專利名稱：骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療缺氧缺血性腦性癱瘓的制劑的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域，涉及間質(zhì)干細(xì)胞的新用途，尤其是涉及骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療缺氧缺血性腦性癱瘓的制劑的用途。
背景技術(shù)：
圍產(chǎn)兒窒息所致的缺血缺氧性腦損傷(HIE)是引起新生兒腦性癱瘓(cerebral palsy)的主要原因。近20年來，盡管產(chǎn)科和新生兒醫(yī)療保健發(fā)展快速，但腦性癱瘓?jiān)谛律鷥褐邪l(fā)病仍無明顯降低，據(jù)1998年北京醫(yī)科大學(xué)等單位抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國0-6歲兒童中約有腦癱患兒31萬，并且每年以4.6萬的速度遞增，美國圍生協(xié)作項(xiàng)目的一項(xiàng)前瞻性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，小兒腦癱發(fā)病率達(dá)4‰?；純褐饕憩F(xiàn)為非進(jìn)行性中樞性運(yùn)動功能障礙，或伴有智力低下等。目前的治療方法主要有(1)以運(yùn)動康復(fù)為主的綜合康復(fù)醫(yī)療；(2)以營養(yǎng)神經(jīng)、松弛肌肉、活血等為主的藥物療法；(3)選擇性脊神經(jīng)后根切斷術(shù)療法；(4)以按摩、針刺等為主的中醫(yī)療法。但由于腦癱是由固定的腦部病變所引起，以上治療方法不能去除或矯正病因，療效不肯定。然而對于腦癱患者尤其是嚴(yán)重病人，患兒不僅承受巨大的肉體痛苦，還會因腦癱不能自理而導(dǎo)致的窒息，使腦缺氧而使其智力呈進(jìn)行性下降。因此，如果能研究出新的有效的腦癱治療方法，將給無數(shù)家庭帶來幸福。
過去的幾十年來，采用干細(xì)胞移植治療腦癱患者尚未見報道，但在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)其它疾病中取得了一定的進(jìn)展。
干細(xì)胞來源主要有1、胚胎神經(jīng)干細(xì)胞有研究報道，采用6-9W流產(chǎn)胎兒腦細(xì)胞治療Parkinson`s病能明顯改善部份患者功能，甚至在有些患者體內(nèi)還能合成多巴胺。但是，由于細(xì)胞來源、倫理道德等諸多因素局限了胚胎神經(jīng)干細(xì)胞在移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床應(yīng)用。2、骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞70年代，F(xiàn)riedenstein等從骨髓中分離培養(yǎng)出一種間質(zhì)干細(xì)胞，深入的研究發(fā)現(xiàn)間質(zhì)干細(xì)胞不僅可以在腦組織成活、遷移，而且表達(dá)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志，明顯改善中風(fēng)等模型大鼠功能。目前，間質(zhì)干細(xì)胞主要來源于成人骨髓，但成人骨髓細(xì)胞來源有限、病原體污染不可避免。尚無采用胚胎骨髓作為干細(xì)胞來源的報道。
顯然，在現(xiàn)有條件下，對缺氧缺血性腦性癱瘓治療作用的有關(guān)技術(shù)和方法均存在種種缺陷和不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療缺氧缺血性腦性癱瘓的制劑的用途。
所述的制劑由骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水配制而成，用于缺氧缺血性腦病的新生兒大鼠模型的有效劑量為5×105細(xì)胞/次。該有效劑量是通過動物模型實(shí)驗(yàn)取得治療效果而確定的。
所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞是按以下方法制備的利用無菌術(shù)分離大鼠孕中期胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞貼壁增殖接近融合時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞制備的制劑，用于對新生兒大鼠進(jìn)行腦內(nèi)定位注射，劑量為5.0×105細(xì)胞/次，在缺氧缺血性腦病模型的制作后24小時內(nèi)移植。
所述的制劑由骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水配制而成，用于新生兒腦癱患者病人的有效劑量為1.0～5.0×106細(xì)胞/次。該有效劑量是通過動物模型實(shí)驗(yàn)取得治療效果以及人體用藥常識而確定的。
所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞是按以下方法制備的利用無菌術(shù)從人胚流產(chǎn)材料中分離胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞貼壁增殖接近融合時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞制備的制劑，用于對新生兒腦癱患者進(jìn)行腦內(nèi)定位注射，劑量為1.0～5.0×106/次，在缺氧缺血性腦病發(fā)生后24-48小時內(nèi)移植。
本發(fā)明利用胚胎骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞通過腦定位輸注方法移植給缺氧缺性腦癱患兒，促進(jìn)其腦組織神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，改善其平衡協(xié)調(diào)、運(yùn)動功能，提高學(xué)習(xí)、記憶能力，達(dá)到提高患兒生活質(zhì)量、減輕家庭和社會負(fù)擔(dān)的目的，為臨床治療腦癱開辟細(xì)胞治療的新途徑。
所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞制備的制劑用于治療缺氧缺血性腦性癱瘓的效果評價1、生存能力包括a)1周內(nèi)模型大鼠存活率；b)1月內(nèi)模型大鼠體重增長情況；2、移植后第42天的學(xué)習(xí)、記憶功能；3、第10周解剖，腦組織病理特征；4、免疫組化和間接免疫熒光分析外源細(xì)胞在腦組織內(nèi)存活、遷移、神經(jīng)細(xì)胞特異性抗原表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)將胚胎骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到新生缺氧缺血性模型大鼠腦內(nèi)，能明顯提高模型大鼠生存能力；改善其運(yùn)動、學(xué)習(xí)、記憶能力；調(diào)理受損腦組織微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和/或功能的修復(fù)。
(2)為臨床治療缺氧缺血性腦病開辟細(xì)胞療法的新途徑。本發(fā)明利用胚胎骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞原始、增殖潛能大、制備簡便，連續(xù)培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能，細(xì)胞同質(zhì)性高，具有正常的核型和端粒酶活性。
(3)本發(fā)明利用骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞腦內(nèi)定位注射治療大鼠缺氧缺血性腦性癱瘓模型證明，骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞能夠阻滯和逆轉(zhuǎn)缺氧缺血性腦性癱瘓的發(fā)展，為臨床治療缺氧缺血性腦性癱瘓開辟細(xì)胞治療的新途徑。


圖1為SD大鼠腦組織病理切片檢查結(jié)果(H&E染色，×200)圖。其中，A圖顯示正常對照組皮質(zhì)層細(xì)胞分布；B圖顯示HIE模型中神經(jīng)元變性壞死(↑)；C圖顯示HIE模型中小腦蒲肯野細(xì)胞核固縮(↑)；D圖顯示HIE/hFBMMSCs移植組皮質(zhì)層神經(jīng)細(xì)胞廣泛增多。
圖2為hFBMMSCs移植組腦組織免疫組化染色檢測結(jié)果(DAB，×100)圖，A圖顯示抗人NSE陽性(↑)；B圖顯示抗人GFAP陽性(↑)。
圖3為HIE/hFBMMSCs間接免疫熒光檢測結(jié)果(×100)圖。其中，1A和1B顯示同一張切片同一部位，A中綠色熒光者為抗人RNP陽性；B中桔紅色熒光者為抗GFAP陽性；2A和2B顯示同一張切片同一部位，A中綠色熒光者為抗人RNP陽性；B中桔紅色熒光者為抗NSE陽性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的制備利用無菌術(shù)分離孕中期胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含8％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，視生長情況隔天換液1次，細(xì)胞貼壁增殖接近融合至細(xì)胞成90％融合態(tài)時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
所述的低糖DMEM增養(yǎng)基選用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01產(chǎn)品，或者GIBCO公司的同類產(chǎn)品。
實(shí)施例二骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的制備利用無菌術(shù)分離孕中期胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，視生長情況3天換液1次，細(xì)胞貼壁增殖接近融合至細(xì)胞成80％融合態(tài)時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
所述的低糖DMEM培養(yǎng)基選用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01產(chǎn)品，或者GIBCO公司的同類產(chǎn)品。
實(shí)施例三骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的制備利用無菌術(shù)分離孕中期胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含15％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，視生長情況4天換液1次，細(xì)胞貼壁增殖接近融合至細(xì)胞成70％融合態(tài)，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
所述的低糖DMEM培養(yǎng)基選用HYCLONE公司的CAT NO.SH30002.01產(chǎn)品，或者GIBCO公司的同類產(chǎn)品。
實(shí)施例四缺氧缺血性腦癱新生大鼠造模1天齡新生F344大鼠(體重5.85±0.39g)，乙醚吸入麻醉后仰臥位固定，頸正中切開皮膚，游離左側(cè)頸總動脈，5號線結(jié)扎后縫合切口，2h后置入37℃恒溫密閉容器中，以1L/min的速度輸入8％O2、92％N2的混合氣體維持3h，取出后置于原飼養(yǎng)環(huán)境中接受母鼠喂養(yǎng)。
實(shí)施例五胚胎骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞輸注實(shí)驗(yàn)1、治療時機(jī)模型制作后24小時內(nèi)。
2、劑量5.0×105/g。
3、途徑腦定位注射。
4、試驗(yàn)對照組采用成組設(shè)計(jì)，同窩大鼠分為模型/干細(xì)胞移植組、模型/生理鹽水組、模型/未治療、正常對照4組。
效果評價1、生存能力(1)1周內(nèi)大鼠存活情況干細(xì)胞移植組，存活率與正常對照組比較不存在顯著性差異；高于生理鹽水組和未治療組。詳見表1(2)1月內(nèi)新生大鼠體重增長情況移植后第5天起，受移植組大鼠體重增長加快，第30天與正常對照組不存在顯著性差異，重于生理鹽水組和未治療組。詳見表22、功能改變細(xì)胞移植后第42天，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試移植組大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，具備與正常組大鼠相近的學(xué)習(xí)、記憶能力，強(qiáng)于生理鹽水注射和未治療組。詳見表33、解剖結(jié)果第10W對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行腦組織結(jié)構(gòu)分析。干細(xì)胞移植組腦組織出現(xiàn)萎縮和水腫比率明顯低于生理鹽水注射組和未治療組，與正常對照組不存在顯著性差異。
4、腦組織病理切片檢查結(jié)果H&E染色，光學(xué)顯微鏡下，干細(xì)胞移植組可見大腦神經(jīng)細(xì)胞增生，尤其在大腦皮質(zhì)層、海馬等部位；部份大腦血管壁，可見大量細(xì)胞遷移環(huán)繞；干細(xì)胞移植進(jìn)針部位可見大量細(xì)胞成團(tuán)或散在分布，呈方向性向周圍遷移。而未治療組和生理鹽水組可見小腦、皮質(zhì)層、海馬等區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，神經(jīng)元核固縮、壞死、膠質(zhì)細(xì)胞吞噬以及膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生形成膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)節(jié)等病變現(xiàn)象。詳見圖1。圖1為SD大鼠腦組織病理切片檢查結(jié)果(H&E染色，×200)圖。其中，A圖顯示正常對照組皮質(zhì)層細(xì)胞分布；B圖顯示HIE模型中神經(jīng)元變性壞死(↑)；C圖顯示HIE模型中小腦蒲肯野細(xì)胞核固縮(↑)；D圖顯示HIE/hFBMMSCs移植組皮質(zhì)層神經(jīng)細(xì)胞廣泛增多。
5、免疫組化分析結(jié)果采用免疫組化技術(shù)分析，移植組大鼠腦組織中存在抗人NSE、GFAP反應(yīng)細(xì)胞，以皮質(zhì)層和海馬等區(qū)域較明顯；其它3組實(shí)驗(yàn)動物均未見NSE或GFAP陽性細(xì)胞。詳見圖2。圖2為hFBMMSCs移植組腦組織免疫組化染色檢測結(jié)果(DAB，×100)圖，A圖顯示抗人NSE陽性(↑)，B圖顯示抗人GFAP陽性(↑)。
6、間接免疫熒光檢測結(jié)果移植組兩側(cè)大腦皮質(zhì)層、海馬等部位檢測到抗人RNP/CD45、抗人RNP/NSE或抗人RNP/GFAP雙陽性完整細(xì)胞，尤其是在進(jìn)針部位，大量雙陽性細(xì)胞成團(tuán)或散在存在，向周圍遷移并且密度呈梯度下降，而其它3組動物腦組織切片均未出現(xiàn)抗人RNP、CD45、NSE、GFAP陽性細(xì)胞。詳見圖3。圖3為HIE/hFBMMSCs間接免疫熒光檢測結(jié)果(×100)圖。其中，1A和1B顯示同一張切片同一部位，A中綠色熒光者為抗人RNP陽性；B中桔紅色熒光者為抗GFAP陽性；2A和2B顯示同一張切片同一部位，A中綠色熒光者為抗人RNP陽性；B中桔紅色熒光者為抗NSE陽性。
表1 新生大鼠1周內(nèi)成活率

表2 4組新生大鼠1M內(nèi)體重增長情況(x±SD)

表3 4組實(shí)驗(yàn)大鼠Morris水迷宮訓(xùn)練和測試結(jié)果(X±SD)sec

*2只鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；#3只鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療缺氧缺血性腦性癱瘓的制劑的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制劑由骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水配制而成，用于缺氧缺血性腦病的新生兒大鼠模型的有效劑量為5×105細(xì)胞/次。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞是按以下方法制備的利用無菌術(shù)分離大鼠孕中期胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞貼壁增殖接近融合時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞制備的制劑，用于對新生兒大鼠進(jìn)行腦內(nèi)定位注射，劑量為5×105/次，在缺氧缺血性腦病模型的制作后24小時內(nèi)移植。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制劑由骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水配制而成，用于新生兒腦癱病人的有效劑量為1.0～5.0×106細(xì)胞/次。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞是按以下方法制備的利用無菌術(shù)從人胚流產(chǎn)材料中分離胚胎骨髓有核細(xì)胞，接種在含胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞貼壁增殖接近融合時，進(jìn)行消化、傳代，依此法反復(fù)傳代，達(dá)到純化和擴(kuò)增間質(zhì)干細(xì)胞的目的，收集細(xì)胞凍存、復(fù)蘇備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞制備的制劑，用于對新生兒腦癱患者進(jìn)行腦內(nèi)定位注射，劑量為1.0～5.0×106/次，在缺氧缺血性腦病發(fā)生后24-48小時內(nèi)移植。
全文摘要
本發(fā)明屬于干細(xì)胞與組織工程領(lǐng)域，涉及骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞用于制備治療缺氧缺血性腦性癱瘓的制劑的用途。所述的制劑由骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞與生理鹽水配制而成，用于缺氧缺血性腦病的新生兒大鼠模型的有效劑量為5×10
文檔編號A61P25/00GK1803193SQ20051003273
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月13日
發(fā)明者項(xiàng)鵬, 李樹濃, 朱美玲 申請人:中山大學(xué)