專利名稱：納豆激酶口服液及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保健食品，具體地說，涉及一種具有心腦血管保健作用的納豆激酶口服液及其制造方法。
背景技術(shù)：
心腦血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全世界每年大約有1500萬人死于心腦血管疾病。我國每年死于心腦血管疾病的人數(shù)也超過全部死亡人數(shù)的50％，且在大城市發(fā)病率尤高。血栓性疾病(例如急性心肌梗塞等)作為中老年人的高發(fā)病，是死亡威脅最大的疾病之一，目前60歲以上的老人已達(dá)到1億以上，占人口比例的8.7％，今后20年我國將進(jìn)入老齡化社會(huì)，心腦血管疾病的防治必須引起足夠的重視。
全世界現(xiàn)有血栓塞病人約1500萬，所需的溶栓藥的潛在市場約20億美元。而現(xiàn)在國內(nèi)市場上使用的溶栓藥物鏈激酶(SK)、尿激酶(UK)、組織型纖溶酶原激活劑(tPA)等都存在幾個(gè)明顯的不足抗再灌注、產(chǎn)生再栓塞和出血性副作用，且價(jià)格昂貴。
納豆激酶(Nattokinase，NK)是1987年由日本生理學(xué)教授須見洋行博士等從200多種食品中首先發(fā)現(xiàn)并命名的一種分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于UK、SK、tPA的蛋白質(zhì)，是納豆菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，等電點(diǎn)是8.7，分子量是25000，具有很強(qiáng)的纖維蛋白溶解能力，并具有活化彈性酶和尿酸酶的活性，在此之后的相關(guān)研究表明，納豆激酶能夠有效的清除人體血液內(nèi)的血栓，是目前溶栓活力最高的蛋白酶(也有報(bào)道認(rèn)為食品中唯有納豆激酶能夠溶解已經(jīng)形成的血栓)，而且對(duì)高血壓，衰老，中風(fēng)，肌肉痙攣和心腦血管疾病也有很好的療效，已被用作溶栓藥物。并且，由于納豆激酶來源于日本傳統(tǒng)的食物(納豆)，安全性好，同時(shí)并可由腸道吸收，在體內(nèi)作用持續(xù)時(shí)間長，最重要的一點(diǎn)是它還能激活人體內(nèi)重組組織型纖溶酶原激活劑(RtPA)，使之溫和、持續(xù)地提高血液的纖溶活性，因此近年來，以納豆激酶為主要成分作為藥品、功能性食品、食品添加劑或者保健品的研發(fā)工作進(jìn)展的非常迅速。日本大和制藥有限公司生產(chǎn)的納豆激酶產(chǎn)品“NKCP”(45美元/盒)作為藥用，有軟交囊、硬膠囊和片劑3種形態(tài)；溫翠普-圣特公司生產(chǎn)的“納豆精”有軟膠囊、硬膠囊兩種形態(tài)，作為食品添加劑和功能性食品在日本和世界各地銷售；過敏癥研究集團(tuán)公司生產(chǎn)的含納豆激酶產(chǎn)品，為復(fù)方制劑，產(chǎn)品名稱為納豆激酶(65美元/盒)，作為食品補(bǔ)劑和功能食品在國內(nèi)外銷售；韓國維壽酶公司生產(chǎn)的以納豆激酶為主要成分的維壽酶是藥用腸溶膠囊，每日服用量為2000IU/日。
從以上介紹可以看出，目前的納豆激酶產(chǎn)品在形式上都為膠囊或片劑，或者被加工成含有納豆激酶的保健食品，其原因主要是因?yàn)榧{豆或納豆激酶本身具有一種獨(dú)特的氣味，對(duì)于很多人而言是一種不適的微臭氣味，所以，目前的生產(chǎn)多是加工成濃縮劑型供吞服。但是，納豆激酶是一種熱敏性的蛋白酶，在加熱(高于60℃)的條件下，很容易變性失活，導(dǎo)致其溶纖活性降低甚至消失，因此，在納豆激酶產(chǎn)品生產(chǎn)中，欲保留較高的納豆激酶纖溶活性，又要實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的高度濃縮，對(duì)于生產(chǎn)工藝提出了很高的要求，例如目前大多采用的G-sphendex Gel過濾純化和冷凍干燥得到干品的方法，生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)規(guī)模小，這也是導(dǎo)致這類產(chǎn)品高價(jià)格的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種納豆激酶口服液，可以作為預(yù)防心腦血管的保健品或輔助治療藥，通過適當(dāng)?shù)呐浞皆O(shè)計(jì)，既保證了口服液的纖溶活性，還具有能被消費(fèi)者接受的口感。
本發(fā)明還提供了該納豆激酶口服液的制造方法。
本發(fā)明提供的納豆激酶口服液，其來自產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物，并含有0.5-3％的環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物，每毫升口服液中的納豆激酶纖溶活性為100-400IU。
本案發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有納豆激酶保健品市場進(jìn)行了大量分析研究后發(fā)現(xiàn)，截止到目前，世界范圍內(nèi)并沒有納豆激酶口服液的相關(guān)報(bào)道，也沒有相關(guān)產(chǎn)品問世。發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索，認(rèn)為納豆激酶纖溶活性在100-400IU/ml范圍內(nèi)的發(fā)酵液，其口感比較好接受，而且這個(gè)濃度范圍的產(chǎn)品作為口服制劑基本可以滿足日常的保健攝入量，尤其是通過環(huán)糊精的調(diào)節(jié)作用，可以直接作為口服液而不必再制備成高純度的干品。由于不需借助各種化學(xué)試劑進(jìn)行沉淀等精制處理，也提高了產(chǎn)品的安全性，并且可以保全發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分?；谶@樣的結(jié)論，本發(fā)明提供的口服液形式的納豆激酶保健品，填補(bǔ)了該類產(chǎn)品的市場空白。
為使口服液具有更好的口感及更全面的保健治療效果，本發(fā)明的納豆激酶口服液組成中可以含有適當(dāng)?shù)恼{(diào)味劑和其它功能性添加劑，包括甜味劑，例如蔗糖、甜菊苷、蜂蜜、蛋白糖、果葡糖漿等；酸味劑，例如檸檬酸或檸檬酸鈉等；功能性添加劑，例如異黃酮、卵磷脂、低聚木糖醇、VE、VC等；防腐劑，可以是苯甲酸鈉或山梨酸鉀等。所述添加劑均應(yīng)滿足食品添加劑的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，它們的含量也應(yīng)該是在規(guī)定限度內(nèi)，經(jīng)適當(dāng)調(diào)配而使口服液具有更加理想的口感和全面的營養(yǎng)保健功效。一般情況下，以口服液產(chǎn)品的總重量為基準(zhǔn)，其中還可包含6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味劑、適量的功能添加劑及0.005-0.01％的防腐劑，也可采用其他甜味劑替代蔗糖，以方便糖尿病人服用。
本案發(fā)明人在探索試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，向上述濃縮液中加入山楂水提物將更顯著地改善口服液的口感，同時(shí)借助山楂中保健成分的加入，也可輔佐納豆激酶的功效。所以本發(fā)明優(yōu)選還提供了一種復(fù)合型的納豆激酶口服液，在上述口服液中還添加了口服液總重量15-30％的山楂水提物，該山楂水提物可以是直接使用山楂果研磨后得到的果漿加水浸提后的上清液，目的在于利用山楂中的山萜和黃酮等保健成分，更提高了納豆激酶的功效。當(dāng)然該添加了山楂水提物的口服液中的納豆激酶纖溶活性仍應(yīng)為100-400IU/ml。
對(duì)于納豆激酶產(chǎn)品的應(yīng)用，營養(yǎng)專家建議每日服用的預(yù)防量為1500-2000IU，所以每天服用本發(fā)明的納豆激酶口服液10-20毫升，就完全可以達(dá)到預(yù)防治療、增進(jìn)健康的目的?？梢姳景l(fā)明的納豆激酶口服液在服用和攜帶上都是很方便的，而由于劑型的改變降低了生產(chǎn)成本，更符合普通消費(fèi)者的需求，可使消費(fèi)人群從特殊化轉(zhuǎn)向大眾化，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
另一方面，在不降低所述納豆激酶口服液產(chǎn)品的保健功能的前提下，本發(fā)明還提供了一種納豆激酶口服液的生產(chǎn)方法，能夠有效的降低成本，縮短生產(chǎn)周期，增加產(chǎn)量，從而解決當(dāng)前納豆激酶保健品生產(chǎn)工藝復(fù)雜生產(chǎn)成本高的問題。
本發(fā)明的納豆激酶口服液的制造方法，主要包括以下步驟(1)利用產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌制備納豆激酶發(fā)酵液；(2)以3000-5000rpm的轉(zhuǎn)速離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)；(3)離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行進(jìn)行脫炭處理；(4)在低于60℃的溫度下進(jìn)行濃縮至預(yù)定濃度，然后加入環(huán)狀糊精或環(huán)糊精衍生物，其含量為口服液的0.5-3％(在實(shí)際操作中，換算成以濃縮液量的質(zhì)量為基準(zhǔn)添加比較方便)，在低于60℃的溫度下攪拌1-2小時(shí)，并進(jìn)行調(diào)配；和(5)低于60℃下對(duì)濃縮液實(shí)施微濾滅菌或輻照滅菌。
本發(fā)明的口服液中的主要活性成分納豆激酶，來自能夠生產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物。枯草桿菌作為一種益生菌，在國內(nèi)外公開的專利和文獻(xiàn)中有大量報(bào)道，市場上也能夠商購得到，例如Bacillus Subtilis AK(PN2003-210136，F(xiàn)ERM P-18291 JP)，Bacillus Subtilis MR141(PN 08-154616，F(xiàn)ERM P-14692 JP)，Bacillus Subtilis IAM1026(PN 5486467，F(xiàn)ERM BP-6713US)，Yunnan SL-001(PN 6420145，F(xiàn)ERM BP-4844 US)，Bacillus SubtilisAS2(PN 99/28441，F(xiàn)ERM BP-6139 PCT)，Bacillus natto KA145(PN2001-238667，F(xiàn)ERM P-17659 JP)，Bacillus natto T0-9(PN 06-261744 FERMP-13164 JP)，Bacillus Subtilis M2-4(PN 6767729，F(xiàn)ERM BP-7155 US)Bacillus Subtilis TOYO-11 TO 13(PN 2003/013565，F(xiàn)ERM BP-8011 TO 8013PCT)，Bacillus natto NLSSe(申請(qǐng)?zhí)?2121352.6，CGMCC NO.0724 CN)，Bacillus Subtilis natto HW4-1(申請(qǐng)?zhí)?2116667.6，CGMCC NO.0718 CN)，Bacillus natto X-501(申請(qǐng)?zhí)?0107589.6，CGMCC NO.0449 CN)，BacillusSubtilis natto(ASI.1086)，Bacillus SP.CK 11-4(Wonkeuk kim.etl.AmericanSociety for Microbiology，VOL 62.NO.7)等，這些菌種在發(fā)酵過程中除能夠產(chǎn)生納豆激酶外，它們各級(jí)代謝產(chǎn)物均含有對(duì)人體有益的成分，因此都可作為本發(fā)明的原料菌種，本發(fā)明優(yōu)選采用納豆桿菌，其能夠通過固體或液體基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生高效纖溶活性的納豆激酶或者類似的溶栓酶。
根據(jù)選定的菌種，選擇其適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其中，可以選用固體發(fā)酵法，把菌種制成菌懸液，接種到固體培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。但是，由于本發(fā)明最終需要制成一種口服液，而當(dāng)采用固體發(fā)酵時(shí)，需要將發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶溶解提取出來，反而會(huì)使生產(chǎn)工藝復(fù)雜、增加生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明優(yōu)選采用液態(tài)發(fā)酵法，其具體工藝如下試管菌種→平板活化→接種→種子液發(fā)酵→生產(chǎn)液發(fā)酵。
選用納豆激酶高產(chǎn)菌株，直接在平板上進(jìn)行分離篩選，分離平板優(yōu)選為LB-瓊脂糖-纖維蛋白平板LB培養(yǎng)基配制時(shí)用0.01M磷酸鉀緩沖液(PB pH7.4)溶解，制作平板時(shí)，將人血纖維蛋白原和凝血酶溶解于其中，其制作方法同瓊脂糖-纖維蛋白平板。
之后進(jìn)行納豆激酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，本發(fā)明中，根據(jù)所選用的不同菌種的最佳培養(yǎng)條件，所用到的發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源、碳源和無機(jī)鹽可以進(jìn)行選擇，例如，氮源可以選擇大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、酪蛋白酸水解物以及干大豆粉末等中的一種或多種混合使用，使用的質(zhì)量濃度優(yōu)選在0.5-4.0％左右；碳源可以是葡萄糖、木糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖和蔗糖中的一種或多種，使用的質(zhì)量濃度優(yōu)選在1.0％-10.0％左右；無機(jī)鹽可以選擇KH2PO4約0.2％、K2HPO4約0.4％、MgSO4約0.05％、和CaCl2約0.02％等。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的方法，使用納豆桿菌進(jìn)行發(fā)酵制備種子液，發(fā)酵至OD＝0.3-1.0，以1.0-2.0％左右的接種量進(jìn)行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵溫度25-40℃，發(fā)酵周期12-35小時(shí)，pH為6-8。
發(fā)酵后的液體，首先需要進(jìn)行低速離心，以除去發(fā)酵液中的大部分菌體和雜質(zhì)。離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為3000-5000rpm；然后，對(duì)離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行脫炭處理，以脫除其中的苦澀味；之后，再進(jìn)行濃縮，由于本發(fā)明中的生產(chǎn)納豆激酶的菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一些有益產(chǎn)物是熱敏性的，因此，本發(fā)明不適宜采用加熱濃縮，適用于本發(fā)明的濃縮方法優(yōu)選為常溫超濾濃縮，超濾膜的截留分子量為50000-200000，超濾壓力0.1-0.3MPa，截留率≥90％，濃縮倍數(shù)視發(fā)酵液中納豆激酶的纖溶活性而確定，一般在10-30倍左右，較適宜的為20倍左右，以得到所要求濃度的濃縮液。
直接口服該濃縮液會(huì)感覺到納豆特有的咸、苦味，對(duì)于多數(shù)人還是感到不好接受，所以再加入1-3％的環(huán)糊精或其衍生物，適當(dāng)加熱(不高于60℃，優(yōu)選30-60℃)攪拌1-2小時(shí)，可達(dá)到改善風(fēng)味的目的，所使用的環(huán)糊精或其衍生物是指食品加工中通常使用的，例如β-環(huán)糊精(β-CD)、羥丙基-β-環(huán)糊精(hp-β-CD)等。當(dāng)然也可同時(shí)加入適合的調(diào)味劑適當(dāng)調(diào)配，例如，以最終得到的納豆激酶口服液的總重量為基準(zhǔn)，添加6-8％的蔗糖、0.15-0.25％的酸味劑、適量的功能添加劑和0.005-0.01％的防腐劑，并攪拌均勻。
根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的方案，在加入環(huán)狀糊精或其衍生物并調(diào)配好的濃縮液中加入山楂水提物，所述山楂水提物的制備方法包括將山楂果研磨后加蒸餾水?dāng)嚢杞?2-24小時(shí)，離心分離收取上清液，制成的口服液中該山楂水提取物占口服液重量的15-30％。
接下來，為延長最終產(chǎn)品的保質(zhì)期，需要對(duì)所制得的口服液進(jìn)行滅菌及灌裝。同樣由于納豆激酶及其它一些熱敏性物質(zhì)的存在，本發(fā)明不能采用熱壓滅菌，必須采用一種“冷殺菌”，即，要求滅菌的溫度不能超過60℃，優(yōu)選在更低的溫度下達(dá)到有效滅菌。本發(fā)明優(yōu)選可以采用微濾除菌或輻照滅菌。微濾膜孔徑0.05-0.45μm，可有效濾去絕大部分的細(xì)菌和病毒，之后進(jìn)行無菌灌裝?；蛘撸捎幂椪諟缇?采用該處理方法應(yīng)該先灌裝再連同包裝一起進(jìn)行滅菌)，放射源可以為Co60，輻照劑量為1-12Kgy，優(yōu)選為3-8Kgy。
通過上述步驟得到的納豆激酶口服液產(chǎn)品，外觀基本為近乎無色(采用LB培養(yǎng)基為黃色，若采用優(yōu)化的培養(yǎng)基則為無色，如果加入山楂水提物則微紅色)透明，調(diào)配后略有納豆的氣味，加入山楂提取物的口服液則帶有山楂的酸甜口味，基本沒有納豆的苦咸口味。該口服液產(chǎn)品可在常溫下至少保存6個(gè)月。
同時(shí)，為驗(yàn)證本發(fā)明的口服液產(chǎn)品中具有良好的纖溶活性，本發(fā)明還對(duì)得到的納豆激酶口服液產(chǎn)品的纖溶活性進(jìn)行了定性和定量鑒定，具體方法如下1、對(duì)納豆激酶口服液的纖溶活性的定性鑒定參照文獻(xiàn)Acta Nutrimenta Sinica，2003，01(25)，146-51中的方法，用凝固血塊溶解法對(duì)納豆激酶口服液的纖溶活性進(jìn)行定性鑒定。即，從上述包裝好的納豆激酶口服液成品中吸取1ml用pH＝7.4的PB緩沖液作適當(dāng)稀釋，加到1滴人血形成的血液凝塊的試管內(nèi)。加入了上述納豆激酶口服液樣品的血液凝塊在1-2小時(shí)內(nèi)全部溶解，而相應(yīng)的加入了作為對(duì)照的生理鹽水的血液凝塊沒有溶解。
2、對(duì)納豆激酶口服液的纖溶活性的定量鑒定參照文獻(xiàn)Arch Biochem Biophys，1952，40346-351中的方法，用纖維蛋白平板法對(duì)納豆激酶口服液的纖溶活性進(jìn)行定量鑒定。制作方法如下將0.1g瓊脂糖溶于10ml PB緩沖液中，加熱溶解后，置于45℃保溫45分鐘。將10mg人血纖維蛋白原純品溶于10ml PB緩沖液中，45℃水浴10分鐘。取1IU的凝血酶加入瓊脂糖溶液中混勻，同時(shí)把纖維蛋白原溶液倒入上述混合液中，立即混勻倒入9cm×9cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置至少一小時(shí)，使其充分凝固。將平皿打孔，上樣10μl，室溫下放置10分鐘，再放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18小時(shí)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量其溶圈直徑Φ，根據(jù)圓面積公式S＝π×Φ2/4計(jì)算出溶圈面積，表示酶活力，或計(jì)算出相當(dāng)尿激酶活力的單位數(shù)(定義為IU)。
3、尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定取不同的國際單位數(shù)(IU)的尿激酶，將其點(diǎn)樣于纖維蛋白平板上，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其溶圈直徑，計(jì)算出溶圈面積。以溶圈面積為橫坐標(biāo)(X軸)，以log10IU+2為縱坐標(biāo)(Y軸)，用Microsoft Excel作出尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得出計(jì)算公式y(tǒng)＝0.0071x-0.2354。
經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明的口服液中納豆激酶的纖溶活性單位在100-400IU/ml，如果每天服用10-20毫升左右，完全可以達(dá)到預(yù)防和治療心腦血管疾病、增進(jìn)健康的目的。
由上述本發(fā)明的納豆激酶口服液及其生產(chǎn)方法可知，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.目前世界范圍內(nèi)并沒有納豆激酶口服液的相關(guān)報(bào)道，因此，本發(fā)明在納豆激酶保健品開發(fā)領(lǐng)域內(nèi)是一項(xiàng)開創(chuàng)性的成果，擴(kuò)大了納豆激酶作為保健品的應(yīng)用領(lǐng)域。
2.本發(fā)明的口服液中，含有生物發(fā)酵所產(chǎn)生的高活性的納豆激酶，作為保健品長期飲用，能有效降解人體血栓的骨架成分-纖維蛋白，從而溶解血栓，起到預(yù)防和治療心腦血管疾病的保健作用。
3.由于加工方法的簡化，并采用合理的滅菌手段，產(chǎn)品營養(yǎng)成分損失少，最大限度的保留了口服液中納豆激酶的生物活性和其它熱敏性生物活性物質(zhì)，即，產(chǎn)品中的納豆激酶纖溶活性較通常的液體發(fā)酵產(chǎn)物高。例如，定性檢測(cè)中加樣1ml，在90min內(nèi)血塊全部溶解，而在纖維蛋白平板定量檢測(cè)中上樣50μl，納豆激酶的纖溶活性可達(dá)到150-400個(gè)尿激酶單位/ml納豆激酶發(fā)酵濃縮樣。
4.本發(fā)明通過適當(dāng)?shù)氖侄魏吞砑舆M(jìn)行調(diào)配，有效掩蓋了納豆激酶及其它有益發(fā)酵產(chǎn)物特殊的氣味，口感有很大改善，適合更廣泛的人群。同時(shí)利用山楂中的山萜和黃酮等保健成分，制備出的含有山楂水提物的口服液產(chǎn)品更提高了納豆激酶的功效。
5.本發(fā)明選用的液體發(fā)酵培養(yǎng)基原料和食品添加劑來源廣泛，價(jià)格便宜，安全可靠。
6.在篩選高產(chǎn)菌株的過程中，傳統(tǒng)的篩選方法一般為生長平板進(jìn)行菌株的生長培養(yǎng)，而后采用分離平板進(jìn)行篩選，而本發(fā)明經(jīng)過研究實(shí)驗(yàn)，采用了一步分離法進(jìn)行菌株的生長、分離和篩選，不僅分離效果好，而且大大簡化了菌株篩選的步驟，節(jié)約了生產(chǎn)時(shí)間。
7.在生產(chǎn)的過程中省略了傳統(tǒng)的葡聚糖凝膠(G-sphendex Gel)或者柱層析過濾純化和冷凍干燥得到干品的步驟，因而生產(chǎn)工藝簡單，生產(chǎn)成本低廉，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，并且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施實(shí)例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)例，這些實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做的某些改變和調(diào)整也應(yīng)視為屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例11、發(fā)酵試管菌種→平板活化→接種→種子液發(fā)酵→生產(chǎn)液發(fā)酵其中的平板培養(yǎng)基和種子發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基，其配方為細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基為大豆蛋白胨1.5％、蔗糖2％、KH2PO40.2％、K2HPO40.4％、MgSO40.05％、CaCl20.02％。
種子液發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵至OD660＝0.3-1.0時(shí)停止；取1.0％的種子液接種到5L生產(chǎn)發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵溫度35℃，發(fā)酵周期12h，pH6，發(fā)酵至產(chǎn)生大量白色的粘性絲狀物時(shí)停止發(fā)酵。
2、發(fā)酵液處理發(fā)酵完畢后，先進(jìn)行低速離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)速為3000rpm；離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行脫炭處理，先期去除發(fā)酵液的苦澀味。
3、濃縮發(fā)酵液經(jīng)過脫炭處理后進(jìn)行超濾濃縮，以在常溫下除去過多的溶劑，使發(fā)酵液中的納豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超濾膜截留分子量為100000，超濾壓力0.1MPa，超濾溫度為常溫，濃縮倍數(shù)為15倍，大約得到0.3L濃縮發(fā)酵液。
4、調(diào)配過濾濃縮液中加入約3g的β-環(huán)糊精，40℃左右維持?jǐn)嚢?-2小時(shí)，使環(huán)糊精完全溶解。
再加入60ml山楂提取液，加入量為上述濃縮液質(zhì)量的20％(約為最終口服液總重量的16％)，同時(shí)按照重量配比分別稱取24g的蔗糖、0.03g的苯甲酸鈉、0.6g的檸檬酸鈉、按順序加入到0.3L的納豆激酶濃縮液中，于配料罐中攪拌混合均勻后，進(jìn)行預(yù)過濾，以除去混合液中的雜質(zhì)。
其中的山楂提取液的制取方法為稱取一定量的山楂果(經(jīng)篩選和清洗)，研磨后加入5倍水，50℃左右攪拌浸提(150-240rpm)約12-15小時(shí)，濾去果渣后離心分離，收取上清液即為山楂提取液。由于果膠的存在，提取液冷卻后為粘稠狀，所以應(yīng)保持40-50℃盡快加入上述濃縮液中，調(diào)配后的口服液具有一定的澄清度，冷卻后有粘稠感，顏色微紅。
5、滅菌滅菌采用微濾除菌，微濾膜孔徑0.1μm，用來去除混合液中的微生物(包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌和病毒)和大分子物質(zhì)(分子量超過50000)，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。
6、灌裝產(chǎn)品滅菌后，按照無菌操作的要求，將藥液灌裝到紫外線滅過菌的容量為10ml的安培瓶中，即得到最終產(chǎn)品。
本實(shí)施例中的最終產(chǎn)品外觀為微紅色的透亮液體，酸甜適口，纖溶活力高，達(dá)到2300IU/支，能有效的預(yù)防和治療心腦血管疾病。該口服液產(chǎn)品常溫可保存6個(gè)月以上。
實(shí)施例21、發(fā)酵試管菌種→平板活化→接種→種子液發(fā)酵→生產(chǎn)液發(fā)酵其中的平板培養(yǎng)基，種子發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基，其配方為細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基為大豆蛋白胨0.5％、蔗糖1.5％、KH2PO40.2％、K2HPO40.4％、MgSO40.05％、CaCl20.02％。
種子液發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵至OD660＝0.3-1.0時(shí)停止；取2％的種子液接種到5L生產(chǎn)發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵周期30h，pH8，發(fā)酵至產(chǎn)生大量白色的粘性絲狀物時(shí)停止發(fā)酵。
2、發(fā)酵液處理發(fā)酵完畢后，先進(jìn)行低速離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)速為5000rpm；離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行脫炭處理，去除發(fā)酵液的苦澀味。
3、濃縮發(fā)酵液經(jīng)過脫炭處理后進(jìn)行超濾濃縮，主要是為了在常溫下除去過多的溶劑，使發(fā)酵液中的納豆激酶和其他的活性成分得到有效的富集。超濾膜截留分子量為80000，超濾壓力0.3MPa，超濾溫度為常溫，濃縮倍數(shù)為25倍，大約得到0.2L濃縮發(fā)酵液。
4、調(diào)配過濾濃縮液中加入約4g的β-環(huán)糊精(最終產(chǎn)品中β-環(huán)糊精的含量在2％左右)，40℃左右維持?jǐn)嚢?-2小時(shí)，使環(huán)糊精完全溶解。
按照重量配比分別稱取0.6g的蛋白糖、3g的蜂蜜，0.02g的苯甲酸鈉、0.3g的檸檬酸鈉、4g的木糖醇，0.5g的卵磷脂，加入到納豆激酶濃縮液中，于配料罐中攪拌混合均勻后，進(jìn)行預(yù)過濾，以除去混合液中的雜質(zhì)。
5、灌裝按照無菌操作的要求，將藥液灌裝到紫外線滅過菌的容量為10ml的安培瓶中。
6、滅菌滅菌采用輻照滅菌，放射源為Co60，輻照劑量為6.5Kgy，以殺死混合液中的微生物，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。
本品外觀為無色透亮液體，酸甜適口，纖溶活性約3200IU/支，營養(yǎng)豐富，添加的卵磷脂能對(duì)納豆激酶起到協(xié)同增效的作用，同時(shí)本產(chǎn)品加入了功能性低聚多糖，不僅能有效的預(yù)防和治療心腦血管疾病，也是糖尿病患者的良好保健品。本實(shí)施例的口服液產(chǎn)品常溫下可保存8個(gè)月以上。
實(shí)施例31、發(fā)酵試管菌種→平板活化→接種→種子液發(fā)酵→生產(chǎn)液發(fā)酵其中的平板培養(yǎng)基，種子發(fā)酵培養(yǎng)基均為LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基，其配方為細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨10g/L，細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基為大豆蛋白胨2.5％、蔗糖6.0％、KH2PO40.2％、K2HPO40.4％、MgSO40.05％、CaCl20.02％。
種子液發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵至OD660＝0.4-0.8時(shí)停止；取2％的種子液接種到5L生產(chǎn)發(fā)酵液進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，發(fā)酵溫度37-38℃，發(fā)酵周期30h，pH7，發(fā)酵至產(chǎn)生大量白色的粘性絲狀物時(shí)停止發(fā)酵。
2、發(fā)酵液處理發(fā)酵完畢后，先進(jìn)行低速離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)，轉(zhuǎn)速為4000rpm；離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行脫炭處理，去除發(fā)酵液的苦澀味。
3、濃縮發(fā)酵液經(jīng)過脫炭處理后進(jìn)行超濾濃縮，超濾膜截留分子量為200000，超濾壓力0.3Mpa，超濾溫度為常溫，濃縮倍數(shù)為10倍，得到大約0.5L發(fā)酵濃縮液。
4、調(diào)配過濾濃縮液中加入15g的羥基丙-β-環(huán)糊精，40℃左右維持?jǐn)嚢?-2小時(shí)，使環(huán)糊精完全溶解。
再加入山楂提取液(提取及加入方法同實(shí)施例1)，加入量為上述濃縮液質(zhì)量的25％，按照重量配比分別稱取40g的蔗糖，0.05g的苯甲酸鈉，1g的檸檬酸，1g的VE，1g的VC加人到納豆激酶濃縮液中，于配料罐中攪拌混合均勻后，進(jìn)行預(yù)過濾，以除去混合液中的雜質(zhì)。
5、灌裝按照無菌操作的要求，將藥液灌裝到紫外線滅過菌的容量10ml的安培瓶中。
6、滅菌滅菌采用輻照滅菌，放射源為Co60，輻照劑量為8Kgy，以殺死混合液中的微生物，延長產(chǎn)品的保質(zhì)期。
本品外觀為微紅色的透亮液體，營養(yǎng)豐富，酸甜適口，纖溶活性約1800IU/支，能有效的預(yù)防和治療心腦血管疾病，并能清除體內(nèi)的有害自由基，起到延緩衰老，增進(jìn)健康的作用。
口感試驗(yàn)50名試驗(yàn)者(隨機(jī)挑選)，分別給予不同樣品(調(diào)味輔料的添加完全相同)品嘗，統(tǒng)計(jì)他們的反映，結(jié)果如下

可見，加入1％環(huán)糊精調(diào)配后的發(fā)酵液已經(jīng)能被多數(shù)人接受，而再加入山楂提取液后，口感更有顯著改善。
山楂水提物的加入對(duì)溶栓效果的影響用纖維蛋白平板法驗(yàn)證山楂水提物的協(xié)同效果按照下表所示的實(shí)驗(yàn)安排，分別從準(zhǔn)備好的1#，2#，3#樣品中吸取50μl，加到提前制備好的含有凝血酶和纖維蛋白原的纖維蛋白平板內(nèi)，于37℃下靜置18個(gè)小時(shí)，觀察反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的溶圈直徑，計(jì)算出相應(yīng)的溶圈面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2#明顯比1#的溶圈面積大22％左右，而作為對(duì)照的3#樣品的血液凝塊沒有溶解，說明納豆激酶和山楂水提物在溶栓作用上存在協(xié)同效果。
納豆激酶和山楂水提物協(xié)同效果實(shí)驗(yàn)

權(quán)利要求
1.一種納豆激酶口服液，由產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌的發(fā)酵液制備而成，其中含有0.5-3％的環(huán)狀糊精或環(huán)糊精衍生物，每毫升口服液中的納豆激酶纖溶活性為100-400IU。
2.權(quán)利要求1所述的納豆激酶口服液，其由納豆桿菌的發(fā)酵液制備而成。
3.權(quán)利要求1所述的納豆激酶口服液，其中還含有15-30％山楂水提物。
4.一種納豆激酶口服液的制造方法，包括以下步驟(1)利用產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌制備納豆激酶發(fā)酵液；(2)以3000-5000rpm的轉(zhuǎn)速離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)；(3)離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行進(jìn)行脫炭處理；(4)在低于60℃的溫度下進(jìn)行濃縮至預(yù)定濃度，然后加入環(huán)狀糊精或環(huán)糊精衍生物，其含量為口服液的0.5-3％，在低于60℃攪拌1-2小時(shí)，并進(jìn)行調(diào)配；和(5)低于60℃下對(duì)濃縮液實(shí)施微濾滅菌或輻照滅菌。
5.權(quán)利要求4所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，使用納豆桿菌進(jìn)行發(fā)酵制備種子液，發(fā)酵至OD＝0.3-1.0，以1.0-2.0％的接種量進(jìn)行液體深層發(fā)酵，發(fā)酵溫度25-40℃，發(fā)酵周期12-35小時(shí)，pH為6-8。
6.權(quán)利要求4所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，所述濃縮為常溫超濾濃縮，超濾膜截留分子量為50000-200000，超濾壓力0.1-0.3Mpa。
7.權(quán)利要求4所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，所述滅菌采用微濾除菌，微濾膜孔徑0.05-0.45μm，之后無菌灌裝。
8.權(quán)利要求4所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，所述滅菌采用輻照滅菌，輻照劑量為1-12Kgy。
9.權(quán)利要求8所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，所述輻照滅菌的放射源為Co60，輻照劑量為3-8Kgy。
10.權(quán)利要求4所述的納豆激酶口服液的制造方法，其中，在加入環(huán)狀糊精或其衍生物并調(diào)配好的濃縮液中加入山楂水提物，所述山楂水提物的制備方法包括將山楂果研磨后加水?dāng)嚢杞?2-24小時(shí)，離心分離收取上清液，制成的口服液中該山楂水提取物占該口服液重量的15-30％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納豆激酶口服液，由產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌的發(fā)酵液制備而成，其中含有0.5－3％的環(huán)狀糊精或環(huán)糊精衍生物，每毫升口服液中的納豆激酶纖溶活性為100－400IU。本發(fā)明同時(shí)還提供了一種納豆激酶口服液的制造方法，包括以下步驟(1)利用產(chǎn)納豆激酶的枯草桿菌制備納豆激酶發(fā)酵液；(2)離心，去除發(fā)酵液中的菌體和雜質(zhì)；(3)離心后的上清液，采用砂棒過濾器進(jìn)行進(jìn)行脫炭處理；(4)濃縮，并加入0.5－3％的環(huán)狀糊精或環(huán)糊精衍生物，攪拌，進(jìn)行調(diào)配；(5)灌裝滅菌。本發(fā)明的納豆激酶口服液口感好，服用方便，對(duì)心腦血管具有很好的保健作用。
文檔編號(hào)A61P9/00GK1799627SQ200510000158
公開日2006年7月12日 申請(qǐng)日期2005年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月5日
發(fā)明者王濤, 張振中, 張鋒, 金兆祥, 譚振波, 翟長寶, 薛峰, 尚青 申請(qǐng)人:張振中, 王濤