專利名稱：一種含紅車軸草素、櫻黃素的藥物組合物及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物及其用途，具體涉及含紅車軸草素(Pratensein)、櫻黃素(Prunetin)的藥物組合物及其在醫(yī)藥上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
異黃酮類成分廣泛存在于植物中，具有多種生物活性，如抗癌、降低血脂、植物雌性激素樣作用、提高機(jī)體免疫力等作用，有關(guān)黃酮類成分的相關(guān)研究一直為國(guó)內(nèi)外學(xué)者所重視并不斷深入。
紅車軸草(Trifolium pretense L.)又名三葉草、紅花苜蓿等，多用作牧草，全草中含多種黃酮和異黃酮類成分化合物，現(xiàn)代藥理研究證明，紅車軸草具有顯著的生物活性，已報(bào)道的活性有1、雌性激素樣作用該植物中含有多種異黃酮類成分具有雌性激素樣作用，如鷹嘴豆芽素(biochanin)A和B(即芒柄花素formononetin)、染料木素(genistein)、大豆素(daidzein)等，但上述異黃酮的雌激素樣作用均弱，當(dāng)然也有研究認(rèn)為鷹嘴豆芽素B作用最弱或無活性。
2、抗癌作用有報(bào)告稱本品水提物給大鼠灌服或注射，能抑制肉瘤S45的生長(zhǎng)；其中所含染料木素對(duì)人鼻咽癌KB細(xì)胞有細(xì)胞毒活性。
3、降血脂作用報(bào)告表明染料木素能降低血清中甘油三酯及膽固醇的作用，而鷹嘴豆芽素A也能抑制血清膽固醇升高，大豆素也顯示明顯的降脂作用。
4、其它作用有文獻(xiàn)報(bào)道本品有抗病原微生物作用，其中所含三葉豆紫檀甙有抗真菌的作用。
目前為止，報(bào)道的紅車軸草總黃酮或紅車軸草提取物多以鷹嘴豆芽素A和B為主要組成成分，或兼帶少量染料木素、大豆素，其中的紅車軸草素、櫻黃素的含量甚微，一般沒有列入含量檢測(cè)范圍，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為


到目前為止，還未見國(guó)內(nèi)外對(duì)紅車軸草素、櫻黃素或其苷類作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑的研究報(bào)道以及相關(guān)醫(yī)藥應(yīng)用方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種含紅車軸草素和/或櫻黃素的藥物組合物，通過選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用，具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)、骨質(zhì)疏松和癌癥等作用。
本發(fā)明紅車軸草素和/或櫻黃素以經(jīng)典的E-SCREEN法測(cè)定雌激素樣活性，顯示出二者均可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，具有雌激素樣作用，活性為藥物雌二醇的10-5-10-3。
本發(fā)明紅車軸草素和/或櫻黃素在心血管系統(tǒng)和骨骼中對(duì)某些雌激素應(yīng)答性組織發(fā)揮選擇性作用。體外試驗(yàn)也證實(shí)二者均可顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，并可顯著增加細(xì)胞基質(zhì)鈣和礦化結(jié)節(jié)鈣。顯示具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)疾病和骨質(zhì)疏松癥方面可發(fā)揮作用。
本發(fā)明動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)紅車軸草素或櫻黃素的毒性很低，大劑量使用時(shí)動(dòng)物的行為也無任何顯著變化。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述通式(1)紅車軸草素、櫻黃素為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的紅車軸草素和/或櫻黃素和藥物組合物可用于制備治療癌癥、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松、心腦血管疾病和藥物先導(dǎo)化合物的藥物。
上述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑等。其制劑形式包括各種固體劑型及液體劑型。另外還可以在組合物中加入其它輔劑和香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的紅車軸草素、櫻黃素可以藥物組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或胃腸外、局部用藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油性懸浮劑等或其它液體制劑如糖漿等；用于胃腸外時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。局部給藥時(shí)，可將其制成霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、皮下植入劑等。優(yōu)選的形式是片劑、緩釋片劑、包衣片劑、膠囊、鼻噴霧劑、皮下植入劑，特別優(yōu)選在腸道的特定部位緩釋的制劑。
本發(fā)明的藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的生產(chǎn)方法制備，例如使紅車軸草素和/或櫻黃素活性成份與一種或多種載體混合，根據(jù)不同適應(yīng)癥選擇不同給藥途徑將其制成臨床應(yīng)用所需的合適劑型。
本發(fā)明的藥物組合物的活性成份是紅車軸草素，櫻黃素，優(yōu)選含有重量比為0.1％-99.5％的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為0.5％-95％的活性成分。
本發(fā)明的活性成份的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等調(diào)整，其每日給藥劑量為1mg-4mg/kg，可以一次或多次施用。
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面的理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)的雌激素樣活性本實(shí)驗(yàn)以MCF-7雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞為生物測(cè)試載體，采用經(jīng)典的E-SCREEN法測(cè)定其雌激素樣活性。
本實(shí)驗(yàn)設(shè)DMSO溶劑對(duì)照組(陰性)、1nM雌二醇對(duì)照組(陽(yáng)性)、紅車軸草素組(1uM、10uM)、櫻黃素組(1uM、10uM)。
結(jié)果顯示紅車軸草素、櫻黃素能顯著的促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，具有雌激素樣作用，但其活性僅為雌二醇的10-5-10-3。
實(shí)施例2紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)與雌激素受體相互作用的分子模擬采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法，以雌激素受體(ERβ，ERα)作為靶標(biāo)模型，以分子力學(xué)優(yōu)化的方法獲得pratensein和prunetin分子的活性構(gòu)象，用分子對(duì)接程序計(jì)算受體與配基間的相互作用。
結(jié)果顯示pratensein及prunetin均可進(jìn)入雌激素受體的結(jié)合腔，結(jié)果還提示二者與ERβ的結(jié)合力要比與ERα的結(jié)合力強(qiáng)7-10倍。另外，分子上某些位置被取代，對(duì)其活性有一定影響。
由于人體ERβ和ERα存在組織分布上的差異，ERβ主要存在于腦、骨骼、膀胱和血管上皮組織，提示pratensein及prunetin可能在心血管系統(tǒng)和骨骼中對(duì)某些和ERα雌激素應(yīng)答性組織發(fā)揮選擇性作用。
實(shí)施例3紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的影響取新生1-3天SD大鼠頭蓋骨用酶消化法分離成骨細(xì)胞，第三代細(xì)胞經(jīng)MTT法、甲基百里香酚藍(lán)(MTB)比色法觀察紅車軸草素、櫻黃素對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增值、細(xì)胞基質(zhì)鈣及礦化結(jié)節(jié)鈣的影響。
結(jié)果顯示紅車軸草素、櫻黃素0.1-10umol/L濃度均能顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并能顯著增加細(xì)胞基質(zhì)鈣和礦化結(jié)節(jié)鈣。具體結(jié)果見下表

*P＜0.05，**P＜0.01與control比較；△P＜0.05，△△P＜0.01與NaF比較實(shí)施例4紅車軸草素(pratensein)、櫻黃素(prunetin)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用pratensein和prunetin與雌激素受體相互作用的分子模擬結(jié)果提示，pratensein、prunetin均極有可能為一選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，結(jié)合對(duì)選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑現(xiàn)有的研究成果，因此pratensein及prunetin極有希望開發(fā)成為預(yù)防或治療與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與癌癥有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與絕經(jīng)期相關(guān)疾病有關(guān)藥物、預(yù)防或治療與心腦血管系統(tǒng)疾病，保護(hù)心血管功能藥物，并以各種劑型使用或各種給藥途徑用于臨床。
實(shí)施例5紅車軸草素、櫻黃素(1∶1)的組合物(樣品I)對(duì)卵巢切除大鼠的影響以30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔給藥麻醉，大鼠備皮，摘除兩側(cè)卵巢，術(shù)后休養(yǎng)9天后開始給藥。大鼠分為四組，正常組、模型組、樣品I 100mg/kg組，雌激素50微克/kg組，每日給藥。持續(xù)30天。
給藥20日起，大鼠每日陰道涂片10天，觀察生理周期。用200微升的移液槍吸取50微升0.9％的生理鹽水注射液，注入陰道，回吸灌洗液，玻片均勻涂片。晾干后瑞士染液、Giemsa染液染色，400倍電子顯微鏡下進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。給藥30日后，取血清，在動(dòng)物全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血清甘油三酯、總膽固醇。測(cè)定大鼠血清雌激素、孕激素含量。
樣品I對(duì)卵巢切除大鼠血清甘油三酯、總膽固醇的影響

研究發(fā)現(xiàn)，藥物有降低甘油三酯和總膽固醇的趨勢(shì)。
預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品I對(duì)卵巢切除大鼠的子宮重量、陰道生理周期變化、血清甘油三酯、總膽固醇等，都有一定的作用。
注樣品I表示的是紅車軸草素、櫻黃素(1∶1)的組合物實(shí)施例6樣品I對(duì)維甲酸所致大鼠骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用。
大鼠隨機(jī)分為6組，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、樣品I低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，除正常對(duì)照組外，各組大鼠均口服維甲酸70mg/kg，服用量1ml/100g大鼠，每天1次，連續(xù)14天，同時(shí)每天各組大鼠依次口服以下樣品，正常對(duì)照組、維甲酸模型組為相應(yīng)溶劑10ml/kg、樣品I低劑量組4mg/kg、中劑量組12mg/kg、高劑量組36mg/kg、陽(yáng)性藥羥乙基膦酸鈉50mg/kg，服用量均為1ml/100g大鼠，每天1次，連續(xù)28天，其間每周稱體重1次，以體重調(diào)整給藥用量。
給藥結(jié)束，取血分離血清，按試劑盒方法測(cè)S-Ca、S-P含量，取大鼠雙側(cè)股骨，在X線骨密度儀掃描，測(cè)出骨密度(g/cm2)，稱骨重(W)，測(cè)骨長(zhǎng)(L)，骨直徑(D)，計(jì)算骨表觀線密度(W/L)、表觀面密度(W/L·D)，然后110℃烘干一小時(shí)，再置于馬福爐內(nèi)200、400、600、800℃各灰化2小時(shí)，灰化結(jié)束冷卻后，稱灰重(Wash·g)，用6NHCl提取后測(cè)骨灰Ca、骨灰P含量，以100g骨灰含Ca或P的克數(shù)表示。
另一側(cè)股骨頭用3％HNO3脫鈣后作石蠟切片，HE染色，顯微鏡下測(cè)骨小梁寬度。以上結(jié)果均以給藥組與模型組比較，模型組與正常對(duì)照組比較。
實(shí)驗(yàn)當(dāng)天及第1周內(nèi)各組動(dòng)物體重?zé)o明顯差異(P＞0.05)，給藥后2、4周維甲酸模型組體重比正常對(duì)照組體重減輕(P＜0.01、P＜0.05)，但用藥后各組動(dòng)物體重均明顯增加，其中低劑量組(4mg/kg)有體重增加但無統(tǒng)計(jì)意義，而樣品I樣品I中、高劑量組(12mg/kg、36mg/kg)及羥乙基膦酸鈉組大鼠第2、4周的體重均比模型組增加(P＜0.05)，各劑量組相互比較無明顯差異。
模型組大鼠股骨骨密度比正常對(duì)照組低(P＜0.01)，血清Ca含量也較模型組低(P＜0.05)，血清磷含量變化不大，但用藥組大鼠股骨密度都比模型組增加(P＜0.05、P＜0.01)，血清鈣及磷的含量均較模型組升高，但樣品I中、高劑量組無明顯差異。陽(yáng)性藥羥乙基膦酸鈉的大鼠股骨骨密度及血清鈣血清磷含量也比模型組有明顯的差異(P＜0.05、P＜0.01)。
樣品I對(duì)維甲酸誘導(dǎo)大鼠骨質(zhì)疏松癥預(yù)防作用的骨指數(shù)影響如下與對(duì)照組比較，模型組的W、L、d、W/L、W/Id均明顯下降，相對(duì)于模型組樣品I中、高劑量組及羥乙基膦酸鈉組的W、W/Ld均明顯提高與對(duì)照組比較，模型組的骨灰重及灰分中骨Ca及骨P含量均降低，但用藥后樣品I中、高劑量組及羥乙基膦酸鈉組骨灰重、骨Ca、骨P含量均相對(duì)增加實(shí)施例7片劑制備方法活性成分、乳糖和淀粉混合，用水均勻濕潤(rùn)，把濕潤(rùn)后的混合物過篩并干燥，再過篩，加入硬脂酸鎂，然后將混合物壓片，每片重250mg，活性成分含量10mg。
實(shí)施例8膠囊制備方法將活性成分與助劑混合，過篩，在合適的容器中均勻混合，把得到的混合物裝入硬明膠膠囊，每個(gè)膠囊重200mg，活性成分含量50mg。
實(shí)施例9注射制備方法將活性成分與氯化鈉9mg溶解于適量注射用水中，過濾所得溶液，在無菌條件下裝入安瓶中，活性成分含量10mg實(shí)施例10鼻噴霧劑制備方法活性成分1mg，氯化鈉8mg，EDTA1mg，磷酸鈉緩沖液(PH6-7)10mg，多乙氧基醚10mg，重蒸鎦水加至2ml，攪拌下于適當(dāng)體積的重蒸鎦水中每次加入一種成分，加水至2ml.后，將該溶液在無菌過濾器上過濾，裝入瓶中并按照適當(dāng)?shù)膭┝糠指簟?br> 權(quán)利要求
1.一種含紅車軸草素、櫻黃素的藥物組合物，其特征是該藥物組合物包括作為活性成分的紅車軸草素和櫻黃素。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征是包括活性成分紅車軸草素，重量比為0.1％-99.5％。
3.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征是包括活性成分櫻黃素，重量比為0.1％-99.5％。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的藥物組合物，其特征是制備作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用，重量比為0.5％-95％的活性成分。
5.如權(quán)利要求1或2或3所述的藥物組合物，其特征是在制備預(yù)防或治療與骨質(zhì)疏松癥、心腦血管系統(tǒng)疾病、癌癥有關(guān)藥物中的應(yīng)用。
6.如權(quán)利要求1或2或3所述的藥物組合物，其特征是在制備藥物先導(dǎo)化合物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征是通過口服、鼻吸入、直腸或胃腸外、局部用藥的方式施用于需要這種治療的患者。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是在腸道的特定部位緩釋的制劑，用量根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等調(diào)整，其每日給藥劑量為1mg-4mg/kg，可以一次或多次施用。
9.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征是制劑可制成固體制劑如片劑、粉劑、粒劑、膠囊等，制成液體制劑如水或油性懸浮劑等或其它液體制劑如糖漿等；用于胃腸外時(shí)，可將其制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等，局部給藥時(shí)，可將其制成霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、皮下植入劑等。
10.如權(quán)利要求8或9所述的藥物組合物，其特征是制劑可制成緩釋片劑、包衣片劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含紅車軸草素和/或櫻黃素的藥物組合物，通過體內(nèi)廣泛分布的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑作用，具有預(yù)防和治療心血管系統(tǒng)和骨質(zhì)疏松等作用。還用于制備治療癌癥和藥物先導(dǎo)化合物的藥物?？梢酝ㄟ^口服、鼻吸入、直腸或胃腸外、局部用藥的方式施用于需要這種治療的患者，每日給藥劑量為1mg－4mg/kg，，可以一次或多次施用。制劑多樣如固體制劑、液體制劑、霜?jiǎng)?、軟膏劑、貼劑、噴霧劑、皮下植入劑等。尤其在腸道部位作用的緩釋片劑、包衣片劑等。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1771934SQ20051003109
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者華茉莉, 方建平 申請(qǐng)人:莊賢韓