含有抗體的該組合物含有用于注射時(shí)，較佳地將抗體溶解在鹽水溶液(具有藥物學(xué)可接受的pH)中。但也可使用可注射的抗體懸浮液。除常用的藥物學(xué)可接受的賦形劑外，此組合物可含有任選成分以確保純度、提高生物可利用性和/或增加滲透性。
含有本發(fā)明抗體的藥物組合物是無(wú)菌的，且足夠穩(wěn)定能耐受保存、分配和使用。另外，此組合物還可含有其他成分以保護(hù)組合物不受微生物的感染、抑制微生物的生長(zhǎng)。制備無(wú)菌注射用溶液的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括(但不限制于)真空干燥、冷凍干燥和旋轉(zhuǎn)干燥。用這些方法產(chǎn)生了一種帶有摻入預(yù)混合物中的賦形劑的活性成分粉末。
含有本發(fā)明抗體的試劑盒也可將本發(fā)明的抗體用于制備試劑盒，此試劑盒可用來(lái)探測(cè)或定量測(cè)定樣品中的尼古丁水平。本發(fā)明的試劑盒在一合適的容器中含有本發(fā)明的尼古丁特異性抗體。對(duì)放射免疫試驗(yàn)而言，這種試劑盒還可含有標(biāo)記的尼古丁。通過(guò)使標(biāo)記的尼古丁與抗體結(jié)合，然后與測(cè)試樣品中的抗體競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)記的尼古丁，來(lái)測(cè)定樣品中的尼古丁。ELISA試劑盒也含有本發(fā)明的抗體。ELISA包括抑制抗體與已知量的尼古丁結(jié)合，與懷疑含有尼古丁的樣品的抑制相比較。比較樣品與已知濃度尼古丁的標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線(xiàn)，可確定樣品中的未知尼古丁。另一種類(lèi)型的ELISA，將懷疑含有尼古丁的樣品在微量滴定板上培養(yǎng)，該微量滴定板上包被有能結(jié)合尼古丁的物質(zhì)。加入本發(fā)明的抗體，并在板上加入酶連接的抗-抗體抗體。加入底物將定量測(cè)定與板結(jié)合的尼古丁的量。
以下實(shí)施例僅進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的制備和使用方法。本發(fā)明的范圍不受以下實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1-合成衍生的尼古丁半抗原(在3’位被取代)合成半抗原的起始物是可商品購(gòu)得的反式-4’-羧基-(-)-可替寧。按Cushman和Castagnoli，Jr.(1972)有機(jī)化學(xué)雜志，37(8)1268-1271描述的修飾方法，酸的甲基酯化后再還原脂，提供醇(反式-3’-羥甲基-(-)-尼古丁)。然后磺酸化該醇，用疊氮基替代磺酸鹽，最終將其還原成胺。
將4g反式-4’-羧基-(-)-可替寧溶解在用無(wú)水甲醇配制的50ml 2N硫酸中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。將得到的懸液用Whatman No.1濾紙過(guò)濾，然后慢慢加到100ml碳酸氫鈉飽和溶液中。蒸發(fā)掉溶劑后，用二氯甲烷提取酯，得到4.2g淡紅色油。在干氬氣下，將用干四氫呋喃(100ml)配制的3.9g該酯的溶液逐滴加到干四氫呋喃(70ml)配制的4當(dāng)量氫化鋁鋰懸液中。室溫?cái)嚢璐藨乙?小時(shí)。在冰浴中冷卻時(shí)，仔細(xì)、可控地添加水來(lái)破壞過(guò)量的氫化物。過(guò)濾得到白色沉淀，將此濾物在硫酸鈉上干燥，減壓下濃縮，得到2.7g黃色油狀醇。
將此醇(1.9g)溶解在20ml二氯甲烷中。然后逐步向此溶液中加入三乙胺(0.75ml)和對(duì)-甲苯磺酰氯(1g)。室溫?cái)嚢璐私奂t色溶液。在硅藻土柱床上過(guò)濾此沉淀的三乙胺鹽酸鹽，減壓下濃縮過(guò)濾物得到棕色油。在硅石快速層析柱上純化此磺酸鹽，用二氯甲烷配制的5％甲醇洗脫，得到2.1g黃色油。
80℃用50ml二甲基甲酰胺配制的疊氮化鈉(0.8g)置換此磺酸鹽(1.8g)1小時(shí)。高真空蒸發(fā)掉二甲基甲酰胺后，將殘留物溶解在二氯甲烷中，用水和鹽水洗滌，硫酸鈉干燥。溶劑蒸發(fā)后，得到呈棕色油狀的疊氮鹽(1.1g)。
將用干四氫呋喃(20ml)配制的該疊氮鹽加到用干四氫呋喃(50ml)配制的氫化鋁鋰懸液中，易產(chǎn)生所需的胺，用薄層層析監(jiān)測(cè)。純化胺的質(zhì)子和碳核磁共振廣譜對(duì)應(yīng)于預(yù)期的結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2-合成衍生的尼古丁半抗原(在4’位被取代)烯醇鹽烷化可替寧，然后還原此烷基化的產(chǎn)物，能實(shí)現(xiàn)在尼古丁的4’位引入官能化的臂。可用各種烷化劑，如合適地被保護(hù)的3-溴-丙胺。例如，可用3-溴-N-芐脂基(carbobenzyloxy)-丙胺或N-(3-溴丙基)-鄰苯二酰胺。烷化和還原后偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)之前，除去胺的保護(hù)基團(tuán)。環(huán)狀內(nèi)酰胺(含有吡咯烷酮(pyrrolidinone)環(huán))的烯醇鹽烷化已有文獻(xiàn)報(bào)道(一般綜述可見(jiàn)G.Helmchen等人(1995)Houben-Weyl-方法中有機(jī)化學(xué)物質(zhì)的立體選擇性合成，E21a卷，762-881，Thieme，Stuttgart，Germany，反應(yīng)的立體考慮則可見(jiàn)A.J.Meyers等人(1997)J.Am.Chem.Soc.，119，4564-4566)。還有一些可替寧自身烯醇鹽烷化的例子(N.-H.Lin等人(1994)J.Med.Chem.，37，3542-3553)。以酮(或醛)和2-烷氧基-3-鏈烯胺(alkenamine)為起始物，用串聯(lián)陽(yáng)離子氮雜-Cope重排-Mannich環(huán)化反應(yīng)，制備了感興趣的4’-乙?；?尼古丁(1∶1混合的兩種差向異構(gòu)體)(L.E.Overman(1983)J.Am.Chem.Soc.，105，6622-6629)?？裳由齑朔磻?yīng)產(chǎn)生4’-醛-尼古丁，適用于偶聯(lián)。
將3-溴-丙胺氫溴化物(4.2g)懸浮在50ml二氯甲烷中，加入三乙胺(約7ml)直至得到清澈的溶液。將溶液冷卻至0℃，逐滴加入氯甲酸芐基酯(2.5ml)。讓反應(yīng)在室溫中攪拌下進(jìn)行16小時(shí)。過(guò)濾掉沉淀的鹽，用冷水、冷的1N HCl和冷水洗滌清澈的有機(jī)層，硫酸鈉干燥，減壓下蒸發(fā)得到黃色油(2.93g粗產(chǎn)物)。
分別與無(wú)水甲苯共蒸發(fā)可替寧(62mg)和3-溴-N-芐脂基-丙胺(100mg)。將可替寧溶解在5ml新鮮蒸餾的無(wú)水四氫呋喃中，加入60μl N，N，N’，N’-四亞甲基二胺(TMEDA)，將溶液浸入乙醇-干冰浴中冷卻至-78℃。將可替寧溶液逐滴加到預(yù)冷至-78℃的四氫呋喃配制的二異丙胺鋰中(LDA，200μl用庚烷-四氫呋喃配制的2M溶液)。-78℃攪拌此桔紅色溶液15分鐘，然后在冰浴(2-6℃)中升溫。再次將反應(yīng)物冷卻至-78℃，并逐滴加入溶解在無(wú)水四氫呋喃的3-溴-N-芐脂基-丙胺，為時(shí)15分鐘。將反應(yīng)混合物升溫至-10℃，然后用甲醇萃取。在硅膠柱上快速層析純化反應(yīng)產(chǎn)物。用硼烷隨后用氟化銫(用熱乙醇配制的)完成這種可替寧衍生物酰胺的還原。在酸性條件中除去芐脂基后得到最終的胺。
實(shí)施例3-合成衍生的尼古丁半抗原(在5’位被取代)通過(guò)使適當(dāng)保護(hù)的烷基鋰化合物與尼古丁反應(yīng)，隨后與氰基硼氫化鈉反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)將功能臂引入尼古丁的5’位，反應(yīng)過(guò)程與Shibagaki等人(1986)Heterocycles，24，423-428和N.-H.Lin等人(1994)見(jiàn)上所述的類(lèi)似。
實(shí)施例4-將衍生的尼古丁半抗原偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)通過(guò)琥珀酸臂將重組外蛋白質(zhì)A(rEPA)連接于衍生的尼古丁半抗原上。用琥珀酐不難將rEPA的15賴(lài)氨酸琥珀酰化。然后，在常規(guī)的偶聯(lián)反應(yīng)中制備了5-10mg/ml溶解在0.05M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(含有0.15M NaCl，pH6.0)的琥珀酰化重組外蛋白質(zhì)A(Suc-rEPA)。將溶解在最少量蒸餾水中的等量3’-氨基甲基-(-)尼古丁(3’AMNic)半抗原加到該蛋白質(zhì)溶液中。在加入前用0.1N HCl將半抗原溶液的pH調(diào)至6.0。最后，將等量的鹽酸1-乙基-3-(3-二乙基氨基)丙基碳化二亞胺(EDC)加到該半抗原蛋白質(zhì)混合物中，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)30分鐘。將得到的尼古丁偶聯(lián)物在Sephadex G-25柱上純化，用pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水洗脫。偶聯(lián)物的回收率為80-90％范圍。
實(shí)施例5-尼古丁負(fù)載基質(zhì)的偶聯(lián)本實(shí)施例描述了半抗原-載體偶聯(lián)物的合成，此偶聯(lián)物含有3’-氨甲基-(-)-尼古丁作為衍生的半抗原，重組外蛋白質(zhì)A(rEPA)作為載體蛋白質(zhì)，己二酸二酰肼(ADH)作為接頭，聚-L-谷氨酸作為半抗原的“基質(zhì)”或多聚支持物。
在本實(shí)施例中所用的聚-L-谷氨酸的平均分子量為39,900，多分散性為1.15，聚合度為264。計(jì)算半抗原和聚合物的反應(yīng)量，使靶向取代的程度約為80％。即當(dāng)達(dá)到80％取代時(shí)，此谷氨酸聚合物平均每分子總共264個(gè)重復(fù)單元中約208個(gè)半抗原單元被偶聯(lián)。
此負(fù)載尼古丁的聚-L-谷氨酸的化學(xué)式如下 如圖所示，聚谷氨酸聚合物含有約52個(gè)谷氨酰胺殘基。但此數(shù)是可變的，取決于所選聚氨基酸殘基的批次和來(lái)源。同樣上圖顯示每個(gè)重復(fù)單元有4個(gè)尼古丁半抗原。這個(gè)數(shù)目是可變的，取決于基質(zhì)與尼古丁半抗原偶聯(lián)時(shí)所用反應(yīng)物的比例。
與衍生的尼古丁偶聯(lián)后，未反應(yīng)的羧基(約20％)與ADH衍生。當(dāng)此基質(zhì)偶聯(lián)于載體時(shí)(如實(shí)施例6所述)，負(fù)載尼古丁基質(zhì)與蛋白質(zhì)的摩爾比為1∶1。因此在偶聯(lián)中，理論上偶聯(lián)反應(yīng)完成時(shí)，尼古丁半抗原與蛋白質(zhì)的摩爾比應(yīng)為200∶1。
用產(chǎn)物的NMR分析估計(jì)了聚谷氨酸上尼古丁取代基的實(shí)際比例。相對(duì)于尼古丁吡啶環(huán)的四個(gè)氫，谷氨酸α-氫峰的強(qiáng)度提供了摻入的尼古丁的比例。估計(jì)出的平均比例為143∶1(尼古丁/載體蛋白質(zhì))。
實(shí)施例6-用負(fù)載尼古丁的基質(zhì)制備尼古丁偶聯(lián)疫苗A.將尼古丁半抗原加載到基質(zhì)上將10mg聚-L-谷氨酸鹽(Sigma，Ca#P-4761)溶解在2ml 0.05M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液(含有0.15M NaCl，pH 6.0)中。將10mg 3’-氨基甲基-(-)-尼古丁溶解在最少量蒸餾水中，用0.1N HCl將溶液的pH調(diào)節(jié)到pH 6.0。邊攪拌，邊將尼古丁半抗原溶液逐滴加入此多肽溶液中，隨后調(diào)節(jié)到pH 6.0。分三批，將20mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)固體加到半抗原-多肽混合物中，為時(shí)20分鐘。反應(yīng)在室溫進(jìn)行1小時(shí)。三次換水來(lái)透析此反應(yīng)產(chǎn)物(尼古丁-取代的基質(zhì))并冷凍。得到12mg呈白色蓬松物質(zhì)的尼古丁取代的聚谷氨酸。
B.將接頭結(jié)合于尼古丁取代的基質(zhì)將10mg尼古丁取代的聚谷氨酸溶解在2ml MES緩沖液(pH 6.0)中。邊攪拌邊將8mg己二酸二酰肼(ADH)加到溶液中，然后再加入10mg EDC。讓反應(yīng)在室溫進(jìn)行1小時(shí)。最后將得到的溶液用pH 6.0 MES緩沖液透析換液3次。
C.偶聯(lián)于載體蛋白質(zhì)將10mg重組外蛋白質(zhì)A(rEPA)溶解在2ml 0.05M MES緩沖液(pH 5.6，含有0.15M NaCl)中。將估計(jì)含有7.5mg此衍生物質(zhì)的ADH-結(jié)合的尼古丁-取代的聚谷氨酸溶液加到此蛋白質(zhì)溶液中。室溫邊攪拌邊將固體EDC分三批加到此混合物中，為時(shí)20分鐘。讓反應(yīng)在室溫下進(jìn)行過(guò)夜。在Sephadex G-25柱上最后純化得到的偶聯(lián)物，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗脫。此產(chǎn)品是偶聯(lián)物的純化制品，其中偶聯(lián)物僅含有(S)-(-)形式的尼古丁。
實(shí)施例7-實(shí)施例4尼古丁載體偶聯(lián)物的特性分析在Superose 12大小排阻層析柱上分析了實(shí)施例4的純化的偶聯(lián)疫苗，并用pH 7.4的PBS洗脫。摻入尼古丁后，測(cè)定260nm UV吸收增加(相對(duì)于280nm的吸收)，計(jì)算出半抗原與蛋白質(zhì)的摩爾比為11∶17。這個(gè)范圍是通過(guò)計(jì)算六批分開(kāi)制備的半抗原-載體偶聯(lián)物(1批17.2，2批16.2，3批13.2，4批12.0，5批11.0，6批17.2)中半抗原/載體蛋白質(zhì)的比例確定的。用MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)一步分析確定此比例得到了與UV吸光度差異基本相同的數(shù)據(jù)。此偶聯(lián)疫苗的蛋白濃度用BCA試劑測(cè)定。對(duì)實(shí)施例4的尼古丁-載體偶聯(lián)物進(jìn)行了穩(wěn)定性研究。研究所用的疫苗裝在1ml玻璃瓶中，濃度為0.5mg/ml，測(cè)定了在以下三種不同溫度時(shí)玻璃瓶中疫苗的穩(wěn)定性-70℃，2-8℃和室溫。
實(shí)施例8-實(shí)施例4的尼古丁載體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性如在-70℃、2-8℃和室溫下六個(gè)月偶聯(lián)物穩(wěn)定性所觀(guān)察的那樣，基于半抗原-接頭-載體之間形成酰胺鍵的偶聯(lián)方法比形成酯鍵看來(lái)更有利。穩(wěn)定性研究包括用如下程序?qū)ε悸?lián)疫苗進(jìn)行監(jiān)測(cè)和分析1.目測(cè)觀(guān)察是否形成任何顆粒(混濁度、沉淀)2.核查pH是否有明顯的變化3.大小排阻層析結(jié)合260和280nm的UV吸光度測(cè)定，以確定尼古丁摻入比例是否改變4.反相層析，核查載體蛋白質(zhì)是否降解5.用銀染色作SDS PAGE，檢查偶聯(lián)的蛋白質(zhì)是否被蛋白酶切割。
如在-70℃和2-8℃6個(gè)月偶聯(lián)物的穩(wěn)定性測(cè)試中所觀(guān)察到的那樣基于在半抗原和接頭之間以及接頭和載體蛋白質(zhì)之間形成酰胺鍵的偶聯(lián)方法看來(lái)是有利的。
實(shí)施例9-實(shí)施例4和6的載體偶聯(lián)物的免疫原性證據(jù)用兩種尼古丁半抗原-載體偶聯(lián)物來(lái)免疫接種小鼠、大鼠和家兔。
A.動(dòng)物測(cè)試多克隆抗體用標(biāo)準(zhǔn)方法免疫接種動(dòng)物。對(duì)小鼠，皮下注射疫苗3次，間隔為2周，在第一次和第二次注射后1周進(jìn)行采血測(cè)試，第三次注射后1周放血。在實(shí)施例10中描述了用ELISA試驗(yàn)對(duì)這些血清樣品進(jìn)行評(píng)價(jià)。用3’AMNic-pGlu結(jié)合的微量滴定板進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。
用此疫苗腹腔內(nèi)免疫接種大鼠3次。間隔兩周進(jìn)行注射，且在第一次和第二次注射后一周測(cè)試血液。第三次注射后一周給大鼠放血。在第一次注射時(shí)用Freund完全佐劑，隨后的注射用Freund不完全佐劑。用ELISA試驗(yàn)評(píng)價(jià)血清樣品。
用100μg疫苗肌內(nèi)免疫接種家兔3次，間隔3周。第一次注射劑中含有Freund佐劑，以后的注射劑中含有Freund不完全佐劑。第二次和第三次注射后一周測(cè)試家兔血液，以確保產(chǎn)生的血液有足夠的滴度。如果獲得合適的滴度(用ELISA測(cè)定)，將家兔置于每周產(chǎn)血方案(20-40ml血清/兔)。全程監(jiān)測(cè)抗體的滴度，如果需要恢復(fù)抗體水平可加強(qiáng)接種動(dòng)物。
表1-5顯示了這些免疫原性研究的結(jié)果。表1和2顯示了小鼠中免疫原性研究的結(jié)果。表1中，所用的偶聯(lián)物是3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀?；?rEPA(實(shí)施例4)。表2中，所用的偶聯(lián)物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(實(shí)施例6)。這些表顯示產(chǎn)生了高滴度的特異性結(jié)合尼古丁的抗體。另外，還顯示這些偶聯(lián)物誘導(dǎo)增強(qiáng)應(yīng)答的能力。
表3和4顯示了大鼠中免疫原性研究的結(jié)果。表3中，所用的偶聯(lián)物是3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀?；?rEPA(實(shí)施例4)。表4中，所用的偶聯(lián)物是3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(實(shí)施例6)。
這些表顯示產(chǎn)生了高滴度的特異性結(jié)合尼古丁的抗體。另外，還顯示這些偶聯(lián)物誘導(dǎo)增強(qiáng)應(yīng)答的能力。
表5顯示了家兔中免疫原性研究的結(jié)果。使用3’氨基甲基-(-)-尼古丁-琥珀酰基-rEPA(實(shí)施例4)或3-氨基甲基-(-)-尼古丁-聚谷氨酸-ADH-rEPA(實(shí)施例6)，產(chǎn)生了對(duì)這兩種偶聯(lián)物的高滴度抗體。這些滴度保持升高6個(gè)月以上。
表1-用3’AMNid-Suc-rEPA處理小鼠

劑量根據(jù)蛋白質(zhì)試驗(yàn)。
滴度是相應(yīng)的注射后一周的算術(shù)平均值。
表2-用3’AMNid-pGlu-ADH-rEPA處理小鼠

劑量根據(jù)凍干偶聯(lián)物的干重。
滴度是相應(yīng)的注射后一周的算術(shù)平均值。
表3-用3’AMNid-Suc-rEPA處理大鼠

劑量根據(jù)蛋白質(zhì)試驗(yàn)。
滴度是相應(yīng)的注射后一周的算術(shù)平均值。
表4-用3’AMNid-pGlu-ADH-rEPA處理大鼠

劑量根據(jù)凍干偶聯(lián)物的干重計(jì)算。
滴度是相應(yīng)的注射后一周的算術(shù)平均值。
表5-用3’AMNic-Suc-rEPA和3’AMNic-pGlu-ADH-rEPA處理家兔

對(duì)3’AMNic-Suc-rEPA根據(jù)蛋白質(zhì)試驗(yàn)計(jì)算劑量，對(duì)3’-AMNic-pGlu-rEPA根據(jù)干重計(jì)算劑量滴度是第三次注射后6-7周的算術(shù)平均值。
實(shí)施例10-ELISA試驗(yàn)和抗體特異性尼古丁分子本身不適合包被ELISA板，需要將它連接于有較好粘附特性的較大分子。聚-L-賴(lài)氨酸或聚-L-谷氨酸通常用于這一目的。將衍生的尼古丁半抗原3’-氨基甲基-(-)-尼古丁(3’AMNic)偶聯(lián)于聚-L-谷氨酸，并將獲得的3’-氨基甲基(-)-尼古丁-聚-L-谷氨酸偶聯(lián)物(3’AMNic-pGlu)用于包被ELISA板。
如下用3’AMNic-pGlu ELISA評(píng)估產(chǎn)生的抗3’AMNic疫苗的抗體100ul/孔，用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)配制的10ng/ml 3’AMNic-pGlu包被Dynatech Immulon4微量滴定板(Chantilly，VA)，室溫(RT)培養(yǎng)過(guò)夜(ON)。然后抽吸這些平板，用PBS配制的1％BSA室溫封閉1小時(shí)。用PBB(1％BSA、0.3％BRIJ用PBS配制，pH 7.2)稀釋樣品和參考血清，直到稀釋液450nm的光密度(OD)接近2.0。用9％NaCl，0.1％BRIJ洗板5次，加入稀釋的樣品和參考血清。將參考品和樣品稀釋2倍，板上的終體積為100μl/孔，37℃培養(yǎng)此板1小時(shí)。然后再洗板，加入用PBB稀釋的過(guò)氧化物酶-偶聯(lián)的抗種系IgG，F(xiàn)c特異性抗體(Jackson，West Grove，PA)，100μl/孔，37℃培育1小時(shí)。洗板，室溫與100μl/孔，用H2O2(由TMB試劑盒提供)1∶1稀釋的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(KPL，Gaithersburg，MD)培育10分鐘。加入100μl/孔1M磷酸終止反應(yīng)，在MR4000微量滴定板讀數(shù)儀(Dynatech)上以450nm讀數(shù)。相對(duì)于參考品以平行線(xiàn)分析定量測(cè)定樣品。指定的參考品為其數(shù)值(U/ml)，相應(yīng)于450nmOD值約2.0的稀釋液。
用ELISA抑制試驗(yàn)評(píng)估了抗體的特異性。將各[3’AMNic-Suc-rEPA]血清稀釋到一濃度，其450nm光密度約為2.0濃度的兩倍。采用上述3’AMNic-pGluELISA，37℃用遞增量的測(cè)試抗原(抑制劑)，以1∶1(v/v)吸收被測(cè)試的稀釋血清3小時(shí)，用未吸收的血清為參考在ELISA中測(cè)試吸收的樣品。確定各樣品相對(duì)未吸收樣品的吸收百分比。
以酒石酸尼古丁作為抑制劑，用ELISA抑制試驗(yàn)計(jì)算含抗體(對(duì)3’AMNic-Suc-rEPA應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的)的大鼠血清的特異性。該抗體的IC50為3.5×10-6M。以酒石酸尼古丁作為抑制劑，用ELISA抑制試驗(yàn)計(jì)算含抗體(對(duì)3’AMNic-Sur-rEPA應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的)的兔血清的特異性。該抗體的IC50為2.3×10-6M。
實(shí)施例11-抗體親和力和結(jié)合能力用0.7ml血漿、Teflon半微量杯、分子量篩截?cái)嘀禐?2-14kD的Spectrapor2膜和Sorenson緩沖液(0.13M磷酸，pH 7.4)，37℃用平衡透析4小時(shí)測(cè)定了抗體的結(jié)合能力，見(jiàn)Pentel等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.246，1061-1066(1987)。在到達(dá)平衡透析終點(diǎn)時(shí)測(cè)定血清的pH，只有最終pH為7.30-7.45的樣品才可用。
用可溶性放射免疫試驗(yàn)計(jì)算抗體對(duì)尼古丁的親和力，見(jiàn)Mueller，Meth.Enzymol.，92，589-601(1983)。測(cè)得IgG的分子量為150kD。
用放射免疫試驗(yàn)得到的結(jié)合常數(shù)和親和力如下?？?[3’AMNic-Suc-rEPA]大鼠血清的IC50(摩爾)為1.36×10-7。Ka(摩爾-1)為2.57×107。結(jié)合部位濃度為2.61×10-6結(jié)合位點(diǎn)/L，尼古丁-特異性IgG濃度為0.2mg/ml。
實(shí)施例12-評(píng)估動(dòng)物模型的血漿和腦中尼古丁的分布在各種動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)了本發(fā)明的疫苗。用大鼠模型來(lái)評(píng)估主動(dòng)或被動(dòng)免疫對(duì)血漿和腦中尼古丁分布的作用。一項(xiàng)研究檢驗(yàn)了被動(dòng)免疫對(duì)尼古丁減弱運(yùn)動(dòng)的作用，即尼古丁對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的作用。另一研究評(píng)估了被動(dòng)免疫對(duì)尼古丁對(duì)心血管系統(tǒng)作用的影響評(píng)估收縮期血壓。
為了評(píng)估本發(fā)明的免疫療法，開(kāi)發(fā)了一動(dòng)物模型，模擬人迅速吸收兩支煙的尼古丁。Hieda(1997)J.Pharmacol.Exp.Ther.283(3)1076-1081描述了這種動(dòng)物模型。在這種模型中，用0.03mg/kg尼古丁靜脈注射大鼠為時(shí)10秒，模擬吸煙者由肺迅速吸收尼古丁。注射尼古丁后3和10分鐘采集血樣，測(cè)定血漿尼古丁。當(dāng)測(cè)定尼古丁腦濃度時(shí)，在注射尼古丁后3分鐘處死動(dòng)物，迅速取出它們的腦。在大鼠中評(píng)估了實(shí)施例4中的疫苗，確定它們對(duì)尼古丁在血漿和腦中分布的作用。
A.主動(dòng)免疫尼古丁疫苗免疫接種大鼠，每次25μg疫苗(3’AMNic-Suc-rEPA)腹腔內(nèi)注射，間隔2周共3次。注射0.03mg/kg尼古丁(為時(shí)10秒)后3和10分鐘，這些動(dòng)物的血漿尼古丁水平升高(與未免疫接種的對(duì)照動(dòng)物相比)。見(jiàn)圖1。所以主動(dòng)免疫對(duì)增加血漿中尼古丁的結(jié)合是有效的。已知適當(dāng)?shù)販p少到達(dá)腦部的尼古丁的量能顯著改變尼古丁的行為作用。
B.被動(dòng)免疫用被動(dòng)免疫，可確定免疫IgG在增加尼古丁血漿水平和減少尼古丁腦水平中的劑量應(yīng)答反應(yīng)作用。每次注射大鼠不同量的抗-(3’AMNic-Suc-rEPA)IgG(12.5-50mg)。如圖2所示，存在明顯的劑量應(yīng)答反應(yīng)作用，增加IgG的劑量，將增加血清尼古丁水平而降低腦尼古丁水平。
如圖3所示，每次注射給予總量為50mg的抗體后30分鐘和1天，大鼠的血清中存在抗尼古丁抗體(抗3’AMNic-Suc-rEPA)而且是活性的。如圖3所示，用尼古丁攻擊后(0.03mg/kg注射10秒)，這些抗體有效地降低了腦中尼古丁濃度，增加了血漿中尼古丁水平(給予抗體后30分鐘和1天)。
用本發(fā)明尼古丁疫苗被動(dòng)免疫有效的另一證明是，它能抵抗連續(xù)注入的尼古丁。在大鼠分開(kāi)的被動(dòng)免疫試驗(yàn)中，多次劑量的尼古丁并沒(méi)有耗竭存在的抗體或明顯降低它們結(jié)合新鮮注入的尼古丁的能力。圖4中，在0時(shí)注入50mg抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]，24小時(shí)后，從右頸靜脈注射5次0.03mg/kg尼古丁(10秒)，每20分鐘一次共80分鐘。進(jìn)行總量為5次的尼古丁注射。第5次尼古丁注射用3H-尼古丁示蹤。第五次注射后1分鐘收集血液和腦。以下顯示了結(jié)果，并在圖4和5中圖解。


這些結(jié)果顯示即使在注射了五次尼古丁后，抗體依然能有效地增加血清尼古丁的水平并降低腦尼古丁水平。用3H-尼古丁的結(jié)果證明抗體能有效地抵抗第五劑注射的尼古丁。
實(shí)施例13-評(píng)估尼古丁的運(yùn)動(dòng)作用設(shè)計(jì)本試驗(yàn)以確定被動(dòng)免疫能否預(yù)防尼古丁的即刻CNS介導(dǎo)作用。由Dr.David Malin開(kāi)發(fā)了用于本試驗(yàn)的大鼠模型，描述見(jiàn)Malin等人，“尼古丁-特異性IgG減少了大鼠腦中尼古丁的分布并減弱其行為和心血管作用”(遞交給尼古丁和煙草研究協(xié)會(huì)的第五次年會(huì)，San Diego，CA，1999年3月5-7日)。為了確定基線(xiàn)，測(cè)定了皮下注射0.8mg/kg酒石酸尼古丁對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)能力水平的作用。0.8mg/kg酒石酸尼古丁是不引發(fā)運(yùn)動(dòng)異常的最高可用劑量。
注射尼古丁后，未用抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]預(yù)處理的和用50mg正常家兔血清IgG預(yù)處理的大鼠活性水平增加。見(jiàn)圖6A的右直方和圖6B的左直方。用50mg抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]免疫IgG預(yù)處理動(dòng)物抑制了這種作用(圖6B右直方)。這顯示抗尼古丁血抗血清消除了尼古丁的體內(nèi)刺激作用。
實(shí)施例14-評(píng)估尼古丁對(duì)收縮期血壓的作用在本試驗(yàn)中，測(cè)定了尼古丁行為作用的另一標(biāo)志收縮期血壓的變化。用抗-[3’AMNic-Suc-rEPA]IgG或?qū)φ誌gG預(yù)處理大鼠。用0.1mg/kg酒石酸尼古丁皮下注射處理大鼠。對(duì)照大鼠顯示當(dāng)用尼古丁處理時(shí)，收縮期血壓增加42.6±3.2mmHg。當(dāng)大鼠用抗尼古丁抗血清IgG預(yù)處理時(shí)，尼古丁的攻擊效果差。當(dāng)抗尼古丁血清給予的量增加時(shí)，可消除尼古丁升高血壓的能力。如圖7所示，作為IgG劑量的函數(shù)血壓呈負(fù)線(xiàn)性趨勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種半抗原載體偶聯(lián)物，它具有下式II結(jié)構(gòu) 式中，n是0-12，Z是NH2、COOH、CHO或SH，且-(CH2)n-Z連接于3’、4’或5’位；其中，該Z部分能直接或通過(guò)接頭連接于載體。
2.如權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物，其特征在于，所述接頭是琥珀?；糠帧?br> 3.如權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物，其特征在于，所述載體蛋白包括T細(xì)胞表位。
4.如權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物，其特征在于，所述T細(xì)胞表位能刺激對(duì)象的T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)該半抗原載體偶聯(lián)物的抗體。
5.權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物在制備用于治療或預(yù)防尼古丁成癮用的藥劑中的用途。
6.針對(duì)權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物產(chǎn)生的抗體。
7.權(quán)利要求6所述的抗體的功能性片段。
8.一種產(chǎn)生抗體的方法，其特征在于，該方法包括用權(quán)利要求1所述的半抗原載體偶聯(lián)物免疫宿主哺乳動(dòng)物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體是多克隆抗體。
11.一種疫苗組合物，它含有權(quán)利要求1所述的至少一種偶聯(lián)物。
12.一種用于檢測(cè)樣品中尼古丁的存在的試劑盒，它包括權(quán)利要求6所述的抗體。
全文摘要
一種新穎半抗原－載體偶聯(lián)物，能在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性結(jié)合尼古丁的抗體。這些偶聯(lián)物含有偶聯(lián)于免疫原性載體蛋白質(zhì)的尼古丁半抗原。這種新穎的偶聯(lián)物保留了尼古丁的手性，呈天然(S)－(－)狀，具有良好的穩(wěn)定性。可將這種偶聯(lián)物用于配制主動(dòng)免疫的疫苗，用于預(yù)防或治療尼古丁成癮。對(duì)該尼古丁半抗原－載體偶聯(lián)物應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的抗體可用于被動(dòng)免疫。給予這些抗體來(lái)預(yù)防和治療尼古丁成癮。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1768861SQ200510092438
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期1999年12月1日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月1日
發(fā)明者S·恩尼法, A·I·法托姆, R·B·納索 申請(qǐng)人:Nabi生物制藥公司