專利名稱：一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，具體是一種在光合細(xì)菌培養(yǎng)條件下加入槲寄生提取液經(jīng)混合發(fā)酵制成的活菌制劑或滅菌制劑，以及該制劑的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
光合細(xì)菌(PSB)是20億年前地球上最早出現(xiàn)的利用太陽(yáng)能進(jìn)行光合作用生長(zhǎng)繁殖的原核古老微生物，能夠進(jìn)行不放氧的光合作用，在自然界C、N、S、P等循環(huán)中起著重要的作用。過(guò)去多被應(yīng)用于有機(jī)廢水的處理中，近年來(lái)逐步認(rèn)識(shí)到菌體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及一些特殊的生理活性，其研究開(kāi)發(fā)日益受到世界各國(guó)的關(guān)注。
槲寄生為桑寄生科槲寄生屬植物。我國(guó)槲寄生屬分布11種及1變種，藥用部分為干燥帶葉莖枝。槲寄生為一味傳統(tǒng)中藥，其性平，味苦，有祛風(fēng)濕，補(bǔ)肝腎，養(yǎng)血，安胎，降血壓作用。
現(xiàn)有技術(shù)中，已有文獻(xiàn)報(bào)道歐洲槲寄生和朝鮮槲寄生的提取物具有抗腫瘤作用，亦有以白果槲寄生或扁枝槲寄生或槲寄生為原料提取的生物堿和糖蛋白提取物制備方法及其在治療癌癥中的應(yīng)用的專利報(bào)道(如公開(kāi)號(hào)為CN 1417208A的中國(guó)發(fā)明專利，槲寄生堿的制法及其在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用；專利號(hào)為CN 00109341.X的中國(guó)發(fā)明專利，一種槲寄生糖蛋白提取物及含有該提取物的藥物組合物及其制備方法)。
已有報(bào)道光合細(xì)菌制劑的制備及其在治療癌癥中的應(yīng)用的文獻(xiàn)，如專利號(hào)為94106408.5的中國(guó)發(fā)明專利，光合細(xì)菌的應(yīng)用及利用它制得的產(chǎn)品；申請(qǐng)?zhí)枮?2110316.X的中國(guó)發(fā)明專利，光合細(xì)菌制劑的制備方法；專利號(hào)為00120974.4中國(guó)發(fā)明專利，一種治療惡性腫瘤的中藥制劑及制備方法；申請(qǐng)?zhí)?9107591.9.的中國(guó)發(fā)明專利，光合細(xì)菌作為醫(yī)藥保健品的應(yīng)用及其制作方法及其產(chǎn)品；專利號(hào)為01800254.4的中國(guó)發(fā)明專利，紅色光合細(xì)菌及其健康食品，等等。
德國(guó)幾家公司曾生產(chǎn)以白果槲寄生提取物為主要活性成分的制劑用于抗腫瘤的臨床治療，但由于槲寄生含有對(duì)人體有害的毒肽，顯示很強(qiáng)的毒性。
上述已有技術(shù)中亦有用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化中草藥制備治療癌癥的藥物的報(bào)道，但所用中草藥均為復(fù)方，中藥復(fù)方開(kāi)發(fā)成現(xiàn)代中藥最重要的必須經(jīng)過(guò)處方分析，拆方研究，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，從研究時(shí)間及經(jīng)費(fèi)上存在很大困難，何況又用光合細(xì)菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，成分會(huì)更加復(fù)雜，加大了開(kāi)發(fā)成藥物的困難，且其專利報(bào)道中無(wú)任何化學(xué)成分說(shuō)明，且其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)抑瘤率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，該制劑生產(chǎn)所需中草藥組方簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)品毒性低、抑瘤率較高，有望開(kāi)發(fā)成預(yù)防和治療腫瘤的有效藥物。
本發(fā)明提供一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，是在光合細(xì)菌培養(yǎng)條件下加入槲寄生提取液，經(jīng)混合發(fā)酵制成的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑或滅菌制劑。
本發(fā)明制劑的制備方法，包括以下步驟(1)在經(jīng)過(guò)滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入1/2-1/30份數(shù)的光合細(xì)菌菌種，在300-3000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-30天，作為光合細(xì)菌培養(yǎng)液；(2)將槲寄生粉碎，用槲寄生原藥材質(zhì)量7-30倍體積的醇液，分2-4次回流提取1-6小時(shí)，回收提取液中的醇至無(wú)醇味，用光合細(xì)菌培養(yǎng)基稀釋至槲寄生原藥材質(zhì)量2-30倍體積，調(diào)pH至6-8，120-125℃滅菌20-40min，制得槲寄生培養(yǎng)基混合液；(3)將光合細(xì)菌培養(yǎng)液和槲寄生培養(yǎng)基混合液按1∶(2-30)混合，在300-3000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑。
將光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑，在120-125℃滅菌20-40min，就制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生滅菌制劑。
所述的槲寄生可以為白果槲寄生V.album.L.、扁枝槲寄生V.articulatum Burm.f.、槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai或棱枝槲寄生V.diospyrosicolum Hayata。
所述光合細(xì)菌可以是下列光合細(xì)菌中的任意一株菌或它們的任意組合紅螺菌屬Rhodospirillium，如深紅紅螺菌(Rhodospirillium rubrum)；紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas，如沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、綠色紅假單胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、綠硫紅假單胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)；紅細(xì)菌屬Rodobacter，如球形紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)等。
上述菌種文獻(xiàn)的出處姚竹云，張肇銘.幾株光合細(xì)菌的表型特征及其DNA-DNA同源性分析.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1996，2(1)84-89；張肇銘，楊素萍，趙春貴.沼澤紅假單胞菌的分離鑒定研究.山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1992，(4)379-385；楊素萍，張肇銘，趙春貴.綠色紅假單胞菌和綠硫紅假單胞菌的分離與鑒定.微生物學(xué)報(bào)，1995，35(2)91-96；張肇銘，鄧松錄，趙良啟，等.紫色非硫光合細(xì)菌的研究A.球形紅假單胞菌的分離、鑒定和生理特性的研究.山西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1984，(4)54-59。
這些菌種可以從山西省太原市山西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院光合細(xì)菌研究室得到。
在制備步驟(2)中所述的醇液可以是甲醇液、乙醇液，也可以是水。
所述光合細(xì)菌培養(yǎng)基為適合光合細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如可以采用現(xiàn)有技術(shù)中所公開(kāi)的光合細(xì)菌培養(yǎng)基，本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選以下培養(yǎng)基，其組成和含量為乙酸鈉 1000-2000mg CaCl2.2H2O50-100mgMgSO4.7H2O 100-300mgEDTA 10-30mg酵母膏 500-1500mg K2HPO4500-1500mg(NH4)2SO41000-2000mg KH2PO4400-1000mg
FeSO4.7H2O 5-15mg 微量元素溶液 1-5ml去離子水 1000-2000ml培養(yǎng)基的pH為6-8。
其中微量元素溶液組成為H3BO3200-300mg Na2MoO4.2H2O 50-100mgCuSO42-10mg MnSO4.4H2O 150-250mgZnSO4.7H2O 20-30mg去離子水 100-200ml與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果首先，本發(fā)明制備的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑，抗癌活性高，抗癌譜廣。不論是活菌制劑還是滅菌制劑，在用于預(yù)防和治療腫瘤的藥物的應(yīng)用方面，均有明顯的效果。如槲寄生用量在6g/kg/日-30g/kg/日時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)小鼠Lewis肺癌的抑瘤率達(dá)59.64％-79.37％，對(duì)小鼠肝癌H22的抑瘤率達(dá)69.90％-80.27％。其抑瘤率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組，且整體抗氧化系統(tǒng)、免疫增強(qiáng)系統(tǒng)指標(biāo)優(yōu)于其它組；槲寄生濃度在120g/L-6g/L時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑體外對(duì)人體胃癌細(xì)胞BGC-803的生長(zhǎng)抑制率為89.50％-42.40％，對(duì)人體卵巢癌細(xì)胞A2780的生長(zhǎng)抑制率為78.21％-29.80％，對(duì)人體口腔癌細(xì)胞KB的生長(zhǎng)抑制率為81.43％-0.00％，且均呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其生長(zhǎng)抑制率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組。
其次，這種制劑毒性低。槲寄生用量相同時(shí)，槲寄生制劑組發(fā)生多只動(dòng)物死亡，而光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組無(wú)明顯副作用。
第三，這種制劑性能獨(dú)特。實(shí)驗(yàn)后剝離腫瘤組織時(shí)發(fā)現(xiàn)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組的荷瘤小鼠的皮下實(shí)體瘤并不和內(nèi)皮粘連，而其它組小鼠的實(shí)體瘤不同程度地與內(nèi)皮粘連；生理鹽水組和培養(yǎng)基組的小鼠實(shí)體瘤不但與內(nèi)皮粘連，而且開(kāi)始浸潤(rùn)到皮下組織，有發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。說(shuō)明光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組很好的抑制了實(shí)體瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。這對(duì)于惡性腫瘤的治療突破有重要的意義。
另外，本發(fā)明產(chǎn)品的特性通過(guò)下列具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明。
(1)成分對(duì)比實(shí)驗(yàn)樣品175％乙醇回流提取槲寄生，回收溶劑得浸膏，用石油醚萃取浸膏后剩余物用95％乙醇溶解得樣品1。樣品2純光合細(xì)菌培養(yǎng)液濃縮后用75％乙醇回流提取，回收乙醇后浸膏用石油醚萃取后剩余物用95％乙醇溶解得樣品2。樣品3槲寄生75％乙醇提取液用光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化后濃縮得浸膏，用石油醚萃取后剩余物用95％乙醇溶解得樣品3。
層析材料硅膠G-CMCNa板；展開(kāi)劑氯仿∶甲醇＝14∶1；顯色劑5％硫酸乙醇溶液。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1由TLC實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三份樣品化學(xué)成分有很大不同。特別是光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生樣品，在Rf＝0.43的位置有一個(gè)很大的橙色主斑點(diǎn)，而槲寄生樣品、純光合細(xì)菌樣品無(wú)此斑點(diǎn)，該成分結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步鑒定。說(shuō)明光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑成分發(fā)生了根本變化。
(2)毒性、免疫功能、抗氧化功能對(duì)比實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物荷瘤小鼠；實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1)表1毒性、免疫功能、抗氧化功能對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

注與生理鹽水對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.01由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，PSB制劑組、PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組可逆轉(zhuǎn)荷瘤小鼠不適，且可提高荷瘤小鼠的免疫能力和抗氧化能力，但PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組更明顯；槲寄生制劑組、簡(jiǎn)單的槲寄生+PSB制劑組免疫能力和抗氧化能力雖有一定提高，但不明顯，且與PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組同樣劑量時(shí)，發(fā)生多只動(dòng)物死亡，實(shí)驗(yàn)中劑量減為PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑組槲寄生量的三分之二。說(shuō)明槲寄生單獨(dú)使用有一定毒性，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化了其毒性成分。而PSB制劑單獨(dú)使用對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率最高為36.32％，對(duì)體外人癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率最高為31.30％，均低于光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生組。
四

圖1是PSB轉(zhuǎn)化槲寄生樣品與純PSB樣品和槲寄生樣品的成分對(duì)照薄層層析圖。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1-4為PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑的制備，實(shí)施例5-10為制劑的應(yīng)用試驗(yàn)。
實(shí)施例1采用如下光合細(xì)菌培養(yǎng)基，其配方為乙酸鈉1500mg，CaCl2.2H2O 75mg，MgSO4.7H2O 200mg，EDTA 20mg，酵母膏1000mg，K2HPO41000mg，(NH4)2SO41500mg，KH2PO4700mg，F(xiàn)eSO4.7H2O 10mg，微量元素溶液4ml，去離子水1500ml。PH為7。
其中微量元素溶液組成和含量為H3BO3250mg，Na2MoO4.2H2O 75mg，CuSO45mg，MnSO4.4H2O 200mg，ZnSO4.7H2O 25mg，去離子水150ml。
在500ml光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入50ml的沼澤紅假單胞菌光合細(xì)菌菌種，在1000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)10天，作為光合細(xì)菌培養(yǎng)液。
將槲寄生Viscum coloratum(Kom.)Nakai的帶葉莖枝，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎。粉碎后的槲寄生粗粉125g用40％乙醇1800ml分三次，每次提取1小時(shí)，合并濾液，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至500ml，以培養(yǎng)基稀釋至800ml，調(diào)pH至7，121℃滅菌30min得槲寄生培養(yǎng)基混合液；將沼澤紅假單胞菌光合細(xì)菌培養(yǎng)液80ml接種到上述槲寄生培養(yǎng)基混合液中，在1500Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)15天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑。
實(shí)施例2光合細(xì)菌培養(yǎng)液的制備，光合細(xì)菌菌種采用綠色紅假單胞菌和球形紅細(xì)菌混合菌株，其他同實(shí)施例1；將白果槲寄生V.album.L.的帶葉莖枝，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎，粉碎后的槲寄生粗粉125g用95％乙醇3500ml分4次提取，每次提取30分鐘，合并濾液，減壓回收提取液中的乙醇，濃縮至150ml，用培養(yǎng)基稀釋至1200ml，調(diào)pH至6，121℃滅菌20min得槲寄生培養(yǎng)基混合液；將250ml光合細(xì)菌培養(yǎng)液接種到上述槲寄生培養(yǎng)基混合液中，在2000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)10天，121℃滅菌40min，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生滅菌制劑。
實(shí)施例3光合細(xì)菌培養(yǎng)液的制備，光合細(xì)菌菌種采用深紅紅螺菌、綠硫紅假單胞菌和海洋紅假單胞菌混合的菌株，其他同實(shí)施例1；將棱枝槲寄生V.diospyrosicolumHayata的帶葉莖枝，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎，粉碎后的槲寄生粗粉125g用80％甲醇1500ml分2次，每次提取4小時(shí)，合并濾液，減壓回收提取液中的甲醇，濃縮至200ml，用培養(yǎng)基稀釋至3000ml，調(diào)pH至8，121℃滅菌30min得槲寄生培養(yǎng)基混合液；將100ml光合細(xì)菌培養(yǎng)液接種到上述槲寄生培養(yǎng)基混合液中，在500Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)30天，即制成為光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑。
實(shí)施例4光合細(xì)菌培養(yǎng)液的制備，光合細(xì)菌菌種采用深紅紅螺菌、沼澤紅假單胞菌、綠色紅假單胞菌、綠硫紅假單胞菌、海洋紅假單胞菌、球形紅細(xì)菌混合的菌株，其他同實(shí)施例1；將扁枝槲寄生V.articulatum Burm.f.的帶葉莖枝，經(jīng)自然風(fēng)干后粉碎，粉碎后的槲寄生粗粉125g用90％甲醇2500ml分三次，每次提取40分鐘，合并濾液，減壓回收提取液中的甲醇，濃縮至200ml，用培養(yǎng)基稀釋至1500ml，調(diào)pH至7，121℃滅菌30min得槲寄生培養(yǎng)基混合液；將100ml光合細(xì)菌培養(yǎng)液接種到上述槲寄生培養(yǎng)基混合液中，在2500Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)20天，121℃滅菌30min，即制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生滅菌制劑。
實(shí)施例5光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)Lewis肺癌的抑制作用。
1.實(shí)驗(yàn)材料瘤株Lewis肺癌，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院提供，山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室傳代保種。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57/BL小鼠，雌雄各半，體重18±1.0g，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。對(duì)照藥環(huán)磷酰胺制劑(CP)，上海華聯(lián)制藥有限公司出品，批號(hào)0402061。
2.實(shí)驗(yàn)方法取新鮮無(wú)壞死的Lewis肺癌瘤組織，無(wú)菌條件下勻漿，制成單細(xì)胞懸液，于C57/BL小鼠每鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2ml，24小時(shí)后將小鼠按雌雄對(duì)半隨機(jī)分成11組，每組10只，設(shè)生理鹽水對(duì)照組(I組)、550培養(yǎng)基組(II組)、環(huán)磷酰胺組(III組)、PSB制劑組(分大小劑量組)(IV、V組)、槲寄生制劑組(分大小劑量組)(VI、VII組)、槲寄生+PSB制劑組(分大小劑量組)(VIII、IX組)、PSB轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑組(分大小劑量組)(X、XI組)。環(huán)磷酰胺組為腹腔注射環(huán)磷酰胺，100mg/kg，1次；其余各組每天給小鼠灌胃給藥1次。各組均連續(xù)給藥15天。停藥后次日斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重，按“抑瘤率＝(1-試驗(yàn)組瘤重/生理鹽水對(duì)照組瘤重)×100％”公式計(jì)算抑瘤率。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)C57/BL小鼠Lewis肺癌生長(zhǎng)的影響

注1、與荷瘤對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.012、制劑均制成濃縮液，小鼠灌胃劑量為0.4ml/次/日實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)槲寄生原藥材用量在6g/kg/日-30g/kg/日時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑，對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞的抑制率達(dá)59.64％-79.37％，其抑瘤率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組，且整體抗氧化系統(tǒng)、免疫增強(qiáng)系統(tǒng)指標(biāo)優(yōu)于其它組，環(huán)磷酰胺組抑瘤率雖高，但造成全身不良反應(yīng)。由于槲寄生組、槲寄生+PSB制劑組中槲寄生用量為30g/kg時(shí)，造成多只動(dòng)物死亡，用量減為20g/kg。
實(shí)施例6光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)小鼠H22肝癌的抑制作用。
1.實(shí)驗(yàn)材料瘤株H22肝癌，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，山西大學(xué)光合細(xì)菌研究室傳代保種。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±1.0g，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。對(duì)照藥環(huán)磷酰胺制劑(CP)，上海華聯(lián)制藥有限公司出品，批號(hào)0402061。
2.實(shí)驗(yàn)方法取接種7天后的肝癌H22腹水，用生理鹽水稀釋成1∶10的細(xì)胞懸液，于昆明種小鼠每鼠右前肢腋部皮下接種0.2ml，24小時(shí)后將小鼠按雌雄對(duì)半隨機(jī)分成11組，每組10只，設(shè)生理鹽水對(duì)照組(I組)、550培養(yǎng)基組(II組)、環(huán)磷酰胺組(III組)、PSB制劑組(分大小劑量組)(IV、V組)、槲寄生制劑組(分大小劑量組)(VI、VII組)、槲寄生+PSB制劑組(分大小劑量組)(VIII、IX組)、PSB轉(zhuǎn)化槲寄生滅菌制劑組(分大小劑量組)(X、XI組)。環(huán)磷酰胺組為腹腔注射環(huán)磷酰胺，100mg/kg，1次；其余各組每天給小鼠灌胃給藥1次。各組均連續(xù)給藥10天。停藥后次日斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重，按“抑瘤率＝(1-試驗(yàn)組瘤重/生理鹽水對(duì)照組瘤重)×100％”公式計(jì)算抑瘤率。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)小鼠H22肝癌生長(zhǎng)的影響

注1、與荷瘤對(duì)照組比較*P＜0.05**P＜0.012、制劑均制成濃縮液，小鼠灌胃劑量為0.4ml/次/日實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)槲寄生原藥材用量在6g/kg/日-30g/kg/日時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑，對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的抑制率達(dá)69.90％-80.27％，其抑瘤率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組，且整體抗氧化系統(tǒng)、免疫增強(qiáng)系統(tǒng)指標(biāo)優(yōu)于其它組。環(huán)磷酰胺組抑瘤率雖高，但造成全身不良反應(yīng)。由于槲寄生組、槲寄生+PSB制劑組中槲寄生用量為30g/kg時(shí)，造成多只動(dòng)物死亡，用量減為20g/kg。
實(shí)施例7光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-803的抑制作用。
1.實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞BGC-803，中國(guó)輻射防護(hù)研究院傳代保種。培養(yǎng)液含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.實(shí)驗(yàn)方法(MTT法)用0.25％的胰酶消化貼壁的BGC-803癌細(xì)胞株，以配成細(xì)胞懸液，濃度為1×108cell·L-1，分裝于96孔板，每孔100μl，置于5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4小時(shí)后，給藥組加入100μl含不同濃度光合細(xì)菌制劑、槲寄生制劑、光合細(xì)菌+槲寄生制劑、光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑的RPMI1640培養(yǎng)液，各組3個(gè)平行孔，對(duì)照組加入等體積的RPMI1640培養(yǎng)液。置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μl 0.2％MTT溶液(RPMI1640配制)。37℃保溫4小時(shí)，棄去上清，每孔加入DMSO 150μl溶解Formazan顆粒，輕度振蕩后，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定OD值，按“生長(zhǎng)抑制率IR(％)＝(1-用藥組OD值/對(duì)照組OD值)×100％”公式計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)槲寄生原藥材濃度在120g/L-6g/L時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人體胃癌細(xì)胞(體外)BGC-803的生長(zhǎng)抑制率為89.50％-42.40％，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其生長(zhǎng)抑制率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組。
實(shí)施例8光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞A2780的抑制作用。
1、實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株人卵巢癌細(xì)胞A2780，中國(guó)輻射防護(hù)研究院傳代保種。培養(yǎng)液含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.實(shí)驗(yàn)方法(MTT法)用0.25％的胰酶消化貼壁的A2780癌細(xì)胞株，其他步驟同實(shí)施例7。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)槲寄生原藥材濃度在120g/L-6g/L時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人體卵巢癌細(xì)胞(體外)A2780的生長(zhǎng)抑制率為78.21％-29.80％，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其生長(zhǎng)抑制率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組。
實(shí)施例9光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人口腔癌細(xì)胞KB的抑制作用。
1.實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株人口腔癌細(xì)胞KB，中國(guó)輻射防護(hù)研究院傳代保種。培養(yǎng)液含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。
2.實(shí)驗(yàn)方法(MTT法)
用0.25％的胰酶消化貼壁的KB癌細(xì)胞株，其他步驟同實(shí)施例7。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)槲寄生原藥材濃度在120g/L-6g/L時(shí)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)人體口腔癌細(xì)胞(體外)KB的生長(zhǎng)抑制率為81.43％-0.00％，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其生長(zhǎng)抑制率大于光合細(xì)菌組、槲寄生組、光合細(xì)菌+槲寄生組。
表4光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生制劑對(duì)3種人癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響

說(shuō)明書(shū)中有關(guān)名詞的解釋PSB光合細(xì)菌；PSB制劑經(jīng)過(guò)濃縮的純光合細(xì)菌培養(yǎng)物；槲寄生制劑經(jīng)過(guò)濃縮的純槲寄生提取液；槲寄生+PSB制劑濃縮的純光合細(xì)菌培養(yǎng)物加上濃縮的純槲寄生提取液機(jī)械混合而成；PSB轉(zhuǎn)化槲寄生制劑將槲寄生提取液經(jīng)光合細(xì)菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化制得的濃縮制劑，即本發(fā)明的制劑。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，其特征在于，該制劑是在光合細(xì)菌培養(yǎng)條件下加入槲寄生提取液，經(jīng)混合發(fā)酵制成的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑或滅菌制劑。
2.按權(quán)利要求1所述一種預(yù)防和治療腫瘤制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)在經(jīng)過(guò)滅菌的光合細(xì)菌培養(yǎng)基中接入1/2-1/30份數(shù)的光合細(xì)菌菌種，在300-3000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-30天，作為光合細(xì)菌培養(yǎng)液；(2)將槲寄生粉碎，用槲寄生原藥材質(zhì)量7-30倍體積的醇液，分2-4次回流提取1-6小時(shí)，回收提取液中的醇至無(wú)醇味，用光合細(xì)菌培養(yǎng)基稀釋至槲寄生原藥材質(zhì)量2-30倍體積，調(diào)pH至6-8，120-125℃滅菌20-40min，制得槲寄生培養(yǎng)基混合液；(3)將光合細(xì)菌培養(yǎng)液和槲寄生培養(yǎng)基混合液按1∶(2-30)混合，在300-3000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3-30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑。
3.按權(quán)利要求2所述一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑的制備方法，其特征在于將光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑在120-125℃滅菌20-40min，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生滅菌制劑。
4.按權(quán)利要求2或3所述一種預(yù)防和治療腫瘤制劑的制備方法，其特征在于所述的槲寄生為白果槲寄生V.album.L.、扁枝槲寄生V.articulatum Burm.f.、槲寄生Viscumcoloratum(Kom.)Nakai或棱枝槲寄生V.diospyrosicolum Hayata。
5.按權(quán)利要求2或3所述一種預(yù)防和治療腫瘤制劑的制備方法，其特征在于所述光合細(xì)菌為紅螺菌屬Rhodospirillium、紅假單胞菌屬Rhodopseudomonas、紅細(xì)菌屬Rodobacter中的任意一株菌或它們的任意組合。
6.按權(quán)利要求2或3所述一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的醇液是甲醇液、乙醇液，也可以是水。
7.按權(quán)利要求1所述一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，其特征為在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物中的用途。
全文摘要
一種預(yù)防和治療腫瘤的制劑，是用光合細(xì)菌培養(yǎng)液和槲寄生提取液混合發(fā)酵制成的光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑或滅菌制劑。其制備方法包括以下步驟(1)制備光合細(xì)菌培養(yǎng)液；(2)制備槲寄生提取液；(3)將光合細(xì)菌培養(yǎng)液和槲寄生提取液按1∶(2－30)混合，在300－3000Lux光照、厭氧條件下，培養(yǎng)3－30天，制成光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑。光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化槲寄生活菌制劑再經(jīng)滅菌制得滅菌制劑。該制劑生產(chǎn)所需中草藥組方簡(jiǎn)單、生產(chǎn)方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)品毒性低、抑瘤率較高，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成預(yù)防和治療腫瘤的有效藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1718215SQ20051001241
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2005年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日
發(fā)明者楊官娥, 張肇銘 申請(qǐng)人:山西大學(xué)