專利名稱：帶色素的組織工程表皮替代物及其制備方法
專利說明帶色素的組織工程表皮替代物及其制備方法 本發(fā)明涉及組織工程領(lǐng)域，具體的說是一種帶色素人工表皮替代物的制備方法及其應(yīng)用。皮膚是人體最大的器官，起著保護機體的重要作用。當(dāng)各種原因造成皮膚缺損時，會造成機體工能的障礙，重則危及生命。對皮膚組織缺損，臨床上常見的治療方法為有斷層皮片或全厚層皮片移植和凡士林紗布，其中，斷層皮片是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但是，對于這種治療方法存在造成新的皮膚創(chuàng)傷、及供體不足的問題。
皮膚缺損后，缺損部位的增生性疤痕是其重要的并發(fā)癥，研究顯示，如果皮膚缺損部位能很快的上皮化，就可以減少缺損部位的瘢痕形成，或減輕疤痕的形成的程度。隨著生物工程技術(shù)、醫(yī)學(xué)的發(fā)展，以及各學(xué)科交叉的深入，組織工程技術(shù)的興起，組織工程皮膚是成為人工皮膚研究的熱點和重點。產(chǎn)生了一系列的專利，其中申請?zhí)枮?00310108082的專利就是關(guān)于一種提高創(chuàng)面上皮化的表皮替代物的構(gòu)建方法。然而，這種單純用表皮細胞構(gòu)建的表皮替代物在損傷部位表皮化過程中，不能修復(fù)該部位損失的色素細胞，如果該部位無黑色素細胞存留，或其它部位的黑色素細胞不能遷移到損傷部位，將來該損傷部位就會留下色素缺失。另外，在臨床中有大量的色素脫失癥患者(如白癜風(fēng))，這些病人常規(guī)的治療方法包括植皮、細胞膜片移植、注射黑色素細胞，但是，植皮給患者帶來新的創(chuàng)傷，細胞膜片移植和黑色素細胞注射療效不確切，因此，臨床上急需一種新的、療效顯著的治療方法。本發(fā)明的目的就是要解決上述的不足而提供一種帶色素的組織工程表皮代替物及其構(gòu)建方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種帶色素的組織工程表皮替代物，其特征在于構(gòu)建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源于細胞庫。
一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配制成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配制成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，并于37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將混合液加入平面皿中，在35～60℃的條件下加熱2～3小時，干燥成膜材；(5)取出膜材，并將膜浸泡在無水乙醇中20分鐘，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應(yīng)3小時；(7)然后用大量的蒸餾水沖洗，并浸泡24小時；(8)在35～60℃的條件下加熱2～3小時，再次干燥成膜；或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-10個/mm2的小孔，即得殼聚糖-明膠膜材；(9)將上述殼聚糖-明膠膜材置于角化上皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)過夜，然后吸干培養(yǎng)液；(10)按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素細胞接種在膜材上；(11)將上述細胞～膜材復(fù)合物置于培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3天換液一次，培養(yǎng)時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配制成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配制成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，并于37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將上述殼聚糖-明膠混合物在-40℃～-70℃預(yù)凍3-5小時；(5)然后用低溫冷凍真空干燥機抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的條件下加熱2-3小時，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸餾水洗滌3-5次；(7)將經(jīng)過上述處理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液進行交聯(lián)反應(yīng)2～3小時；(8)沖洗干凈；(9)重新真空冷凍干燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架；(10)將上述殼聚糖-明膠支架置于角化上皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)過夜，然后吸干培養(yǎng)液；(11)然后按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素在支架上；(12)將上述細胞～支架復(fù)合物置于培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3天換液一次，培養(yǎng)時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
所述的培養(yǎng)液為角化上皮細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液和黑色素細胞培養(yǎng)的混合液，比例為7∶3～3∶7。
所述的培養(yǎng)時間為3～15天。
其表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，可以根據(jù)患者的膚色進行調(diào)整。
黑色素培養(yǎng)基為在商品化M154培養(yǎng)基加BPE(0.15～0.3％v/v)、胰島素(3～6μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(3～7μg/ml)、堿性成纖為生長因子(2～4ng/ml)、氫化可的松(0.15～0.2μg/ml)、肝磷脂(2.5～4μg/ml)、TPA(8～12ng/ml)、血管內(nèi)皮素(1.5-4.5ng/ml)。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是一種帶色素的表皮替代物，它在修復(fù)創(chuàng)傷部位的上皮組織同時，修復(fù)該部位的黑色素細胞，兼顧了該部位色素和周圍組織協(xié)調(diào)的美觀問題，使患者的損傷部位的皮膚修復(fù)更加的完美。1、表皮細胞、黑色素細胞的分離、培養(yǎng)將皮膚組織用氯霉素溶液洗滌3-5次，或(和)用75％的乙醇溶液用浸泡1分鐘，PBS洗滌2-3次；用剪刀制成2-4mm寬的皮條，將0.15～0.5u/ml的Dispase消化37℃消化2-7小時，或4℃消化8-12小時，將上皮層和真皮層分離；表皮層然后加0.05％胰酶加0.53mM的EDTA消化8-20分鐘，將消化液用胰酶抑制劑中止消化，經(jīng)150目的不銹鋼慮網(wǎng)過濾，收集細胞分成兩份，一份加表皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，一份加黑色素細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，并分別進行細胞擴增。
黑色素培養(yǎng)基為在商品化M154培養(yǎng)基加BPE(0.2％v/v)、胰島素(5μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(5μg/ml)、堿性成纖為生長因子(3ng/ml)、氫化可的松(0.18μg/ml)、肝磷脂(3μg/ml)、TPA(10ng/ml).
2、生物材料的制備a)殼聚糖/明膠分別用1％的乙酸和蒸餾水溶解，配制成濃度分別為2％和4％的殼聚糖溶液和明膠溶液，按重量比為1∶9～9∶1混合，37℃攪拌混合24小時，較一定量的混合液加入平皿中，干燥成厚度為100～600um的膜材；在35～60℃加熱2～3小時；將膜從培養(yǎng)掀起，浸泡在無水乙醇20分鐘，去乙醇，加30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應(yīng)3小時，大量的蒸餾水沖洗，并浸泡24小時，再次干燥成膜備用，或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-4個/mm2的小孔備用。
b)按上述的殼聚糖和明膠的成分比例，制成殼聚糖/明膠混合物，并在在-40℃～-70℃預(yù)凍3-5小時，用低溫冷凍真空干燥機抽干水分，得到厚度為100～1000μm多孔支架。然后把支架再35-60℃加熱2-3小時，用1～4％的NaOH溶液浸泡，蒸餾水洗滌3-5次。加30mM的EDC進行交聯(lián)反應(yīng)2～3小時，用流水沖洗；或用1～5％戊二醛溶液交聯(lián)反應(yīng)2～3小時，用2％硼氫化鈉溶液洗滌，蒸餾水沖洗。重新真空冷凍干燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架。
3、表皮替代物的構(gòu)建將上述的生物支架放置在混和培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)過夜，吸干；按1×104～1×106/cm2的密度接種細胞，細胞包括表皮細胞和黑色素細胞，表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，具體根據(jù)患者的膚色進行調(diào)整。接種后2-4小時，加培養(yǎng)液，在37℃，5％二氧化碳，飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。每3天換液一次，培養(yǎng)時間為3～15天，以5～7為最佳，形成單層的細胞生物支架復(fù)合物備用。
4、表皮細胞替代物的臨床應(yīng)用表皮替代物可以應(yīng)用于臨床大面積燒傷創(chuàng)面、整形外科中的供皮區(qū)創(chuàng)面、各種慢性潰瘍等皮膚缺損的修復(fù)，以及各種皮膚色素脫失。
在患者大腿部的色素脫失部位取中厚皮片后，留下6×4cm2供皮區(qū)創(chuàng)面，用根據(jù)本專利的技術(shù)方案構(gòu)建的色素的表皮替代物進行治療，將表皮細胞替代物的細胞面與患者的創(chuàng)面接觸，常規(guī)創(chuàng)面包扎處理。7天后打開外敷料，觀察創(chuàng)面情況。2個月后，發(fā)現(xiàn)損傷部位上皮化良好，并且原來色素脫失部位，重新有色素沉著。
權(quán)利要求
1.一種帶色素的組織工程表皮替代物，其特征在于構(gòu)建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源于細胞庫。
2.一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配制成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配制成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，并于37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將混合液加入平面皿中，在35～60℃的條件下加熱2～3小時，干燥成膜材；(5)取出膜材，并將膜浸泡在無水乙醇中20分鐘，除去乙醇；(6)再加入30mM的EDC或0.25％戊二醛溶液反應(yīng)3小時；(7)然后用大量的蒸餾水沖洗，并浸泡24小時；(8)在35～60℃的條件下加熱2～3小時，再次干燥成膜；或在膜上打直徑為20到50微米，密度為1-10個/mm2的小孔，即得殼聚糖-明膠膜材；(9)將上述殼聚糖-明膠膜材置于角化上皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)過夜，然后吸干培養(yǎng)液；(10)按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素細胞接種在膜材上；(11)將上述細胞～膜材復(fù)合物置于培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3天換液一次，培養(yǎng)時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
3.一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解，配制成濃度為2％的殼聚糖溶液；(2)明膠用蒸餾水溶解，配制成濃度4％明膠溶液；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液按重量比為1∶9～9∶1混合，并于37℃的條件下攪拌混合24小時；(4)將上述殼聚糖-明膠混合物在-40℃～-70℃預(yù)凍3-5小時；(5)然后用低溫冷凍真空干燥機抽干水分，得到多孔支架；(6)把支架在35-60℃的條件下加熱2-3小時，再用1～4％的NaOH溶液浸泡，然后用蒸餾水洗滌3-5次；(7)將經(jīng)過上述處理的支架，加30mM的EDC或用1～5％戊二醛溶液進行交聯(lián)反應(yīng)2～3小時；(8)沖洗干凈；(9)重新真空冷凍干燥，得到多孔的殼聚糖-明膠多孔支架；(10)將上述殼聚糖-明膠支架置于角化上皮細胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)過夜，然后吸干培養(yǎng)液；(11)然后按1×104～1×106/cm2的密度接種表皮細胞和黑色素在支架上；(12)將上述細胞～支架復(fù)合物置于培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3天換液一次，培養(yǎng)時間為3～15天，即可得帶色素組織工程表皮替代物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液為角化上皮細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液和黑色素細胞培養(yǎng)的混合液，比例為7∶3～3∶7。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于所述的培養(yǎng)時間為3～15天。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于其表皮細胞和黑色素細胞的比例為99∶1～65∶35，可以根據(jù)患者的膚色進行調(diào)整。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種帶色素的組織工程表皮替代物的制備方法，其特征在于黑色素培養(yǎng)基為在商品化M154培養(yǎng)基加BPE(0.15～0.3％v/v)、胰島素(3～6μg/ml)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(3～7μg/ml)、堿性成纖為生長因子(2～4ng/ml)、氫化可的松(0.15～0.2μg/ml)、肝磷脂(2.5～4μg/ml)、TPA(8～12ng/ml)、血管內(nèi)皮素(1.5-4.5ng/ml)。
全文摘要
一種帶色素人工表皮替代物的制備方法及其應(yīng)用，其特征在于構(gòu)建的細胞包含表皮細胞和黑色素細胞其來源于細胞庫，其制備方法為(1)將殼聚糖用1％的乙酸溶解；(2)明膠用蒸餾水溶解；(3)將殼聚糖溶液和明膠溶液混合攪拌混合；(4)將混合液加入平面皿中加熱，干燥成膜材；(5)取出膜材；(7)然后用大量的蒸餾水沖洗浸泡；(8)加熱；(9)置于培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)；(10)將上述細胞～膜材復(fù)合物置于培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，即得帶色素組織工程表皮替代物；本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，它在修復(fù)創(chuàng)傷部位的上皮組織同時，修復(fù)該部位的黑色素細胞，兼顧了該部位色素和周圍組織協(xié)調(diào)的美觀問題，使患者的損傷部位的皮膚修復(fù)更加的完美。
文檔編號A61L27/00GK1786155SQ20051003105
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月21日
發(fā)明者吳蓮蓮, 丁建明 申請人:吳蓮蓮, 丁建明