專利名稱：治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法，屬于中藥領域。
背景技術：
帕金森病和帕金森綜合癥(Parkinson，PD)是臨床常見病，特別是隨著人口老齡化，老年人口的比例和絕對數(shù)逐漸增加，作為老年退行性腦病的帕金森病和帕金森綜合癥其發(fā)病率和患病率正迅速增加。帕金森病(PD)是以進行性運動功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病，震顫、僵直及運動減少是其最主要的臨床表現(xiàn)。
目前，市場上尚無治療帕金森病和帕金森綜合癥的中成藥。帕金森病及帕金森綜合癥的治療主要是藥物治療和手術治療兩大類，手術療法由于有嚴格的適應癥(原發(fā)性帕金森病的部分患者)、70％左右的復發(fā)率、技術難度大，存在手術并發(fā)癥、價格昂貴等因素，因此，僅僅限于大醫(yī)院的少量患者，不能普及，而大量的患者還是主要依靠藥物治療為主。目前的藥物治療主要是西藥為主，常用的藥物分為多巴胺類制劑，如左旋多巴、美多芭、息寧等，這是治療帕金森病的主要藥物，另外，還有多巴胺受體激動劑，如溴隱停、協(xié)良行等，抗膽堿能藥物，如安坦等，另外，還有增加多巴胺釋放的藥物，如金剛烷胺，抑制多巴胺降解的藥物，如Selegiline等。目前的治療藥物主要是改善癥狀，不能延緩病情的發(fā)展，并且，很多研究發(fā)現(xiàn)，雖然多巴胺類替代療法療效顯著，但應用過早，或長期應用，或用量較大，反而可能促進自身的多巴胺能神經(jīng)細胞的萎縮，和產生多巴胺的功能喪失，使病情進行性加重，因此，現(xiàn)在一般不主張早期應用多巴胺類制劑，也不主張大量應用。而提出“細水長流，不求全效”的用藥思路，或推廣“假日療法”等。一般多巴胺類制劑的療效在用藥5～10年后趨于消失，機體不再有效地吸收和利用多巴胺，最后出現(xiàn)無藥可醫(yī)的局面。另外，治療帕金森病的藥物多數(shù)存在較多的副作用，長期應用的患者多數(shù)出現(xiàn)幻覺、異動癥、低血壓、胃部不適、嚴重心衰、心律失常、精神病、運動障礙等不良反應，并且長期應用還可以出現(xiàn)“開關現(xiàn)象”、“劑末現(xiàn)象”、“劑量高峰多動癥”等特殊問題，同時很多合并癥如冠心病、低血壓、糖尿病、青光眼、胃病等均因為不良反應限制了西藥的應用。還有巴胺類替代療法對帕金森綜合癥往往療效較差，甚至無效，所以，積極尋找其它安全有效的治療辦法，改善患者生存質量，尤其是早期輕型患者，能代替巴胺類制劑的又無不良反應的藥物以及重癥患者提高巴胺類制劑療效、增加其療效持續(xù)時間、減輕其不良反應的增效減毒，改善患者生存質量的藥物是現(xiàn)代帕金森病藥物研究和開發(fā)的重點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種在總結多年臨床治療帕金森病經(jīng)驗的基礎上，通過對帕金森病臨床患者的臨床癥狀、證候和體質的特點、以及病因病機的深入研究而制成治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物。
本發(fā)明的另一個目的是提供了該中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明藥物選擇白芍、鉤藤、天麻、蒺藜、石決明、制何首烏、珍珠母、牡蠣、丹參、炙甘草進行組合的，將這些藥物組合使得各藥物功效產生作用，從而能夠有效地治療帕金森病患者的癥狀。其中選用白芍是因為白芍具有平抑肝陽，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙，與天麻、鉤藤等配伍，可以起到平肝潛陽，熄風止痙，用于陰虛陽亢，風邪內動，肢體或頭部震顫、抖動，眩暈、頭痛、煩躁易怒等肝陽上亢，肝風內動證；選用鉤藤是因為鉤藤具有息風止痙，平肝清熱之功，與白芍合用加強白芍平肝息風舒解肢體筋脈攣縮，動作緩慢不靈和肢體震顫的作用；選用天麻是因為天麻具有息風止痙，平肝潛陽，祛風通絡之功。與白芍合用，可以加強平抑肝陽、舒痙止顫的作用；選用蒺藜是因為蒺藜具有平肝疏肝，祛風明目之功，與白芍、天麻等合用，可以輔助和加強白芍、鉤藤平肝潛陽，息風止痙的作用；選用石決明是因為石決明具有清泄肝火，鎮(zhèn)潛肝陽之功，同時由于具有咸寒滋養(yǎng)肝陰的作用，與白芍合用，可以加強白芍的滋補肝之陰血緩解筋脈拘急的作用；選用制何首烏是因為制何首烏具有補益肝腎陰血，潤腸通便之功。與白芍合用，可以加強白芍的滋補肝之陰血緩解筋脈拘急的作用。同時，何首烏還具有潤腸通便之功，對帕金森病患者多數(shù)合并有的便秘有較好的作用；選用珍珠母是因為珍珠母具有平肝潛陽，清肝明目，鎮(zhèn)靜安神作用，與白芍合用，可以加強白芍的平抑肝陽，養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙的作用。與石決明、佐藥牡蠣等重鎮(zhèn)藥平肝潛陽藥物合用，可以加強平肝潛陽，重鎮(zhèn)止顫的作用。與鉤藤合用，可以加強鉤藤平抑肝陽之功；選用牡蠣是因為具有平肝潛陽，重鎮(zhèn)安神的作用，與石決明、珍珠母合用，適用于肝陰不足，肝陽上亢所致的震顫、眩暈、頭痛、煩躁易怒等證。同時牡蠣質重能鎮(zhèn)，具有安神之功，適用于心神不安，驚悸怔忡，失眠多夢等證；選用丹參是因為丹參具有活血止痛，清心除煩的功效，另外丹參活血養(yǎng)血可加強白芍養(yǎng)血滋陰的作用，丹參藥性偏涼，善入心經(jīng)，能清心除煩安神，與重鎮(zhèn)的石決明、珍珠母、牡蠣合用，對于帕金森病患者的心神不安，驚悸怔忡，失眠多夢等證有較好的治療作用；選用炙甘草是因為炙甘草具有益氣補中，緩急止痛，調和藥性的作用，炙甘草味甘，與白芍合用，酸甘化陰，柔筋緩急止痛，可以加強白芍的養(yǎng)血斂陰，柔肝止痙，緩解筋脈拘急，進而增加肢體靈活性。同時由于炙甘草味甘性平，得中和之性，能緩和鉤藤、天麻、蒺藜諸藥之剛性，使其作用柔和而持久，不致于作用過強而傷肝，與石決明、珍珠母、牡蠣等質重的介類重鎮(zhèn)之品合用，可以減輕對胃的刺激，減緩其重鎮(zhèn)潛降之性，固護肝胃，因此既有佐藥的作用，又有使藥的作用。綜合全方諸藥，本品具有平肝潛陽，養(yǎng)血斂陰，熄風止痙，養(yǎng)心安神，舒痙止顫之功，諸藥合力，起到了滋補肝腎，平肝潛陽，息風止痙的作用，正好與本品的病機肝腎陰虛、肝陽上亢，肝風內動基本一致，達到改善帕金森氏病、帕金森綜合癥患者的癥狀和生存質量。
本發(fā)明藥物是由下列組份制成的(用量為重量份)白 芍73.73～2.99鉤 藤73.73～2.99天麻44.16～1.79蒺 藜74.72～3.03石決明73.73～2.99制何首烏53.09～2.15
珍珠母73.73～2.99牡 蠣73.73～2.99丹參53.09～2.15炙甘草22.23～0.90。
制備本發(fā)明藥物的配方優(yōu)選重量(份)配比范圍是白 芍47.88～2.99鉤 藤47.88～2.99天麻28.68～1.79蒺 藜48.52～3.03石決明47.88～2.99制何首烏34.48～2.15珍珠母47.88～2.99牡 蠣47.88～2.99丹參34.48～2.15炙甘草14.44～0.90。
本發(fā)明藥物的最佳重量(份)配比是白 芍11.97 鉤 藤11.97 天麻7.17蒺 藜12.13 石決明11.97 制何首烏8.62珍珠母11.97 牡 蠣11.97 丹參8.62炙甘草3.61。
本發(fā)明藥物可以采用中藥制劑的常規(guī)方法制備成任何常規(guī)的內服藥品。
將上述各組份制成本發(fā)明藥物的制備方法是a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，提取多次，每次0.5～3.0小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～1.3，備用；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小時，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。
輔料可以是糊精、阿斯帕坦。
本發(fā)明藥物具有平肝潛陽、熄風止痙之功效。用于治療因肝陽上亢，肝風內動引起的帕金森病和帕金森綜合癥，癥見肢體振顫、僵硬、不靈活，動作緩慢，便秘，面部表情呆板、行動困難，眩暈、頭痛、煩躁易怒、肢體麻木、失眠、多夢、心悸，舌質紅，脈弦等病癥。


圖1是HPLC標準品檢測圖譜。
圖2是HPLC紋狀體樣品檢測圖譜。
圖3是致帕金森病樣模型大鼠黑質處酪氨酸羥化酶免疫組化染色圖譜。
圖4是本發(fā)明藥物對單側黑質紋狀體通路損毀大鼠模型的藥理作用的技術路線圖。
圖5是本發(fā)明藥物顆粒對藥物性肌肉震顫模型小鼠的藥理作用示意圖。
圖6是本發(fā)明藥物顆粒對MPTP致PD樣模型小鼠的藥理作用示意圖。
具體實施例方式
以下通過實驗例來進一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果，這些實驗例為本發(fā)明藥物的藥效學試驗[實驗例I]本發(fā)明藥物對單側黑質紋狀體通路損毀大鼠模型的藥理作用本實驗例考察本發(fā)明藥物對單側黑質紋狀體通路損毀致帕金森病樣模型大鼠的運動功能、大鼠皮層過氧化脂質水平、紋狀體內多巴胺含量及黑質處神經(jīng)元數(shù)量的影響。
實驗材料1、動物SD大鼠，雄性，體重200±20g2、試劑與儀器試劑6-羥多巴胺(6-hydroxydapamine，6-OHDA)、辛烷磺酸鈉鹽(octylsulfate sodium salt，OSA)、多巴胺(Dopamine，DA)、二羥基苯乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、二羥基苯甲胺(3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid，TBA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra-acetic acid，EDTA)、高氯酸、甲醇、酚、酪胺酸羥化酶抗體。
儀器SN-2N型動物腦立體定位儀、8453型紫外可見分光光度計、高效液相色譜儀、460電化學檢測器、碳18反相色譜柱、T21型高速冷凍離心機、Image-pro plus圖象采集及分析系統(tǒng)。
實驗方法1、紋狀體6-OHDA定向損毀大鼠模型的建立參照Yukio lchitani等的方法建立6-OHDA紋狀體定向損毀的大鼠PD模型6-OHDA溶于0.9％生理鹽水中(含0.1％抗壞血酸)。大鼠以10％水合氯醛麻醉，腦立體定位儀定位，平顱頭位，右側為健側，左側進行四點注射，四點分別為前囟前(AP)0.5-1.0mm，中線旁開(ML)3.0mm，自顱骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一點，及平前囟，中線旁開(ML)3.0mm，自顱骨表面深度(DV)5.5mm及4.5mm各一點，每點注射6-OHDA 2μl(3μg/μl)。對照組(假手術)注射等量生理鹽水。
2、大鼠旋轉行為的檢測及模型鼠的篩選參照郜文等的實驗方法術后2周起對各組實驗動物腹腔注射鹽酸阿樸嗎啡(0.25mg/kg)，觀察其行為學變化，3分鐘后，開始記錄大鼠旋轉次數(shù)，連續(xù)測定40分鐘。
在造模4周后進行篩選傳統(tǒng)的帕金森病樣大鼠模型制備方式為黑質處6-OHDA的定向損毀，選擇旋轉圈數(shù)＞6圈/分鐘的大鼠作為合格大鼠模型，但此時大鼠腦中多巴胺(DA)的含量已嚴重下降，多降低95％以上，為便于觀察藥物作用效果，我們選擇了6-OHDA紋狀體處定向損毀的中度損毀造模方式，選擇恒定向健側旋轉且旋轉圈數(shù)＞40圈/40分鐘的大鼠作為合格模型鼠，選擇任一次測定均不產生旋轉行為的假手術大鼠作為對照鼠，其余則淘汰。
在用藥2周和6周時，分別測定阿樸嗎啡誘導的各組大鼠的旋轉行為，測定時間40分鐘。計算每只大鼠用藥后旋轉圈數(shù)下降率。計算方法下降率＝(用藥前旋轉圈數(shù)-用藥后旋轉圈數(shù))/用藥前旋轉圈數(shù)×100％。
3、分組及給藥將經(jīng)篩選合格大鼠隨機分組。假手術組蒸餾水(10ml/kg)連續(xù)灌胃7周；模型組蒸餾水(10ml/kg)連續(xù)灌胃7周；本發(fā)明藥物組分別給予顆粒1g/kg、2g/kg、4g/kg連續(xù)灌胃7周；美多巴組(陽性對照藥組)給予美多巴50mg/kg/日(一日兩次)連續(xù)灌服7周。
4、腦組織脂質過氧化產物丙二醛(MDA)測定腦組織稱重，以1∶8的比例加0.2M pH7.4磷酸鹽緩沖液進行勻漿，3000rpm離心10min，取上清0.5ml。加1/24mol/L H2SO44ml、10％磷鎢酸0.5ml攪拌，室溫放置5分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，倒控1min。加1/24mol/LH2SO42ml、10％磷鎢酸0.3ml，攪拌，室溫放置5分鐘，3000rpm離心10分鐘，棄上清，倒控1分鐘。按下表加試劑。
測定管標準管空白管勻漿沉淀物 有- -四乙氧基丙烷(5nmol/ml) - 0.5 -生理鹽水(ml) 0.5 - 0.50.05mol/L HCl(ml)1 1 1TBA溶液6.7mg/ml(ml) 1 1 1加塞混勻，置沸水浴1h后冷卻，2000rpm離心5min，取上清，532nm測OD值計算丙二醛濃度丙二醛濃度＝f/F×5nmol/ml(F標準溶液OD，f樣品(OD)5、高效液相色譜法對腦組織單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產物的測定標準品配制各標準品都溶于流動相中，濃度為0.1mg/ml，使用時分別稀釋到10ng/ml，進樣量10μl。
色譜條件Waters公司碳十八反相色譜柱，洗脫液80mM磷酸氫二鈉，60mM檸檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。調pH為4.3，經(jīng)過濾脫氣后使用，流量1.0ml/min。電化學檢測器工作電壓0.7v，測定溫度37℃。標準品在濃度和峰面積間有良好的線性關系，r2＞0.99。
樣品預處理參照張林魁等人的方法進行樣品的預處理按照1∶10(w/v)的比例向紋狀體內加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，內標DHBA濃度為200ng/ml)制備勻漿，置高速冷凍離心機12000轉，溫度為4℃離心20分鐘。取上清10μl測定其中的多巴胺用其代謝產物的含量。
6、腦黑質處酪胺酸羥化酶的免疫組織化學染色灌注固定，取材用10％水合氯醛腹腔注射麻醉動物，將動物固定于平臺上，開胸，由心尖剪開左心室，插入灌注針頭至主動脈根部，并剪開右心耳，快速灌注溫鹽水，直至心室內無血，肝臟變白，再用預冷的灌注固定液進行灌注固定，直至動物全身僵直，再慢灌10-20分鐘后，取出腦組織放入后固定液中，待組織下沉后應用。
免疫組織化學染色將腦組織從后固定液中取出，用自來水沖洗，修塊，置于異戊烷中，放入液氮中速凍10-15鈔，組織經(jīng)冠狀切面切為40μm厚的組織薄片，將組織片放入PBS液中洗滌，5分鐘/次×3次，組織片用3％H2O2室溫孵育10分鐘，以去除內源性過氧化物酶活性，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，用5-10％封閉用羊血清室溫孵育30分鐘，以減少非特異性吸附，吸出羊血清，加入1∶5000稀釋的酪胺酸羥化酶抗體(TH室溫孵育2小時后轉入4℃孵育48小時。PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，加入生物素標記的鼠二抗(稀釋度為1∶300，37℃水浴箱中保溫30分鐘，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，加入辣根過氧化物酶標記的三抗(稀釋度為1∶200)，37℃水浴箱中保溫60分鐘，PBS洗液充分洗滌，5分鐘/次×3次，DAB顯色，鏡下控制染色程度，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照的設立分別以洗液和非免疫的正常兔血清代替一抗進行免疫組化染色，其余步驟同前。陽性反應為組織細胞結構呈棕黃色顆粒聚集。
免疫組織化學染色結果的圖象分析每組隨機選取3只大鼠行免疫組化切片，將切片置于10×10顯微鏡下觀察各動物黑質陽性細胞，用Image-pro plus軟件采集圖象并分析，記錄陽性細胞數(shù)，面積及平均灰度。
實驗結果
1.本發(fā)明藥物對模型大鼠旋轉行為的影響對于單側的黑質紋狀體通路損毀模型，同側的黑質-紋狀體通路破壞，紋狀體內的神經(jīng)元失去多巴胺能神經(jīng)的支配，其多巴胺受體處于一種超敏狀態(tài)，當給予外源性的多巴胺受體激動劑如阿樸嗎啡后，動物損傷側的反應就強于健側而無法保持平衡，并向健側旋轉，旋轉的頻率大致與黑質內的多巴胺能神經(jīng)元的受損程度一致。本研究給藥前、給藥后2周及6周，分別對大鼠進行了旋轉行為測定，為消除動物個體差異對實驗結果的影響，我們對每只大鼠分別進行給藥后自身旋轉次數(shù)下降率的計算，對模型組與其它各組下降率(％)作t檢驗。實驗發(fā)現(xiàn)模型組大鼠較對照組旋轉圈數(shù)明顯增高，本發(fā)明藥物各劑量組都明顯減少大鼠旋轉次數(shù)，其中本發(fā)明藥物1g/kg和2g/kg劑量組與模型組相比差異具顯著性(表1)。
表1.本發(fā)明藥物對6-OHDA大鼠旋轉行為的影響組別只數(shù)用藥前 用藥2周 用藥6周圈/40min 圈/40min 下降率％ 圈/40min 6周下降率％假手術組 10 0.0±0.0 0.0±0.0 /0.0±0.0 /模型組 10 96.2±88.190.4±102.5 25.2±36.9 87.5±132.6 27.6±30.3美多巴 10 136.9±92.0 111.7±94.0 29.1±24.9 67.8±82.867.5±30.9**本發(fā)明藥物1g/kg 10 105.5±97.9 68.8±102.6 49.0±40.5 54.4±87.556.9±42.2*本發(fā)明藥物2g/kg 10 122.3±71.6 79.8±49.237.2±38.1 54.8±42.154.9±26.2本發(fā)明藥物4g/kg 9 138.1±68.6 101.0±70.5 33.4±29.4 80.1±74.850.3±30.5對下降率(％)作t檢驗，與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.012)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠皮層過氧化脂質的影響給藥7周后，將大鼠斷頭處死，取腦皮層測定脂質過氧化代謝產物丙二醛(MDA)含量。結果表明模型組大鼠與正常對照組相比，皮層MDA的含量明顯升高，而本發(fā)明藥物顆粒用藥組則可顯著降低MDA的水平(表2)。
表2本發(fā)明藥物顆對6-OHDA大鼠腦皮層MDA的影響組別 N MDA(nmol/mg蛋白)假手術組 1868.9±13.4*模型組 1277.5±11.5本發(fā)明藥物1g/kg 1077.7±6.7本發(fā)明藥物4g/kg 1069.4±8.5*與模型組相比，*P＜0.053)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠腦紋狀體多巴胺神經(jīng)遞質及其代謝產物含量的影響大鼠給藥7周后，斷頭處死，取腦紋狀體，用高效液相色譜儀測定單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產物的含量。在此項檢測指標中，我們采用的計算方法如下神經(jīng)遞質含量降低率＝(健側神經(jīng)遞質含量-損毀側含量)/健側神經(jīng)遞質含量×100％。結果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠損毀側紋狀體內多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)含量降低率比對照組明顯加重。應用本發(fā)明藥物顆粒后，可明顯縮小損傷側與未損傷側神經(jīng)遞質含量的差異(請參閱圖1、圖2，表3)表3本發(fā)明藥物顆粒對6-OHDA模型大鼠紋狀體中多巴胺及其代謝產物含量降低率的影響組別 NDA降低率(％) DOPAC降低率(％)HVA降低率(％)假手術組 642.7±27.8**22.4±27.6**21.4±20.1**模型組 783.1±8.177.0±5.9 68.7±13.9美多巴50mg/kg868.0±17.5 61.3±13.9**59.2±14.5本發(fā)明藥物1g/kg 669.6±13.2*62.7±12.6*56.0±3.7*本發(fā)明藥物2g/kg 974.1±8.3*69.9±8.4*65.6±6.5本發(fā)明藥物4g/kg 672.7±20.6 61.0±16.9*67.9±16.9神經(jīng)遞質含量降低率＝(健側神經(jīng)遞質含量-損毀側含量)/健側神經(jīng)遞質含量×100％與模型組相比*P＜0.05，**P＜0.014)本發(fā)明藥物顆粒對模型大鼠黑質處酪胺酸羥化酶染色陽性細胞的影響在本項指標中，我們將每組動物左右側黑質處酪胺酸羥化酶(TH)染色陽性的細胞數(shù)進行自身對比，計算損毀側TH陽性細胞數(shù)及細胞面積的下降率，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠損毀側黑質處TH陽性細胞的下降率明顯高于正常對照組，應用本發(fā)明藥物顆?？墒菇档偷腡H陽性細胞率明顯回升(表4)表4，本發(fā)明藥物顆粒對6-OHDA模型大鼠黑質處酪胺酸羥化酶染色陽性細胞的影響組別 N 陽性細胞數(shù)下降率％ 陽性細胞面積下降率％假手術 3 32.32±15.61**26.35±15.32**模型組 3 87.32±4.21 80.83±8.92美多巴50mg/kg 3 62.37±19.93**58.90±22.20**本發(fā)明藥物1g/kg3 36.15±12.00**35.04±13.03**本發(fā)明藥物2g/kg3 37.54±6.62**38.28±5.16**本發(fā)明藥物4g/kg3 64.10±11.99**68.95±14.44**陽性細胞數(shù)下降率＝(健側-損傷側TH陽性細胞數(shù))/健側TH陽性細胞數(shù)×100％陽性細胞面積下降率＝(健側-損傷側TH陽性細胞面積)/健側TH陽性細胞面積×100％與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01實驗表明，本發(fā)明藥物顆?？梢詼p少神經(jīng)毒物6-羥多巴胺(6-OHDA)對黑質內多巴胺能神經(jīng)元的損害，對其具有良好的保護作用，明顯提升動物損毀紋狀體內多巴胺及其代謝產物的含量。
本發(fā)明藥物顆粒對藥物性肌肉震顫模型小鼠的藥理作用本實驗例選用了兩種藥物性肌肉震顫模型檳榔堿震顫和氧合震顫素震顫。記錄動物出現(xiàn)震顫的潛伏期及震顫持續(xù)的時間，以觀察本發(fā)明藥物顆粒對藥物震顫行為的影響。
實驗材料1、動物ICR小鼠，雄性，清潔級，體重18±2g。
2、試劑氧化震顫素(Oxotremorin)、檳榔堿(Arecoline)。
實驗方法1、動物分組及給藥情況小鼠隨機分組，正常對照組小鼠在給予0.9％生理鹽水單次腹腔注射(0.3ml/只)前，給予蒸餾水連續(xù)灌胃(0.3ml/只)3周；模型組小鼠給予檳榔堿(25mg/kg)或氧化震顫素(0.15mg/kg)單次腹腔注射前蒸餾水連續(xù)灌胃(0.3ml/只)3周；藥物預實驗后，我們對本發(fā)明藥物組顆粒用藥組小鼠造模前連續(xù)灌胃3周，本發(fā)明藥物顆粒劑量分別為1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴組(陽性對照藥組)小鼠在造模前1天，美多巴65mg/kg灌胃。
2、檳榔堿肌肉震顫小鼠行為評價采用成年ICR小鼠，檳榔堿25mg/kg腹腔注射，記錄每只小鼠自給予檳榔堿后至產生肉眼明顯可見的肌肉震顫所需時間為震顫潛伏期，震顫產生后至消失所需時間為震顫持續(xù)時間。
3、氧化震顫素震顫小鼠行為評價采用成年ICR小鼠，氧化震顫素0.15mg/kg腹腔注射，記錄每只小鼠自給予氧化震顫素后至產生肉眼明顯可見的肌肉震顫所需時間為震顫潛伏期，震顫產生后至消失所需時間為震顫持續(xù)時間。
實驗結果1、本發(fā)明藥物顆粒對檳榔堿致小鼠震顫行為的影響結果表明模型組小鼠在給予檳榔堿腹腔注射后，出現(xiàn)明顯的震顫、流涎、躁動不安等行為，其震顫持續(xù)的時間明顯高于對照組。本發(fā)明藥物顆粒給藥組小鼠在腹腔注射檳榔堿后，震顫、流涎、躁動不安等癥狀較模型組減輕，震顫持續(xù)時間較模型組顯著縮短(表5)。
表5本發(fā)明藥物顆粒對檳榔堿致小鼠震顫時間的影響組別 N 持續(xù)時間(秒)對照組 15 0.0±0.0**模型組 15 430.5±55.1美多巴(65mg/kg) 15 397.3±39.3*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 15 395.8±46.9*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 370.6±37.9**本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 15 406.8±46.9與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本發(fā)明藥物顆粒對氧化震顫素致小鼠震顫行為的影響結果表明模型組小鼠在給予氧化震顫素腹腔注射后，出現(xiàn)明顯的震顫行為，其震顫持續(xù)的時間明顯高于對照組。本發(fā)明藥物顆粒給藥組小鼠在腹腔注射氧化震顫素后，震顫、流涎、躁動不安等癥狀較模型組減輕，震顫持續(xù)時間較模型組顯著縮短(表6)。
表6本發(fā)明藥物顆粒對氧化震顫素致小鼠震顫時間的影響組別 N 持續(xù)時間(秒)對照組 15 0.0±0.0**模型組 15 38.9±7.6美多巴(65mg/kg) 15 32.1±4.1**本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 15 39.5±3.9*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 34.4±5.9*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 15 32.8±6.4*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01帕金森病人最直觀的臨床表現(xiàn)是肌肉震顫、僵直及運動不能。檳榔堿和氧化震顫素均為M受體激動劑，可以引起肌肉的劇烈收縮，能夠模擬該病的震顫表現(xiàn)，故本模型也是評價抗帕金病藥效的一種必要動物模型。本發(fā)明藥物能夠顯著縮短動物震顫持續(xù)時間。
本發(fā)明藥物顆粒對MPTP致PD樣模型小鼠的藥理作用實驗材料1、動物C57BL小鼠，雌、雄各半，清潔級，體重18±2g。
2、試劑及儀器1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)。
儀器CS-2型小鼠自主活動程序儀。
實驗方法1、MPTP致帕金森病小鼠模型的建立MPTP直接溶于0.9％無菌生理鹽水中，調節(jié)其終濃度為2mg/ml。模型組動物連續(xù)腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。
2、分組及給藥C57BL小鼠隨機分組。正常對照組蒸餾水灌胃3周后，腹腔注射與模型組等劑量的生理鹽水8天。模型組蒸餾水灌胃3周后，MPTP20mg/kg連續(xù)腹腔注射，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒用藥組在給予本發(fā)明藥物顆粒3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒在給予3周后，腹腔注射MPTP20mg/kg，共造模8天。本發(fā)明藥物顆粒的劑量分別為1g/kg、2g/kg、4g/kg；美多巴組(陽性對照藥組)為造模當天開始給予美多巴65mg/kg。
3、小鼠爬桿實驗參照Nobutaka Arai；Kazuaki Misugi的實驗方法略加修改，具體測定方法如下實驗用具為自制不銹鋼桿長0.5米，直徑1cm(其上用膠布纏繞)頂端為一直徑2.5cm的木制圓球，動物給予MPTP前一天，先進行爬桿訓練，引導動物10秒內由桿頂爬至桿底，每只訓練4次。正式測定時，首先測定應用MPTP前小鼠的爬桿時間，在給予MPTP后1-2小時內，對動物進行第二次爬桿時間的測定。具體測定方法如下持小鼠尾部，將其頭向下置于桿頂部(以小鼠后肢置于球上為準)，讓其自然爬下，記錄小鼠自站于桿頂至雙前肢接觸桿底平臺所需時間。測定時限120秒，鼠不能持桿，完全自然下滑者，記錄其爬桿時間為120秒。計算各組小鼠給予MPTP前后爬桿時間的差值(給予MPTP后爬桿時間短于未處理時，其數(shù)據(jù)記錄為0)。連續(xù)測定造模8天內各組小鼠處理前后爬桿時間差值。
4、小鼠自發(fā)活動記數(shù)測定參照李斌等報告的方法，應用中國醫(yī)學科學院藥物研究后研制的CS-2型小鼠自主活動程序儀測定小鼠自發(fā)活動次數(shù)，當計算機進入測定程序后，將小鼠放入活動箱中(高13cm，直徑25cm)，每次同時測定4只小鼠，每個活動箱中一只，由計算機自動記錄小鼠活動情況，測定每只鼠5分鐘內的活動次數(shù)，進行統(tǒng)計學處理。
5、高效液相色譜法對腦組織單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產物的測定標準品配制各標準品都溶于流動相中，濃度為0.1mg/ml，使用時，分別稀釋到10ng/ml，進樣量10μl。
色譜條件Waters公司碳十八反相色譜柱，洗脫液80mM磷酸氫二鈉，60mM檸檬酸，0.22mM乙二胺四乙酸二鈉，0.5mM octyl sulfate sodium salt，20％甲醇。調pH為4.3，經(jīng)過濾脫氣后使用，流量1.0ml/min。電化學檢測工作電壓0.7v，測定溫度37℃。標準品在濃度和峰面積間有良好的線性關系，r2＞0.99。
樣品預處理參照張林魁等人的方法進行樣品的預處理按照1∶20(w/v)的比例向紋狀體內加入0.1M高氯酸(每100ml含L-半胱氨酸5mg，內標DHBA濃度為200ng/ml)制備勻漿，置高速冷凍離心機12000轉4℃離心20分鐘。取上清10μl測定其中的多巴胺及其代謝產物的含量。
實驗結果1、本發(fā)明藥物顆粒對小鼠爬桿時間的影響爬桿時間反映了動物的協(xié)調運動能力。協(xié)調性好則動物爬桿時間所需時間短，協(xié)調性差，則爬桿時間長。結果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠爬桿時間與正常對照組相比顯著延長，本發(fā)明藥物顆粒用藥組小鼠爬桿時間明顯縮短(表7)。
表7本發(fā)明藥物顆粒對小鼠爬桿時間的影響組別N 造模后時間-造模前時間(秒)對照組 140.32±0.69**模型組 159.19±5.09美多巴(65mg/kg) 157.09±3.20*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 135.67±3.18**本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 156.70±3.68*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 145.45±2.64*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.012、本發(fā)明藥物顆粒對小鼠自主活動的影響自主活動數(shù)反映了動物的隨意運動能力。模型組小鼠與正常對照組相比，自主活動明顯減少。本發(fā)明藥物顆粒用藥組小鼠自主活動較模型組顯著增加(表8)。
表8本發(fā)明藥物顆粒對小鼠自主活動的影響組別 N 造模后時間-造模前時間(秒)對照 14 38.6±33.0**模型 15 12.2±9.2美多巴(65mg/kg) 15 70.0±34.7**本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 13 18.7±8.4*本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 15 18.9±11.9*本發(fā)明藥物顆粒噸/kg 14 20.7±13.2*與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.013、本發(fā)明藥物顆粒對MPTP模型小鼠腦紋狀體中多巴胺及其代謝產物含量的影響小鼠造模后14天，斷頭處死，取腦紋狀體用HPLC電化學檢測器測定單胺類神經(jīng)遞質及其代謝產物的含量。結果顯示模型組小鼠腦紋狀體內多巴胺(DA)、多巴酸(DOPAC)及高香草酸(HVA)的含量較對照組都明顯降低，差異具顯著性。各劑量本發(fā)明藥物顆粒都能不同程度的提高模型動物腦紋狀體內多巴胺的含量(表9)。
表9.本發(fā)明藥物顆粒對MPTP模型小鼠紋狀體多巴胺及其代謝產物含量的影響(ng/mg紋狀體重)組別 N DA DOPACHVA對照 10 7.02±2.54**6.17±1.99**2.91±0.57**模型 10 2.08±1.24 2.76±2.24 2.07±0.66美多巴(65mg/kg) 10 3.54±1.91*4.11±2.43 3.17±1.60*本發(fā)明藥物顆粒1g/kg 10 2.82±1.12 4.55±1.88*2.50±0.82本發(fā)明藥物顆粒2g/kg 10 3.60±1.83*5.37±1.78**2.76±0.90*本發(fā)明藥物顆粒4g/kg 10 4.43±2.32**3.74±1.18 2.30±0.53與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01結論1、對于單側黑質紋狀體通路損毀致帕金森病(PD)大鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒對模型鼠的異常旋轉行為有明顯的改善作用，它還能夠抑制模型鼠大腦皮層脂質過氧化產物的增多，增加黑質處酪胺酸羥化酶染色陽性神經(jīng)元數(shù)目，提升大鼠腦紋狀體內多巴胺及其代謝產物的含量。
2、對于檳榔堿及氧化震顫素所致的肌肉震顫小鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒能明顯減少震顫持續(xù)時間。
3、對于MPTP腹腔注射PD小鼠模型，本發(fā)明藥物顆粒能明顯增強小鼠運動協(xié)調性，縮短其爬桿時間，增強小鼠自主活動能力，提升小鼠腦紋狀體內多巴胺及其代謝產物的含量。
本發(fā)明藥物的顆粒劑制備本發(fā)明藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆茫籧)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的糊精及阿斯帕坦3g，噴霧干燥后制成本發(fā)明藥物的顆粒劑，經(jīng)過篩、整粒、分裝。
本發(fā)明藥物的膠囊劑制備本發(fā)明藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；
b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆?；c)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的輔料，制粒，干燥，分裝入明膠硬膠囊，即得到本發(fā)明藥物的膠囊劑。
本發(fā)明藥物的片劑制備該治病帕金森病的藥物由下列重量配比的原料藥制成白芍11.97、鉤藤11.97、天麻7.17、蒺藜12.13、石決明11.97、制何首烏8.62、珍珠母11.97、牡蠣11.97、丹參8.62、炙甘草3.61。
它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加4倍量70％的乙醇，回流提取3次，每次1.5小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液減壓回收乙醇并濃縮至相對密度為1.10～1.12，溫度為60℃?zhèn)溆?；c)藥渣與白芍、天麻、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加8倍量的水，煎煮2次，每次1.5小時，水煎液濾過，合并兩次濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.15～1.17，溫度為60℃；d)加入適量的輔料，制粒，干燥，壓制成片，分裝，即得到本發(fā)明藥物的片劑。
以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，凡依本發(fā)明專利要求范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明專利權利要求的涵蓋范圍。
權利要求
1.一種治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其特征在于它由下列重量配比的原料制成的藥劑白 芍 73.73～2.99 鉤 藤 73.73～2.99 天麻 44.16～1.79蒺 藜 74.72～3.03 石決明 73.73～2.99 制何首烏 53.09～2.15珍珠母 73.73～2.99 牡 蠣 73.73～2.99 丹參 53.09～2.15炙甘草 22.23～0.90。
2.根據(jù)權利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其中各原料的重量配比是白 芍 47.88～2.99 鉤 藤 47.88～2.99 天麻 28.68～1.79蒺 藜 48.52～3.03 石決明 47.88～2.99 制何首烏 34.48～2.15珍珠母 47.88～2.99 牡 蠣 47.88～2.99 丹參 34.48～2.15炙甘草 14.44～0.90。
3.根據(jù)權利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物，其中各原料的重量配比是白 芍 11.97鉤 藤 11.97天麻 7.17蒺 藜 12.13石決明 11.97制何首烏 8.62珍珠母 11.97牡 蠣 11.97丹參 8.62炙甘草 3.61。
4.根據(jù)權利要求1所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥藥物的制備方法，其特征在于，它包括下列步驟a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，回流提取多次，每次0.5～3.0小時，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～1.3，備用；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，每次0.5～3.0小時，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。
5.根據(jù)權利要求4所述的治療帕金森病及帕金森綜合癥藥物的制備方法，其特征在于輔料是糊精、阿斯帕坦。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有效治療帕金森病及帕金森綜合癥的藥物及其制備方法，它是以白芍、鉤藤、天麻、蒺藜、石決明、制何首烏、珍珠母、牡蠣、丹參、炙甘草為原料，通過下述步驟制備a)將鉤藤、天麻、制何首烏、丹參加10～90％的乙醇，回流提取多次，合并乙醇提取液、過濾；b)濾液回收乙醇并濃縮至相對密度為1.0～13；c)藥渣與白芍、蒺藜、石決明、珍珠母、牡蠣、炙甘草加水煎煮多次，水煎液濾過，合并濾液及醇提濃縮液，濃縮至相對密度為1.1～1.4；d)加入適量的輔料，制成藥劑。本發(fā)明配方及制作方法獨特，治療效果顯著。
文檔編號A61P25/00GK1739743SQ20051003279
公開日2006年3月1日 申請日期2005年1月19日 優(yōu)先權日2005年1月19日
發(fā)明者王永炎, 袁銳光, 龍超峰, 謝稱石, 陳木洲 申請人:廣東眾生藥業(yè)股份有限公司