專利名稱：貓眼草提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從藥用植物貓眼草(Euphorbia Lluaulata Bge)中分離提取抗炎活性物質(zhì)及其制備方法和用途。

背景技術：
困擾人們的日常炎性疾病包括，關節(jié)炎癥例如骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、類風濕性脊椎炎、痛風關節(jié)炎等；炎性皮膚病例如濕疹、牛皮癬、皮炎等；炎性眼疾例如眼色素層炎、結(jié)膜炎等；肺部疾病例如哮喘、支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合癥等；菌血癥、那毒素血癥、口瘡潰瘍、齦炎、胰腺炎等；胃腸道疾病例如節(jié)段性回腸炎、萎縮性胃炎、潰瘍性結(jié)腸炎、腹腔炎、消化性潰瘍、應激性腸道綜合癥例如由幽門螺旋桿菌感染而引起的粘膜炎癥或者由非甾體類抗炎藥引起的腸胃病等等。
有關各種炎癥致病作用的機理，已知體內(nèi)一氧化氮(NO)是介導細胞免疫和炎癥的毒性物質(zhì)。其前體是左旋精氨酸(L-arg)，L-arg在NO合成酶(NOS)的作用下生成NO。目前已經(jīng)分離出三種不同類型的NOS，包括內(nèi)皮NO合成酶(eNOS)，神經(jīng)元NO合成酶(nNOS)及誘導型NO合成酶(iNOS)。目前已知，巨噬細胞、肝細胞、平滑肌細胞、腺癌細胞以及上皮細胞均能表達iNOS。某些炎性細胞因子和微生物產(chǎn)物如脂多糖(LPS)則可誘導iNOS表達。iNOS一旦被誘導即可表達出高度活性，產(chǎn)生大量NO。
因此，長時間以來，人們致力于尋找誘導型NO合成酶iNOS的抑制劑來治療與之相關的炎性疾病。但這些抑制劑大多局限于化學合成的物質(zhì)，副作用較大。現(xiàn)有技術中尚未發(fā)現(xiàn)從天然中草藥植物中提取抗炎活性物質(zhì)的報道。
貓眼草(Euphorbia Lluaulata Bge)在中國作為鎮(zhèn)咳、去痰藥使用，用于慢性支氣管炎。收載于《中華人民共和國藥典》1977年版一部中，中國名為貓眼草，日本名為ビョウガンソウ(貓眼草)。分布在中國河北、內(nèi)蒙古、山西等地區(qū)的干燥地帶，為多年生草本植物。
本植物味苦，性微寒，有毒；具有祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、散結(jié)消腫，拔毒，止癢、抗菌的藥理作用。用于慢性支氣管炎的治療時臨床效果好，主要用于慢性支氣管炎的咳嗽痰多；外治淋巴結(jié)結(jié)核，癬皰發(fā)癢等。例如，中國專利CN1326751A(
公開日2001年12月19日)就披露了一種貓眼草水煮液經(jīng)加工制成用于醫(yī)療淋巴結(jié)核和鼠疫的貓眼膏。
但迄今為止，對于貓眼草的活性成分的研究很少深入。在貓眼草中已經(jīng)探明分布和結(jié)構的化合物舉例如下該植物莖、葉中含有黃酮苷、甾類、揮發(fā)油、酚類化合物；從地上部分分離得到茨烷醇、櫟精等苷類化合物；種子及全草中含有香豆素類化合物。但是各類化合物的作用大多尚待進一步明確。
因此本發(fā)明人從貓眼草中提取具有明確抗炎活性的組分，其安全無毒，并能有效地抑制iNOS酶活，從而抑制NO的大量生成，達到抗炎作用。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種貓眼草提取物名稱為櫟精-3-O-(2″，3″-二棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷的化合物，其具有如下的結(jié)構式
本發(fā)明涉及一種從藥用植物貓眼草(Euphorbia LluaulataBge)中提取活性物質(zhì)的方法，其特征在于包括如下的步驟 1)用丙酮對貓眼草進行提取并濃縮； 2)對上述步驟1得到提取物懸浮在水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇作為洗脫液分別萃取，得到萃取物； 3)對步驟2所述有機溶劑萃取物進行NO生成抑制活性測試和毒性試驗，并對NO生成抑制活性高且無毒性作用的萃取物進一步柱層析分離，得到洗脫液； 4)對步驟3中分離得到的洗脫液進行NO生成抑制活性測試，并對NO生成抑制活性高的洗脫液進一步分離精制，得到活性物質(zhì)； 5)對步驟4中分離得到的單一成分化合物進行NO生成抑制活性測試以及理化特性分析以確定其結(jié)構。
其中，步驟1優(yōu)選丙酮提取濃度為70％。
其中，步驟3優(yōu)選用Sephadex LH-20層析柱進行分離，依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脫。
其中，步驟4優(yōu)選為用CHP-20層析柱和/或HPLC進行精制，精制方法為利用CHP-20層析柱分離，依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脫；利用HPLC(柱YMC Guard park ODS-AL150×10mm I.D.)上精制，流動相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外檢測波長254nm。
其中，NO生成抑制活性測試是利用小鼠巨噬細胞系RAW264.7進行分析的，供試品濃度為100μg/ml。
其中的毒性作用是通過MMT細胞毒性試驗進行分析的。
其中的理化特性分析技術包括核磁共振技術。
優(yōu)選其中的活性化合物具有抗炎活性。
其中的活性化合物包括櫟精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、櫟精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、櫟精、3，4-二羥基苯甲酸、藤黃菌素、芹菜素等。
櫟精-3-O-(2″，3″-二棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、櫟精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷具有抑制NO生成的活性。
本發(fā)明還涉及櫟精-3-O-(2″，3″-二棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、櫟精-3-O-(2″-棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、櫟精、3，4-二羥基苯甲酸、藤黃菌素、芹菜素在制備治療與NO合成酶相關的炎癥的藥物中的用途。
本發(fā)明所取得的有益技術效果是首次從貓眼草中分離得到具有明確抗炎活性的物質(zhì)，其作為天然的誘導性NO合成酶iNos的抑制劑，克服了化學合成物質(zhì)的毒副作用。

具體實施例方式 實施例1.貓眼草提取物的制備方法 (1)貓眼草的粗提方法和產(chǎn)物 取貓眼草(Euphorbia lunulata Bge)9.0kg，用70％丙酮(27L)提取三次，濃縮提取液，所得浸膏加水使之成為懸濁液，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。對這三種萃取物分別進行NO生成抑制實驗和MTT實驗，樣品濃度為100μg/ml。結(jié)果示于表1 表1.各萃取物的收率、NO生成抑制率及MTT毒性 選擇其中NO生成抑制率高而又無MTT毒性的乙酸乙酯萃取物繼續(xù)下一步的操作。
(2)乙酸乙酯萃取物層析分離方法和產(chǎn)物 將乙酸乙酯萃取物46.1g上Sephadex LH-20層析柱進行分離，依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脫，收集洗脫液共計9個餾分，并對其逐個進行NO生成抑制實驗，結(jié)果示于表2(Fr.意為組分) 表2.各餾分收率和NO生成抑制率 選擇其中NO生成抑制率高且收率較好的餾分4和8繼續(xù)下一步的操作，鑒于組分5收率最高，且NO生成抑制率也不是太低，也進入下一輪操作。
(3)餾分4、5和8的分離精制方法和產(chǎn)物 因此利用CHP-20層析柱對Fr.4、Fr.6、Fr.8分別進行分離，依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脫。
其中，自Fr.4中分離純化得到6個組分Fr.4-A(867.2mg)、Fr.4-B(58.1mg)、Fr.4-C(57.7mg)、Fr.4-D(81.5mg)、Fr.4-E(0.52g)、Fr.4-F(16.6mg)。其中的Fr.4-D在反相TLC(0.1％TFA∶甲醇＝60∶40)顯示一個單獨的點，在反相高效液相層析HPLC(柱YMC Guard park ODS-AL 150×10mm I.D.)上精制，流動相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外檢測波長254nm，得化合物(1)〔5.3mg〕。
其中，自Fr.5中分離純化得到5個組分Fr.5-A(2.02g)、Fr.5-B(0.16g)、Fr.5-C(33.2mg)、Fr.5-D(0.07g)、Fr.5-E(56.4mg)。在Fr.5-A中有結(jié)晶析出，用甲醇重結(jié)晶，得化合物(2)〔0.25g〕。
其中，自Fr.8中分離純化得到9個組分Fr.8-1(10.7mg)、Fr.8-2(17.0mg)、Fr.8-3(356.5mg)、Fr.8-4(352mg)、Fr.8-5(34.5mg)、Fr.8-6(13.1mg)、Fr.8-7(19.4mg)、Fr.8-8(354mg)、Fr.8-9(98.1mg)。Fr.8-4經(jīng)HPLC(柱YMC Guardpark ODS-AL)上精制，流動相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)紫外檢測波長254nm，得化合物(3)〔3.3mg〕。
實施例2.主要化合物的理化性狀 對分離純化得到的3個化合物的理化參數(shù)進行分析，主要數(shù)據(jù)顯示于表3、4和5中。
表3.化合物1-3的基本理化性狀 表4.化合物1和2的1H和13C-核磁共振數(shù)據(jù)(500MHz，溶于DMSO-d6) 表5.化合物3的1H和13C-核磁共振數(shù)據(jù)(300MHz，溶于丙酮) 化合物1-3的結(jié)構如下
實施例3.貓眼草提取物的NO生成抑制活性 所用材料 RAW264.7細胞(巨噬細胞，經(jīng)Abelson白血病毒轉(zhuǎn)化)，由美國ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)獲得。用含10％FBS的Ham’s F12培養(yǎng)液在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)。
IFN-γGenzyme/Techne公司；LPSSigma公司；磺胺Wako公司；N-1-鹽酸萘乙二胺(N-1-Naphthyethylene-diamine Dihyrochloride)Wako公司Griess試劑(1)將N-1-鹽酸萘乙二胺溶于5ml注射用水中； (2)向5ml注射用水50mg磺胺中加入250μl磷酸。
儀器微滴定板讀數(shù)器(3550型微滴定板讀數(shù)器，BIO-RAD)。
具體方法與結(jié)果 取RAW264.7細胞50ml放于Falcon管中離心(1000rpm，3min，4℃)，沉淀細胞，用吸管除去上清，加入新培養(yǎng)基10ml、使之懸濁。(調(diào)整濃度至1.5×105個/ml)注入96孔板，每孔200μl，在CO2孵箱中放置1-2小時。加入LPS(10μg/ml Sigma055B5)2μL、小鼠INF-γ(33ng/ml Genzyme)2μL、待測化合物0.4μL。放入CO2孵箱中培養(yǎng)16小時。終濃度為INF-γ0.33ng/ml、LPS 100ng/ml。待測化合物溶于DMSO、相對培養(yǎng)基的含量為0.2％。顯微鏡下觀察。進行MTT實驗。利用griess法進行NO生成評價，取上清100μL加入0.1％N-1-鹽酸萘乙二胺溶液50μL、對胺基苯磺酸酰胺50μL、室溫避光放置10′。利用分光光度計測570nm(對照655nm)的O.D.值?；钚栽u價 計算出NO2-的量，代入下面的公式求出抑制效果 抑制效果(％)＝{1-(X-Y)/(Z-Y)}×100 X在實驗化合物存在下，由IFN-γ和LPS誘導產(chǎn)生的NO2的量， Y在實驗化合物、IFN-γ和LPS均不存在的情況下，誘導產(chǎn)生的NO2的量， ZIFN-γ和LPS誘導產(chǎn)生的NO2的量。
NO生成抑制效果的IC50如下表6所示 表6.化合物1-3的NO生成抑制活性結(jié)果 可見，化合物1、2和3都具有很強的NO生成抑制活性。
實施例4.貓眼草提取物對iNOS、TNF-a、COX-2、IL-12的mRNA表達抑制實驗 RAW264.7細胞(1.2×106細胞/mL)與化合物IFN-γ(10U/mL)和LPS(100ng/mL)一起培養(yǎng)6小時。用RNA分離試劑盒(QIAGEN公司制造)抽提總RNA。測定260nm下的吸光值確定RNA的量、用250ngRNA和寡(dT)12-18引物反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以所得的cDNA為模板進行PCR反應。所述的反應在50mM KCl、5mM MgCl2、0.2mM dNTP、0.6單位的Ampli Taq酶(Ampli Taq gold)(Applied Biosstems)、0.4μMmol正義及反義引物在30μl的反應溶液中進行。針對INOS所用引物為5’-ACCTACTTCCTGGACATTACGACCC-3’[S]、5’-AAGGGAGCAATGCCCGTACCAGGCC-3’[AS]；β-肌幾動蛋白的引物為5’-TGGATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’[S]、5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’[AS]；TNF-a的引物為5’-AGGCGCCACCACGCTCTTCT-3’[S]、5’-GGCAGCCTTGGCCCTTGAA-3’[AS]。COX-2的引物為5’-TCAAAAGAAGTGCTGGAAAAGGTT-3’[A]、5’-TCTACCTGAGTGTCTTTGACTGTG-3’[AS]。IL-12的引物為5’-AAGGAAAATGGAATTTGGTCCACTG-3’[S]、5’-GATGATGTCCCTGATGAAGAAGCTG-3’[AS]。PCR反應是按如下方式進行的94℃1分鐘(變性)、60℃1分鐘(退火)、72℃1.5分鐘為一個循環(huán)共進行25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖中電泳后，經(jīng)溴化乙錠染色測定。
貓眼草提取物對iNOS的mRNA表達具有濃度依賴性的抑制作用。并且，由對TNF-a、IL-12和COX-2的mRNA的表達抑制可以推定其可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化(下圖)。

上圖為貓眼草提取物對iNOS、TNF-a、COX-2和IL-12的mRNA的表達抑制結(jié)果。
結(jié)果顯示貓眼草提取物對iNOS的mRNA表達具有濃度依賴性的抑制作用。對TNF-2、IL-12及COX-2的mRNA的表達也有抑制作用，推測對轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化抑制。以上這些炎癥因子與急慢性炎癥、過敏性疾病等疾病機理密切相關，在貓眼草提取物中分離到的這些炎癥因子抑制劑可以用于制備治療急慢性炎癥、過敏性疾病等相關疾病的藥物。
權利要求
1.一種貓眼草提取物，其特征在于包括名稱為櫟精-3-O-(2″，3″-二棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷具有如下的結(jié)構式
2.如權利要求1所述的貓眼草提取物，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
3.貓眼草提取物1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
4.貓眼草提取物櫟精-3-O-(2″-棓酰基)-β-D-吡喃半乳糖苷，其特征在于它具有抑制NO生成的活性。
5.貓眼草提取物櫟精-3-O-(2″，3″-二棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、櫟精-3-O-(2″-棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、櫟精、3，4-二羥基苯甲酸、藤黃菌素、芹菜素，其特征在于在制備治療與NO合成酶相關的炎癥的藥物中的用途。
6.一種從藥用植物貓眼草中提取活性物質(zhì)的方法，其特征在于包括如下的步驟
1)用丙酮對貓眼草進行提取并濃縮；
2)對上述步驟1得到提取物懸浮在水中，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇作為洗脫液分別萃取得到萃取物；
3)對步驟2)所述萃取物進行NO生成抑制活性測試和毒性試驗，并對NO生成抑制活性高且無毒性作用的萃取物進一步柱層析分離，得到洗脫液；
4)對步驟3)中分離得到的洗脫液進行NO生成抑制活性測試，并對NO生成抑制活性高的洗脫液進一步分離精制得到活性物質(zhì)。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的步驟1)優(yōu)選丙酮提取濃度為70％。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于所述的步驟3)優(yōu)選用Sephadex LH-20層析柱進行分離，用甲醇、丙酮洗脫。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于所述的步驟3)依次用50％甲醇、70％甲醇、甲醇、丙酮洗脫。
10.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的步驟4)優(yōu)選為用CHP-20層析柱和/或HPLC進行精制。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于所述的步驟4)精制方法為利用CHP-20層析柱分離中用甲醇洗脫；HPLC中流動相用TFA-甲醇-乙腈。
12.如權利要求11所述的方法，其特征在于所述的步驟4)依次用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇洗脫；利用HPLC精制，流動相0.1％TFA-甲醇-乙腈(60∶30∶5)。
13.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的NO生成抑制活性測試是利用小鼠巨噬細胞系RAW264.7進行分析的，供試品濃度為100μg/ml。
14.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的的毒性作用是通過MMT細胞毒性試驗進行分析的。
15.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述的的活性物質(zhì)是從櫟精-3-O-(2″，3″-二棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、櫟精-3-O-(2″-棓?；?-β-D-吡喃半乳糖苷、1，3，4，6-四-O-棓酰-B-D葡萄糖苷、海棠苷、櫟精、3，4-二羥基苯甲酸、藤黃菌素、芹菜素所組成的組中選擇的。
全文摘要
本發(fā)明公開一種從藥用植物貓眼草中分離活性化合物的方法，包含步驟為對貓眼草丙酮提取物進行有機溶劑萃取粗提；對有機溶劑萃取物進行NO生成抑制活性測試，并對NO生成抑制活性高且無毒性作用的萃取物進一步分離；對分離得到的組分進行NO生成抑制活性測試，并對NO生成抑制活性高的組分利用進一步分離精制；對分離得到的單一成分化合物進行NO生成抑制活性測試以及理化特性分析以確定其結(jié)構。分離得到的化合物具有抑制NO生成的活性。其中化合物1－3的結(jié)構如右式。
文檔編號A61K36/47GK1988899SQ200480042279
公開日2007年6月27日 申請日期2004年3月4日 優(yōu)先權日2004年3月4日
發(fā)明者王立巖, 北中進 申請人:學校法人日本大學, 王立巖