專利名稱：：治療炎性骨病的藥物組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于治療炎性骨病的藥物組合物及其制備方法，尤其是源于中藥的治療關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等的藥物組合物及其可工業(yè)的制備方法。
背景技術(shù)：
：炎性骨病主要涉及的炎癥介質(zhì)有IL-1、TNF-α、IL-2、前列腺素E2，且往往伴有痛疼。例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥病變?yōu)橹饕卣鞯淖陨砻庖咝约膊?。該病以?duì)稱性關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和僵硬為主要特征，并伴有免疫功能的異常。遺傳、感染、環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等多種復(fù)雜因素參與或加重類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病變過(guò)程。其病理特點(diǎn)是滑膜細(xì)胞增生，多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)，血管翳形成，繼而引起軟骨和骨組織的破壞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失?；ぜ?xì)胞增生與高水平的細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)，這些細(xì)胞因子通過(guò)與靶細(xì)胞上的特意性受體結(jié)合來(lái)表達(dá)其生物學(xué)功能。細(xì)胞因子是細(xì)胞間相互作用的重要介質(zhì)，如被抗原-HLA復(fù)合物活化了的巨噬細(xì)胞能分泌白介素-1(IL-1，下同)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，下同)等，它們起了活化T淋巴細(xì)胞的作用。活化了的淋巴細(xì)胞則分泌IL-2、λ干擾素等，λ干擾素又轉(zhuǎn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的HLA-DR分子的表達(dá)，IL-2促使T淋巴細(xì)胞本身的增殖及巨噬細(xì)胞的活化。細(xì)胞因子一方面使巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞在疾病過(guò)程中持續(xù)被活化，造成RA慢性過(guò)程；另一方面它也是許多臨床表現(xiàn)的因素。如IL-1等促使花生四稀酸的代謝造成滑膜炎癥，它也激活膠原酶和破骨細(xì)胞，致使關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞，促使肝合成急性期蛋白以致血沉、C反應(yīng)蛋白升高。TNF-α可刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生IL-6以及促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，還可促進(jìn)中性粒細(xì)胞黏附與血管內(nèi)皮和游走進(jìn)入關(guān)節(jié)滑膜液中。因此IL-1、TNF-α是RA發(fā)病機(jī)理中居于中心地位的促炎癥細(xì)胞因子，是關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的炎癥介質(zhì)[參見(jiàn)蔡青，孟濟(jì)明，IL-1和TNF與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。上海免疫學(xué)雜志，1998，18(1)62-3]。有研究表明，IL-2在RA病人的血液及關(guān)節(jié)滑液中大量增加，除了作為炎性因子損傷關(guān)節(jié)滑膜之外，也可能參與了免疫平衡紊亂的病理過(guò)程，IL-2的表達(dá)增加與疾病的嚴(yán)重性相關(guān)(RomasE，BakharevskiO，HardsDK，etal.Expressionofosteoclastdifferentiationfactoratsitesofboneerosionincollagen-inducedarthritis.ArthritisRheum，2000；43(4)821-6.)。前列腺素2(PGE2，下同)既是炎癥介質(zhì)，又是免疫調(diào)質(zhì)。在RA中滑膜細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素等炎性介質(zhì)，高濃度的PGE2能使骨組織吸收破壞增加，還刺激軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，減少糖蛋白合成，增加粘蛋白降解，并產(chǎn)生膠原酶及其它中性蛋白酶，釋放骨鈣，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)崩解，軟骨吸收和骨破壞。目前治療炎性骨病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎尚未找到特異有效的治療方法，常用藥物可分為非甾體抗炎藥(NSAIDs)、慢作用抗風(fēng)濕藥(SAARDs)、腎上腺皮質(zhì)激素等；治療的主要目的是控制炎癥和關(guān)節(jié)的破壞。由于上市的藥物中大多存在各種不同的缺點(diǎn)，一般治標(biāo)不治本，且難以阻止疾病的進(jìn)程，長(zhǎng)期使用不良反應(yīng)較多，臨床應(yīng)用受到限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是研究源于中藥的治療炎性骨病的藥物組合物及其制備方法，尤其是治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)增生、神經(jīng)痛等。不僅能夠具有顯著鎮(zhèn)痛和消炎作用，而且可以標(biāo)本兼治，力求不良反應(yīng)少，并能阻止疾病的進(jìn)程。即本發(fā)明藥物組合物應(yīng)能夠抑制涉及關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的炎癥介質(zhì)IL-1、TNF-α，應(yīng)能夠抑制IL-2的表達(dá)，以阻止疾病的進(jìn)程，應(yīng)能降低炎性腫脹足前列腺素E2的含量，以抑制骨組織吸收破壞，最終改善病變關(guān)節(jié)的病理組織結(jié)構(gòu)，以有效治療炎性骨病。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案。一種治療炎性骨病的藥物組合物，其特征在于主要是由下列重量份的原料藥制成黃連2-10份、黃柏2-10份、黃芩2-10份、蜈蚣1-5份、全蝎1-5份、壁虎1-5份。本發(fā)明藥物組合物，優(yōu)選原料藥的用量為黃連4-8份、黃柏4-8份、黃芩4-8份、蜈蚣2-3份、全蝎2-3份、壁虎2-3份。更優(yōu)選原料藥的用量為黃連6份、黃柏6份、黃芩6份、蜈蚣3份、全蝎3份、壁虎3份。本發(fā)明藥物組合物的制備方法，包括下列步驟1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用水和/或乙醇提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B，與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得口服制劑。前述藥物組合物的制備方法，其步驟2)中原料藥用含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；步驟3)中濃縮液B加入乙醇至溶液含醇量達(dá)70-80％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；將濃縮液C與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得膠囊劑、口服液、片劑或丸劑。優(yōu)選的制備方法中，原料藥用水或20～50％乙醇液提取，得提取液A；向濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)80-90％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得膠囊劑或丸劑。本發(fā)明藥物組合物的制備方法，包括下列步驟1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用水和/或乙醇提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B；4)取步驟3)的濃縮液B加入乙醇至溶液含醇量達(dá)70-80％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；5)向步驟4)的濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)80-90％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，加入水，放置后，過(guò)濾，濾液濃縮至浸膏D；6)取步驟5)的浸膏D與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成各種制劑。前述藥物組合物的制備方法中，優(yōu)選1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用液含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B；4)取步驟3)的濃縮液加入乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；5)向步驟4)的濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)85％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，加水至溶液體積為藥材重量的1.2-1.5倍，放置后過(guò)濾，濾液濃縮，得浸膏D；取浸膏D與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成各種制劑。前述制備方法中，優(yōu)選將所述重量配比的原料藥用水或20～50％乙醇提取，得提取液A；濃縮后過(guò)濾，向?yàn)V液中加乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，取濾液濃縮除盡乙醇，冷藏過(guò)夜后，過(guò)濾，取濾液加乙醇至溶液含醇量達(dá)85％，再冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并蒸發(fā)除盡乙醇得濃縮液，加水至溶液體積為藥材重量的1.3-1.4倍，冷藏后過(guò)濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，按常規(guī)制成注射液或口服制劑。本發(fā)明藥物組合物在制備抑制炎癥介質(zhì)IL-1、TNF-α和/或抑制IL-2的表達(dá)藥物中的應(yīng)用，包括在制備治療炎性骨病中藥物中的應(yīng)用，所述炎性骨病有風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)增生，以及與炎性骨病有關(guān)的神經(jīng)痛。本發(fā)明治療炎性骨病的高、中、低三個(gè)劑量組藥物組合物，包括治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)增生、神經(jīng)痛等。不僅具有顯著鎮(zhèn)痛和消炎作用，而且可以標(biāo)本兼治，不良反應(yīng)少，并能阻止疾病的進(jìn)程。即本發(fā)明藥物組合物抑制了涉及關(guān)節(jié)軟骨破壞的最重要的炎癥介質(zhì)IL-1、TNF-α，抑制了IL-2的表達(dá)，阻止了疾病的進(jìn)程，降低了炎性腫脹足前列腺素E2的含量，抑制了骨組織吸收破壞，最終改善了病變關(guān)節(jié)的病理組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到有效治療炎性骨病的有益效果。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明藥物組合物可抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹、角叉菜膠所致的大鼠足跖腫脹、抑制大鼠棉球肉芽組織增生及氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的原發(fā)性和繼發(fā)性病變；對(duì)小鼠熱板、醋酸扭體致痛均有明顯的鎮(zhèn)痛作用。本發(fā)明病理切片結(jié)果顯示本發(fā)明藥物組合物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠病變關(guān)節(jié)的病理組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善作用，而佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型組踝關(guān)節(jié)周?chē)浗M織內(nèi)見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜上皮細(xì)胞增生、腫脹，滑膜組織不完整。本發(fā)明藥物組合物能降低大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞因子的含量以及抑制淋巴細(xì)胞的分裂增殖。本發(fā)明藥物組合物能降低大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎炎性腫脹足前列腺素E2的含量。所有這些實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明藥物組合物不是單純的鎮(zhèn)痛或消炎，而是標(biāo)本兼治。氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎類似于人的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，常用來(lái)篩選抗風(fēng)濕藥。其病理變化一般分為三個(gè)階段①致炎后10天內(nèi)逐漸出現(xiàn)早期炎癥反應(yīng)，尤其頭三天足腫脹達(dá)高峰，以后逐漸減弱。②第10天到18天因遲發(fā)型超敏反應(yīng)，可出現(xiàn)多發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀。③26天以后癥狀逐漸減輕和消退，可能遺有永久性關(guān)節(jié)畸形(陳紀(jì)潘，趙會(huì)芳等，通痹靈對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞功能的影響[J]。中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，1999，19(3)167-169)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明本發(fā)明藥物組合物對(duì)第一階段至第三階段均有效。圖1、體外給藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺和脾淋巴細(xì)胞增殖及IL-2產(chǎn)生的影響(x±S，n＝4)具體實(shí)施方式原料藥黃連(Coptischinensis)、黃柏(Phellodendro)、黃芩(Radixscutellariae)、蜈蚣(Scolopendrasubspinipesmutilans)、全蝎(Scorpio)、壁虎(Gekko)(又名天龍)均為市購(gòu)，且符合藥典相關(guān)項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例一稱取黃連、黃柏、黃芩各100克；蜈蚣、全蝎、壁虎各50克。原生藥450克，粉為粗末，加水煎煮三次，每次一小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至近600ml，放冷，過(guò)濾，濾液加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纖維素適量，混合均勻，制成適宜軟材過(guò)22目篩制顆粒，60℃鼓風(fēng)干燥，20目篩整粒，顆粒填充入2號(hào)膠囊殼成品。實(shí)施例二黃連、黃柏、黃芩各10克，蜈蚣、天龍、全蝎各1克，粉碎成粗末，混合，95％乙醇浸泡過(guò)夜，回流三次，合并乙醇液，過(guò)濾，濃縮至0.75g藥材/ml，加入常規(guī)矯味劑，得口服液。實(shí)施例三黃連、黃柏、黃芩各20克，蜈蚣、天龍、全蝎各50克，粉為粗末，混合，20％乙醇浸泡過(guò)夜，回流3次，合并回流液，過(guò)濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.35的浸膏，加入淀粉和微晶纖維素適量，混合均勻，制成適宜軟材過(guò)22目篩制顆粒，60℃鼓風(fēng)干燥，20目篩整粒，顆粒填入2號(hào)膠囊殼。實(shí)施例四黃連、黃柏、黃芩各60克，蜈蚣、天龍、全蝎各30克，粉為粗末，混合，50％乙醇浸泡過(guò)夜，回流3次，合并回流液，過(guò)濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纖維素適量，混合均勻，制成適宜軟材過(guò)22目篩制顆粒，60℃鼓風(fēng)干燥，20目篩整粒，顆粒填入2號(hào)膠囊殼。實(shí)施例五稱取黃連、黃柏、黃芩各40克，蜈蚣、天龍、全蝎各30克。將原生藥粉為粗末，加水煎煮三次，每次一小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至273ml，放冷，過(guò)濾，濾液加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)70％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至273ml，冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液再加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)80％，再冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并蒸發(fā)除盡乙醇得濃縮液，加蒸餾水至273ml，冷藏冰箱40小時(shí)，過(guò)濾棄去鞣質(zhì)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，加入淀粉和微晶纖維素適量，混合均勻，制成適宜軟材過(guò)22目篩制顆粒，60℃鼓風(fēng)干燥，20目篩整粒，顆粒填充入2號(hào)膠囊殼成品。實(shí)施例六稱取黃連、黃柏、黃芩各80克；蜈蚣、全蝎、壁虎各30克。原生藥粉為粗末，加水煎煮三次，每次一小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至約462ml，放冷，過(guò)濾，濾液加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)80％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至近462ml，冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液再加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)90％，再冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并蒸發(fā)除盡乙醇得濃縮液，加蒸餾水至近462ml，冷藏冰箱40小時(shí)，過(guò)濾棄去鞣質(zhì)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，加入注射用水至0.75g藥材/ml，精濾后灌裝，經(jīng)滅菌、燈檢、質(zhì)檢后，得本發(fā)明藥物組合物注射液。實(shí)施例七稱取黃連、黃柏、黃芩各100克；蜈蚣、全蝎、壁虎各50克。原生藥粉為粗末，加水煎煮三次，每次一小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至近600ml，放冷，過(guò)濾，濾液加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至近600ml，冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液再加95％乙醇至溶液含醇量達(dá)85％，再冷藏，過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并蒸發(fā)除盡乙醇得濃縮液，加蒸餾水至近600ml，冷藏冰箱40小時(shí)，過(guò)濾棄去鞣質(zhì)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，加入注射用水至0.75g藥材/ml，精濾后灌裝，經(jīng)滅菌、燈檢、質(zhì)檢后，得本發(fā)明藥物組合物注射液。實(shí)施例八稱取黃連、黃柏、黃芩各80克；蜈蚣、全蝎、壁虎各20克。原生藥粉為粗末，加水煎煮三次，每次一小時(shí)，過(guò)濾，合并濾液，濾液濃縮至浸膏，常規(guī)制作丸劑。實(shí)施例九本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)研究大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎是兼有體液免疫和細(xì)胞免疫變化的慢性系統(tǒng)性免疫性炎癥，與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有許多共同的組織學(xué)和免疫學(xué)特征。實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹和大鼠棉球肉芽腫的形成有明顯抑制作用，它既可抑制大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎致炎局部的早期反應(yīng)，又可抑制對(duì)側(cè)足因遲發(fā)性超敏反應(yīng)引起的腫脹?？擅黠@抑制角叉菜膠所致大鼠足跖的炎癥反應(yīng)；對(duì)小鼠熱板和醋酸扭體致痛有明顯的鎮(zhèn)痛作用。復(fù)方乙酰水楊酸片，規(guī)格25mg/片，由南京白敬宇制藥廠提供，批號(hào)030228。地塞米松(Dexamethasone)針劑，規(guī)格5mg/ml，由金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠提供，批號(hào)021205。度冷丁(Dolantin，Pethidine)，規(guī)格100mg/2ml，由湖北宜藥集團(tuán)有限責(zé)任公司提供，批號(hào)010408。本發(fā)明藥物組合物選用實(shí)施例一、二、三、四口服制劑灌胃，或者實(shí)施例七的注射液腹腔注射。二甲苯(Xylene)，蘇州振興化工研究所，批號(hào)971101；角叉菜膠，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)073K0051；氟氏完全佐劑，規(guī)格10ml/支，Sigma公司，由北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司提供，批號(hào)033K8933。昆明種小鼠，體重20±2克SD大鼠，雄性，體重180±20克；由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物房提供；合格證號(hào)SCKX(蘇)，2002-0011。1、小鼠耳二甲苯致炎試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法取體重20±2克的昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)分成五組，每組12只。分別為陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林)、陰性對(duì)照組(蒸餾水)及本發(fā)明藥物組合物高、中、低(分別用H、M、L表示，下同)三個(gè)劑量組。陽(yáng)性及陰性對(duì)照組連續(xù)口服給藥7天，每天一次本發(fā)明藥物組合物組分別連續(xù)肌注或口服給藥7天，每天一次。結(jié)果見(jiàn)下述各表。表1、本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹度的影響試驗(yàn)(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)蒸餾水實(shí)施例七注射液肌注實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組(阿司匹林0.2g/kg/20ml)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg/20ml)、中(0.39g/kg/20ml)兩個(gè)劑量組均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹(P＜0.01)；其抑制率分別為30.8％、23.1％、13.7％。表2、本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的結(jié)果或影響如下**P＜0.01，*P＜0.05對(duì)模型組實(shí)施例一口服制劑實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比，阿司匹林(0.20g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)兩個(gè)劑量組均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹(P＜0.01，P＜0.05)；其抑制率分別為45.5％、39.3％、33.9％。表3、本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響**P＜0.01對(duì)模犁組實(shí)施例三口服制劑實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比，阿司匹林(0.20g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹(P＜0.01)；其抑制率分別為48.5％、50.3％、43.7％、24.4％。表4、本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響**P＜0.01，*P＜0.05對(duì)模型組實(shí)施例四口服制劑實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比，阿司匹林(0.20g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)兩個(gè)劑量組均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹(P＜0.01，P＜0.05)其抑制率分別為49.6％、47.1％、40.3％。表5、本發(fā)明藥物組合物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響**P＜0.01，*P＜0.05對(duì)模型組實(shí)施例二口服制劑實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比，阿司匹林(0.20g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)兩個(gè)劑量組均可明顯抑制二甲苯致小鼠耳腫脹(P＜0.01，P＜0.05)；其抑制率分別為47.5％、40.2％、35.2％。2、大鼠足跖角叉菜膠致腫法取健康雄性SD大鼠，體重160-180克，50只，按體重隨機(jī)分成5組，即陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松)、陰性對(duì)照組(生理鹽水)以及本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組；各組分別給予地塞米松、生理鹽水以及本發(fā)明藥物組合物肌注，連續(xù)七天，每天一次(表中如未特別注明mg/kg，均表示劑量單位為g/kg，下同)。末次給藥后30分鐘，分別在每鼠右后足跖皮下注射1％角叉菜膠0.1ml致炎，測(cè)量致炎前及致炎后1、2、4、6小時(shí)右后足跖關(guān)節(jié)下的容積，以致炎前體積為基數(shù)，計(jì)算致炎后各時(shí)段點(diǎn)的腫脹度和腫脹度抑制率。所有數(shù)據(jù)均用x±SD表示，采用t檢驗(yàn)比較給藥組與模型對(duì)照組差異情況。結(jié)果見(jiàn)下。表6、本發(fā)明藥物組合物對(duì)角叉菜膠致大鼠足跖腫脹度的影響試驗(yàn)(n＝10，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水表7、本發(fā)明藥物組合物大鼠足跖角叉菜膠致腫法4小時(shí)點(diǎn)的抑制率和活性比(n＝10，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松0.4mg/kg/2ml)與本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三個(gè)劑量組1、2、4、6小時(shí)點(diǎn)均明顯抑制角叉菜膠所致大鼠關(guān)節(jié)腫脹其中在4小時(shí)點(diǎn)的抑制率和活性比最大(P＜0.01)；在4小時(shí)點(diǎn)的抑制率分別為62.9％、54.2％、53.3％、41.8％，活性比分別為0.86、0.85、0.66。3、大鼠棉球肉芽腫法實(shí)驗(yàn)方法取健康雄性SD大鼠，體重160-180克，50只，在乙醚淺麻醉、無(wú)菌條件下作一胸部切口，將20±1mg無(wú)菌棉球植入兩側(cè)腋窩下，切口縫合后以青霉素及鏈霉素防止感染。手術(shù)后將大鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組。手術(shù)當(dāng)天手術(shù)前1小時(shí)給藥，肌肉注射連續(xù)7天，每天一次物。表8、本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠棉球肉芽腫形成的影響試驗(yàn)(n＝10，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松0.4mg/kg/2ml)與本發(fā)明藥物組合物高劑量組(0.54g/kg/2ml)能明顯抑制大鼠棉球肉芽腫的形成(P＜0.01)；其抑制率分別為76.0％、25.7％。4、氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎試驗(yàn)按文獻(xiàn)方法(陳奇中藥藥理研究方法學(xué)[M]。北京人民衛(wèi)生出版社，1993，369)先用強(qiáng)力碘消毒大鼠左后足跖，再將0.1ml氟氏完全佐劑(FCA)皮內(nèi)注入大鼠足跖。取健康雄性SD大鼠，體重160-200克，50只，按體重平均分為5組，每組10只，即陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組，以Freund’s完全佐劑致炎(即在大鼠左后腳足跖部皮內(nèi)注射0.1mlFCA，注射前先用強(qiáng)力碘消毒)，從致炎前兩天開(kāi)始給藥，給藥途徑為肌注。采用容積法測(cè)量給藥前及致炎后的足容積；然后按文獻(xiàn)方法(鄭高利，賴氨匹林的解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用。新藥與臨床，1997，1(3)32)計(jì)算腫脹度及腫脹度抑制率。[Vn為致炎前足容積；Vt為致炎后足容積][Et為給藥組平均腫脹度；Ec為對(duì)照組平均腫脹度]表9、本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性病變影響的試驗(yàn)(n＝10，x±S)<tablesid="table11"num="011"><tablewidth="849">組別劑量(g/kg)注射側(cè)足跖腫脹度(ml)2d7d14d21d生理鹽水地塞米松本發(fā)明藥物組合物(H)本發(fā)明藥物組合物(M)本發(fā)明藥物組合物(L)0.4mg/kg0.540.270.13554.0±7.022.0±7.0**29.0±5.0**30.0±5.0**36.0±5.0**68.0±12.011.0±6.0**23.0±5.0**22.0±5.0**31.0±4.0**63.0±11.04.0±4.0**16.0±5.0**18.0±5.0**25.0±4.0**53.0±9.00.0±0.0**12.0±5.0**13.0±7.0**23.0±4.0**</table></tables>**P＜0.01對(duì)生理鹽水表10、各組對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎原發(fā)性病變第七天的抑制率和活性比(n＝10，x±S)<tablesid="table12"num="012"><tablewidth="805">組別劑量(g/kg)腫脹度(ml)抑制率(％)活性比</table></tables>**P＜0.01對(duì)生理鹽水表11、本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變影響的試驗(yàn)(n＝10，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水表12、本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎繼發(fā)性病變第15天的抑制率和活性比(n＝10，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水實(shí)驗(yàn)表明與陰性對(duì)照組相比，本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三個(gè)劑量組均能夠顯著抑制氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠足跖各時(shí)段點(diǎn)的腫脹度(P＜0.01)；且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，效果越顯著。對(duì)與原發(fā)性病變其在第7天的抑制率分別為66.2％、67.6％、54.4％，對(duì)與繼發(fā)性病變其在第15天的抑制率分別為58.2％、56.7％、44.1％。5、小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法選取55℃熱板痛閾值＞5秒＜30秒的雌性未孕昆明種小鼠60只，體重18-22克。按疼痛時(shí)間分成5組，每組12只分別為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組，連續(xù)給藥7天，每天一次肌肉注射給藥，陽(yáng)性對(duì)照組淤第七天給藥一次，末次給藥后0.5，1，2，3h測(cè)定疼痛閾值。表13、本發(fā)明藥物組合物對(duì)小鼠熱板法痛閾值的影響試驗(yàn)(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水表14、小鼠熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)60分鐘點(diǎn)增加的痛閾值和增加痛閾值的百分比(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)生理鹽水實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg/2ml)、中(0.39g/kg/2ml)、低(0.195g/kg/2ml)三個(gè)劑量組均可提高小鼠熱板法痛閾值，有明顯的鎮(zhèn)痛作用其在60分鐘點(diǎn)提高的痛閾值分別為16.7s、15.7s、12.2s，鎮(zhèn)痛抑制率分別為81.1％、75.5％、61.0％與陰性對(duì)照組相比有顯著性意義(P＜0.01)。6、小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法取體重18-22克的昆明種雄性小鼠60只，按體重隨機(jī)分為5組，每組12只分別為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組，除陽(yáng)性對(duì)照組外，其余各組肌注給藥，連續(xù)7天，每天一次；陽(yáng)性對(duì)照組第七天給藥一次；末次給藥后30分鐘，每鼠分別腹腔注射0.6％醋酸生理鹽水0.2ml。表15、本發(fā)明藥物組合物對(duì)小鼠醋酸扭體的影響試驗(yàn)(n＝12，x±S)<tablesid="table18"num="018"><tablewidth="709">組別劑量(g/kg)扭體次數(shù)抑制率(％)活性比生理鹽水度冷丁本發(fā)明藥物組合物(H)本發(fā)明藥物組合物(M)本發(fā)明藥物組合物(L)13mg0.780.390.19524.0+3.72.6±1.5**6.0±1.6**9.8±1.3**16.5±2.5**089.275.059.231.2010.840.660.35</table></tables>**P＜0.01對(duì)生理鹽水實(shí)施例七注射液肌注實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg/2ml)、中(0.39g/kg/2ml)、低(0.195g/kg/2ml)三個(gè)劑量組均可減少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明其對(duì)0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；其鎮(zhèn)痛抑制率分別為75.0％、59.2％、31.2％；與陰性對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。下述實(shí)驗(yàn)方法同前，陽(yáng)性對(duì)照組淤第七天給予度冷丁口服一次，其它各組分別給予等量生理鹽水及本發(fā)明藥物組合物口服，連續(xù)給藥7天，每天一次，未次給藥后30分鐘，每鼠分別腹腔注射0.6％醋酸生理鹽水0.2ml。表16、本發(fā)明藥物組合物對(duì)小鼠醋酸扭體的影響試驗(yàn)<tablesid="table19"num="019"><tablewidth="802">組別劑量(g/kg)扭體均數(shù)(次)抑制率(％)活性比模型組度冷丁本發(fā)明藥物組合物(高)本發(fā)明藥物組合物(中)13mg0.780.3922.04±3.73.6±2.4**7.5±3.3**10.8±3.1**083.665.950.9010.790.61</table></tables>**P＜0.01對(duì)模型組實(shí)施例一口服制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果從上表可見(jiàn)，度冷丁(0.013g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組均可減少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明其對(duì)0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；其鎮(zhèn)痛抑制率分別為83.6％、65.9％、50.9％、38.6％；與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。17、本發(fā)明藥物組合物對(duì)醋酸致小鼠疼痛的影響(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)模型組從上表實(shí)施例三口服制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，度冷丁(0.013g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組均可減少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明其對(duì)0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；其鎮(zhèn)痛抑制率分別為90.5％、58.6％、44.3％、33.8％；與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。表18、本發(fā)明藥物組合物對(duì)醋酸致小鼠疼痛的影響(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)模型組從上表實(shí)施例四口服制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，度冷丁(0.013g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組均可減少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明其對(duì)0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；其鎮(zhèn)痛抑制率分別為87.4％、79.1％、70.9％、58.7％；與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。表19、本發(fā)明藥物組合物對(duì)醋酸致小鼠疼痛的影響(n＝12，x±S)**P＜0.01對(duì)模型組從上表實(shí)施例二口服制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，度冷丁(0.013g/kg)與本發(fā)明藥物組合物高(0.78g/kg)、中(0.39g/kg)、低(0.195g/kg)三個(gè)劑量組均可減少0.6％醋酸溶液所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，表明其對(duì)0.6％醋酸溶液致小鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；其鎮(zhèn)痛抑制率分別為77.0％、56.5％、38.5％、27.5％；與對(duì)照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)施例十本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)的影響大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型的制備及給藥(同氟氏完全佐劑誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎試驗(yàn))各組動(dòng)物于末次給藥后1小時(shí)，在乙醚麻醉下處死，取兩足(含跗骨關(guān)節(jié))。10％甲醛固定，脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟包埋，5μm切片，HE染色后鏡下觀察大鼠炎性腫脹足的病理變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(一)正常對(duì)照組關(guān)節(jié)囊滑膜組織完好，滑膜上皮細(xì)胞被覆完整，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，骨板和骨細(xì)胞無(wú)異常。組織病變?cè)u(píng)分0級(jí)。(二)模型對(duì)照組關(guān)節(jié)囊滑膜組織不完整，滑膜上皮細(xì)胞增生肥大(++-+++)，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未可見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+++)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，部分骨板破壞，骨細(xì)胞無(wú)異常。組織病變?cè)u(píng)分3級(jí)。(三)低劑量組關(guān)節(jié)囊滑膜組織不完整，滑膜上皮細(xì)胞壞死脫落(++-+++)，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未可見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(++)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，骨板和骨細(xì)胞無(wú)異常。較模型組比較，形態(tài)學(xué)有所改善。組織病變?cè)u(píng)分2級(jí)。(四)中劑量組關(guān)節(jié)囊滑膜組織不完整，滑膜上皮細(xì)胞壞死脫落(++)，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未可見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，骨板和骨細(xì)胞無(wú)異常。較模型組比較，形態(tài)學(xué)介與大劑量組和小劑量組之間。組織病變?cè)u(píng)分2級(jí)。(五)高劑量組關(guān)節(jié)囊滑膜組織較完整，滑膜上皮細(xì)胞壞死脫落(+)，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未可見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，骨板和骨細(xì)胞無(wú)異常。較模型組比較，形態(tài)學(xué)好與中劑量組。組織病變?cè)u(píng)分1級(jí)。(六)陽(yáng)性對(duì)照組關(guān)節(jié)囊滑膜組織較完整，滑膜上皮細(xì)胞壞死脫落(+)，纖維膜清晰可見(jiàn)，囊腔內(nèi)未可見(jiàn)滲出物，滑膜、滑膜下組織見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(+)。骨小梁排列呈網(wǎng)狀，大小基本一致，骨板和骨細(xì)胞無(wú)異常。形態(tài)學(xué)與高劑量組接近。組織病變?cè)u(píng)分1級(jí)。實(shí)施例十一本發(fā)明藥物組合物對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎淋巴細(xì)胞功能和細(xì)胞因子的影響地塞米松針劑，規(guī)格5mg/mL，由金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠提供，批號(hào)021205；本發(fā)明藥物組合物為自制制劑，試驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌注射用水稀釋至所需濃度；氟氏完全佐劑，規(guī)格為10ml/支，Sigma公司生產(chǎn)，由北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司提供，批號(hào)為033k8933；刀豆蛋白A、脂多糖，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，用完全RPMI1640培養(yǎng)液配成1g/L母液，經(jīng)內(nèi)徑0.2μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；RPMI1640培養(yǎng)粉，美國(guó)Gibco公司，RPMI1640培養(yǎng)液加25mM/LHepes，1mM/L丙酮酸鈉，2mM/L谷胺酰胺，50μM/L二巰基乙醇，10萬(wàn)IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素，10％小牛血清(NBS)，pH7.4。Hepes，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。MTT，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用含0.5％GS的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)配成5g/L使用液，4℃冰箱避光保存。異丙醇(AR)由本?；瘜W(xué)試劑庫(kù)提供，酸化異丙醇的配制即含0.04mM/L鹽酸的異丙醇。大鼠IL-1β、TNF-α定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。健康成年SD大鼠，♂，體重(180±20)g，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物房提供，合格證號(hào)sckx(蘇)2002-0011。Napco-6100型CO2培養(yǎng)箱，美國(guó)杜邦公司產(chǎn)品。EL301Stripreader(酶標(biāo)儀)，美國(guó)Bio-Tek公司產(chǎn)品。按文獻(xiàn)方法(陳奇，中藥藥理研究方法學(xué)[M]。北京人民衛(wèi)生出版社，1993，369)，先用強(qiáng)力碘消毒大鼠左后足跖，再將0.1ml氟氏完全佐劑(FCA)皮內(nèi)注入大鼠足跖。將SD大鼠按體重隨機(jī)分為6組，即正常組，地塞米松組，生理鹽水組，本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組。給藥方案陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組分別注射地塞米松16mg/Kg與生理鹽水，隔5天一次，給藥組按成人體表面積與大鼠體表面積之比例換算，每日一次，給藥途徑肌注。胸腺、脾淋巴細(xì)胞懸液的制備(魏偉，沈玉先，徐叔云，免疫細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。見(jiàn)徐叔云、陳修主編藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版)，北京人民衛(wèi)生出版社，20021421-22)將大鼠放血致死，取胸腺或脾，放入盛有冷的10mlHBSS瓶皿中的不銹鋼絲網(wǎng)100目上，剔除脂肪和結(jié)締組織。將胸腺或脾剪成兩段，用結(jié)核菌素注射器的針芯輕輕捻碎組織，使單個(gè)細(xì)胞經(jīng)網(wǎng)進(jìn)入溶液中，再經(jīng)不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾至離心管中，離心(250g，5min)后棄上清。經(jīng)低滲處理除去紅細(xì)胞，用冷HBSS液洗滌細(xì)胞3次，最后用含10％NBS的完全1640培養(yǎng)液1-2ml懸浮細(xì)胞，作細(xì)胞計(jì)數(shù)及測(cè)定細(xì)胞的存活率，并調(diào)整細(xì)胞為1×1010.L-1。淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定(魏偉，沈玉先，徐叔云，淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定。見(jiàn)徐叔云、卞如濂、陳修主編藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版)，北京人民衛(wèi)生出版社，20021426-28)T淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定無(wú)菌取胸腺，制備胸腺淋巴細(xì)胞懸液，用完全1640培養(yǎng)液調(diào)至1×1010.L-1，于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，ConA100μL(終濃度5mg.L-1)體外實(shí)驗(yàn)加細(xì)胞懸液100μL，ConA50μL，不同濃度的本發(fā)明藥物組合物50μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5％CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)結(jié)束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L-1)10μL，于震蕩器上振蕩1min，再放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。培養(yǎng)結(jié)束后以760g，離心10min，吸棄上清后每孔加入120μL的0.04M酸化異丙醇，于震蕩器上振蕩30s，在酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處讀取每孔A值，結(jié)果以A的均值表示。B淋巴細(xì)胞功能的測(cè)定無(wú)菌取脾，，制備脾淋巴細(xì)胞懸液，用完全1640培養(yǎng)液調(diào)至1×1010.L-1，于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，LPS100μL(終濃度4mg.L-1)體外實(shí)驗(yàn)加細(xì)胞懸液100μL，LPS50μL，不同濃度的本發(fā)明藥物組合物50μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，在培養(yǎng)結(jié)束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L-1)10μL，于震蕩器上振蕩1min，再放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。培養(yǎng)結(jié)束后以760g，離心10min，吸棄上清后每孔加入120μL的0.04M酸化異丙醇，于震蕩器上振蕩30s，在酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處讀取每孔A值，結(jié)果以A的均值表示。IL-2的誘生與檢測(cè)(沈玉先，魏偉，徐叔云，細(xì)胞因子的測(cè)定。見(jiàn)徐叔云、卞如濂、陳修主編藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第三版)，北京人民衛(wèi)生出版社，20021438-42)常規(guī)制備胸腺淋巴細(xì)胞懸液，用含10％NBS的完全1640培養(yǎng)液調(diào)成5×1010.L-1。在無(wú)菌24孔培養(yǎng)板中，加入100μL細(xì)胞懸液，100μLConA(終濃度5mg.L-1)，800μL完全1640培養(yǎng)液，總體積1ml，體外實(shí)驗(yàn)加細(xì)胞懸液500μL，ConA250μL，不同濃度的本發(fā)明藥物組合物250μL，混合后置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后離心(500g，10min)，收集上清，于-20℃保存待測(cè)。采用活化的小鼠脾細(xì)胞MTT比色法檢測(cè)。常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液2×109.L-1，加入5mg.L-1ConA，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4d，用5％NBS-Hank’s液洗滌細(xì)胞3次，用完全1640培養(yǎng)液調(diào)成1×109.L-1活化的小鼠脾細(xì)胞懸液。于96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100μL細(xì)胞懸液，100μL含IL-2的上清，同時(shí)設(shè)相應(yīng)濃度的ConA和培養(yǎng)液對(duì)照。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)結(jié)束前2h每孔加入MTT溶液(5g.L-1)10μL，于震蕩器上振蕩1min，再放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。培養(yǎng)結(jié)束后以760g，離心10min，吸棄上清后每孔加入120μL的0.04M酸化異丙醇，于震蕩器上振蕩30s，在酶標(biāo)儀于570nm波長(zhǎng)處讀取每孔A值，結(jié)果以A的均值表示。血清IL-1β、TNF-α含量的測(cè)定采用雙抗體夾心法，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品100μL加入經(jīng)抗大鼠細(xì)胞因子抗體包被的酶標(biāo)板內(nèi)，37℃120分鐘，用洗滌液洗板4-6次，向?yàn)V紙上印干，加入生物素化的第一抗體工作液50μL，37℃60分鐘，洗板同前，加入酶標(biāo)抗體工作液100μL，37℃60分鐘，洗板同前，加入酶底物OPD工作液100μL，37℃暗反應(yīng)5-10分鐘，加入一滴終止液，于492nm處測(cè)吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62.5、32、16、0pg/ml之OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)細(xì)胞因子的含量。所有數(shù)據(jù)均以x±S形式表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。表20、本發(fā)明藥物組合物治療給藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺和脾淋巴細(xì)胞增殖及IL-2產(chǎn)生的影響(x±S，n＝10)**P＜0.01對(duì)正常組；*P＜0.05，**P＜0.01對(duì)模型組實(shí)驗(yàn)表明佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的生成明顯高于正常組，本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)兩個(gè)劑量組可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的生成，其對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制率分別為32.1％、31.0％，對(duì)IL-2生成的抑制率分別為17.5％、14.0％；與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)。LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化。各組體外給藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠胸腺和脾淋巴細(xì)胞增殖及IL-2產(chǎn)生的影響(見(jiàn)圖1)圖1中**P＜0.01對(duì)正常組；*P＜0.05，**P＜0.01對(duì)模型組實(shí)驗(yàn)表明佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的生成明顯高于正常組，本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)兩個(gè)劑量組均可明顯抑制T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的生成，其對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制率分別為39.0％、22.1％，對(duì)IL-2生成的抑制率分別為27.3％、18.2％；與模型組比較，有顯著性差異。LPS誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖無(wú)明顯變化。各組治療給藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影響見(jiàn)下表13表21、本發(fā)明藥物組合物治療給藥對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α的影響(x±S，n＝10)**P＜0.01對(duì)正常組；*P＜0.05，**P＜0.01對(duì)模型組實(shí)驗(yàn)表明佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠誘導(dǎo)的血清中IL-1β、TNF-α的量明顯高于正常組，陽(yáng)性對(duì)照組(0.4mg/kg/2ml)及本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)兩個(gè)劑量組均可明顯降低血清中IL-1β、TNF-α的含量，其降低IL-1β的量分別為4.0pg/ml、3.3pg/ml、3.1pg/ml，降低TNF-α的量分別為4.6pg/ml、3.5pg/ml、3.2pg/ml。與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)顯示FCA大鼠ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯升高，而LPS誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)不明顯，這可能是FCA大鼠以T細(xì)胞免疫功能改變?yōu)橹?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示體內(nèi)外給藥可明顯抑制ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的生成；提示本發(fā)明藥物組合物可能通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞的激活致細(xì)胞因子的釋放和抑制T淋巴細(xì)胞的激活增殖兩條途徑減少I(mǎi)L-2的釋放來(lái)改善異常的免疫功能狀態(tài)，可能是其抑制關(guān)節(jié)炎形成的機(jī)制之一。國(guó)內(nèi)外研究表明有效抑制IL-1、TNF-α的產(chǎn)生，阻止滑膜成纖維的高度增殖是RA治療的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠IL-1β、TNF-α定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒測(cè)定大鼠血清中IL-1β、TNF-α的含量，結(jié)果表明本發(fā)明藥物組合物能夠降低大鼠血清中IL-1β、TNF-α的量；證明本發(fā)明藥物組合物通過(guò)抑制細(xì)胞因子的過(guò)度分泌治療RA。實(shí)施例十二本發(fā)明藥物組合物對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠炎性腫脹足前列腺素E2(PGE2)含量的影響地塞米松針劑，規(guī)格5mg/mL，由金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠提供，批號(hào)021205；本發(fā)明藥物組合物為自制制劑，試驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌注射用水稀釋至所需濃度；甲醇、氫氧化鉀由中國(guó)藥科大學(xué)化學(xué)試劑庫(kù)提供；氟氏完全佐劑，規(guī)格為10ml/支，Sigma公司生產(chǎn)，由北京舒伯偉化工儀器有限責(zé)任公司提供，批號(hào)為033k8933。健康成年SD大鼠，♂，體重(180±20)g，由中國(guó)藥科大學(xué)動(dòng)物房提供，合格證號(hào)sckx(蘇)2002-0011。按文獻(xiàn)方法(陳奇，中藥藥理研究方法學(xué)[M]。北京人民衛(wèi)生出版社，1993，369)，先用強(qiáng)力碘消毒大鼠左后足跖，再將0.1ml氟氏完全佐劑(FCA)皮內(nèi)注入大鼠足跖。將SD大鼠按體重隨機(jī)分為5組，即地塞米松組，生理鹽水組，本發(fā)明藥物組合物高、中、低三個(gè)劑量組。給藥方案陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組分別注射地塞米松16mg/Kg與生理鹽水，隔5天一次，給藥組按成人體表面積與大鼠體表面積之比例換算，每日一次，給藥途徑肌注。末次給藥后1h在每只大鼠的左后踝關(guān)節(jié)上0.5cm處剪下炎性腫脹足，稱重、去皮、剪碎，生理鹽水5ml浸泡1h，取出鼠爪，離心浸泡液，吸取上清夜0.1ml。加0.5M/L的氫氧化鉀-甲醇溶液2ml，在50℃水浴中異構(gòu)化20分鐘，用甲醇稀釋至20ml，于波長(zhǎng)270nm處測(cè)定光密度值(OD)，以每克組織相當(dāng)?shù)奈展饷芏戎当硎綪GE2的含量[30-31]。所有數(shù)據(jù)均以x±S形式表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)及軟組織PGE2含量的影響見(jiàn)下表14表22、本發(fā)明藥物組合物對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)及軟組織PGE2含量的影響(x±S，n＝10)**P＜0.01對(duì)模型組。實(shí)驗(yàn)表明佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型組PGE2含量明顯高于其它各給藥組，本發(fā)明藥物組合物高(0.54g/kg/2ml)、中(0.27g/kg/2ml)、低(0.135g/kg/2ml)三個(gè)劑量組均可降低炎性腫脹足PGE2的含量，其降低的量分別為25.6、16.1、10.0(OD×1000)；與陰性對(duì)照組相比，有顯著性意義(P＜0.01)。權(quán)利要求1.一種治療炎性骨病的藥物組合物，其特征在于主要是由下列重量份的原料藥制成黃連2-10份、黃柏2-10份、黃芩2-10份、蜈蚣1-5份、全蝎1-5份、壁虎1-5份。2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中原料藥的用量為黃連4-8份、黃柏4-8份、黃芩4-8份、蜈蚣2-3份、全蝎2-3份、壁虎2-3份。3.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中原料藥的用量為黃連6份、黃柏6份、黃芩6份、蜈蚣3份、全蝎3份、壁虎3份。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)藥物組合物的制備方法，包括下列步驟1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用水和/或乙醇提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B，與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得口服制劑。5.權(quán)利要求4藥物組合物的制備方法，其特征在于步驟2)中原料藥用含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；步驟3)中濃縮液B加入乙醇至溶液含醇量達(dá)70-80％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；將濃縮液C與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得膠囊劑、口服液、片劑或丸劑。6.權(quán)利要求4藥物組合物的制備方法，其特征在于原料藥用水或20～50％乙醇液提取，得提取液A；向濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)80-90％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，與藥學(xué)上可接受的輔料混合，制得膠囊劑或丸劑。7.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)藥物組合物的制備方法，包括下列步驟1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用水和/或乙醇提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B；4)取步驟3)的濃縮液B加入乙醇至溶液含醇量達(dá)70-80％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；5)向步驟4)的濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)80-90％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，加入水，放置后，過(guò)濾，濾液濃縮至浸膏D；6)取步驟5)的浸膏D與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成各種制劑。8.權(quán)利要求7藥物組合物的制備方法，其中1)稱取各原料藥，備用；2)將所述重量配比的原料藥用液含0～95％乙醇的水溶液提取，得提取液A；3)將步驟2)的提取液A濃縮，得濃縮液B；4)取步驟3)的濃縮液加入乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮，得濃縮液C；5)向步驟4)的濃縮液C中，加入乙醇至溶液含醇量達(dá)85％；將該含醇液放置后過(guò)濾，取濾液濃縮至無(wú)醇味后，加水至溶液體積為藥材重量的1.2-1.5倍，放置后過(guò)濾，濾液濃縮，得浸膏D；取浸膏D與藥學(xué)上可接受的載體混合，制成各種制劑。9.權(quán)利要求8藥物組合物的制備方法，其中將所述重量配比的原料藥用水或20～50％乙醇提取，得提取液A；濃縮后過(guò)濾，向?yàn)V液中加乙醇至溶液含醇量達(dá)75％，靜置過(guò)夜，過(guò)濾，取濾液濃縮除盡乙醇，冷藏過(guò)夜后，過(guò)濾，取濾液加乙醇至溶液含醇量達(dá)85％，再冷藏過(guò)夜，過(guò)濾，濾液回收乙醇并蒸發(fā)除盡乙醇得濃縮液，加水至溶液體積為藥材重量的1.3-1.4倍，冷藏后過(guò)濾，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.36的浸膏，按常規(guī)制成注射液或口服制劑。10.權(quán)利要求1-3任一藥物組合物在制備抑制炎癥介質(zhì)IL-1、TNF-α和/或抑制IL-2的表達(dá)藥物中的應(yīng)用，包括在制備治療炎性骨病中藥物中的應(yīng)用，所述炎性骨病有風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)增生，以及與炎性骨病有關(guān)的神經(jīng)痛。全文摘要一種治療炎性骨病的藥物組合物，主要由黃連2－10份、黃柏2－10份、黃芩2－10份、蜈蚣1－5份、全蝎1－5份、壁虎1－5份制成，其可抑制炎癥介質(zhì)IL－1、TNF－α、IL－2及前列腺素E2，用于治療炎性骨病，包括風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、骨質(zhì)增生以及神經(jīng)痛，具有顯著鎮(zhèn)痛和消炎作用，不良反應(yīng)少，標(biāo)本兼治。文檔編號(hào)A61P19/00GK1733129SQ20051004157公開(kāi)日2006年2月15日申請(qǐng)日期2005年8月23日優(yōu)先權(quán)日2005年8月23日發(fā)明者吳玉林,王從品,李運(yùn)曼申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)