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作為細胞因子釋放調(diào)節(jié)劑的棓單寧和鞣花單寧的制作方法

文檔序號:1097442閱讀:705來源:國知局
專利名稱:作為細胞因子釋放調(diào)節(jié)劑的棓單寧和鞣花單寧的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及作為細胞因子產(chǎn)生和分泌調(diào)節(jié)劑的棓單寧和鞣花單寧,所述細胞因子包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β),并涉及它們的合成,以及它們在受細胞因子釋放增加或降低影響的疾病和癥狀中的使用方法。
背景技術(shù)
棓單寧和鞣花單寧是植物多元酚的可水解單寧類中的成員。單寧是在整個植物王國中發(fā)現(xiàn)的次生代謝物,其在十九世紀五十年代首次得到分離和表征。至今,已經(jīng)鑒定了超過500種鞣花單寧和200種棓單寧。
棓單寧是最簡單的可水解單寧。這類化合物由糖核,通常是葡萄糖組成,所述糖核已被棓酸?;?。棓單寧中的變化來自異頭碳原子立體化學的差異和糖核的棓酰化的程度。
更復(fù)雜的鞣花單寧由與棓單寧相同的結(jié)構(gòu)單元組成。鞣花單寧的定義特征是至少存在一個六氫聯(lián)苯酚部分(hexahydrodiphenoyl,HHDP),推測其由兩個棓?;g的分子內(nèi)氧化C-C偶聯(lián)形成。已鑒定HHDP單元在糖核的1,6-、1,3-、3,6-和2,4-位橋連,但是在2位和3位之間或4位和6位之間橋連最為常見。
鞣花單寧可以是單體或低聚物。簡單的鞣花單寧中的變化包括異頭碳的立體化學以及HHDP單元的數(shù)目、定位和立體化學的不同。更高級單寧可以是二聚物、三聚物或四聚物。低聚鞣花單寧的糖核通過最有可能由兩個異頭棓?;鶈卧g的分子間C-O氧化偶聯(lián)形成的脫氫二棓?;倌軋F,或者通過棓?;虷HDP單元間的相似鍵合而連接。
脂多糖(LPS)或細菌內(nèi)毒素是所有格蘭氏陰性菌細胞壁中的成分。LPS的結(jié)構(gòu)由共價連接的四個部分組成由寡糖組成的O-特異性鏈、由辛酮糖酸和吡喃庚糖(heptopyranose)組成的外核和內(nèi)核,以及脂質(zhì)膜固定凹,稱為質(zhì)脂A。宿主免疫細胞對LPS的反應(yīng)包括細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的分泌。這些細胞因子,尤其是TNF-α,超量產(chǎn)生可能導(dǎo)致膿毒癥和敗血癥性休克。
由于暴露于來自格蘭氏陰性菌感染的LPS而導(dǎo)致產(chǎn)生低水平(<1ng/mL)TNF-α,引起膿毒癥。膿毒癥的特征癥狀為降體溫、發(fā)熱、白細胞數(shù)目增加。高水平TNF-α(>100ng/mL)的產(chǎn)生可能導(dǎo)致潛在的致命癥狀敗血癥性休克。敗血癥性休克僅在美國每年就引起20000多人死亡,它在加強監(jiān)護病房中是最主要的死亡原因。這種癥狀引起循環(huán)性虛脫,導(dǎo)致多器官衰竭和心血管脫垂。
LPS的脂質(zhì)A部分介導(dǎo)分子的內(nèi)毒素活性。該過程由細菌溶解引發(fā),導(dǎo)致LPS從細菌細胞壁中釋放以及脂質(zhì)A的暴露。血清中低濃度的LPS被LPS結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合。該二聚復(fù)合物連接于外周血單核細胞的(PBMC′s)CD14上的膜結(jié)合受體。CD14必須與確定為Tlr4的第二受體連接(或刺激第二受體)來引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),導(dǎo)致細胞因子釋放。在高濃度LPS下,直接結(jié)合到第二膜結(jié)合受體,L-選擇蛋白上成為可能,這也導(dǎo)致細胞因子釋放。
LPS如何與LBP相互作用,或者LPS/LBP復(fù)合物如何連接到CD14上仍不清楚。已知與所有其他合成和天然的脂質(zhì)A樣品相比,合成和天然的大腸桿菌(E.coli)脂質(zhì)A具有最高的內(nèi)毒素活性。鑒定賦予內(nèi)毒素活性的大腸桿菌脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)特征的嘗試已產(chǎn)生陰性結(jié)果。大腸桿菌脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)的任何變化均導(dǎo)致內(nèi)毒素活性下降或缺乏。
目前,還沒有敗血癥性休克的廣泛有效的治療。目前用于抑制LPS誘導(dǎo)的細菌性膿毒癥的方法包括使用1)可能阻斷脂質(zhì)A/受體相互作用的LPS拮抗劑;或2)設(shè)計以隔絕敗血癥性休克反應(yīng)的各種成分(LPS、TNF-α、TNF-α受體、LPS受體等)的單克隆抗體。前一方案通常依賴于相當有效但結(jié)構(gòu)上如此復(fù)雜以至于大規(guī)模生產(chǎn)有問題的脂質(zhì)A類似物/衍生物,或者依賴于更容易獲得但有效性較差的小分子試劑。后一方法受成本考慮的阻礙,并且最終在體內(nèi)功效試驗中令人失望。
據(jù)信TNF-α和其他細胞因子的過量產(chǎn)生也是幾種虛弱疾病,如麻風、類風濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)的原因,后者屬于晚期艾滋病的范圍內(nèi)。因此,細胞因子分泌的抑制已成為許多治療的目標。
提高TNF-α水平是許多以腫瘤緩解為目標的治療方案的焦點。在最佳情況下,直接給予腫瘤部位相對高濃度的TNF-α在黑素瘤和肉瘤患者中產(chǎn)生顯著反應(yīng)。Barbara等,1996。然而,全身施用TNF-α由于其嚴重的炎性作用(類似于IL-1β)和從血清中快速清除(t1/2≈6.5-10.5min),因而是無效治療。Sanches-Cantu等,1991。
可水解單寧的鞣花單寧亞科包括500多種結(jié)構(gòu)得到表征的成員。在來自中國和日本的富含多元酚的民間藥物中這些次生植物代謝物所起的作用日益引起人們的關(guān)注,這導(dǎo)致幾種有望成為有效抗病毒和抗癌治療藥的鞣花單寧的鑒定。參見例如Berlinck等(1995)。
已發(fā)現(xiàn)許多低聚鞣花單寧,包括coriariin A和結(jié)構(gòu)相關(guān)的物種agrimoniin和gemin A,通過增加IL-1β的產(chǎn)生而誘導(dǎo)感染肉瘤-180腫瘤的小鼠的腫瘤消退。Miyamoto等,Chem.Pharm.Bull.1987和Anticancer Res.1993。已發(fā)現(xiàn)單體鞣花單寧tellimagrandin I、tellimagrandin II、β-D-PGG和pedunculagin是效果較差的抗腫瘤藥。
本發(fā)明者現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn)某些棓單寧和鞣花單寧在增量調(diào)節(jié)和減量調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生中起作用。已發(fā)現(xiàn)這些化合物中有些對降低TNF-α分泌有用,從而使它們在與TNF-α的過量產(chǎn)生有關(guān)的疾病,如敗血癥性休克、麻風和惡質(zhì)病的治療的開發(fā)中適用。已發(fā)現(xiàn)其他棓單寧有效增加TNF-α水平,用于腫瘤消退。
因此,本發(fā)明的主要目的是提供用棓單寧和鞣花單寧調(diào)節(jié)細胞因子,如TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生的組合物和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用棓單寧和鞣花單寧增加TNF-α和其他細胞因子的水平以誘導(dǎo)腫瘤消退的組合物和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用棓單寧治療與細胞因子,包括IL-1β和TNF-α的急性超量產(chǎn)生有關(guān)的疾病,如膿毒癥和敗血癥性休克的組合物和方法。
本發(fā)明的再一目的是提供用棓單寧治療與低水平細胞因子,包括IL-1β和TNF-α的慢性超量產(chǎn)生有關(guān)的疾病,如麻風、類風濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)的組合物和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用低毒性的棓單寧和鞣花單寧調(diào)節(jié)TNF-α的產(chǎn)生的組合物和方法。
本發(fā)明的另一目的是提供用在體內(nèi)有效的棓單寧和鞣花單寧調(diào)節(jié)TNF-α的產(chǎn)生的組合物和方法。
本發(fā)明的再一目的是提供用易于合成且生產(chǎn)經(jīng)濟的棓單寧和鞣花單寧調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生的組合物和方法。
本發(fā)明的再一目的是提供用棓單寧調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生的組合物和方法,所述棓單寧是LPS拮抗劑。
本發(fā)明的另一目的是提供用棓單寧和鞣花單寧調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生的組合物和方法,所述棓單寧和鞣花單寧是LPS激動劑。
本發(fā)明的另一目的是提供用誘導(dǎo)細胞因子IL-1β不分泌或幾乎不分泌的棓單寧調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生的組合物和方法。
通過下文本發(fā)明的詳細描述,實現(xiàn)上述各目的和其他目的的方法和手段將變得清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明描述了用棓單寧和鞣花單寧、它們的前藥和類似物調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生的方法和組合物。具體地說,本發(fā)明的化合物毒性低,并且取決于它們的結(jié)構(gòu),已發(fā)現(xiàn)它們在作為細胞因子拮抗劑或激動劑起作用方面有效。
本發(fā)明的細胞因子拮抗劑由單體棓單寧β-黃棓酰單寧,優(yōu)選的二聚棓單寧組成,其中連接化合物的兩個糖核的連接分子引起核的誤調(diào)(misalignment)。在這方面,連接分子不應(yīng)該是二芳基醚,因為這種連接分子排列(align)糖核并使該化合物起細胞因子激動劑的作用。這些拮抗劑在治療膿毒癥/敗血癥性休克和其他與細胞因子的超量產(chǎn)生有關(guān)的慢性和急性癥狀如麻風、類風濕性關(guān)節(jié)炎和惡病質(zhì)中有效。
本發(fā)明的激動劑為具有連接化合物的糖核的醚鍵的二聚棓單寧和鞣花單寧。這些化合物促進TNF-α的釋放,進而誘導(dǎo)IL-1β和其他細胞因子的產(chǎn)生,從而使它們在許多抗癌策略中有效。本發(fā)明進一步包括合成coriariin A和仿生合成coriariin A、tellimagrandin II的單體前體的新路線。


圖1顯示在暴露于不同濃度的coriariin A、agrimoniin和LPS 4h時,IL-1β從人外周血單核細胞(h-PBMC′s)中的釋放。
圖2顯示從被固定濃度的β-D-PGG、二聚棓單寧和LPS刺激的h-PBMC′s中釋放IL-1β的時程。
圖3顯示從被固定濃度的β-D-PGG、二聚棓單寧和LPS刺激的h-PBMC′s中釋放TNF-α的時程。
圖4顯示在暴露于不同濃度的β-D-PGG(24h)、二聚棓單寧(24h)、coriariin A(4h)和LPS(4h)時,受試者1的h-PBMC′s的IL-1β釋放。
圖5顯示在暴露于不同濃度的β-D-PGG(24h)、二聚棓單寧(24h)、coriariin A(4h)和LPS(4h)時,受試者2的h-PBMC′s的IL-1β釋放。
圖6顯示在暴露于不同濃度的β-D-PGG(24h)、二聚棓單寧(24h)、coriariin A(4h)和LPS(4h)時,受試者1的h-PBMC′s的TNF-α釋放。
圖7顯示在暴露于不同濃度的β-D-PGG(24h)、二聚棓單寧(24h)、coriariin A(4h)和LPS(4h)時,受試者2的h-PBMC′s的TNF-α釋放。
圖8顯示用LPS(24h保溫)刺激的小鼠PEC′s的TNF-α分泌。
圖9顯示用coriariin A類似物(24h保溫)刺激的小鼠PEC′s的TNF-α分泌。
圖10顯示僅用LPS+LPS的β-PGG治療的大鼠的TNF-α分泌。
圖11顯示用17c-21c、18c和21c刺激的第一受試者的h-PBMC′s的TNF-α分泌;以及用17c、19c和20c刺激的第二受試者的h-PBMC′s的TNF-α分泌。
圖12顯示用LPS(5μg/mL)和17c-20c(10μg/mL)刺激的第三受試者的h-PBMC′s的隨時間的TNF-α分泌。
圖13顯示以最大反應(yīng)的百分比表示的,18c-20c對h-PBMC′s(第四受試者)的LPS(10μg/mL)誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制。在將LPS加入h-PBMC′s中45分鐘后加入底物。
圖14顯示以最大反應(yīng)的百分比表示的,17c、18c和20c對h-PBMC′s(第三受試者)的LPS(5μg/mL)誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制。在將LPS加入h-PBMC′s中45分鐘后加入底物。
圖15顯示以最大反應(yīng)的百分比表示的,17c-20c對h-PBMC′s(第五受試者)的LPS(5μg/mL)誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制。在將LPS加入h-PBMC′s中45分鐘后加入底物。
圖16顯示用17c-20c刺激的h-PBMC′s(第二受試者)的IL-1β分泌。
圖17顯示以最大反應(yīng)的百分比表示的,19c和20c對h-PBMC′s(第四受試者)的LPS(1μg/mL)誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制。在將LPS加入h-PBMC′s中45分鐘后加入底物(8h保溫)。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)TNF-α和其他細胞因子的分泌的棓單寧和鞣花單寧的開發(fā)。本發(fā)明依據(jù)于單寧似乎至少在利用Tir4受體的程度上通過與LPS相同的生物學途徑起作用的發(fā)現(xiàn)。取決于它們的結(jié)構(gòu),本發(fā)明的單體和二聚棓單寧在增加或抑制TNF-α和其他細胞因子的產(chǎn)生和釋放方面有效。本發(fā)明的TNF-α拮抗劑通過減少細胞因子的分泌而在治療敗血癥性休克和其他與TNF-α和其他細胞因子的超量產(chǎn)生有關(guān)的疾病或癥狀中有效,優(yōu)選的化合物不或幾乎不引起IL-1β分泌。TNF-α激動劑在增加TNF-α和其他細胞因子的分泌方面有效,因此具有抗腫瘤活性。
在過去的幾年中,可水解的單寧的鞣花單寧亞科的成員在有機合成中提供了許多當前挑戰(zhàn),以及在抗癌和抗敗血癥性休克化療中的許多激動人心的機會??伤獾膯螌幇?gòu)象易變的、弱蛋白結(jié)合的棓單寧(Kd≈mM)和鞣花單寧。在本發(fā)明以前,據(jù)信只有后一類成員能夠提供選擇性生物活性所必需的受體締合的需要程度(IC50′s≈μM到nM)。
本發(fā)明者現(xiàn)在驚奇地發(fā)現(xiàn),簡單的單體和二聚棓單寧和鞣花單寧能夠提供與LPS受體締合的需要程度,以提供TNF-α和其他細胞因子的釋放的選擇性釋放或抑制。與鞣花單寧相比,棓單寧化合物相對更易于合成,并且類似于鞣花單寧,它表現(xiàn)出低程度的細胞毒性。此外,已證明本發(fā)明的棓單寧和鞣花單寧對TNF-α受體比以前已知的單寧化合物更具特異性,并且在抗癌和抗敗血癥性休克策略中表現(xiàn)出有效性。
如上所述,植物多元酚的鞣花單寧科包括一類500多種結(jié)構(gòu)多樣的成員。在來自中國和日本的富含單寧的民間藥物中這些次生植物代謝物所起的作用日益引起人們的關(guān)注,這導(dǎo)致幾種在抗癌和抗病毒測定中顯示高度活性的鞣花單寧的鑒定。這些鞣花單寧通常固有地顯示低的細胞毒性,因此它們在新的治療的開發(fā)中得到研究。
幾種鞣花單寧的體內(nèi)抗腫瘤效力的檢測證明二聚鞣花單寧與單體(棓)鞣花單寧相比是更有效的殺腫瘤藥。Miyamoto,Chem.Pharm.Bull.1987。在肉瘤-180腫瘤接種前或后,經(jīng)腹膜給予小鼠單寧引起相同程度的腫瘤消退。Miyamoto,Jpn.J.Pharmacol.1987。這些觀察結(jié)果表明內(nèi)源可誘導(dǎo)的因子可能在鞣花單寧的抗腫瘤活性中起作用。
Miyamoto在分子基礎(chǔ)上對一系列單寧抗腫瘤活性的體外研究揭示了它們刺激小鼠腹膜溢泌物細胞和人外周血單核細胞(h-PBMC′s)的白細胞介素-1β(IL-1β)分泌的能力。Miyamoto,Chem.Phar.Bull.1987。IL-1β能夠增量調(diào)節(jié)殺腫瘤天然殺傷細胞的活性,提示Hokuriku小組的提議,即這種細胞因子介導(dǎo)鞣花單寧的體內(nèi)抗腫瘤活性。Miyamoto,Anticancer Res.1993。
本發(fā)明者意外地發(fā)現(xiàn),TNF-α似乎是造成免疫介導(dǎo)的腫瘤消退的原因的細胞因子。因此,由于目前已證明單寧刺激TNF-α分泌,Miyamoto對IL-1β水平的測定實際上可能已反映了至少一些可歸于新生TNF-α的次級生產(chǎn)。
本發(fā)明的TNF-α激動劑是具有二芳基醚連接單元的二聚棓單寧和鞣花單寧。本發(fā)明優(yōu)選的化合物是天然存在的二聚鞣花單寧coriariin A和agrimoniin,和coriariin A的棓單寧類似物。coriariin A和agrimoniin的結(jié)構(gòu)如下 本發(fā)明最優(yōu)選的化合物具有如下結(jié)構(gòu)
可以理解,天然存在的二聚鞣花單寧coriariin A的該類似物除了缺乏coriariin A的O(4)/O(6)偶聯(lián)的HHDP單位外,與母體化合物相同。
本發(fā)明的激動劑的合成也作為coriariin A新合成方案的一個模型。另外,本文描述了coriariin A的單體前體,tellimagrandin II的仿生合成。
本發(fā)明的TNF-α激動劑的任何合成策略一定有兩個關(guān)鍵1)脫氫二棓?;堰B接單元的形成;2)具有立體化學控制的β-異頭棓?;I的建立。除了異頭酯立體化學,telligrandin II合成需要1)HHDP部分的(S)-阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的立體選擇性形成,和2)以與分子中存在的其他官能團相容的方式選擇性操縱異頭中心。已證明Pb(OAc)4介導(dǎo)的氧化棓?;悸?lián)是立體化學可靠的(S)-HHDP單元的制備的穩(wěn)固策略。TNF-α激動劑和tellimagrandin II中的β-異頭棓?;I可以通過在適宜堿的存在下,偶聯(lián)用棓酰氯適當?shù)乇Wo的中間體的異頭羥基而得以保證。
本發(fā)明者提出通過兩個活化的β-D-PGG單元的二聚進行的仿生方法。該路線如下所示
路線3 在此,醇11的?;谌野吩诖嬖谙掠脳旛B?6實現(xiàn),提供五酯17,其特征為異頭位的嚴格β-立體化學?;衔?7的脫甲硅基作用提供兒茶酚18,用鄰氯醌將兒茶酚18氧化成鄰醌19。鄰醌19從反應(yīng)混合物中干凈地沉淀,避免了進一步純化這種敏感化合物的需要。B(OAc)3介導(dǎo)的鄰醌19的Diels-Alder二聚作用與后續(xù)的三步還原/重排順序提供全芐基化的棓單寧二聚體12,從鄰醌19開始計,收率為44%。在最后一步中,12中芐酯的氫解作用提供二聚棓單寧,收率為50%。
tellimagrandin II 2的合成從已知的乙縮醛20開始。參見以下合成路線
路線4
糖核2位和3位的棓?;峁┒?1,收率為78%。21中O(4)、O(6)亞芐基乙縮醛的脫保護提供中間體二醇,收率為84%,該中間體立刻用過量22在O(4)和O(6)位酯化,以提供四棓?;衔?3。二甲硅烷基醚23的脫甲硅基作用提供氧化環(huán)化前體。在該雙酚的O(4)和O(6)位的棓?;姆肿觾?nèi)PB(OAc)4介導(dǎo)的氧化偶聯(lián)提供具有4,6-(S)-HHDP的化合物24a-c,為三種區(qū)域異構(gòu)體(regioisomer)的混合物,收率為67%。24a-c中二苯亞甲基縮酮的氫解作用是反復(fù)無常的反應(yīng),因此采用兩步脫保護/保護策略。24a-c的二苯亞甲基縮酮用80%HOAc裂解,所得的六酚化合物通過兩個步驟直接被芐基化,提供單一異構(gòu)體收率為50%。。
所有酚位置上芐酯的存在證明在tellimagrandin II合成的最后階段中的優(yōu)勢,因為賦予后來的中間體有利的色譜和光譜性質(zhì),同時保留在最后步驟中給出純多元酚產(chǎn)物的手段。25的O(1)-硝基芐基醚的選擇性光化學裂解提供特征為游離異頭羥基的全芐基化tellimagrandin I衍生物26,收率為66%。用該醇在三乙胺的存在下酯化3,4,5-三芐基苯甲酰氯提供27,其全部為β-酯化產(chǎn)物,收率為41%。在最后步驟中,27中芐基醚的氫解作用提供粗品tellimagrandinII,它通過用己烷和乙醚反復(fù)過濾和研制得以純化,得到2,其為灰色固體,收率為30%。化學合成的tellimagrandin II 2的所有光譜數(shù)據(jù)和發(fā)表的天然存在的化合物的數(shù)據(jù)一致。(S)-HHDP阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的存在由CD測定確證。
總之,從棓單寧鄰醌中間體合成含脫氫二棓?;训亩蹢攩螌幍氖状稳铣傻靡酝瓿?。該合成闡明了在獲得這類化合物中鄰醌的B(OAc)3介導(dǎo)的Diels-Alder二聚作用的價值。另外,闡明了tellimagrandin II,coriariin A的生物合成前體的合成。
本發(fā)明的細胞因子拮抗劑包括單體棓單寧β-PGG和具有連接化合物的兩個糖核的非二芳基連結(jié)單元的優(yōu)選的二聚棓單寧。
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)單體棓單寧β-PGG在抑制LPS誘導(dǎo)的h-PBMC′s的TNF-α分泌方面有效。β-PGG的結(jié)構(gòu)如下 初步的體內(nèi)結(jié)果顯示β-PGG在抑制TNF-α和其他細胞因子的釋放。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)為了引起抑制,需要大量β-PGG,因為β-PGG是能與其他血蛋白如大鼠血清白蛋白相互作用的小單體棓單寧。另外,即使用β-PGG治療的大鼠顯示低水平的TNF-α分泌,但仍觀察到低血壓形式的敗血癥性休克反應(yīng)。據(jù)信這種生理效應(yīng)歸因于已被證明也介導(dǎo)敗血癥性休克的細胞因子IL-1β的分泌。β-PGG引起hPBMC′s的高水平IL-1β分泌。因此本發(fā)明者測試了其他二聚棓單寧,以發(fā)現(xiàn)在生物學相互作用中更具選擇性的TNF-α抑制劑,所述抑制劑導(dǎo)致幾乎沒有或沒有IL-1β釋放。
本發(fā)明優(yōu)選的細胞因子拮抗劑是具有連接兩個糖核的連接單元的二聚棓單寧。與本發(fā)明的激動劑的二芳基醚鍵不同,細胞因子拮抗劑的連接單元引起糖核誤調(diào),賦予化合物它們的拮抗活性。因此,本發(fā)明的拮抗劑的連接單元不能是二芳基醚。
優(yōu)選的拮抗劑具有以下通式
其中L選自以下基團 這些優(yōu)選的化合物比β-PGG引起更少的細胞因子分泌,它們能夠抑制PBMC′s中LPS誘導(dǎo)的TNF-α水平。
本發(fā)明最優(yōu)選的拮抗劑具有選自以下的連接分子 這些拮抗劑最為優(yōu)選,因為它們幾乎不或不引起IL-1β分泌。如上所述,細胞因子IL-1β也在LPS刺激的敗血癥性休克反應(yīng)中釋放。幾乎不或根本不引起IL-1β分泌的化合物將是有效的敗血癥性休克治療的最佳化合物,因為它們本身較少誘導(dǎo)敗血癥性休克反應(yīng)。
二聚棓單寧細胞因子拮抗劑的合成包括適宜的雙酰氯和醇22的簡單偶聯(lián),如以下反應(yīng)路線所示

偶聯(lián)后,接著用芐基醚氫化作用,獲得終產(chǎn)品17c-21c。提供17b、18b和21b的偶聯(lián)以高度非對映選擇性進行,得到β,β′端基異構(gòu)體。19b的合成需要比其他類似物更高的溫度。該類似物以4∶1的β,β′對α,α′端基異構(gòu)立體化學的比例獲得,該比例通過1H NMR測定。與β,β′端基異構(gòu)體的H(1)質(zhì)子(6.02ppm,J=9.8Hz)相比,α,α′端基異構(gòu)體的H(1)質(zhì)子出現(xiàn)在更遠的低磁場(6.88ppm)并具有更小的偶合常數(shù)(J=3.2Hz)。20b的合成導(dǎo)致β,β′、α,α′和α,β′端基異構(gòu)體的混合物。然而,將20a緩慢加如醇22主要生成β,β′異構(gòu)體。α端基異構(gòu)體的H(1)質(zhì)子出現(xiàn)在6.69ppm,偶合常數(shù)為4.15Hz。
酰氯19a和20a不可商購,但易于制備。例如,19a可以通過用草酰氯和催化DMF將雙酸23轉(zhuǎn)化成酰氯而制備,如下所示路線8 化合物21a通過三步制備。二芳基醚酯24通過Ullmann偶聯(lián)制備。24的水解導(dǎo)致雙酸25,雙酸25用草酰氯和催化DMF轉(zhuǎn)化成酰氯,如下所示
路線9 本發(fā)明的細胞因子激動劑和拮抗劑通??梢杂糜谥委煱┌Y、敗血癥性休克和其他期望增加或抑制細胞因子分泌的疾病和癥狀。本發(fā)明的棓單寧和鞣花單寧與藥學可接受的載體一起給予。任何藥學可接受的載體都可用于該目的,條件是該載體不顯著干擾棓單寧和鞣花單寧的穩(wěn)定性或生物利用度。
本發(fā)明的棓單寧和鞣花單寧可以以任何有效的藥學可接受的形式給予溫血動物,包括人和其他動物受試者,例如局部、灌洗、口服、栓劑、非胃腸或可輸注的劑形,以局部、口腔、舌下或鼻噴霧或其他任何有效的轉(zhuǎn)運藥物的方式給予。給藥途徑優(yōu)選設(shè)計為優(yōu)化藥物的轉(zhuǎn)運和/或定位到細胞因子受體。
除了活性化合物,即棓單寧,本發(fā)明的藥物組合物可以含有有助于活性化合物加工成可藥用制劑的適宜的賦形劑和輔劑??诜┬伟ㄆ瑒?、膠囊劑、顆粒劑和糖衣丸。可以直腸給予的制劑包括栓劑。其他劑形包括非胃腸或口服給予的適宜溶液,以及可以口腔或舌下給予的組合物。
本發(fā)明的藥物制劑以本領(lǐng)域公知的方式制造。例如,藥物制劑可以通過常規(guī)的混合、成粒、制作糖衣丸、溶解、凍干方法的手段制備。所用方法最終取決于所用活性成分的物理性質(zhì)。
適宜的賦形劑是,特別是,填料如糖,例如乳糖或蔗糖甘露糖醇或山梨糖醇,纖維素制劑和/或磷酸鈣,例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣,以及粘合劑如淀粉、糊,使用例如玉米淀粉、麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要,可以加入崩解劑,如上述淀粉以及羧甲基淀粉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽,如藻酸鈉。輔劑是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑,例如硅石、滑石粉、硬脂酸或其鹽,如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣和/或聚乙二醇。糖衣丸核可以具有適宜的包衣,如果需要,它可以抵抗胃液。
為了該目的,可以使用濃糖溶液,其任選地含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化鈦,漆溶液和適宜的有機溶劑或溶劑混合物。為了產(chǎn)生抵抗胃液的包衣,可以將適宜的纖維素制劑如醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、染料和顏料的溶液加入糖衣丸包衣的片中,例如為鑒定或為表征化合物制劑的不同組合。
其他可以用于口服的藥物制劑包括由明膠制成的推入配合(push-fit)膠囊劑,以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨糖醇制成的軟密封膠囊和。推入配合膠囊可以含有顆粒形式的活性化合物,活性化合物可以與填料如乳糖,粘合劑如淀粉,和/或滑潤劑如滑石粉或硬酯酸鎂,以及任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中,活性化合物優(yōu)選溶解或懸浮在適宜的液體中,如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外,可以加入穩(wěn)定劑??芍蹦c使用的可能藥物制劑包括,例如由活性化合物和栓劑基質(zhì)組成的栓劑。適宜的栓劑基質(zhì)為,例如,天然或合成的甘油三酯、鏈烷烴、聚乙二醇,或高級鏈烷醇。另外,還可能使用由活性化合物和基質(zhì)的組合組成的明膠直腸膠囊。可能的基質(zhì)材料包括例如液體甘油三酯、聚乙二醇或鏈烷烴。
非胃腸給予的適宜配方包括水溶或水分散形式的活性化合物的水溶液。另外,可以以適宜的油注射懸浮液給予活性化合物的懸浮液。適宜的親脂性溶劑或載體包括脂肪油,例如,芝麻油或合成脂肪酸酯,例如油酸乙酯或甘油三酯。含水注射懸浮液可以含有增加懸浮液粘度的物質(zhì),包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。這種組合物還可以包含輔劑如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。它們還可以通過用保留細菌的濾器過濾,或通過向組合物中摻入殺菌劑而滅菌。在給予前,它們還可以以能溶解或懸浮在無菌水、鹽水或其他注射介質(zhì)中的無菌固體組合物的形式生產(chǎn)。
除了用常規(guī)載體給藥外,活性成分可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的專門的給藥技術(shù)如可移動的輸注泵而給予。
其他用于給藥的配方可以根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法和量制備,如Remington′s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Wiley Publishing(1990)中所述。
本發(fā)明的組合物以足以預(yù)防瘧疾感染和/或治療活性感染的量與藥學可接受的載體一起給予。即使在高劑量下,本發(fā)明的棓單寧也具有極低的毒性和低度副作用。棓單寧的劑量范圍將取決于多種因素而變化,如它是用于預(yù)防還是治療活性感染或惡性腫瘤(malignancy),給藥途徑,預(yù)期的劑量方案等。棓單寧化合物優(yōu)選地置于藥物載體中,由此藥物組合物中化合物的終濃度為約1-10%(重量)。通常,該類型的藥物組合物的劑量范圍在每天約10至約1000mL的范圍內(nèi)。否則,棓單寧的劑量通常為約0.1-1000mg/kg/天,優(yōu)選為約0.1-100mg/kg/天。前述劑量可以以單一劑量給予或分成多劑量給予。棓單寧可以每天給予一次到幾次。
除棓單寧和鞣花單寧之外的其他可與載體成分相容的藥物也可以摻入藥物配方中。這種藥物可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定,它們可以包括,例如,抗生素、其他抗病毒藥、抗炎藥等。
可以理解,本發(fā)明不僅涵蓋上述棓單寧和鞣花單寧化合物本身的用途,而且還涵蓋代謝成該化合物的它們的前藥和它們的類似物和生物活性的鹽形式,以及提供相同藥效的光學異構(gòu)體。
以下實施例用以闡明但并不限制本發(fā)明。因此,可以進行各種配方改變和給藥方法改變,它們?nèi)栽诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。
實施例1二聚棓單寧和鞣花單寧的合成在200、300或360MHz(1H)分光計上記錄核磁共振譜(1HNMR,13C NMR)。在2-硝基苯辛基醚(NPOE)基質(zhì)或硝基芐基醇(NBA)基質(zhì)中獲得低分辨快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)。高分辨快原子轟擊質(zhì)譜在Austin的University of Texas中進行。圓二色性(CD)測定使用200nm到350nm的波長范圍。在1mm池中在25℃下以0.5nm的間隔掃描,平均時間為10.0s。所用溶液的濃度為1mg/mL。液體(閃蒸)柱色譜用32-63μm硅膠和所指明的溶劑進行。燃燒分析由用MidwestMicrolab,Indianapolis,IN或Galbraith Laboratories,Knoxville,TN進行。醚(Et2O)和四氫呋喃(THF)通過在氮氣氛下從鈉/二苯酮蒸餾而純化。苯、二氯甲烷(CH2Cl2)、甲醇和甲苯在氬氣氛下從CaH2蒸餾。濕度敏感反應(yīng)在Ar的惰性氣氛下在預(yù)干燥的玻璃器皿中進行。1H和13C NMR譜的副本在Supporting Information中提供,以確定這些未進行燃燒分析的化合物的純度。
修改的Steglich酯化反應(yīng)一般過程A。將適宜的多元醇(1.0當量)、酸(每羥基1當量)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.5當量)、DMAP·HCl(0.5當量)和1.3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(每羥基1.25當量)在無水CH2Cl2(酸0.1M)中的溶液用Ar吹,并且在Ar下加熱回流15-20h。溶液冷卻到室溫(rt),用等體積Et2O稀釋,通過C鹽過濾,將濾液傾入冰冷的1M H3PO4中。分離有機層,用鹽水洗滌,用無水硫酸鈉干燥,過濾并真空濃縮。粗產(chǎn)物通過閃蒸柱色譜用所指明的溶劑純化。
修改的Steglich酯化反應(yīng)一般過程B。將適宜的多元醇(1.0當量)、酸(每羥基1當量)、4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP)(0.5當量)、DMAP·HCl(0.5當量)和1,3-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)(每羥基1.5當量)在無水CH2Cl2(酸0.1M)中的溶液用Ar吹,并且在Ar下加熱回流15-20h。溶液冷卻到在室溫(rt),并通過C鹽過濾。濾液用等體積的EtOAc稀釋并傾入冰冷的1M H3PO4中。分離有機層,用鹽水洗滌,用無水硫酸鈉干燥,過濾并真空濃縮。粗產(chǎn)物通過閃蒸柱色譜用所指明的洗脫劑純化,提供期望的酯。
甲硅烷基醚脫保護反應(yīng)一般過程C。向適宜的叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)保護的葡萄糖衍生物(1.0當量)在無水THF(TBDMS保護的葡萄糖衍生物0.01M-0.05M)中的溶液中加入氟化四正丁銨(TBAF)在THF(1.0M的THF溶液)中的溶液(每TBDMS基1.5當量)。在室溫下攪拌反應(yīng)物,并接著進行TLC(10-45min)。在所指明的時間段結(jié)束時,將反應(yīng)溶液用冰冷的1M H3PO4小心處理,產(chǎn)物用Et2O萃取。分離Et2O層,用水洗滌,然后用鹽水洗滌,用無水硫酸鈉干燥,過濾并真空干燥。用所指明的溶劑進行粗品殘余物的閃蒸柱色譜,提供純的產(chǎn)品。
2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-α-D-吡喃葡萄糖。將1,2,3,4,6-五(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡萄糖(7.0g,3.1mmol)溶解在200mL無水THF和100mL無水MeOH的混合物中,并冷卻到0℃。將氨氣鼓入溶液10分鐘。在0℃下攪拌反應(yīng)物30分鐘,并接著暖至室溫并再攪拌2.5h。除去溶劑,接著用在己烷中的10%、25%和50%EtOAc洗脫,進行閃蒸柱色譜,獲得4.16g(73%)2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-D-吡喃葡萄糖白色固體泡沫(α,β端基異構(gòu)體的混合物)。將一部分該產(chǎn)品(30mg)通過制備TLC用在苯中的10%EtOAc進一步純化。IR(CH2Cl2)3483,1725cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.42-6.64(m,68H),6.23,(t,J=9.9Hz,1H),5.79(d,J=3.7Hz,1H),5.70(t,J=9.9Hz,1H),5.75-4.65(m,27H),4.29(dd,J=4.3Hz,12.1Hz,1H),3.40(bs,1H);13CNMR(CDCl3,90MHz)δ166.7,165.7,165.4,165.1,152.54,152.50,152.4,143.1,142.9,142.8,142.7,142.6,137.4,137.35,137.3,136.6,136.45,136.4,136.33,136.3,128.5,128.4,128.33,128.2,128.1,128.07,128.05,128.0,127.94,127.9,127.86,127.8,127.78,127.56,127.51,127.4,127.3,124.6,124.1,123.9,109.4,109.3,109.1,90.4,75.1,75.0,72.8,71.2,71.1,70.9,70.0,67.6,63.1;MS(+FAB)1869(MH+,0.5)。C118H100O22C計算C,75.80;H,5.35;實測C,76.13;H,5.45。
3-芐氧基-1,2-二氧還己-3,5-二烯-5-苯甲酸甲酯。向冷卻到-30℃的鄰氯醌(1.97g,8.02mmol)在5mL Et2O中的溶液中經(jīng)加液漏斗在6小時內(nèi)滴加3-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酸甲酯(2.0g,7.3mmol)在115mL Et2O中的溶液。在-30℃下進一步攪拌反應(yīng)物0.5h,然后在-20℃貯存20h。過濾收集沉淀的紅色固體,用冷Et2O洗滌并在真空泵上干燥,獲得1.11g(55%)的鄰苯醌。IR(CDCl3)1727,1671cm-1;1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.41-7.26(m,5H),6.74(s,1H),6.73(s,1H1,6.56(s,2H),3.92(s,3H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ179.9,174.2,164.7,152.1,141.3,134.3,128.8,128.7,127.7,124.4,107.7,71.1,53.4;MS(-FAB)272(M-,12)。C15H12O5計算C,66.18;H,4.41;實測C,65.75;H,4.45。
二芳基醚。將鄰苯醌(200mg,0.72mmol)溶解在5mL CDCl3中,加入B(OAc)3(136mg,0.72mmol),將非均相混合物在-2-65℃(油浴溫度)加熱15h,此時1H NMR分析表明鄰苯醌不存在。反應(yīng)混合物冷卻并過濾。用冷CH2Cl2洗滌B(OAc)3小球并,將濾液和洗滌液蒸發(fā),獲得棕色油,它立刻與NaOAc(60mg,0.76mmol)在5mL HOAc中攪拌2h。將該反應(yīng)混合物在EtOAc和水間分配,有機層用鹽水洗滌并用硫酸鈉干燥。真空濃縮有機層提供黃色的油,它通過閃蒸柱色譜(-78℃,氬氣氛下)純化,獲得150mg脫氫二棓?;锦膮^(qū)域異構(gòu)體混合物黃色固體。將苯醌混合物立即與Na2S2O4(180mg,1.08mmol)在8mL THF/2mL水中在0℃下攪拌10min。在此時,深黃色反應(yīng)混合物脫色成淺黃色溶液。將反應(yīng)混合物在EtOAc和水間分配,有機層用鹽水洗滌,并用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑,獲得150mg白色固體(脫氫二棓?;训膮^(qū)域異構(gòu)體混合物)。粗品白色固體(150mg,0.27mmol)用BnCl(126μL,1.10mmol)、K2CO3(190mg,1.37mmol)和KI(27mg,0.16mmol)在30mL回流丙酮中芐基化24小時。冷卻反應(yīng)混合物,通過C鹽過濾,將濾液真空濃縮成油,它通過閃蒸柱色譜用1∶1 Et2O∶己烷純化。IR(CH2Cl2)1718cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.45-7.13(m,27H),6.90(d,J=1.8Hz,1H),5.14(s,4H),5.12(s,4H),4.97(s,2H),3.79(s,3H),3.71(s,3H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ166.4,165.2,152.6,149.9,146.8,146.5,142.5,141.7,137.9,136.8,136.7,136.6,136.3,128.61,128.6,128.5,128.34,128.3,129.2,128.1,127.96,127.9,127.7,127.5,125.0,119.8,110.8,109.14,109.12,75.6,75.3,75.1,71.4,71.2,52.3,52.1;MS(-FAB)816.5(M+,100),HRFABMS。C51H44O10計算816.2934;實測816.2933。
3,4,5,3′,4′-五芐氧基脫氫二棓酸。將二芳基醚(0.30g,0.37mmol)和氫氧化鋰水合物(0.15g,3.7mmol)在16mL 3∶1甲醇∶水混合物中回流并用TLC監(jiān)測3.5h。冷卻反應(yīng)混合物并真空除去溶劑。殘余物用己烷中的50%EtOAc,然后用EtOAc中的1%HOAc作為洗脫劑進行閃蒸柱色譜,獲得0.18g(62%)雙酸白色固體。IR(KBr片)2629,1688cm-1;1H NMR(丙酮-d6,300MHz)δ7.57-7.17(m,27H),6.96(d,J=1.7Hz,1H),5.26(s,2H),5.22(s,2H),5.20(s,2H),5.15(s,2H),5.01(s,2H);13C NMR(丙酮-d6,50MHz)δ167.2,165.9,153.8,150.9,150.5,149.0,147.5,147.2,143.1,142.5,139.1,138.0,137.9,137.7,137.6,129.4,129.3,129.2,129.1,128.97,128.92,128.9,128.8,128.7,128.5,128.3,128.2,126.3,121.3,111.7,109.8,76.1,75.9,75.6,71.9,71.7,52.2,52.0;MS(+FAB)788.5(M+,100),HRFABMS。C49H40O10計算788.2621;實測788.2614。
1-O-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-α-D-吡喃葡糖基三氯亞氨逐乙酸酯(Trichloroacetimidate)。將2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-D-吡喃葡萄糖(1.0g,0.54mmol)在10mL無水苯中的溶液加入脫脂氫化鈉(0.014g,0.58mmol)中,接著加入三氯乙腈(536μL,5.20mmol),將所得溶液在室溫下攪拌18h。用水稀釋反應(yīng),將產(chǎn)物萃取到25mL EtOAc中。分離有機層并用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥。真空濃縮溶液并通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%,然后用20%EtOAc作為洗脫劑純化,獲得0.90g(84%)1-O-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-α-D-吡喃葡糖基三氯亞氨逐乙酸酯白色固體。IR(CH2Cl2)3342,1728,1678cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.65(S,1H),7.41-7.15(m.68H),6.88(d,J=3.6Hz,1H),6.21(t,J=10.1Hz,1H),5.73(t,J=10.1Hz,1H),5.54(dd,J=3.7Hz,10.2Hz,1H),5.13-4.88(m,24H),4.82-4.65(m,2H),4.32(dd,J=5.0Hz,12.2Hz,1H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ165.54,165.50,165.1,165.0,160.5,152.60,152.57,152.51,152.50,143.3,143.1,142.8,137.4,137.3,136.6,136.5,136.4,136.3,128.52,128.50,128.43,128.40,128.34,128.30,128.24,128.20,128.13,128.11,128.10,128.0,127.96,127.9,127.82,127.8,127.6,127.52,127.50,124.6,123.9,123.5,109.6,109.4,109.2,109.1,93.2,90.8,75.1,71.3,71.21,71.20,71.11,71.1,70.8,69.2,62.8;MS(+FAB)2012(MH+,78)。C120H100Cl3NO22計算C,71.61;H,4.97;Cl,5.22;N,0.70;實測C,71.61;H,5.07;Cl,5.42;N,0.72。
1-O-3,4,5-三乙酰氧基苯甲?;?2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。將1-O-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-α-D-吡喃葡糖基三氯亞氨逐乙酸酯(170mg,0.08mmol)和3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸(25mg,0.08mmol)在0.8mL無水甲苯中的溶液回流18h。冷卻反應(yīng)物,真空除去溶劑,殘余物通過硅膠閃蒸柱色譜用己烷中的20%、40%和60%EtOAc作為洗脫劑純化,獲得60mg(33%)1-O-3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷白色固體。IR(CH2Cl2)1738,1731cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.81(s,1H),7.46-7.16(m,69H),6.27(d,J=8.2Hz,1H),6.05(t,J=9.7Hz,1H),5.81(t,J=9.1Hz,1H),5.69(t,J=9.6Hz,1H),5.15-4.88(m,24H),4.75(d,J=10.1Hz,1H),4.42-4.32(m,2H),2.27(s,3H),2.25(s,6H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ167.6,166.4,165.8,165.2,165.1,162.9,152.8,152.73,152.7,143.8,143.3,142.7,139.7,137.7,137.6,137.5,136.9,136.7,136.6,136.5,128.7,128.6,128.53,128.50,128.4,128.3,128.21,128.20,128.1,128.0,127.8,127.79,127.75,126.8,124.7,123.8,123.7,123.1,109.6,109.5,109.3,109.2,93.3,75.33,75.3,73.53,73.5,71.4,71.3,71.2,69.9,63.4,20.8,20.3;MS(+FAB)2147(MH+,25),C131H110O29計算C,73.25;H,5.13;實測C,72.84;H,5.34。
3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酸。將3-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酸(3.00g,11.5mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(4.34g,28.8mmol)在13mL DMF(溶解反應(yīng)物所需的最小體積)中的溶液用N,N′-二異丙基乙胺(6.0mL,35mmol)處理。將混濁的棕色溶液在室溫下攪拌18h,這時TLC表明起始原料徹底消失,并存在3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酸和3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷基(3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基)苯甲酸酯。反應(yīng)混合物用20mL 1M H3PO4處理并用200mL Et2O萃取。分離有機層并用水(10×50mL)洗滌,接著用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥并真空濃縮。殘余物通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%,接著用25%EtOAc洗脫純化,獲得1.53g標題化合物白色固體和3.61g 3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷基(3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基)苯甲酸酯黃色油。將甲硅烷基酯產(chǎn)物在60mL 1∶6∶2的HOAc∶THF∶水的溶液中在室溫下攪拌2.5h,這時TLC顯示只存在標題化合物。將反應(yīng)溶液用飽和碳酸氫鈉水溶液處理并萃取到EtOAc中。分離有機層并用水,然后用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑,接著用己烷研碎殘余物,進一步獲得2.52g 3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酸(在兩步內(nèi)獲得4.05g,71%)。IR(CH2Cl2)3504,1684cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.42-7.33(m,7H),5.05(s,2H),0.99(s,9H),0.90(s,9H),0.24(s,6H),0.07(s,6H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ171.9,151.2,147.7,136.2,128.6,128.4,128.2,116.3,107.8,70.9,26.1,25.8,19.0,18.6,-3.8,-4.1;MS(+FAB)488(MH+,52)。C26H40O5Si2計算C,63.93;H,8.19;實測C,64.17,H,8.00。
3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酰氯。將3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酸(1.50g,3.07mmol)在30mL CH2Cl2中的溶液用草酰氯(295μL,3.38mmol)處理,接著用催化量的DMF處理。在室溫下攪拌反應(yīng)物,并用TLC監(jiān)測。2h后,顯示原料消耗,真空除去溶劑,并且在高真空下干燥,獲得1.55g(100%)產(chǎn)物。IR(CH2Cl2)1742cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.44-7.34(m,7H),5.05(s,2H),0.99(s,9H),0.90(s,9H),0.26(s,6H),0.07(s,6H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ167.3,151.3,147.9,143.9,135.7,128.8,128.5,128.4,124.6,118.2,108.9,71.2,26.0,25.7,18.7,18.6,-4.0,-4.1;MS(+FAB)(MH+24),HRFABMS。C26H39O4Si2Cl計算507.2154;實測507.2126。
1-O-(3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲?;?-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷。將三乙胺(116μL,1.62mmol)加到2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?D-吡喃葡萄糖(1.00g,0.54mmol)和3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酰氯(0.33g,0.65mmol)在12mL無水CH2Cl2(乙醇0.05M)中的溶液中,將溶液在室溫下攪拌18h。用10mL 1M HCl處理反應(yīng)物,并用25mL EtOAc萃取。分離有機層,用水,然后用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥并真空濃縮。用己烷中的10%,接著用25%EtOAc作為洗脫劑將粗品混合物進行閃蒸柱色譜,獲得0.96g(76%)1-O-(3,4-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲酰基)-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷白色固體泡沫。IR(CH2Cl2)1732cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.48-7.13(m,75H),6.28(d,J=8.2Hz,1H),6.08(t,J=9.7Hz,1H),5.88(dd,J=9.9Hz,8.3Hz,1H),5.78(t,J=9.6Hz,1H),5.17-4.79(m,27H),4.43-4.38(m,2H),0.98(s,9H),0.87(s,9H),0.25(s,3H),0.20(s,3H),0.03(s,3H),0.02(s,3H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.6,165.5,164.9,164.7,164.4,152.5,152.4,152.3,151.1,147.7,143.1,143.0,142.9,142.5,142.2,137.4,137.3,137.2,136.7,136.3,135.9,128.7,128.5,128.4,128.35,128.32,128.24,128.21,128.1,128.06,128.03,127.96,127.90,127.81,127.7,127.5,127.4,124.5,123.8,123.7,123.66,123.6,120.0,116.1,109.3,109.1,107.8,92.7,75.1,75.0,73.5,73.1,71.1,71.0,70.9,70.8,69.8,63.2,26.0,25.7,18.5,18.4,-3.4,-3.5;C144H138O26Si計算C,73.90;H,5.90,實測C,73.91;H,5.94。
1-O-(2-芐氧基-4,5-二羥基苯甲?;?-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。通過用一般過程C,將1-O-(3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-5-芐氧基苯甲?;?2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(1.10g,0.47mmol)(在THF中的0.02M溶液)在45min內(nèi)脫甲硅烷基化,在通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%、25%,然后用50%EtOAc作為洗脫劑,獲得0.80g(80%)1-O-(3-芐氧基-4,5-二羥基苯甲?;?-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。IR(CDCl3)3534,1732cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.45-7.16(M,75H),6.24(d,J=8.1Hz,1H),6.04(t,J=9.6Hz,1H),5.96(bs,1H),5.83(dd,J=9.7,8.1Hz,1H),5.73(t,J=6Hz,1H),5.50(bs,1H),5.14-4.76(m,27H),4.43-4.34(m,2H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.6,165.5,165.0,164.9,164.3,152.59,152.57,152.47,145.7,143.7,143.3,143.2,143.1,142.6,138.1,137.5,137.3,136.4,136.3,135.6,128.7,128.6,128.5,128.45,128.40,128.3,128.2,128.1,128.09,128.06,127.9,127.8,127.5,124.6,123.8,123.7,123.6,119.9,111.9,109.4,109.3,109.2,106.7,92.9,75.1,75.08,73.4,73.37,73.3,71.4,71.34,71.3,71.22,71.2,71.1,69.9,63.2。C132H110O26計算C,75.07;H,5.21;實測C,74.88;H.5.22。
1-O-(3-芐氧基-1,2-二氧環(huán)己-3,5-二烯-5-苯甲?;?-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。向冷卻到-30℃的鄰氯醌(100mg,0.38mmol)在4mL無水Et2O(鄰氯醌0.1M)中的溶液中經(jīng)過加液漏斗在1.5內(nèi)滴加1-O-(2-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酰基)-2,3,4,6-四(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(0.80g,0.38mmol)在12mL無水Et2O(聯(lián)苯酚0.03M)中的溶液。加完后,將所得深紅色溶液在-30℃再攪拌3h,接著貯存在-20℃的冷藏箱中18h。過濾收集沉淀的紅色固體,用冷Et2O洗滌,并在真空泵上干燥,獲得0.53g(66%)紅色無定形粉末產(chǎn)品。IR(CDCl3)1730,1672cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.45-7.17(m,73H),6.79(d,J=1.4Hz,1H),6.47(s,1H),6.13(d,J=7.9Hz,1H),6.03(t,J=9.6Hz,1H),5.74(t,J=9.2Hz,2H),5.15-4.85(m,26H),4.79(d,J=9.5Hz,1H),4.41-4.32(m,2H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ179.6,173.8,165.6,165.5,164.9,164.8,162.8,152.6,152.5,152.4,143.3,143.2,140.1,137.4,137.3,136.6,136.3,136.2,134.2,128.8,128.6,128.5,128.49,128.42,128.3,128.2,128.14,128.10,127.99,127.92,127.88,127.85,127.83,127.76,127.5,125.6,124.4,123.4,123.3,109.4,109.3,109.2,106.8,93.8,75.1,73.5,72.9,71.2,71.18,71.12,71.0,69.3,62.8;MS(+FAB)2109(MH+,21)。C132H108O26計算C,75.14;H,5.12;實測C,74.75;H,5.29。
芐基化二聚體12。將鄰苯醌(100mg,0.047mmol)溶解在1.5mL(CDCl3)中,加入B(OAc)3(10mg,0.052mmol),將非均相混合物在62-65℃(油浴溫度)下加熱24小時,這時1H NMR分析顯示不存在鄰苯醌。冷卻反應(yīng)混合物并過濾。殘余物用CH2Cl2洗滌,蒸發(fā)濾液和洗滌液,獲得微紅棕色固體,該固體立即用在HOAc(2mL)∶THF(0.5mL)中的NaOAc(4mg,0.052mmol)溶液處理2h。將反應(yīng)混合物在EtOAc和水間分配。用鹽水洗滌EtOAc層,用硫酸鈉干燥并真空濃縮,獲得黃色殘余物。在-78℃用己烷中的10%,然后用50%EtOAc作為洗脫劑進行閃蒸柱色譜,獲得78mg黃色固體,該固體立即在0℃下用Na2S2O4(2mg,0.071mmol)在10mL 8∶2THF∶水中的溶液處理10min。深黃色反應(yīng)混合物在這段時間內(nèi)脫色成淺黃色溶液。將反應(yīng)混合物在EtOAc和水間分配,用鹽水洗滌有機層,用硫酸鈉干燥,并真空濃縮成白色固體,該固體在高真空下干燥。粗品白色固體(78mg,0.018mmol)用芐基氯(9μl,0.07mmol)、K2CO3(13mg,0.09mmol)和KI(92mg,0.01mmol)在5mL回流丙酮芐基化24h。冷卻反應(yīng)混合物,通過C鹽過濾,濾液真空濃縮成油,油通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%,然后用20%EtOAc作為洗脫劑,獲得46mg(4步后,44%)全芐基化二聚棓單寧。IR(CH2Cl2)1731cm-1;1HNMR(CDCl3,300MHz)δ7.64-7.05(m,163H),7.04(s,1H),6.23(d,J=8.1Hz,1H),6.08(m,2H),5.94(t,J=9.8Hz,1H),5.84(t,J=9.0Hz,1H),5.74(t,J=9.7Hz,1H),5.70-5.62(m,2H),5.15-4.70(m,59H),4.58-4.31(m,5H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ169.0,165.62,165.6,165.0,164.9,164.7,164.2,152.6,152.54,152.5,143.3,143.21,143.2,143.1,142.7,137.5,137.4,136.7,136.5,136.4,136.3,128.51,128.5,128.42,128.4,128.3,128.2,128.1,128.0,127.9,127.8,127.61,127.6,127.5,124.6,123.7,123.6,123.3,19.5,109.41,109.4,109.2,93.0,92.2,75.1,73.5,73.3,73.2,71.4,71.3,71.2,71.1,71.0,69.8,69.7,63.1;MS(+FAB)4493(MH+,35)。C285H236O52計算C,76.20;H,5.26;實測C,76.07;H.5.52。
苯酚二聚物。將二聚物(32mg,0.007mmol)和在C上的10%Pd(6mg,20%(重量))在2.5mL無水THF中的溶液在室溫下在1atm氫氣壓下攪拌20h,用氬氣吹幾次。通過C鹽過濾兩次,并減壓濃縮。所得棕灰色殘余物用Et2O、己烷,然后用苯研磨,獲得6mg(50%)的脫芐基化的二聚棓單寧淺灰色固體。1H NMR(丙酮-d6,300MHz)δ7.42-6.93(m,18H),6.78(s,1H),6.32(d,J=8.3Hz,1H),6.18(d,J=8.3Hz,1H),6.09-5.87(m,2H),5.69-5.39(m,4H),4.56-4.25(m,6H);13C NMR(丙酮-d6,90MHz)δ169.4,166.4,165.9,165.8,165.6,165.5,164.9,146.0,145.8,139.3,139.1,129.3,129.2,128.5,121.5,120.7,120.6,120.0,110.4,110.3,110.1,93.4,92.9,74.0,73.3,71.8,69.3,69.2,66.9,62.8;MS(+FAB)1879(MH+,22),1901(M+Na+,36),HRFABMS。C82H62O52計算1878.2207;實測1878.2190;C82H62O52Na計算1901.2105;實測1901.2085。
2-硝基芐基4,6-O-亞芐基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。通過用一般過程A,將2-硝基芐基-4,6-O-亞芐基-β-D-吡喃葡糖苷(5.20g,12.9mmol)和3,4,5-三芐氧基苯甲酸(11.4g,25.8mmol)偶聯(lián),獲得12.6g(78%)2-硝基芐基-4,6-O-亞芐基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷白色固體泡沫,接著通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%,接著用20%EtOAc作為洗脫劑。IR(CDCl3)1728cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.06-8.03(m,1H),7.67-7.64(m,1H),7.44-7.17(m,41H),5.78(t,J=9.5Hz,1H),5.60-5.55(m,2H),5.33(d,J=15.4Hz,1H),5.12-4.99(m,13H),4.94(d,J=7.8Hz,1H),4.49(dd,J=10.3Hz,4.6Hz,1H),3.99-3.87(m,2H),3.77(dd,J=9.4Hz,4.7Hz,2H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.2,164.9,152.5,152.4,146.6,142.8,142.7,137.3,136.6,136.5,136.4,133.8,133.7,129.1,128.4,128.3,128.2,128.1,128.06,128.0,127.9,127.8,127.5,127.4,126.1,124.3,124.0,109.3,109.2,101.5,101.3,78.7,75.1,72.1,72.2,71.2,68.5,68.1,66.8;MS(+FAB)1248(MH+,22),C76H65NO16計算C,73.13;H,5.21;N,1.12;實測C,73.11;H,5.17;N,0.92。
2-硝基芐基2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷。將2-硝基芐基4,6-O-亞芐基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(1.4g,1.1mmol)和碘(0.28g,1.1mmol)在17mL無水CH3OH和17mL無水CH2Cl2中的溶液在氬氣氛下加熱回流48h。溶液冷卻到室溫。用飽和Na2S2O3處理,并用EtOAc萃取。分離有機層,用水洗滌,然后用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥并真空濃縮。通過閃蒸柱色譜用苯中的30%,然后用50%EtOAc作為洗脫劑,獲得1.10g(84%)2-硝基芐基2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷白色固體泡沫。IR(CH2Cl2)1726cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.04-8.01(m,1H),7.64-7.60(m,1H),7.43-7.17(m,36H),5.53(dd,J=9.7Hz,8.0Hz,1H),5.33-5.27(m,2H),5.13-4.83(m,13H),4.96(d,J=8.0Hz,1H),4.91-4.84(m,1H),4.04-3.93(m,3H),3.64-3.60(m,1H),3.56(bs,1H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ167.5,165.1,152.6,146.8,137.3,136.4,133.8,133.7,128.52,128.5,128.44,128.4,128.14,128.1,127.99,127.91,127.6,127.53,127.5,124.7,124.0,123.5,109.3,109.2,100.7,78.1,75.1,71.6,71.2,71.1,71.0,69.9,68.1,62.1;MS(+FAB)1159(M+,18)。C69H61NO16計算C,71.44;H,5.26;N,1.21;實測C,71.30;H,5.45;N,1.18。
2-硝基芐基4,6-二(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-4,5-二苯基甲基亞甲基二氧芐氧基)-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。通過用一般過程B,將2-硝基芐基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(2.10g,1.81mmol)與3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-4,5-二苯基亞甲基二氧苯甲酸(1.62g,3.62mmol)偶聯(lián),獲得2.99g(80%)2-硝基芐基4,6-二(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-4,5-二苯基亞甲基二氧苯甲?;?-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷白色固體泡沫,接著用己烷中的10%,然后用20%EtOAc作為洗脫劑進行閃蒸柱色譜。IR(CH2Cl2)1729cm-1;1H NMR(CDCl3,75MHz)δ8.05(d,J=1.3Hz,1H),7.98(d,J=4Hz,1H),7.70-7.15(m,60H),5.84(t,J=9.7Hz,1H),5.67-5.56(m,2H),5.31(d,J=15.2Hz,2H),5.13-4.89(m,14H),4.64,(d,J=10.6Hz,1H),4.38-4.32(m,1H),4.15-4.12(m,1H),0.99(s,9H),0.96(s,9H)0.19(s,6H),0.18(s,6H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.6,165.3,1649,1644,152.5,148.6,146.8,142.8,142.0,141.7,139.9,139.6,138.6,l37.4,136.5,133.7,129.2,128.9,128.4,128.3,128.1,128.0,127.6,127.5,126.2,124.6,124.2,124.0,123.5,122.5,119.1,118.8,118.2,109.3,109.1,104.1,100.1,75.1,75.0,73.3,72.8,72.3,71.2,71.1,68.9,68.3,62.5,26.05,26.04,18.3,18.2,-4.0;MS(+FAB)2020(MH+,23)。C121H113NO24Si2計算C,71.92;H,5.59;N,0.69;實測C,72.16;H,5.80;N,0.58。
2-硝基芐基4,6-二(3,4-二苯基亞甲基二氧-5-羥基苯甲?;?-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷。通過用一般過程C,將2-硝基芐基4,6-二(3-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-4,5-二苯基亞甲基二氧-苯甲?;?2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(2.64g,1.31mmol)(THF中的0.05M溶液)在35min內(nèi)脫甲硅烷基化,獲得1.80g(77%)2-硝基芐基4,6-二(3,4-二苯基亞甲基二氧-5-羥基苯甲酰基)-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷,接著己烷中的10%,然后用40%EtOAc作為洗脫劑進行閃蒸柱色譜。IR(CH2Cl2)3554,1729cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.05-8.02(m,1H),7.68(d,J=7.8Hz,1H),7.68-7.08(m,60H),6.26(bs,1H),5.83(t,J=9.6Hz,1H),5.63-5.52(m,2H),5.42(d,J=15.8Hz,1H),5.14-4.87(m,14H),4.62(d,J=12.1Hz,4H),4.31-4.25(m,1H),4.11-4.06(m,1H);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.6,165.4,164.9,164.5,152.5,148.5,148.3,146.3,142.8,139.6,139.2,138.,138.7,138.6,137.4,137.3,135.5,134.4,134.2,129.4,129.3,128.5,128.4,128.35,128.31,128.3,128.2,128.1,127.99,127.90,127.8,127.6,127.5,126.3,126.2,124.8,124.1,123.7,123.6,122.7,118.9,118.7,114.4,113.6,109.3,109.2,103.6,100.7,75.1,73.2,72.7,72.3,71.2,71.1,69.5,67.7,63.2;MS(+FAB)1792(MH+,40)。C109H85NO24C,73.03;H,4.75;N,0.78;實測C,73.23;H,4.88;N,0.55。
2-硝基芐基4,6-(3,4-二苯基亞甲基二氧-5-羥基-3′,4′-二苯基亞甲基二氧-5′羥基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷的區(qū)域異構(gòu)體混合物。將Pb(OAC)4(0.49g,1.10mmol)在5mL無水CH2Cl2中的溶液在30min內(nèi)滴加到冷卻的(-30℃)2-硝基芐基4,6-二(3,4-二苯基亞甲基二氧-5-羥基苯甲?;?-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(1.80g,1.0mmol)和吡啶(326μL,4.0mmol)在180mL無水CH2Cl2(雙酚0.005M)中的脫氧溶液中。將深橙色溶液在-30℃下再攪拌1h,用100mL飽和的NaHCO3水溶液處理,并用250mL EtOAc萃取。用75mL 1M H3PO4,然后用鹽水洗滌有機層,用硫酸鈉干燥。真空濃縮,接著將所得黃色殘余物通過硅膠色譜用己烷中的10%、20%,然后用35%EtOAc作為洗脫劑純化,獲得1.21g(67%)三種區(qū)域異構(gòu)體的混合物黃色固體。IR(CH2Cl2)1747.1731cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.05-8.02(m,1H),7.98-7.00(m,57H),6.79-6.71(M,2H),5.66-5.56(m,2H),5.48-5.29(m,2H),5.18-4.79(m,15H),4.14-3.90(m,2H);MS(+FAB)1790(MH+,80)。C109H83NO24計算C,73.11;H,4.64;N,0.78;實測C,72.89;H,4.88;N,0.67。
2-硝基芐基4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。將2-硝基芐基4,6-(3,4-二苯基亞甲基二氧-5-羥基-3′,4′-二苯基亞甲基二氧-5′-羥基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(1.30g,0.73mmol)在75mL 80%HOAc中回流16h。除去溶劑,獲得油,用己烷研磨,獲得1.10g粗品2-硝基芐基4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六羥基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷黃色固體。將粗品六羥基化合物(1.10g,0.75mmol)和氫化鈉(0.22g,9.03mmol)(油中的60%懸浮液)在0℃下在10mL無水THF中攪拌10min。加入芐基溴(0.81mL,6.8mmol),然后加入碘化四正丁銨(TBAI)(0.25g,0.68mmol)之后,使所得混濁的棕色懸浮液在30分鐘內(nèi)暖至室溫,在室溫下進一步攪拌18h。用水稀釋反應(yīng)物,并用Et2O萃取。分離有機層,用水,然后用鹽水洗滌,用硫酸鈉干燥,并濃縮成黃色油。殘余物通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%、20%,然后用30%EtOAc作為洗脫劑純化,獲得0.75g(50%)2-硝基芐基4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷白色固體泡沫。IR(CH2Cl2)1728cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.08-8.05(m,1H),7.70-7.67,(m,1H),7.49-6.85(m,68H),5.73-5.61(m,2H),5.47-5.34(m,2H),5.23-4.73(m,27H),4.22-4.17(m,1H),4.11(d,J=13.2Hz,1H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ167.4,166.7,165.9,164.9,152.7,152.6,152.5,152.3,152.2,146.8,144.7,144.5,143.1,137.7,137.6,137.5,137.4,16.5,136.4,133.9,133.7,128.7,128.,128.5,128.46,128.39,128.36,128.33,128.26,128.22,128.1,128.02,128.01,127.9,127.87,127.84,127.7,127.6,127.56,127.50,127.4,127.3,127.2,126.7,124.6,124.1,123.9,123.6,123.4,109.5,108.0,107.9,101.3,75.4,75.1,75.0,74.9,73.4,72.4,71.9,71.3,71.2,71.1,70.3,68.1,67.9,63.1;MS(+FAB)2002(MH+,56);C125H103NO24計算C,74.96;H,5.15;N,0.69;實測C,74.73;H,5.17;N,0.64。
4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-α-D-吡喃葡萄糖。將2-硝基芐基4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷(100mg,0.05mmol)溶解在6mL THF、6mL EtOH和1mL蒸餾水中,在懸掛在Rayonet光化學裝置中的Pyrex管內(nèi)于350nm下照射7.5h。真空除去溶劑,獲得油,用己烷中的10%,然后用20%EtOAc作為洗脫劑進行閃蒸柱色譜,獲得62mg(66%)4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三(芐氧基)苯甲?;?-D-吡喃葡萄糖白色固體(α,β端基異構(gòu)體的混合物)。該產(chǎn)品樣品(25mg)通過制備薄層色譜用苯中的5%EtOAc作為洗脫劑進行進一步純化,獲得15mg產(chǎn)品。IR(CH2Cl2)3512,1725cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.47-6.83(m,66H),6.05(t,J=10.1Hz,1H),5.72(d,J=3.7Hz,1H),5.40-4.69(m,28H),3.94(d,J=12.9Hz,1H),3.37(bs,1H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ167.7,167.0,165.9,165.3,152.64,152.6,152.54,152.52,152.3,152.2,144.7,144.3,142.9,142.8,137.7,137.6,137.5,137.4,137.3,136.5,136.42,136.4,136.31,136.3,128.8,128.5,128.4,128.4,128.32,128.3,128.2,128.1,128.0,127.97,127.91,127.88,127.83,127.7,127.6,127.56,127.53,127.3,127.6,127.56,127.53,127.3,124.1,123.9,123.7,123.4,109.3,108.0,107.8,90.7,75.5,75.4,75.1,75.0,74.8,73.1,71.2,71.1,71.0,70.9,70.4,67.0,63.5。MS(+FAB)1867(MH+,16);HRMS C118H98O22計算1866.6549;實測1866.6528。
4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-1,2,3-三(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷。將4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-2,3-二(3,4,5-三芐氧基苯甲酰基)-D-吡喃葡萄糖(100mg,0.05mmol)在5mL苯中的溶液加入到含有3,4,5-三芐氧基苯甲酰氯(30mg,0.06mmol)和三乙胺(22μL,0.15mmol)在2mL苯中的溶液的燒瓶中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌18h。溶液接著用5mL冰冷的1M HCl處理,并用15mL EtOAc萃取。用水,然后用鹽水洗滌有機層,并用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑,獲得白色固體,該固體通過閃蒸柱色譜用己烷中的10%EtOAc,然后用25%EtOAc作為洗脫劑純化,獲得50mg(41%)4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-1,2,3-三(3,4,5-三芐氧基)苯甲酰基-β-D-吡喃葡糖苷白色固體。IR(CDCl3)1735cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.50-6.84(m,83H),6.10(d,J=7.6Hz,1H),5.82(m,2H),5.51(t,J=9.7Hz,1H),5.42(dd,J=6.4,13.3Hz),5.21-4.72(m,30H),4.38(dd,J=6.0,9.9Hz,1H),4.10(d,J=12.9Hz,1H);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ167.4,166.8,165.7,164.8,164.2,152.7,152.61,152.6,152.5,152.3,152.2,144.8,144.4,143.3,143.2,143.1,137.64,137.6,137.5,137.34,137.31,137.3,136.44,136.4,136.3,128.6,128.42,128.4,128.38,128.3,128.22,128.2,128.03,128.0,127.97,127.91,127.9,127.7,127.6,127.5,127.3,123.8,123.6,123.4,123.2,109.5,109.4,109.3,107.91,107.9,93.1,75.5,75.4,75.1,75.0,74.8,73.1,72.7,71.6,71.2,70.1,63.0;MS(+FAB)2288(M+,20),C146H120O26計算C,76.57;H,5.24;實測C,76.38,H,5.40。
Tellimagrandin II。將4,6-(3,4,5,3′,4′,5′-六芐氧基)二苯酚基-1,2,3-三(3,4,5-三(芐氧基)苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷(26mg,0.01mmol)和10%Pd/C(5mg,起始原料的20%(重量))在1.5mL THF中的溶液用氫氣吹六次,在室溫下氫氣氛下攪拌18h。反應(yīng)混合物接著用氬氣吹兩次,并通過C鹽過濾兩次。將濾液濃縮成深棕色固體,該固體用己烷和乙酸乙酯研磨幾次并干燥,獲得3mg(30%)tellimagrandin II灰色固體。1H NMR(丙酮-d6,200MHz)δ7.11(s,2H),6.99(s,2H),6.96(s,2H),6.65(s,1H),6.45(s,1H),6.20(d,J=8.3Hz,1H),5.84(t,J=9.7Hz,1H),5.59(t,J=8.9Hz,1H),5.37(dd,J=6.4,13.4Hz,1H),5.21(t,J=10Hz,1H),4.54(dd,J=5.9,9.9Hz,1H),3.88(d,J=14Hz,1H);13C NMR(丙酮-d6,90MHz)δ168.0,167.6,166.2,165.4,165.0,146.1,145.9,145.8,145.3,144.5,139.8,139.3,139.1,136.6,126.6,126.0,120.6,120.5,119.9,115.5,110.4,110.2,110.1,108.3,107.9,93.7,73.2,73.1,71.7,70.7,63.1;MS(+FAB)938(M+,56),937(M-1,95);CD(MeOH)235nm.+31.7,261nm,-7.5,281.5nm,+7.7;HRMS C41H29O26計算937.0947;實測937.0943。
實施例2暴露于二聚棓單寧和鞣花單寧后hPBMC′s的TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生agrimoniin和coriariin A的可靠樣品由Yoshida教授(OkayamaUniversity,日本)提供。二聚棓單寧(coriariin A的類似物)和β-D-PGG如所述合成。LPS(大腸桿菌(E.coli)055:B5苯酚提取物,MW范圍50-100KD)。Ficoll-Histopaque(ρ=1.077g/mL)、無菌、雜交瘤檢測的胎牛血清(FCS)、慶大霉素10mg/M1、L-谷氨酰胺,200mM.DextranB-512Leuconostoc平均分子量(Av M.W.)580000和錐蟲藍(TrypanBlue)染液購自Sigma。具有酚紅的Hanks緩沖鹽溶液1X,mediatech(HBSS)和RPMI 1640 1X,mediatech購自Fisher Scientific。人IL-1β和TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自R and D System,Minneapolis,MN。新鮮肝素化血得自健康人受試者(20-34歲)。
劑量-反應(yīng)數(shù)據(jù)一般過程。通過報道的過程分離H-PBMC′s(10.18)。計數(shù)細胞并提供錐蟲藍排除確定活力(通常,活力超過95%)。將在0.5mL孔中的細胞濃度通過用期望量的RPMI稀釋調(diào)節(jié)為1×106細胞/孔。
將適宜量的在HBSS中的單寧(或LPS)貯備液加入各孔,提供附圖中報道的濃度值。每個濃度值測定三次,進行空白測定確保(細菌)污染不使試驗復(fù)雜化。將培養(yǎng)平板在5%CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)所指明的時間。在該時間間隔的終點,從各孔收集450μL培養(yǎng)上清液,在25℃,400g下離心10min,停止后,貯存在-78℃以進行細胞因子的ELISA分析。ELISA測定用標準校正曲線根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行,以從觀察到的吸光度計算細胞因子濃度。報道的細胞因子值是三次測定的平均值±SE。
結(jié)果本發(fā)明的二聚抗腫瘤鞣花單寧coriariin A和agrimoniin、單體棓單寧β-D-五棓?;咸烟?β-D-PGG)和二聚棓單寧在本研究中都得到測定。二聚棓單寧是coriariin A的類似物,它除了在O(4)和O(6)上的棓酰基環(huán)未以六羥基二苯酚基(HHDP)鍵連接外,與母體鞣花單寧相同。h-PBMC′s進行研究的化合物一起培養(yǎng)所指明的時間,并且用可商購的ELISA試劑盒獨立地測定存在于培養(yǎng)上清液中的IL-1β和TNF-α的量。在各例中,將LPS用作陽性對照,而未處理的細胞用作陰性對照。
天然產(chǎn)物的初步試驗在Miyamoto描述的條件下進行,用28μMagrimoniin處理4小時后,h-PBMC′s分泌高于空白約1ng/mL的1L-1β(圖1),與以前報道的結(jié)果類似(在20nM agrimoniin下約1.2ng/mL)。用這些相同的試驗條件,以方便與Hokuriku University以前的研究進行比較,coriariin A也顯示顯著的1L-1β誘導(dǎo)能力,基于摩爾可能是agrimoniin的兩倍(圖1)。使用定性L929鼠成纖維細胞溶解測定(19,20),用coriariin A與agrimoniin進行的附加檢測試驗(scouting experiment)顯示,這些二聚鞣花單寧也促進顯著量的TNF-α釋放。h-PBMC上清液中TNF-α水平的間接測定提供第一證據(jù),其暗示在單寧介導(dǎo)的抗腫瘤活性中的這種細胞因子,促進對agrimoniin和下述相關(guān)物種的TNF-α釋放能力的定量評價。
agrimoniin介導(dǎo)的h-PBMC′s的IL-1β分泌的時程由Miyamoto描繪。處理4h后這種細胞因子的顯著釋放明顯,在約24h時達到最大分泌。相反,在用β-D-PGG或二聚棓單寧處理后,本研究中所用的h-PBMC′s的IL-1β釋放和TNF-α釋放的動力學可測定地遵從于不同的圖形(圖2和3)。在所有情況下,細胞因子流出的最大值在約24h觀察到(類似于Miyamoto的系統(tǒng)),但是在較早的4h時,只檢測到痕量的細胞因子。然而,這些數(shù)據(jù)清楚地證明,二聚棓單寧和β-D-PGG在很大程度上有效刺激h-PBMC′s的IL-1β產(chǎn)生。相比而言,在這些特定濃度值上,二聚體結(jié)構(gòu)似乎比低級類似物在引起TNF-α釋放方面更有效。這些令人激動的觀察結(jié)果提示更詳細的多酚結(jié)構(gòu)的劑量-反應(yīng)圖形的研究。不幸的是,天然產(chǎn)物agrimoniin的有限供應(yīng)防礙了其TNF-α反應(yīng)的測定。
將來自兩個不同受試者的h-PBMC′s用于獨立的試驗,以獲得在24h暴露時,單體物種及其相應(yīng)的二聚體的1L-1β和TNF-α劑量-反應(yīng)曲線。圖4-7。coriariin A和LPS的數(shù)據(jù)包括在這些圖中,以進行比較。圖4和5闡明β-D-五棓?;咸烟窃谌魏问茉囌咧姓T導(dǎo)1L-1β分泌的能力與coriariin A相似。另外,這些圖顯示棓單寧-鞣花單寧雜交物,β-D-PGG的O-1-棓?;悸?lián)的二聚體也具有相似的性質(zhì)??傊?,這些結(jié)果不支持以下主張這些多酚化合物必須符合嚴格分子識別標準以引起IL-1β釋放。由于Miyamoto的小鼠研究事實上鑒別了單寧抗腫瘤活性所需的良好限定的結(jié)構(gòu)(即,壽命增加coriariin A(238%),β-D-PGG(82%)消退者coriariin A(3/6),β-D-PGG(0/6)),因此整個動物抗腫瘤反應(yīng)中IL-1β的作用值得懷疑。
然而,TNF-α釋放數(shù)據(jù)(圖6和7)顯示不同的結(jié)果。β-D-PGG在濃度相當時在任何受試者中均比二聚體或coriariin A更少促進TNF-α流出。另外,類似物的劑量-反應(yīng)圖形至少在較低濃度范圍內(nèi)與coriariin A的相似。這些數(shù)據(jù)表明,單體和二聚單寧物種間通過在h-PBMC′s內(nèi)在TNF-α誘導(dǎo)途徑中一些識別元素而存在基于結(jié)構(gòu)的差異。TNF-α引發(fā)能力的該區(qū)別平行于在小鼠/肉瘤-180系統(tǒng)中的抗腫瘤性質(zhì)的總趨勢。而且在不同物種IL-1β分泌圖形的相似性可能剛好是第一次形成的TNF-α的增量調(diào)節(jié)IL-1β的產(chǎn)生的能力的結(jié)果。
總之,與單體化合物β-PGG相比,二聚單寧coriariin A和coriariinA類似物誘導(dǎo)h-PBMC′s的高水平TNF-α分泌的能力得到證明。這一觀察結(jié)果與早期體內(nèi)研究一致,其中二聚單寧與單體單寧相比顯示更好的抗腫瘤活性。這些試驗結(jié)果表明,與單寧一起培養(yǎng)的h-PBMC′s產(chǎn)生TNF-α的程度與單寧的抗腫瘤功效相關(guān)。二聚棓單寧的活性與相關(guān)的鞣花單寧coriariin A的活性不同,為將這種結(jié)構(gòu)簡單、容易合成的物種用作基于單寧的化療藥的開發(fā)中的先導(dǎo)物提供可能性。
實施例3單寧酸起作用的生物途徑進行了研究單寧酸是否通過LPS受體系統(tǒng)調(diào)節(jié)免疫功能的試驗。具體地說,單寧酸是否與LBP/CD14和Tlr4相互作用而誘導(dǎo)細胞因子分泌?為了測試該問題,使用在低于100ng/mL的水平下對LPS無反應(yīng)的小鼠品系C3H/HeJ。這些小鼠在它們的Tlr4蛋白的編碼區(qū)具有脯氨酸對組氨酸的點突變,據(jù)信Tlr4蛋白抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
為了證明C3H/HeJ小鼠對LPS無反應(yīng),將來自C3H/HeJ小鼠和對LPS有反應(yīng)的對照組小鼠(C3H/HeOuJ)的腹膜溢泌物細胞(PEC′s)用低劑量LPS處理,通過標準ELISA測定TNF-α分泌。這些結(jié)果證明HeJ小鼠事實上對LPS無反應(yīng)(未觀察到TNF-α分泌),而OuJ小鼠顯示常規(guī)LPS劑量反應(yīng)曲線(圖8)。接著測試Coriariin A類似物。已證明該化合物誘導(dǎo)h-PBMC′s的TNF-α分泌,其劑量反應(yīng)曲線類似于LPS。發(fā)現(xiàn)HeJ小鼠也對coriariin A類似物無反應(yīng),而OuJ小鼠相對于它們的LPS響應(yīng)顯示低反應(yīng)(圖9)。這些初步結(jié)果表明單寧通過與LPS所用的相同的Tlr4-介導(dǎo)的途徑起作用。
實施例4用β-PGG進行的體內(nèi)研究本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)棓單寧β-PGG能夠抑制h-PBMC′s的LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌。與Hershey Medical School的Charles Lang博士合作研究了β-PGG在體內(nèi)的能力。在該試驗中,使用兩組大鼠。一組靜脈給予1mg/kg LPS和25mg β-PGG。第二組僅給予1mg/kg LPS。與僅給予LPS的大鼠相比,大多數(shù)給予β-PGG的大鼠表現(xiàn)降低的TNF-α分泌水平(圖10)。這些初步體內(nèi)結(jié)果令人鼓舞,然而將β-PGG用作抑制劑的幾個問題是明顯的。需要大量β-PGG以引發(fā)抑制,因為β-PGG是小單體棓單寧,它能夠與其他血蛋白如大鼠血清白蛋白相互作用。另外,即使用β-PGG處理的大鼠顯示低水平TNF-α分泌,但仍觀察到低血壓形式的敗血癥性休克。該生理作用可能歸因于已證明介導(dǎo)敗血癥性休克的細胞因子IL-1β的分泌。β-PGG引起h-PBMC′s的高水平IL-1β分泌。
實施例5二聚棓單寧類似物的合成下一目的是合成更大的棓單寧,它們在生物相互作用方面比單體棓單寧β-PGG更具選擇性。因此,制備了一系列二聚棓單寧類似物,以確定連接兩個糖核的連接單元的改變對生物活性的影響。以不同原因選擇連接(即更剛性),但是與活性coriariin A類似物相比,所有連接都改變糖核間的距離。具有連接17、18和19的類似物(如上所述)是比coriariin A類似物中存在的二芳基醚鍵更剛性的連接。類似物允許更大的柔韌性,21測試芳環(huán)苯氧基化的必要性。
這些化合物的合成涉及適宜的雙酰氯和醇的直接偶聯(lián),接著是芐基醚氫化,獲得終產(chǎn)物17c-21c。提供17b、18b和21b的偶聯(lián)以對β,β′端基異構(gòu)體的高非對映異構(gòu)選擇性進行。19b的合成需要比其他類似物更高的溫度。該類似物以4∶1的β,β′∶α,α′端基異構(gòu)立體化學的比率獲得,該比例由1H NMR確定。與β,β′端基異構(gòu)體的H(1)(6.02ppm,J=9.8Hz)相比,α,α′端基異構(gòu)體的H(1)質(zhì)子出現(xiàn)在更低磁場(6.88ppm),并具有更小的偶合常數(shù)(J=3.2Hz)。20b的合成總是導(dǎo)致β,β′、α,α′和α,β′端基異構(gòu)體的混合物。然而,20a的緩慢加入醇22主要獲得β,β′異構(gòu)體。α端基異構(gòu)體的H(1)質(zhì)子出現(xiàn)在6.69ppm,偶合常數(shù)為4.15Hz。
酰氯19a和20a不可商購,但容易合成。例如,19a通過用草酰氯和催化DMF將雙酸23轉(zhuǎn)化成酰氯而制備(路線8)。化合物21a通過三個步驟制備。二芳基醚酯通過Ullmann偶聯(lián)制備。水解導(dǎo)致雙酸生成,雙酸通過草酰氯和催化DMF轉(zhuǎn)化成酰氯。
實施例6二聚棓單寧類似物的生物活性四項研究測定類似物17c-21c對h-PBMC′s的細胞因子釋放的影響。所有測定都伴隨適宜的對照空白(陰性)和LPS(陽性)。
在第一項研究中,在各化合物17c-21c的存在下測定h-PBMC′的TNF-α分泌的誘導(dǎo)。將h-PBMC′s和各化合物一起培養(yǎng)24小時。通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)測定細胞培養(yǎng)上清液中的TNF-α水平。各測定的數(shù)據(jù)點代表三次測定的平均值。只有含二芳基醚的物種21c誘導(dǎo)h-PBMC′s的顯著量的TNF-α分泌,這對有效的LPS拮抗劑而言是不期望的特性(參見圖11)。
在第二項研究中,化合物17c-20c抑制h-PBMC′s的LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生的能力用四項試驗進行研究。第一項試驗是動力學試驗,其中將h-PBMC′s先與固定濃度的LPS(5μg/mL)一起培養(yǎng)45分鐘。培養(yǎng)后,加入固定濃度的(10μg/mL)化合物17c-20c。在不同時間間隔收集細胞。動力學分析顯示這些化合物能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌。最佳時間通過在各時間點比較單獨由LPS分泌的TNF-α的量和由LPS和底物分泌的TNF-α的量而確定。發(fā)現(xiàn)總抑制在8小時時最大(圖12)。
第二項試驗確定抑制所需底物的最小量。將LPS(10μg/mL)和h-PBMC′s一起培養(yǎng)45分鐘,接著加入不同濃度的17c-20c。8小時后收集細胞培養(yǎng)上清液。使用來自不同受試者的細胞的固有可變性,或者試驗日期的可變性使得難以比較抑制劑的總體有效性。因此,為了更易于確定給定化合物的最大抑制發(fā)生的濃度,通過計算最大分泌值的百分比(單獨基于LPS)將TNF-α分泌歸一化(圖13)。發(fā)現(xiàn)抑制是劑量依賴性的。各底物的抑制最佳濃度不同,但總體劑量反應(yīng)趨勢相同。總的來說,18c和20c的最大抑制為45%,19c為25%。
第三項試驗用更低劑量的LPS(5μg/mL)研究17c、18c和20c抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌的能力(圖14)。同樣,反應(yīng)是劑量依賴性的。17c和20c的最大抑制是45%,18c是35%。這些結(jié)果與圖13中所示的結(jié)果相似,表明兩種LPS劑量可能已經(jīng)將受體飽和。
在第四項試驗中將不同濃度的底物17c-20c和LPS同時加入,以確定加入序列對抑制TNF-α分泌的影響(圖15)。加入時間似乎使總劑量反應(yīng)趨勢不同。然而最大抑制與加入LPS后45分鐘加入化合物的情況相同(各化合物約40%)。
在第三項研究中,測定化合物17c-20c誘導(dǎo)h-PBMC′s的IL-1β分泌的能力(圖16)。如引言中所述,細胞因子IL-1β也在LPS刺激的敗血癥性休克反應(yīng)中釋放。幾乎不或根本不引起IL-1β分泌的化合物將是有效治療敗血癥性休克的最佳化合物,因為它們本身很少可能誘導(dǎo)敗血癥性休克反應(yīng)。選擇用于進一步研究的化合物是19c和20c,因為它們誘導(dǎo)最低量的IL-1β產(chǎn)生。
最后,在最末一項研究中,再次測試類似物19c和20c抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌(圖17)。在該試驗中,使用更低劑量的LPS,以確定當存在更低劑量的LPS時抑制是否更顯著。LPS加入45分鐘后加入底物,8小時后收集細胞。當使用更少量的LPS時,底物似乎并不是更好的抑制劑,再次可能反映在該劑量下受體被LPS飽和。
結(jié)論初步試驗提示,鞣花單寧可能通過與LPS相同的生物途徑起作用,至少在利用Tlr4受體方面是這樣,但是進一步研究得到保證。已證明棓單寧β-PGG抑制大鼠中LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌。然而,要看到抑制作用,需要大量的該化合物,并且在所有情況下都觀察到敗血癥性休克反應(yīng)。高水平的誘導(dǎo)的IL-1β可能是該觀察結(jié)果的原因。合成了二聚單寧類似物17c-21c作為有效的LPS拮抗劑。化合物17c-20c幾乎不引起或不引起h-PBMC′s的TNF-α分泌,它們能抑制h-PBMC′s中LPS誘導(dǎo)的TNF-α水平?;衔?9c-20c是最有希望的拮抗劑,它們幾乎不引起細胞因子IL-1β分泌。這些化合物將需要進一步的體內(nèi)研究,以確定它們是否是膿毒癥/敗血癥性休克治療藥的開發(fā)中的備選物質(zhì)。
合成化學在300或360MHz(1H)分光計上記錄核磁共振譜(1H NMR,13CNMR)。在硝基芐基醇(NBA)基質(zhì)中獲得低分辨快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)。高分辨快原子轟擊質(zhì)譜在Austin的University of Texas中進行。元素分析由Midwest Microlab,Indianapolis,IN進行。閃蒸柱色譜用32-63μm硅膠和所指明的溶劑進行。醚和四氫呋喃通過在氬氣氛下從鈉/二苯酮蒸餾而純化。苯、二氯甲烷和甲醇在氬氣氛下從CaH2蒸餾。三乙胺從CaH2蒸餾并貯存在4分子篩上。濕度敏感反應(yīng)在氬氣氛下在預(yù)干燥的玻璃器皿中進行。
3-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酸甲酯。向3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(10.0g,54.3mmol)和大孔樹脂(0.2g)在40mL苯中的溶液中加入原甲酸三甲酯(32mL,270mmol)。將反應(yīng)混合物在氬氣氛下加熱回流18h。接著趁熱過濾反應(yīng)混合物,并真空濃縮濾液。向所得油中加入20mL丙酮、芐基溴(38.7mL,326mmol)和碳酸鉀(烘干的,22.4g,163mmol)。將反應(yīng)混合物在氬氣氛下加熱回流20h。冷卻混合物,用三乙胺(37.3mL,272mmol)處理,并用EtOAc萃取。有機層依次用10%H2SO4、H2O和鹽水洗滌,并用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑。向剩余的油中加入20mL MeOH和TsOHH2O(100mg,0.5mmol)。將該溶液在室溫下在氬氣氛下攪拌20h。冷卻反應(yīng)混合物,真空濃縮并用EtOAc萃取。有機層依次用NaHCO3、H2O和鹽水洗滌,并用硫酸鈉干燥。過濾并濃縮后,產(chǎn)物通過閃蒸柱色譜用己烷中的25%EtOAc作為洗脫劑而純化,獲得10g(71%)3-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酸甲酯。
3,4,5-三芐氧基苯甲酸甲酯。將芐基溴(10.6mL,89.7mmol)加入3,4,5-三羥基苯甲酸甲酯(5.0g,27mmol)和碳酸鉀(烘干的,12.4g,89.7mmol)在250mL丙酮中的溶液。將該溶液在氬氣氛下加熱回流24h。冷卻反應(yīng)混合物,用三乙胺(7.6mL,54mmol)處理,并用EtOAc萃取。有機層依次用10%H2SO4、H2O和鹽水洗滌,并用硫酸鈉干燥。過濾并濃縮后,收集到11.8g(96%)3,4,5-三芐氧基苯甲酸甲酯乳白色固體。
5-芐氧基-3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酰氯。將5-芐氧基-3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酸(1g,2mmol)在46mL苯中的溶液加入NaH(80mg,2mmol)在2mL苯中的溶液。將所得溶液和草酰氯(0.9mL,10mmol)一起在氬氣氛下攪拌20h。除去溶劑,獲得0.93g(91%)5-芐氧基-3,4-二-叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酰氯黃色固體。
1-O-(3-芐氧基-1,2-二氧環(huán)己-3,5-二烯-5-苯甲?;?-2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰基)-β-D-吡喃葡糖苷。將鄰氯醌(47mg,0.17mmol)在1mL無水乙醚中的溶液(鄰氯醌0.17M)冷卻到-40℃。在15分鐘內(nèi)向該溶液中滴加1-O-(2-芐氧基-4,5-二羥基苯甲酰基)2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷(330mg,0.16mmol)在24mL無水乙醚中的溶液(聯(lián)苯酚0.007M)。將所得紅色溶液在-40℃在氬氣氛下攪拌2h,接著轉(zhuǎn)移到-20℃冷藏箱中并放置20h。過濾紅色沉淀,用冷乙醚洗滌,并真空干燥,獲得260mg(79%)1-O-(3-芐氧基-1,2-二氧環(huán)己-3,5-二烯-5-苯甲酰基)-2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β-D-吡喃葡糖苷。
一般過程A2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-D-葡萄糖的二?;?。(α,β端基異構(gòu)體的混合物)向2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-D-葡萄糖(300mg,0.2mmol)在1.5mL無水CH2Cl2中的溶液中加入三乙胺(67μL,0.43mmol),接著加入適宜的雙酰氯(0.1mmol)。將該溶液在氬氣氛下攪拌18h。反應(yīng)混合物用1N HCl處理,并用EtOAc萃取。有機層依次用H2O和鹽水洗滌,接著用硫酸鈉干燥。過濾并在真空除去溶劑后,產(chǎn)物通過閃蒸柱色譜用3∶5∶12的EtOAc∶苯∶己烷純化。
一般過程B氫化。向0.008M適宜的芐基化二聚體在THF中的溶液中加入10%Pd/C(0.6eq)。將反應(yīng)混合物用H2吹4X,并在室溫下在氫氣氛下攪拌18h。反應(yīng)混合物通過C鹽過濾,再用丙酮洗滌。濃縮后,將所得灰色固體用己烷和乙醚研磨,并在35℃下真空干燥。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,B′-D,D′-吡喃葡糖基對苯二甲酸酯。通過使用一般過程A,將對苯二甲酰氯偶聯(lián)于2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰基)-D-葡萄糖,并通過閃蒸色譜純化,獲得61%1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰基)-β,B′-D,D′-吡喃葡糖基對苯二甲酸酯。IR(CDCl3)1734(C=O)cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.02(s,4H,(C=O)ArH),δ7.43-7.15(m,136H,ArH),δ6.25(d,J=8.3Hz,2H,H(1),H(1)′),δ6.05(app.t,J=9.8Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.82(dd,J=10.2,8.3Hz,2H,H(2),H(2)′),δ5.7(app.t,J=9.8Hz,2H,H(4),H(4)′),δ5.11-4.91(m,48H,ArOCH2),δ4.77(d,J=9.4Hz,2H,Ha(6),Ha(6′),δ4.47-4.42(m,2H,H(5),H(5)′),δ4.35-4.29(m,2H,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.64,165.51,164.99,164.82,163.67,152.57,152.52,152.43,143.17,143.10,142.56,137.43,137.31,137.23,136.59,136.33,136.24,132.92,130.28,128.51,128.46,128.41,128.24,128.19,128.10,128.01,127.82,127.52,124.40,123.56,123.47,109.28,109.09,109.03,93.17,75.06,73.37,73.25,71.14,71.11,70.98,69.75,63.19;MS(+FAB)3867(MH+16);C244H202O46計算C,75.74;H,5.23;實測C,75.59;H,5.29。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基對苯二甲酸酯。通過使用一般過程B,將1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基對苯二甲酸酯氫化,獲得定量收率的1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲酰基)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基對苯二甲酸酯。IR(KBr)3422(OH)1702(C=O)cm-1;1H NMR((CD3)2CO,300MHz)δ8.5-7.4(m,24H,OH),δ8.05(s,4H,(C=O)ArH),δ7.13-6.94(m,16H,ArH),δ6.37(d,J=8.3Hz,2H,H(1),H(1)′),δ6.02(app.t,J=9.5Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.68-5.58(m,4H,H(2),H(2)′,H(4),H(4)′),δ4.61-4.54(m,4H,H(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′),δ4.41-4.35(dd,J=12.5,4.5Hz,2H,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR((CD3)2CO,75MHz)δ165.45,164.94,164.88,164.66,163.30,145.13,145.06,144.99,138.54,138.31,138.15,135.93,133.25,130.01,128.36,120.48,119.69,119.61,119.43,109.39,109.23,93.18,73.19,72.07,70.92,68.28,61.82;MS(+FAB)1706(M+6)(MH+7);HRFABMS C76H58O46計算1706.219926;實測1706.223226。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D-吡喃葡糖基間苯二價酸酯。通過使用一般過程A,將間苯二甲酰氯偶聯(lián)于2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-D-葡萄糖,通過閃蒸色譜純化,獲得48%1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基間苯二甲酸酯。IR(CDCl3)1730(C=O)cm-1;1HNMR(CDCl3,300MHz)δ8.76(s,1H,(C=O)ArH(C=O)),δ8.19(dd,J=7.9,1.5Hz,2H,(C=O)ArH)δ7.42-7.15(m,137H,ArH),δ6.26(d,J=8.2Hz,2H,H(1),H(1)′),δ6.01(app.t,J=9.4Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.79(dd,J=9.8,8.3Hz,2H,H(2),H(2)′),δ5.74(app.t,J=9.4Hz,2H,H(4),H(4)′),δ5.09-4.90(m,48H,ArOCH2),δ4.76(d,J=9.0Hz,2H,Ha(6),Ha(6)′),δ4.41-4.30(m,4H,H(5),H(5)′,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ165.66,165.53,164.95,164.86,163.60,152.58,152.55,152.43,143.18,143.06,142.57,137.48,137.34,137.29,136.64,136.40,136.36,136.29,129.34,128.93,128.85,128.74,128.51,128.43,128.28,128.13,128.04,127.82,127.72,127.55,124.44,123.66,123.60,109.30,109.08,93.12,75.16,75.09,73.33,73.19,71.22,71.15,70.99,69.70,63.13;MS(+FAB)3867(MH+7);C244H202O46計算C,75.74;H,5.23;實測C,75.61;H,5.23。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D-吡喃葡糖基間苯二甲酸酯。通過使用一般過程B,將1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基間苯二甲酸酯氫化,獲得定量收率的1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲酰基)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基間苯二甲酸酯。IR(KBr)3405(OH)1702(C=O)cm-1;1H NMR((CH3)2CO),300MHz)δ8.58(s,1H,(C=O)ArH(C=O)),δ8.45-7.85(m,24H,OH),δ8.17(dd,J=7.5,1.5Hz,2H,(C=O)ArH),δ7.61(t,J=7.9Hz,1H,ArH)δ7.12-6.94(m,16H,ArH),δ6.40(d,J=7.9Hz,2H,H(1),H(1)′),δ6.00(app.T,J=9.4Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.68-5.59(m,4H,H(2),H(2)′,H(4),H(4)′),δ4.61-4.49(m,4H,H(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′),4.42-4.36(dd,J=12.8,4.5Hz,2H,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ166.04,165.51,165.38,165.23,163.81,145.66,145.60,144.53,139.05,138.85,138.71,136.87,135.31,135.19,130.33,130.13,121.05,120.28,120.86,120.28,120.21,120.06,109.96,109.89,109.79,93.68,73.79,72.80,71.50,69.80,62.42;MS(+FAB)1706(M+14);HRFABMS C36H58O46計算1706.219926;實測1706.222124。
聯(lián)苯基-4,4′-二碳酰二氯。將聯(lián)苯基-4,4′-二羧酸(200mg,0.8mmol)在15mL CH2Cl2中的溶液和草酰氯(0.8mL,9mmol)及1滴DMF在氬氣氛下攪拌18h。真空除去溶劑,獲得211mg(93%)聯(lián)苯基-4,4′-二碳酰二氯黃色固體。光譜數(shù)據(jù)與文獻光譜數(shù)據(jù)相符。IR(CH2Cl2)1781(C=O)cm;1H NMR(CDCl3),360MHz)δ8.2(d,J=8.2Hz,4H,(C=O)ArH),δ7.7(d,J=8.7Hz,4H,ArH);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ167.9,145.8,133.2,132.1,127.9。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基聯(lián)苯基-4,4′-二酯。向2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-D-葡萄糖(440mg,0.24mmol)在3mL無水THF中的溶液中加入三乙胺(67μL,0.48mmol),接著加入聯(lián)苯基-4,4′-二碳酰二氯(33mg,0.12mmol)。將所得混合物加熱到50℃并在氬氣氛下攪拌40h(注如果混合物加熱到回流(65℃),獲得4∶1的β,β′α,α′異構(gòu)體混合物。反應(yīng)混合物用1N HCl處理并用EtOAc萃取。有機層依次用H2O和鹽水洗滌,接著用硫酸鈉干燥。真空除去溶劑后,產(chǎn)物通過閃蒸色譜用3∶5∶12的EtOAc∶苯∶己烷洗脫而純化,獲得1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基聯(lián)苯基-4,4′-二酯(17%)。IR(CDCl3)1732(C=O)cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.08(d,J=8.3Hz,4H,(C=O)ArH),δ7.57(d,J=8.6Hz,4H,ArH),δ7.47-7.18(m,136H,ArH),δ6.35(d,2H,J=8.3Hz,H(1),H(1)′),δ6.07(app.T,2H,J=9.4Hz,H(3),H(3)′),δ5.87(dd,J=9.5,8.3Hz,2H,H(2),H(2)′),δ5.76(app.T,J=9.7Hz,H(4),H(4)′),δ5.15-4.80(m,50H,ArCH2O,Hb(6),Hb(6)′),δ4.49-4.33(m,4H,H(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′);13C NMR(CDCl3,75MHz)δ168.59,165.60,165.54,165.03,164.24,152.56,152.50,152.42,144.55,143.00,142.49,137.42,137.30,137.24,136.63,136.31,136.24,133.42,132.57,128.79,128.71,128.66,128.59,128.46,128.39,128.26,128.19,128.10,127.99,127.82,127.58,127.51,123.61,123.52,109.28,109.09,109.00,75.11,75.06,71.18,71.08,70.98,69.27,63.12;C250H206O46計算C,76.10;H,5.23;實測C,75.85;H,5.31。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基聯(lián)苯基-4,4′-二酯。通過使用一般過程B,將1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰基)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基聯(lián)苯基-4,4′-二酯氫化,獲得1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲酰基)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基聯(lián)苯基-4,4′-二酯(86%)。IR(KBr)3448(OH)1702(C=O)cm-1;1H NMR((CD3)2CO,300MHz)δ8.28-8.08(m,24H,OH),δ8.05(d,J=8.7Hz,4H,(C=O)ArH),δ7.79(d,J=8.3Hz,4H,ArH)δ7.14-6.95(m,16H,ArH),δ6.40(d,J=8.3Hz,2H,H(1),H(1)′),δ6.02(app.t,J=9.8Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.71-5.61(m,4H,H(2),H(2)′,H(4),H(4)′),δ4.61-4.52(m,4HH(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′),δ4.41-4.39(dd,J=12.4,4.9Hz,2H,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR((CD3)2CO,90MHz)δ167.28,166.77,166.66,166.50,165.68,146.92,146.81,146.54,140.29,140.10,139.93,138.88,132.31,132.25,130.20,129.42,122.37,121.56,121.49,121.38,111.22,111.11,111.05,94.69,74.96,74.03,72.78,71.18,63.66;MS(+FAB)1782(M+);HRFABMS C82H62O46計算1782.251226;實測1782.250700。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基庚二酸酯。通過使用一般過程A,將庚二酰氯偶聯(lián)于2,3,4,6-四(3,4,5-三芐基苯甲?;?-D-葡萄糖,并通過閃蒸色譜純化,獲得45%1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基庚二酸酯(α,α,β,β和α,β端基異構(gòu)體的混合物)。IR(CDCl3)1730(C=O)cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ7.43-7.18(m,136H,ArH),δ6.09(d,J=7.9Hz,2H,H(1),H(1)′),δ5.98(app.t,J=9.4Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.81-5.6(m,2H,H(2),H(2)′),δ5.41-5.36(m,2H,H(4),H(4)′),δ5.13-4.72(m,50H,ArOCH2,Ha(6),Ha(6)′)δ4.54-4.27(m,4H,H(5),H(5)′,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR(CDCl3,90MHz)δ171.53,165.82,165.63,164.69,152.68,152.57,152.52,152.44,143.25,143.12,143.08,142.99,142.66,142.57,137.48,137.34,136.65,136.48,136.41,136.36,136.21,128.52,125.46,128.39,128.31,128.26,128.21,128.13,128.11,128.02,127.83,127.56,124.48,123.81,123.68,123.64,123.57,109.40,109.23,109.09,92.05,75.12,75.08,73.54,72.98,71.28,71.16,71.09,70.99,69.90,63.05,33.66,28.12,23.93;MS(+FAB)3861(MH+50)。
1,1′O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基庚二酸酯。通過使用一般過程B,將1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基庚二酸酯氫化,獲得定量收率的1,1′O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲酰基)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基庚二酸酯。IR(KBr)3422(OH)1718(C=O)cm-1;1HNMR((CD3)2CO,300MHz)δ8.17-7.45(m,24H,OH),δ7.21-6.82(m,16H,ArH),δ6.05(d,J=8.3Hz,2H,H(1),H(1)′),δ5.79(app.t,J=9.4Hz,2H,H(3),H(3)′),δ5.48(app.t,J=9.8Hz,2H,H(2),H(2)′),δ5.96(dd,J=9.8,1.5Hz,2H,H(4),H(4)′),δ4.40-4.34(m,4H,H(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′),δ4.25(dd,J=12.5,4.5Hz,2H,Hb(6),Hb(6)′)13C NMR(CD3)2CO,75MHz)δ171.33,165.83,165.23,164.97,145.47,145.43,145.39,145.26,138.86,138.80,138.58,138.49,128.54,120.79,119.98,119.89,119.80,109.67,109.63,109.54,109.49,92.16,73.30,72.62,71.15,68.57,62.15,33.61,28.15,24.38;MS(+FAB)1701(MH+);HRFABMS C35H64O46計算1700.226876;實測1700.257740。
2,3′-氧-二-苯甲酸。將24(0.12g,0.41mmol)和LiOH·H2O(0.11g,2.5mmol)在3mL MeOH和1mL H2O中混合。反應(yīng)混合物在氬氣氛下加熱回流5h。將溶液冷卻到室溫,用1N HCl酸化,并用EtOAc萃取。有機相用鹽水洗滌,并用硫酸鎂干燥。過濾并真空除去溶劑后,收集到0.1g(93%)白色粉末。1H NMR((CD3)2CO,300MHz)δ9.5(br s,2H,CO2H),δ8.00(dd,J=7.9Hz,1.9Hz,1H,H(3)),δ7.75(app.d的t,J=7.8,1.2,1H,H(4)′),δ7.64(ddd,J=8.2,7.5,1.8Hz,1H,H(5)),δ7.53-7.46(m,2H,H(2)′,H(5)′),δ7.35(app.t的d,J=7.6,1.1Hz,1H,H(4)),δ7.21(ddd,J=8.2,2.6,1.0Hz,1H,H(6)′),δ7.14(ddJ=8.2,1.0Hz,1H,H(6));13C NMR((CD3)2CO,75MHz)δ166.6,166.0,158.8,155.6,134.4,132.6,132.5,130.3,125.0,124.7,124.2,122.5,122.3,118.4。
2.3′-氧-二-苯甲酰氯。將草酰氯(0.058μL,0.66mmol)緩慢滴加到25(0.057g,0.22mmol)在2mL無水CH2Cl2和1滴DMF中的懸浮液中。懸浮液逐漸變成澄清黃色溶液。反應(yīng)混合物在氬氣氛下攪拌3h。真空除去溶劑,獲得0.063g(97%)黃色油產(chǎn)物。IR(CDCl3)1758(C=O)cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz)δ8.19(dd,J=8.3,1.7Hz,1H,H(3)),δ7.93-7.90(m,1H,H(4)′),δ7.68(app.t,J=2.1Hz,1H,H(2)′),δ7.66-7.60(m,1H,H(4)),δ7.52(app.t,J=8.1Hz,1H,H(5)′),δ7.36-7.31(m,2H,H(5),H(6)′),δ7.00(dd,J=8.3,0.7Hz,1H,H(6));13C NMR(CDCl375MHz)δ167.6,163.9,156.9,155.4,136.1,135.0,134.3,130.5,126.8,125.8,125.4,124.5,1205,120.4。
1.1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲酰)-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基-(2.3′-氧-二-苯甲酸酯)。通過使用一般過程A,將21a偶聯(lián)于2,3,4,6-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-D-葡萄糖,并通過閃蒸色譜純化,獲得35%1.1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基-(2,3′-氧-二-苯甲酸酯)。IR(CDCl3)1731(C=O)cm-1;1H NMR(CDCl3,300MHz),δ7.97(dd,J=7.9,1.5Hz,1H,ArH(3)),δ7.76-7.73(m,1H,ArH(4)′),δ7.66-7.65(m,1H,Ar(H2)),δ7.41-7.15(m,138H,ArH,ArH(4),ArH(5)′),δ7.13-7.00(m,2H,ArH(5),ArH(6)′),δ6.72(d,J=7.9Hz,1H,H(1)),δ6.26(d,J=7.9Hz,1H,H(1)′),δ6.04(app.t,J=9.8Hz,1H,H(3)),δ5.97(app.t,J=9.8Hz,1H,H(3)′),δ5.82-5.68(m,4H,H(2),H(2)′,H(4),H(4)′),δ5.10-4.9(m,48H,ArOCH2),δ4.93-4.72(m,2H,H(5),H(5)′),δ4.37-4.27(m,4H,Ha(6),Ha(6)′,Hb(6),Hb(6)′)。13C NMR(CDCl3,90MHz)δ165.5,165.4,165.0,164.9,164.8,164.8,164.0,162.8,162.8,162.4,157.3,156.7,152.5,152.5,152.4,152.4,143.1,143.1,143.0,143.0,143.0,142.5,142.5,137.5,137.5,137.4,137.3,137.3,136.7,136.6,136.4,136.4,136.3,136.3,134.9,132.6,130.2,130.2,128.5,128.4,128.3,128.3,128.2,128.1,128.0,127.9,127.8,127.5,124.8,124.5,124.5,123.7,123.7,123.6,120.6,120.3,119.5,109.3,109.1,109.1,92.9,92.5,75.1,75.1,73.6,73.4,73.1,71.2,71.1,71.1,71.0,69.8,69.7,67.5,63.2,62.9。
1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基-(2.3′-氧-二-苯甲酸酯)。通過使用一般過程B,將1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三芐氧基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基-(2.3′-氧-二-苯甲酸酯)氫化,獲得定量收率的1,1′-O-2,2′,3,3′,4,4′,6,6′-四(3,4,5-三羥基苯甲?;?-β,β′-D,D′-吡喃葡糖基-(2.3′-氧-二-苯甲酸酯)。1H NMR(CDCl3,360MHz)δ8.18(m,24H,ArOH),δ7.91(m,1H,ArH(3)),δ7.71(d,J=7.8Hz,1H,ArH(4)′),δ7.60-7.53(m,2H),δ7.4-6.94(m,20H,ArH),δ6.39(d,J=8.2Hz,1H,H(1)),δ6.35(d,J=8.2Hz,1H,H(1)′),δ6.04(app.T,J=9.8Hz,1H,H(3)),δ5.97(app.T,J=9.6Hz,1H,H(3)′),δ5.71-5.56(m,4H,H(2),H(2)′,H(4),H(4)′),δ4.61-4.40(m,6H,H(5),H(5)′,Ha(6),Ha(6)′,Hb(6),Hb(6)′);13C NMR((CD3)2CO,90MHz)δ166.0,165.4,165.2,165.1,165.1,164.1,164.1,162.6,157.9,156.6,145.6,145.5,145.4,138.9,138.7,138.6,135.5,132.3,130.8,130.7,124.9,124.6,124.2,121.8,121.3,121.3,120.9,119.6,109.8,109.8,109.7,93.4,93.0,73.6,73.5,72.8,72.6,71.3,71.2,68.8,68.7,62.3,62.2,62.2;MS(+MALDI)1822(MNa+)。
材料化合物在實驗室中合成。LPS(大腸桿菌(E.coli)055B5苯酚提取物)。Ficoll-Histopaque(ρ=1.077g/mL)、無菌、雜交瘤檢測的胎牛血清(FCS)、慶大霉素10mg/Ml、L-谷氨酰胺、Dextran B-512Leuconostoc平均分子量(Av M.W.)580000和錐蟲藍(Trypan Blue)染液購自Sigma。具有酚紅的Hanks緩沖鹽溶液lX,mediatech(HBSS)和RPMI 1640 1X,mediatech購自Fisher Scientific。人、大鼠和小鼠IL-1β和TNF-αELISA試劑盒購自R and D System,Minneapolis,MN。新鮮肝素化人血得自健康人受試者。C3H/HeJ和C3H/HeOuJ小鼠得自Jackson Labs,Bay City,ME。
表1被LPS刺激的PEC′s的TNF-α分泌(表格中所有SD=標準偏差)

表2用16刺激的小鼠PEC′s的TNF-α分泌

表3用LPS+1和僅用LPS治療的大鼠的TNF-α分泌

表4用17c-21c刺激的h-PBMC′s的TNF-α分泌

表5用LPS和17c-20c刺激的h-PBMC′s的TNF-α隨時間分泌

表618c-20c對h-PBMC′s的LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制在LPS加入45分鐘后加入底物

表7從由17c-20c刺激的h-PBMC′s中分泌IL=1β

表819c和20c對h-PBMC′s的LPS誘導(dǎo)的TNF-α分泌的抑制在LPS加入45分鐘后加入底物

應(yīng)該理解,本發(fā)明的棓單寧和鞣花單寧組合物可以含有上述分子式范圍內(nèi)的棓單寧和鞣花單寧、這些化合物的光學異構(gòu)體或前藥或類似物,或D或L形式的外消旋混合物。同樣,可以進行對該組合物的劑量和配方和本文表述的范圍的微小改變,它們?nèi)栽诒景l(fā)明的范圍和實質(zhì)內(nèi)。
盡管已參照特定組合物、有效性理論等對本發(fā)明進行了描述,但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員,存在這并不意味著本發(fā)明只限于這樣的說明性實施方案或機理,在不背離如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的范圍或?qū)嵸|(zhì)的前提下,可以對其進行改變。所有這些明顯的改變和變化均包括在如所附權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。除非特別指明,權(quán)利要求覆蓋任何對預(yù)期目的有效的任何順序的成分和步驟。
本文中引用和列于以下的所有文章均引入本文作參考。
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權(quán)利要求
1.用于抑制細胞因子的釋放的藥物組合物,所述組合物包含選自β-D-五棓酰基葡萄糖和二聚棓單寧的棓單寧,以及藥學可接受的載體,其中連接棓單寧的糖核的連接單元是誤調(diào)該棓單寧的糖核的連接。
2.用于預(yù)防或治療膿毒癥或敗血癥性休克的藥物組合物,所述組合物包含選自β-D-五棓?;咸烟呛投蹢攩螌幍幕衔?,以及藥學可接受的載體,其中連接該二聚棓單寧的糖核的連接單元是誤調(diào)該棓單寧的糖核的連接。
3.抑制細胞因子的釋放的方法,所述方法包括給予細胞因子釋放抑制有效量的棓單寧。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中給予的所述棓單寧的劑量在約0.1-1000mg/kg/天的范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中所述棓單寧以單劑量給予。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中所述棓單寧以分開的劑量給予。
7.根據(jù)權(quán)利要求3的方法,其中所述棓單寧選自藥學可接受的載體中的β-D-五棓?;咸烟呛投蹢攩螌?,其中連接二聚棓單寧的糖核的連接單元是誤調(diào)該棓單寧的糖核的連接。
8.用于抑制細胞因子的釋放的藥物的制備方法,所述方法使用選自β-D-五棓?;咸烟呛投蹢攩螌幍乃幬锍煞?。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于抑制細胞因子的釋放的藥物組合物,所述組合物包含選自β-D-五棓?;咸烟呛投蹢攩螌幍臈攩螌帲约八帉W可接受的載體,其中連接棓單寧的糖核的連接單元是誤調(diào)該棓單寧的糖核的連接。
文檔編號A61P43/00GK1732961SQ20051009150
公開日2006年2月15日 申請日期2000年11月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月19日
發(fā)明者肯尼思·S.·費爾德曼 申請人:賓州研究基金會
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