專利名稱：杠柳苷a和e的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物杠柳苷A和E的藥物用途，具體地說，本發(fā)明是關(guān)于天然產(chǎn)物杠柳苷A和E用于制備免疫抑制藥物的用途。
背景技術(shù)：
免疫抑制劑(immunosuppressor)是對(duì)免疫有抑制作用的藥物，不同的具體藥物分別作用于免疫反應(yīng)及調(diào)節(jié)的不同環(huán)節(jié)免疫抑制劑。在臨床上主要用于治療自身免疫性疾病和防止臟器移植排斥。免疫抑制劑主要分為以下幾種(1)化學(xué)制劑類，如烷化劑類的氮芥。(2)激素類，如糖皮質(zhì)激素。(3)真菌代謝產(chǎn)物，如環(huán)孢素A(cyclosporinA，CsA)。(4)中藥及其有效成分。
免疫抑制藥物大多具有明顯的毒副作用，主要是骨髓抑制，肝、腎毒性等。由于免疫抑制藥物的作用是非特異的，所以可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的下降，病原微生物感染增加，長(zhǎng)期應(yīng)用可能提高腫瘤發(fā)病率。由于免疫抑制劑大多數(shù)具有一定的毒副作用，因此，尋找新的高效低毒的免疫抑制劑具有重要的意義。
香加皮為蘿藦科植物(Periploca sepium Bge.)杠柳的根皮。又名羊奶條，羊角桃，羊交葉。主產(chǎn)山西、河南、河北、山東、甘肅、湖南等省。香加皮多年來一直被當(dāng)作五加皮入藥，商品習(xí)稱香加皮或者北五加。
化合物杠柳苷A為從杠柳中分離的到的一種孕烷苷類化合物(Periplocoside E)，化學(xué)名為Δ5-pregnene-3β，17α，20(S)-triol 3-O-(4’，6’-dideoxy-3’-O-methyl-Δ3’-D-2’-hexosuloside)20-O-(2-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosy(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→5)-3，7-dideoxy-4-O-methyl-α-D-gluco-2-heptulopyranosyl(2-4)-dioxy-(1→3)-β-D-canaropyranoside)，是一種天然化合物，其分子式為C72H114O27，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，杠柳苷A具有一定的抗腫瘤活性。
其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
化合物杠柳苷E為從杠柳中分離的到的一種孕烷苷類化合物(Periplocoside E)，化學(xué)名為Δ5-pregnene-3β，17α，20(S)-triol 20-(2-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosy(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→5)-3，7-dideoxy-4-O-methyl-α-D-gluco-2-heptulopyranosyl(2-4)-dioxy-(1→3)-β-D-canaropyranoside)，是一種天然化合物，其分子式為C65H106O24，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下 目前尚未發(fā)現(xiàn)有天然產(chǎn)物杠柳苷A，E具有免疫抑制活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于提供天然產(chǎn)物杠柳苷A和E的藥物用途，它們可以用于制備免疫抑制藥物。
本申請(qǐng)的發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，天然產(chǎn)物杠柳苷A和E具有免疫抑制作用。因此，杠柳苷A和E可以用來制備免疫抑制藥物，如在無菌條件下制成液體劑型如針劑、溶液，或者是口服劑型如片劑和膠囊等。


圖1是杠柳苷E對(duì)ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。
圖2是杠柳苷E對(duì)LPS刺激的淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用。
圖3是杠柳苷E對(duì)淋巴細(xì)胞的毒性。
圖4是杠柳苷E對(duì)同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖反映的抑制作用。
圖5是杠柳苷E對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 北五加中活性成分杠柳苷E的免疫抑制作用一.實(shí)驗(yàn)材料試驗(yàn)動(dòng)物純系Balb/c雌性小鼠，6-8周齡。
RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco，pH7.2)添加10％胎牛血清(FBS)，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素，10mM HEPES，及50μM 2-ME。
刺激劑伴刀豆蛋白(ConA)，細(xì)菌脂多糖(LPS，來自Escherichia Coli O55B5)，臨用前以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至合適濃度。
二.實(shí)驗(yàn)方法[一]淋巴細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)1.脊椎處死小鼠，無菌取其脾臟，磨碎制成單細(xì)胞懸液，用MTT溶解液(10％SDS，50％二甲基甲酰胺；pH7.2)去除紅細(xì)胞后，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成5×106/ml。
2.96孔培養(yǎng)板中加入80μl的細(xì)胞懸液，40μl的樣品，(補(bǔ)充樣品的濃度，是什么樣品？是A還是E？)40μl含10％FBS的培養(yǎng)液；對(duì)照加80μl培養(yǎng)液，總體積為160μl。并設(shè)空白對(duì)照。
3.放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。在結(jié)束培養(yǎng)前6-7小時(shí)，每孔加5mg/ml MTT16μl。
4.結(jié)束培養(yǎng)時(shí)，每孔加80μl MTT溶解液(10％SDS，50％二甲基甲酰胺；pH7.2)，在培養(yǎng)箱中放置6-7小時(shí)后，用酶標(biāo)儀于570nm處測(cè)定OD570值。
淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)1.脫脊椎處死小鼠，無菌取脾臟制成單細(xì)胞懸液，用含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成4×106/ml。
2.于96孔板中加入100μl的細(xì)胞懸液，50μl的樣品溶液，50μl ConA或LPS溶液，對(duì)照孔加50μl含10％FBS的培養(yǎng)液?？傮w積為200μl。
3.于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。在結(jié)束培養(yǎng)前7-8小時(shí)，每孔加0.5μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷(25μl/孔)。
4.結(jié)束培養(yǎng)，用細(xì)胞收集儀(HARVESTER96，TOMTEC)收集細(xì)胞于玻璃纖維膜上，加入閃爍液，用液體閃爍記數(shù)儀(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)檢測(cè)細(xì)胞DNA中[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量，反映細(xì)胞增殖情況。
同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(MLR)1.脫脊椎處死C57BL/6和Balb/c小鼠，無菌取其脾臟，磨碎制成單細(xì)胞懸液，去除紅細(xì)胞后，用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)成6×106/ml。
2.C57BL/6脾細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，Balb/c脾細(xì)胞(經(jīng)鈷60照射，3000rads)為刺激細(xì)胞，兩種細(xì)胞等體積混合。
3.于96孔板中加入C57BL/6和Balb/c脾細(xì)胞混合液100μl，樣品100μl，對(duì)照加100μl含10％血清的培養(yǎng)液。并做兩種細(xì)胞的單獨(dú)培養(yǎng)對(duì)照。
4.37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3，4，5天。在結(jié)束培養(yǎng)前1天，加入3H稀釋液25μl(即，3.8×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷)。
5.結(jié)束培養(yǎng)時(shí)，將培養(yǎng)板凍存于-20℃冰箱。
6.細(xì)胞收集儀(HARVESTER96，TOMTEC)收集細(xì)胞于玻璃纖維膜上，用液閃記數(shù)儀(MicroBeta Trilux，PerkinElmer)檢測(cè)DNA對(duì)[3H]-胸腺嘧啶核苷的摻入量，反映細(xì)胞增殖情況。
遲發(fā)性超敏反應(yīng)動(dòng)物模型(DTH)1.Day0，Balb/c小鼠(雌性，6-8周齡)每組八只，每只后腳以20μl 0.5％DNFB致敏。次日加強(qiáng)。(DNFB溶于[丙酮∶橄欖油＝4∶1]油劑中)；2.Day(7-9)，鼠右耳內(nèi)外兩側(cè)各10μl 0.4％DNFB進(jìn)行攻擊；3.攻擊前1天腹腔注射一次，攻擊前腹腔注射一次，24小時(shí)后，再給藥一次；4.攻擊后30-48小時(shí)，檢測(cè)各指標(biāo)。
三.實(shí)驗(yàn)結(jié)果[一]五加皮提取物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制活性及其毒性免疫應(yīng)答過程的效應(yīng)表現(xiàn)主要是由以T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)和B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)組成。我們?cè)隗w外用T細(xì)胞絲裂原ConA和B細(xì)胞絲裂原LPS直接刺激細(xì)胞和細(xì)胞的活化分裂增殖來評(píng)價(jià)藥物淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制活性。在諸多五加皮提取物中，杠柳苷E和杠柳苷A表現(xiàn)出對(duì)淋巴細(xì)胞增殖有較好的抑制活性。在無淋巴細(xì)胞毒劑量1μM時(shí)，杠柳苷E對(duì)ConA刺激的T細(xì)胞增殖的抑制率是72％，對(duì)LPS刺激的B細(xì)胞增殖的抑制率是53％；杠柳苷A對(duì)ConA刺激的T細(xì)胞增殖的抑制率是47％，對(duì)LPS刺激的B細(xì)胞增殖的抑制率是26％。所以我們選擇活性相對(duì)更強(qiáng)的杠柳苷E作經(jīng)一步研究。
表五加皮活性提取物對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制活性及其毒性
杠柳苷E對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的作用和毒性杠柳苷E的TC50是10.1±1.4μM，在低于5μM時(shí)沒有淋巴細(xì)胞毒性。對(duì)ConA刺激的T細(xì)胞增殖的抑制IC50是0.64±0.23μM；對(duì)LPS刺激的B細(xì)胞增殖的抑制IC50是0.90±0.17μM。綜合以上結(jié)果，我們?cè)隗w內(nèi)和體外進(jìn)一步檢查其免疫抑制藥理活性。
杠柳苷E對(duì)同種異體混合淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(MLR)的作用異體抗原是輸血、器官移植后引起機(jī)體排異反應(yīng)的主要原因。應(yīng)答淋巴細(xì)胞和異源性淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，表達(dá)在異源性淋巴細(xì)胞上的異體抗原，主要是組織相容性抗原MEC-I、MHC-II分子，刺激應(yīng)答T細(xì)胞引發(fā)免疫增殖反應(yīng)。我們通過藥物對(duì)MLR的作用來評(píng)價(jià)藥物對(duì)更接近生理的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的藥理作用。杠柳苷E顯著的抑制了MLR中應(yīng)答淋巴細(xì)胞的增殖，其EC50是0.25±0.13μM。
杠柳苷E對(duì)遲發(fā)性超敏反應(yīng)動(dòng)物模型(DTH)的作用為了進(jìn)一步檢查在體內(nèi)的免疫藥理活性。我們選用了經(jīng)典的小鼠DTH反應(yīng)模型。DTH實(shí)驗(yàn)是一種體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的方法，與接觸性超敏反應(yīng)相似。DTH也包括致敏和觸發(fā)兩個(gè)階段。致敏約需要6天，在觸發(fā)后的24～48小時(shí)DTH的炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰。在初始的致敏階段有記憶性的抗原特異性細(xì)胞分布到外周各淋巴組織，在任何局部的抗原刺激會(huì)使這些細(xì)胞迅速活化引起DTH。結(jié)果顯示，體內(nèi)給藥杠柳苷E在5mg/kg，20mg/kg時(shí)，能顯著抑制耳腫脹程度(P＜0.01)。與對(duì)照組相比抑制率分別53.9％和66.6％。
小結(jié)天然產(chǎn)物杠柳苷A和E對(duì)于小鼠的T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，杠柳苷A和E對(duì)于DTH反應(yīng)模型的小鼠的耳腫脹程度都具有顯著的抑制作用(P＜0.01)，且毒性較低?？梢赃M(jìn)一步將其開發(fā)成為高效低毒的免疫抑制藥物，如在無菌條件下被制成液體劑型如針劑、溶液，或者是口服劑型如片劑和膠囊等。由于這些技術(shù)都是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，因此不再贅述。
權(quán)利要求
1.結(jié)構(gòu)式如下的天然產(chǎn)物杠柳苷A和E用于制備免疫抑制劑，包括作為活性成分的T、B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)抑制劑中應(yīng)用。 (1)杠柳苷A (2)杠柳苷E
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于制備治療自身免疫疾病的藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于免疫性疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、胰島素依賴性糖尿病、潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化、硬皮病、重癥肌無力、多發(fā)肌炎、自身免疫性血細(xì)胞減少癥、脈管炎綜合癥或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于在制備治療炎癥反應(yīng)、纖維化或由自身免役疾病及相關(guān)疾病所致具有組織損傷或感染的功能異常藥物中應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于在制備治療過敏性疾病藥物中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于過敏性疾病為支氣管哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎或花粉病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于在制備治療排異反應(yīng)的藥物中應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于在制備治療由骨髓造血干細(xì)胞移植所致的移植物抗宿主疾病藥物中應(yīng)用。
9.權(quán)利1到8項(xiàng)中任一項(xiàng)的免疫抑制劑，其中所述的抑制劑包括具有權(quán)利要求9所列結(jié)構(gòu)式的化學(xué)成分作為活性成分的植物提取物及復(fù)方藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了天然化合物杠柳苷A和E的藥用用途。通過實(shí)驗(yàn)證明，杠柳苷A和E具有明顯的免疫抑制作用，且具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)；因此，可以用于制備免疫抑制藥物，且具有廉價(jià)、安全的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1939324SQ200510030148
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者趙維民, 左建平, 劉群芳, 朱一娜, 鄒健, 楊以阜, 田佳, 周宇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所