專利名稱：溶栓激酶(納豆激酶)生產(chǎn)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提出發(fā)酵法生產(chǎn)溶栓激酶(納豆激酶)方法及其應(yīng)用，是微生物技術(shù)領(lǐng)域科技發(fā)明。主要涉及提高溶栓激酶產(chǎn)率方法，適合工業(yè)化生產(chǎn)溶栓激酶膜分離提取方法以及功能性配伍溶栓激酶組合物應(yīng)用于溶血栓、輔助降血壓、輔助調(diào)血脂。
背景技術(shù)：
溶栓激酶是枯草桿菌生長代謝產(chǎn)生的一種易溶于水的胞外堿性蛋白酶，最初由日本學(xué)者于1987年從傳統(tǒng)食品納豆中提取得到，命名為納豆激酶。從1996年起，國內(nèi)學(xué)者也從納豆類似食品(豆豉、豆醬等豆類發(fā)酵食品)中提取得到溶栓激酶，其性質(zhì)與納豆激酶基本一致，從豆類發(fā)酵食品中分離出微生物經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證明溶栓激酶具有高纖溶活性，不僅具有較強(qiáng)的直接降解纖維蛋白作用，還有激活血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織纖溶酶原激活劑，還能激活尿激酶原產(chǎn)生尿激酶，既可靜脈給藥，也可口服給藥，酶活活性穩(wěn)定，是一種較為理想的溶栓制劑。
血管栓塞、高血壓、血脂水平升高、高血粘、冠心病、中風(fēng)互相關(guān)聯(lián)常常合并存在，因此，單一成分有一定局限，采用功能性輔助成分配伍，綜合防治可以起到協(xié)同增效作用。
葉酸(folic acid)又叫葉精，是一種水溶性維生素。葉酸作為輔酶是構(gòu)成含鐵血紅蛋白的成分，主要生理功能是預(yù)防惡性貧血。葉酸在體內(nèi)必須轉(zhuǎn)變成具有生物活性的四氫葉酸才能發(fā)揮作用。維生素C可將葉酸還原成四氫葉酸。葉酸是蛋白質(zhì)和核酸合成的必需因子，在細(xì)胞分裂和繁殖中起重要作用；使甘氨酸和絲氨酸相互轉(zhuǎn)化，使苯丙氨酸形成酪氨酸，組氨酸形成谷氨酸，使半胱氨酸形成蛋氨酸；參與大腦中長鏈脂肪酸如DHA的代謝，肌酸和腎上腺素的合成等。膳食中缺乏葉酸將使血中高半胱氨酸水平提高，易引起動(dòng)脈硬化；膳食中攝入葉酸不足，易誘發(fā)結(jié)腸癌和乳腺癌。葉酸在正常情況下沒有毒性。葉酸易被紫外線破壞，因此，新鮮蔬菜在室溫下貯藏2～3天其葉酸量會(huì)損失50～70％。食物中50～95％的葉酸在烹調(diào)時(shí)被破壞。葉酸缺乏癥在全世界被公認(rèn)為一個(gè)保健問題。
維生素B12(vitamin B12)是體內(nèi)多種代謝過程中所必需的輔酶，參與蛋白質(zhì)、脂肪、糖的代謝。在造血系統(tǒng)中，對(duì)紅血球的形態(tài)和代謝，特別是在DAN合成中作為輔酶，有重要作用。
外源性葉酸、VB12補(bǔ)充劑可預(yù)防心臟系統(tǒng)疾病。早有研究證實(shí)高半胱氨酸含量偏高的人群更易患中風(fēng)、心臟?。黄湫呐K系統(tǒng)疾病致死率也會(huì)增加。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，服用葉酸或VB12補(bǔ)充劑可使體內(nèi)高半胱氨酸含量分別降低25％、32％。葉酸和VB12具有治療心臟病的強(qiáng)大潛能。葉酸以及VB12在預(yù)防心臟系統(tǒng)疾病方面比大蒜、VE或其它飲食補(bǔ)充物更有效。FDA曾于1998年發(fā)布通知，要求谷類制品(如面食)中都必須加入葉酸補(bǔ)充劑。據(jù)調(diào)查，此后美國國民體內(nèi)的平均高半胱氨酸水平趨于下降。
Vc能增強(qiáng)人體抵抗力，保護(hù)微血管，預(yù)防壞血病促進(jìn)傷口愈合。維生素C能增加鐵的利用，其生化過程是通過使膳食中三價(jià)鐵還原為二價(jià)鐵，促進(jìn)鐵的吸收，再以鐵蛋白的形式儲(chǔ)存于肝和骨骼中。實(shí)踐表明，在補(bǔ)充鐵的同時(shí)補(bǔ)充VC可使鐵的吸收率提高22％基本可以達(dá)到血紅素的正常吸收率。
卵磷脂具有很多的生理功能，在本組方中主要作用是增強(qiáng)老年人的記憶力，延緩腦細(xì)胞衰老，預(yù)防老年癡呆癥。卵磷脂中的不飽和脂肪酸的乳化作用能將體內(nèi)多余脂肪溶解成極小的顆粒，代謝排除體外，從而達(dá)到減肥的目的。防治心腦血管疾病，卵磷脂具有極佳的脂溶乳化性，可以迅速快捷地化解沉積的膽固醇和有害血脂，就像流淌在血管中的清道夫，隨時(shí)會(huì)為您去污除垢，徹底消除心血管疾病的誘因。
目前，發(fā)酵法生產(chǎn)溶栓激酶的分離提取工藝多是采用鹽析、透析、離子交換、離心、濃縮等才能得到精制溶栓激酶，其提取步驟多，操作復(fù)雜，酶活損失大，不利于規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
該發(fā)明以農(nóng)副產(chǎn)品(白砂糖、大豆等)為原料，利用枯草桿菌高產(chǎn)溶栓激酶菌株，采用液體深層發(fā)酵工藝，采用復(fù)雜系統(tǒng)調(diào)控技術(shù)優(yōu)選發(fā)酵條件，經(jīng)膜分離技術(shù)、凍干等工藝技術(shù)，生產(chǎn)溶栓激酶。該酶屬于絲氨酸蛋白酶，功能用途是溶化血栓、抑制血小板凝固，預(yù)防高血壓和動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)血脂、保持血流通暢。既可作為醫(yī)藥原料，也可作為功能性食品專用酶，食品添加劑，功能性食品；可開發(fā)成沖劑，片劑，(腸溶)膠囊，口服液等。
本發(fā)明采用的發(fā)酵配料和工藝，提高了深層發(fā)酵溶栓激酶產(chǎn)率，解決了目前溶栓激酶提取工藝復(fù)雜，操作步驟繁雜的問題，提供了一種行之有效、過程短、步驟簡(jiǎn)單的適合工業(yè)化分離提取溶栓激酶的方法。該酶經(jīng)功能性成分科學(xué)配伍，可以增強(qiáng)血栓預(yù)防和治療效果。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明內(nèi)容技術(shù)方案1、發(fā)明涉及的工藝流程原料→粉碎→配料→滅菌→接種→發(fā)酵→膜分離(兩級(jí)微濾→兩級(jí)超濾)→凍干，然后按照產(chǎn)品用途包裝成成凍干粉原料，或添加功能性成分，制成溶栓激酶組合產(chǎn)品。
2、深層發(fā)酵配料和工藝條件枯草桿菌培養(yǎng)產(chǎn)生溶栓激酶，特征在于利用碳源有木糖、麥芽糖、葡萄糖和白砂糖，該發(fā)明優(yōu)選白砂糖；利用氮源有大豆(包括豆粕、豆粉、豆餅、大豆蛋白)及其酶解產(chǎn)物、營養(yǎng)素A、玉米提取物；利用無機(jī)鹽有KH2PO4，K2HPO4，MgSO4·7H2O等；進(jìn)行深層發(fā)酵。
發(fā)酵配料種子培養(yǎng)基葡萄糖1％，牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，KH2PO40.2％，K2HPO40.4％，pH7.0～pH7.2，0.1MPa、20min。
發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖0.5～5％，黃豆粉0～5％，酵母膏0.1～1％，F(xiàn)eCl30.005～0.01％，泡敵0.2～0.5％，KH2PO40.01～0.2％，K2HPO40.2～0.5％，MgSO4·7H2O0.01～0.1％。
發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵罐裝量60-80％，通氣量為10.5～1(V/V)，起始pH6.6～pH7.4，滅菌0.1MPa、20～30min，罐壓0.03～0.05MPa，種量2～3％，溫度32～38℃，攪拌速度280～350rpm，發(fā)酵周期42～45小時(shí)。
3、分離提取工藝條件和溶栓激酶制備發(fā)酵成熟醪液經(jīng)預(yù)冷；經(jīng)兩級(jí)微濾處理得到清亮濾過液；經(jīng)第一級(jí)中空纖維超濾柱，收集滲透液；經(jīng)第二級(jí)中空纖維超濾柱濃縮20余倍，添加輔料(作用是保護(hù)酶活，改善品質(zhì)和加工性能)，冷凍干燥，得到微黃色的溶栓激酶粉未。
第一級(jí)微濾膜孔孔徑為0.2um～0.45um，第二級(jí)為0.02um～0.1um，第一級(jí)超濾膜孔孔徑為300KD～500KD，第二級(jí)為5KD～10KD，保持分離系統(tǒng)溫度0℃～18℃。
上述溶栓激酶制備涉及輔料包括可溶性糖類、變性淀粉、糊精類(麥芽糊精或環(huán)狀糊精)、乳清粉，或其中1種或幾種。
4、栓激酶應(yīng)用枯草桿菌生產(chǎn)的溶栓激酶粉未，可作為醫(yī)藥原料，也可作為功能性食品專用酶，食品添加劑；將溶栓激酶粉未，按口服5000IU～6000IU的劑量加入功能性輔助成分(期待增強(qiáng)溶栓效果)，混合得到溶栓激酶組合物，制成沖劑、腸溶膠囊，口服液等，作為心腦血管保健食品和預(yù)防或治療藥品。
在上述溶栓激酶應(yīng)用中，涉及功能性輔助成分包括葉酸、Vc、卵磷脂、低聚糖(低聚異麥芽或低聚麥芽糖)，VB12，或其中1種到幾種。其中添加量葉酸1～5毫克/天，Vc100～200毫克/天、卵磷脂0.4～0.5克/天、VB122～6毫克/天，優(yōu)選低聚異麥芽糖調(diào)整容量。
該技術(shù)方案優(yōu)點(diǎn)經(jīng)過多批次溶栓激酶深層發(fā)酵，微濾澄清、超濾分離和濃縮、冷凍干燥制樣，功能性成分科學(xué)配伍，分裝技術(shù)方法試驗(yàn)研究，是行之有效的。具有原料易得，發(fā)酵酶活高，工藝流程短，能耗低，操作方便，提取收率高，相對(duì)成本低，適合規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)國家認(rèn)可的單位進(jìn)行急毒檢測(cè)，該產(chǎn)品達(dá)到無毒級(jí)。經(jīng)四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院關(guān)于溶栓激酶體外溶栓檢測(cè)，溶栓效果非常明顯。
實(shí)例1溶栓激酶的生產(chǎn)枯草芽胞桿菌斜面菌種活化后，接入搖瓶種子培養(yǎng)基，32～38℃恒溫150～250rpm培養(yǎng)24小時(shí)，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵罐發(fā)酵42～45小時(shí)后出罐。平均酶活達(dá)到2100IU，預(yù)冷到10℃左右，泵入兩級(jí)微濾機(jī)，收集濾過液，酶活收率90％以上；再經(jīng)第一級(jí)中空纖維超濾去除大分子，第二級(jí)中空纖維超濾濃縮達(dá)到20余倍，酶活收率80％以上；將溶栓激酶濃縮液添加輔料，冷凍干燥，可以得到酶活20000IU/克以上的固體粉未。
實(shí)例2溶栓激酶應(yīng)用(以膠囊成品為例)該技術(shù)方案生產(chǎn)的溶栓激酶活性(相當(dāng)于尿激酶)達(dá)到20000IU克以上，以日服5000IU，日服2次，每次1粒，可直接裝入腸溶膠囊，低聚異麥芽糖調(diào)整容量，每粒裝量0.25克。
還可將1克溶栓激酶(以20000IU/克計(jì)算)凍干粉，組合功能性輔助料葉酸8毫克，Vc400毫克，VB1212毫克，大豆卵磷脂1克，混合均勻，分裝腸溶膠囊8粒。
上述產(chǎn)品，作為心腦血管疾病易發(fā)人群的保健品，用于預(yù)防或輔助治療血栓類心腦血管疾病。
權(quán)利要求
1.以輔料、功能性輔助成分組合的溶栓激酶(納豆激酶)，用作醫(yī)藥原料，功能性食品及其添加劑、食品專用酶、溶栓藥品；可制成片劑、粉劑、口服液、膠囊等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶栓激酶采用如下工藝過程生產(chǎn)原料→粉碎→配料→滅菌→接種→發(fā)酵→膜分離(兩級(jí)微濾→兩級(jí)超濾)→輔料→凍干(溶栓激酶原料)→功能輔助成分→溶栓激酶組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶栓激酶輔料包括可溶性糖類、變性淀粉、糊精類(麥芽糊精或環(huán)狀糊精)、乳清粉，用量按需要的酶活單位任意比添加。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶栓激酶功能性輔助成分及用量分別為葉酸1～5毫克/天、Vc100～200毫克/天、卵磷脂0.4～0.5克/天、低聚糖(低聚異麥芽糖或低聚麥芽糖)、VB122～6毫克/天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的溶栓激酶發(fā)酵配料包括白砂糖0.5～5％，黃豆粉0～5％，酵母膏0.1～1％，泡敵0.2～0.5％，F(xiàn)eCl30.005～0.01％，KH2PO40.01～0.2％，K2HPO40.2～0.5％，MgSO4·7H2O 0.01～0.1％；發(fā)酵工藝條件為發(fā)酵罐裝量60-80％，通氣量為1∶0.5～1(V/V)，起始pH6.6～pH7.4，滅菌0.1MPa、20～30min，罐壓0.03～0.05MPa，種量2～3％，溫度32～38℃，攪拌速度280～350rpm，發(fā)酵周期42～45小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述溶栓激酶分離提純工藝采用以下步驟發(fā)酵成熟醪液經(jīng)兩級(jí)微濾，澄清發(fā)酵液經(jīng)第一級(jí)超濾除去大分子物質(zhì)得到粗酶液；粗酶液經(jīng)第二級(jí)超濾除去小分子物質(zhì)得到溶栓激酶濃縮液；濃縮酶液添加輔料，經(jīng)冷凍干燥制成溶栓激酶原料；提取工藝條件為第一級(jí)微濾膜孔孔徑為0.02um～0.45um，第二級(jí)為0.02um～0.1um，第一級(jí)超濾膜孔孔徑為300KD～500KD，第二級(jí)為5KD～10KD，保持膜分離系統(tǒng)溫度0℃-18℃。
7.一種由權(quán)利要求1～6所述的溶栓激酶應(yīng)用，該酶可與輔料中的一種或幾種混合；可與功能性輔助成分中的一種或幾種混合，按照所需酶活單位調(diào)配，制成以溶栓激酶為主要成分的心腦血管疾病預(yù)防或治療產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提出發(fā)酵法生產(chǎn)高活性溶栓激酶方法和用途，是微生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)發(fā)明。該發(fā)明以農(nóng)副產(chǎn)品(白砂糖、大豆、淀粉等)為原料，利用枯草桿菌高產(chǎn)溶栓激酶菌株，采用液體深層發(fā)酵工藝，復(fù)雜系統(tǒng)調(diào)控代謝技術(shù)，經(jīng)膜分離技術(shù)、凍干等工藝技術(shù)生產(chǎn)溶栓激酶。該酶屬于絲氨酸蛋白酶，功能用途是溶化血栓、抑制血小板凝固、預(yù)防高血壓和動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)血脂、保持血流通暢。既可作為醫(yī)藥原料，也可作為功能性食品專用酶，食品添加劑，功能性食品，溶栓藥品；可開發(fā)成沖劑，片劑、(腸溶)膠囊，口服液等。本發(fā)明采用的發(fā)酵配料和工藝，提高了溶栓激酶產(chǎn)率，解決了目前溶栓激酶純化工藝復(fù)雜，操作步驟繁雜的問題，該酶經(jīng)功能性成分科學(xué)配伍，可以增強(qiáng)血栓、高血壓和高血脂預(yù)防和治療效果。
文檔編號(hào)A61K9/14GK1940064SQ20051002178
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者程金權(quán), 謝文淵, 康建平, 潘紅梅, 王擁軍 申請(qǐng)人:四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院