專利名稱：包含角蛋白的傷口護(hù)理產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含角蛋白的傷口護(hù)理產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
傷口和損傷可由多種原因引起，包括外科手術(shù)、跌打損傷、燒傷、擦傷和皮膚移植。傷口難以治愈，并且可導(dǎo)致諸如潰瘍和敗血病之類的問題。尤其需要注意的是慢性傷口，例如褥瘡和糖尿病性潰瘍。隨著年齡的增長(zhǎng)，這些疾病的治療顯得越來越重要。在慢性傷口的情況下，部分由于延長(zhǎng)的炎癥反應(yīng)以及炎癥細(xì)胞釋放的破壞性酶類，傷口治愈過程中發(fā)生的涉及止血和炎癥、肉芽組織形成及上皮再形成和骨再塑的常規(guī)級(jí)聯(lián)生化過程被打斷。
已發(fā)現(xiàn)維持濕潤(rùn)環(huán)境有時(shí)可提高傷口治愈速率。已開發(fā)了許多可提供該環(huán)境的產(chǎn)品，以提高慢性傷口修復(fù)的速度。這些敷料中所用的材料在一定程度上是生物相容的，包括聚乳酸、殼多糖、海藻酸鹽衍生物和膠原。這些材料對(duì)傷口滲出物的反應(yīng)以及這些材料提供的生物活性環(huán)境是其對(duì)傷口效能的根本。
市售敷料包括各種合成材料，例如硅酮化合物、尼龍織物或凡士林紗布等[A.J.Platt，A.Phipps和K.Judkins，皮膚移植部位硅酮網(wǎng)布敷料與石蠟紗布敷料的比較試驗(yàn)(A comparative study of silicone net dressing and paraffingauze dressing in skin-grafted sites)，Burns，22(7)，1996，p.543-545；Claudia Valenta和Barbara G.Auner，皮膚和經(jīng)皮遞送聚合物的應(yīng)用(The useof polymers for dermal and transdermal delivery)，European Journal ofPharmaceutics and Biopharmaceutics，58(2)，2004，p.279-289]。雖然這些常用傷口敷料便宜易得，但它們通常與傷口區(qū)域的親和性差，對(duì)于長(zhǎng)時(shí)間治愈慢性傷口來說，水氣透過性不足是最難以接受的[Marcel F.Jonkman，IzakMolenaar，Paul Nieuwenhuis，Peter Bruin和Albert J.Pennings，評(píng)價(jià)傷口覆蓋物的水汽透過性的新方法(New method to assess the water vapourpermeance of wound coverings)，Biomaterials，9(3)，1988，p.263-267]。高效傷口敷料常常來源于具有類似于患者皮膚性質(zhì)的天然材料。
可使用天然材料或通過合成材料與天然材料的組合制備傷口敷料(JP#47470/1988；Jen Ming Yang和Hao Tzu Lin，含殼聚糖的PP-g-AA-g-NIPAAm雙接枝無紡織物傷口敷料的性質(zhì)(Properties of chitosancontaining PP-g-AA-g-NIPAAm bigraft nonwoven fabric for wound dressing)，Journal of Membrane Science，243(1-2)，2004，第1-7頁)。傷口敷料的使用是傷口處理的非常重要的組成部分，是成功實(shí)現(xiàn)治愈結(jié)果的關(guān)鍵[GordonFreedman，Hyacinth Entero和Harold Brem，慢性傷口患者疼痛的實(shí)際處理發(fā)病機(jī)制介導(dǎo)的處理(Practical treatment of pain in patients with chronicwoundspathogenesis-guided management)，The American Journal ofSurgery，188(1)，2004，p.31-35]。最適當(dāng)?shù)膫诜罅媳Ｗo(hù)受損組織，維持濕潤(rùn)環(huán)境，可滲透水，抑制微生物，將治療劑遞送至傷口部位，易于涂覆，不需要頻繁更換，無毒無抗原。
目前，市場(chǎng)上有幾種形式的傷口敷料，包括封閉敷料、非粘結(jié)敷料、吸收敷料和薄片、泡沫、粉末和凝膠形式的敷料。已嘗試提供改進(jìn)的敷料，尤其對(duì)于慢性傷口，通過使用生物材料如細(xì)胞和生長(zhǎng)因子促進(jìn)傷口。至今，已證明由于生產(chǎn)過程、儲(chǔ)存和穩(wěn)定性的問題，這些生物材料成本非常高，而且在加速慢性傷口治愈過程中，它們具有最小的臨床相關(guān)性。最重要地，有效的傷口處理要求了解組織修復(fù)過程并知道傷口敷料的性質(zhì)。只有同時(shí)考慮這兩種因素，才能以合理和可預(yù)知的方式選擇敷料。
角蛋白存在于許多生物組織中，在皮膚、頭發(fā)和其它物質(zhì)中作為結(jié)構(gòu)成分。已發(fā)現(xiàn)從頭發(fā)提取的角蛋白是傷口敷料中的有價(jià)值組分。US5932552提供了通過還原或氧化反應(yīng)制備的生物相容性角蛋白材料，用作傷口護(hù)理制品中的組分。本領(lǐng)域中氧化角蛋白以產(chǎn)生極性基團(tuán)的方法使角蛋白強(qiáng)烈降解，使蛋白質(zhì)受到損傷，并喪失來自蛋白質(zhì)氨基酸組成和三級(jí)結(jié)構(gòu)的核心物理性質(zhì)。此外，制備這些材料的氧化過程是不可逆的，形成的磺基丙氨酸基團(tuán)不能再轉(zhuǎn)化為胱氨酸以完成有用的結(jié)構(gòu)功能。本領(lǐng)域中通過還原反應(yīng)產(chǎn)生可溶性蛋白質(zhì)的方法在強(qiáng)堿條件下進(jìn)行，也能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的損傷和角蛋白核心物理性質(zhì)的損失。
角蛋白纖維的核心成分，尤其是羊毛和頭發(fā)中存在的中間絲蛋白和基質(zhì)蛋白質(zhì)，在纖維中起特定作用，這反映在其三級(jí)結(jié)構(gòu)和氨基酸組成中。當(dāng)使用這些蛋白質(zhì)的純化形式時(shí)，可利用這些特征產(chǎn)生具有良好物理性質(zhì)和較強(qiáng)吸收能力的材料。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，分離角蛋白的方法應(yīng)溫和以防止蛋白質(zhì)受損傷，實(shí)施可逆的胱氨酸修飾以通過形成胱氨酸鍵重建堅(jiān)固的材料，并且易于從角蛋白來源中分離特定角蛋白片段。本發(fā)明提供根據(jù)上述原則制備的用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的新材料。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種使用角蛋白片段的傷口護(hù)理產(chǎn)品。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于傷口護(hù)理的S-磺化的完整角蛋白片段，或至少為公眾提供一種有用的選擇。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其中，所述蛋白片段是完整的。
本發(fā)明還提供一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其中，所述蛋白片段來自中間絲蛋白家族。
本發(fā)明還提供一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其中，所述蛋白片段來自高硫蛋白家族。
本發(fā)明還提供一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其中，所述蛋白片段是S-磺化的。
蛋白片段可水解。
優(yōu)選蛋白質(zhì)S-磺化。
蛋白質(zhì)可來自高硫蛋白家族。
蛋白質(zhì)可以是中間絲蛋白。
優(yōu)選材料是纖維、薄膜、泡沫或水凝膠。
本發(fā)明還提供一種制備傷口護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括a)制備10％的角蛋白溶液；b)混合角蛋白與水溶性聚合物，形成緊密混合液(intimate mixture)；c)澆鑄所得水性混合液；和d)按順序凍融，形成水凝膠。
可通過引入交聯(lián)劑，形成二硫鍵并除去磺化官能團(tuán)，以改善生物材料的物理-機(jī)械性質(zhì)。
用作還原劑的交聯(lián)劑可以是硫醇(thiol)或巰基醋酸鹽。
物理-機(jī)械性質(zhì)可以是濕強(qiáng)度或干強(qiáng)度。
巰基醋酸鹽可以是巰基醋酸銨溶液。
水溶性聚合物可以是聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等。
本發(fā)明還提供改善根據(jù)本發(fā)明方法通過加入交聯(lián)劑制備的傷口護(hù)理產(chǎn)品濕強(qiáng)度性質(zhì)的方法。
交聯(lián)劑優(yōu)選醛。
交聯(lián)劑選自甲醛、乙二醛、戊二醛等。
附圖簡(jiǎn)要說明現(xiàn)在將以例子的方式，參考以下具體實(shí)施方式
，描述本發(fā)明。


圖1顯示用角蛋白和其它材料處理傷口的反應(yīng)；圖2顯示羊成纖維細(xì)胞在角蛋白材料上的增殖；圖3顯示人成纖維細(xì)胞在角蛋白材料上的增殖；圖4顯示在角蛋白基質(zhì)的存在下，Con(A)刺激對(duì)T-細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；圖5顯示在角蛋白基質(zhì)的存在下，72小時(shí)后Con(A)刺激對(duì)T-細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
發(fā)明詳述所述硬的α-角蛋白，如來自人頭發(fā)、羊毛、動(dòng)物纖維、角、蹄或其它哺乳動(dòng)物源的α-角蛋白，可以按照其生物化學(xué)性質(zhì)，尤其是其分子量和氨基酸組成，分成具體的組分。表1說明了通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的一般角蛋白片段的常規(guī)分析方法確定的氨基酸組成，這也是本發(fā)明的主題。這涉及分析物的酸水解，所述酸水解將所有的胱氨酸和不穩(wěn)定胱氨酸衍生物轉(zhuǎn)化成半胱氨酸，通常記錄為半-半胱氨酸。
表1說明了角蛋白片段的氨基酸組成本發(fā)明所用的S-磺化角蛋白中間絲蛋白質(zhì)(SIFP)、S-磺化角蛋白高硫蛋白(SHSP)、S-磺化角蛋白肽(SPEP)。Gillespie和Marshall在《羊毛織品和頭發(fā)的蛋白質(zhì)中的易變性》(Variabilityin the proteins of wool and hair)，Proc.Sixth Int.Wool Text.Res.Conf.，Pretoria，2，67-77，1980一文中所述的中間絲蛋白質(zhì)(IFP)、高硫蛋白(HSP)以及全羊毛品。所有剩余物以mol％表述。S-磺基半胱氨酸、胱氨酸和半胱氨酸還原和烷基化后以S-羧基甲基半胱氨酸進(jìn)行測(cè)量，并記為cys。
表2說明了通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的一般角蛋白片段的常規(guī)分析方法確定的分子量，這也是本發(fā)明的主題。常規(guī)分析法涉及利用還原反應(yīng)將角蛋白中的胱氨酸鍵切斷，確定呈天然、未交聯(lián)狀態(tài)的蛋白質(zhì)(最類似于未角質(zhì)化狀態(tài)的蛋白質(zhì))的質(zhì)量。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定質(zhì)量。在肽SPEP的情況下，使用質(zhì)譜儀確定質(zhì)量。使用這些方法，所述角蛋白在不進(jìn)行任何肽鍵水解的條件下變得具有可溶性，并測(cè)定了分子量的精確測(cè)量值。
表2角蛋白片段的分子量本發(fā)明所用的S-磺化角蛋白中間絲蛋白質(zhì)(SIFP)、S-磺化角蛋白高硫蛋白(SHSP)、S-磺化角蛋白肽(SPEP)。Gillespie和Marshall在《羊毛織品和頭發(fā)的蛋白質(zhì)中的易變性》(Variability in theproteins of wool and hair)，Proc.Sixth Int.Wool Text.Res.Conf.，Pretoria，2，67-77，1980一文中所述的中間絲蛋白質(zhì)(IFP)、高硫蛋白(HSP)和全羊毛織品。
氨基酸組成和分子量在較小程度上隨角蛋白類型、物種以及同一物種的不同品種變化，例如在來自不同綿羊品種的羊毛。表1和2所給出的數(shù)值指示了所述的角蛋白源。但是，單獨(dú)類型的角蛋白或角蛋白片段具有不同的特征，尤其是分子量和氨基酸組成。
本發(fā)明的主題是包含完整S-磺化角蛋白片段的材料?！巴暾笔侵傅鞍踪|(zhì)沒有顯著水解，所述水解限定為通過加入水使鍵斷裂。Gillespie在《皮膚的生物化學(xué)和生理學(xué)》(Biochemistry and physiology of the skin，第1卷，Goldsmith編著，Oxford University Press，London，1983，第475-510頁)認(rèn)為“完整”是指呈角化聚合狀態(tài)的蛋白質(zhì)，還表示多肽亞單元，它們復(fù)合形成羊毛和頭發(fā)中的完整角蛋白。在本發(fā)明中，“完整”是指Gillespie所述的多肽亞單元。這些相當(dāng)于其天然形式的角蛋白，沒有角化過程形成的二硫交聯(lián)。
角蛋白片段是角蛋白族內(nèi)明顯不同的類，如本領(lǐng)域熟知的中間絲蛋白質(zhì)、高硫蛋白或高甘氨酸-酪氨酸蛋白質(zhì)。中間絲蛋白質(zhì)如Orwin等在《哺乳動(dòng)物硬角蛋白的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)》(Structure and Biochemistry of Mammalian HardKeratin，Electron Microscopy Reviews，4，47，1991)一文中詳述的那樣，也是指Gilliespie在《皮膚的生物化學(xué)和生理學(xué)》(Biochemistry andphysiology of the skin，第1卷，Goldsmith，編著Oxford University Press，London，1983，475-510頁)中所述的低硫蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)族的關(guān)鍵特征是分子量為40-60kD，半胱氨酸含量(以半-半胱氨酸計(jì))約為4％。所述高硫蛋白族也如Orwin和Gillispie在同一出版物中所述的那樣。這種蛋白質(zhì)族具有高度的異質(zhì)性，但是其特征在于分子量為10-30kD，半胱氨酸含量大于10％。這種族的亞類--超高硫蛋白的半胱氨酸的含量高達(dá)34％。所述高甘氨酸-酪氨酸蛋白質(zhì)族也如Orwin和Gillispie在同一出版物中所述的那樣。這種族也稱為高酪氨酸蛋白質(zhì)，其特征在于分子量小于10kD，酪氨酸含量通常大于10％，甘氨酸含量通常大于20％。
在本發(fā)明中，“角蛋白片段”是角蛋白的純化形式，它主要包含(雖然并不完全包含)上述一種不同的蛋白質(zhì)組。在本發(fā)明中，S-磺化角蛋白具有主要呈S-磺基半胱氨酸形式的半胱氨酸/胱氨酸，通常稱為Bunte鹽。這種高極性組將可溶性賦予蛋白質(zhì)，盡管在溶液中穩(wěn)定，所述S-磺基是不穩(wěn)定的半胱氨酸衍生物，很容易與硫醇類(如半胱氨酸)和其它還原劑反應(yīng)。與還原劑反應(yīng)導(dǎo)致S-磺基半胱氨酸再次轉(zhuǎn)化為半胱氨酸。S-磺基半胱氨酸在化學(xué)上和磺基丙氨酸不同，雖然兩者均包含SO3-基。磺基丙氨酸是通過氧化半胱氨酸或胱氨酸不可逆地產(chǎn)生的，一旦形成，就不能將二硫交聯(lián)再次形成半胱氨酸。S-磺基半胱氨酸容易與半胱氨酸反應(yīng)，容易形成二硫交聯(lián)。
SIFP的制備方法如WO03011894所述。
下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的這些和其它方面。
使用如NZ/PCT/00169所述的方法(被納入本文)，高度S-磺化角蛋白可形成多種基質(zhì)，包括多孔海綿、薄膜和纖維。
純化的羊毛角蛋白中間絲蛋白尤其適合再形成基質(zhì)，部分由于其高分子量和三級(jí)結(jié)構(gòu)。NZ/PCT/00169中所述方法使這些材料廣泛用來形成有用的基質(zhì)。
S-磺化角蛋白可通過多種方法制備，包括PCT/NZ02/00125所述方法(被納入本文)。
多孔海綿基質(zhì)尤其適用于傷口環(huán)境，因?yàn)槠湓谖諅跐B出物和維持傷口治愈的健康環(huán)境中起著重要作用。此外，它還可用作遞送可刺激治愈過程的其它治療劑，如生長(zhǎng)因子、抗菌劑或培養(yǎng)細(xì)胞的介質(zhì)。通過使用S-磺化角蛋白片段來構(gòu)建基質(zhì)可促進(jìn)這些特征。S-磺基的高度極性使得來自上述材料的基質(zhì)具有高吸收性。此外，S-磺化角蛋白生物相容，且體外不引起副反應(yīng)。
薄膜是治療傷口所用敷料中的重要組分，提供保護(hù)傷口的屏障，并維持促進(jìn)治愈的適當(dāng)環(huán)境。S-磺化角蛋白薄膜生物相容，且體外不引起副反應(yīng)。因此，它們是傷口敷料中的有用組分。
S-磺化角蛋白中間絲蛋白重建纖維可用作傷口敷料的組分。纖維尤其多樣，因?yàn)槠淇尚纬煽椢锘驘o紡織物，纖維圖案可用于控制材料的化學(xué)性質(zhì)，以加強(qiáng)敷料與傷口的相互作用。再生纖維在傷口護(hù)理中的應(yīng)用已得到許多研究，尤其是海藻纖維。來自S磺化中間絲蛋白的重建角蛋白纖維是一種具有類似應(yīng)用的新材料。
水凝膠常用于傷口敷料，在控制傷口環(huán)境和提供用于遞送活性劑的合適基質(zhì)以刺激或幫助治愈中起著重要作用。由于高度有序性以及蛋白質(zhì)完整性質(zhì)所實(shí)現(xiàn)的分子間作用，S-磺化角蛋白，尤其是S-磺化完整角蛋白中間絲蛋白是形成水凝膠的優(yōu)良底物。
來源于SIFP和SHSP蛋白片段的角蛋白材料含有不同量的高極性S-磺基，因而其物理化學(xué)性質(zhì)不同，尤其是其吸收濕氣的能力不同。來源于這些材料組合的傷口敷料或多或少地吸收濕氣，因而可控制其吸收傷口滲出物的程度。
噴霧或凍干粉末制備的S-磺化角蛋白是高度吸收性材料，它是傷口敷料中的有價(jià)值組分，尤其用于水凝膠型敷料，其中，目前市售產(chǎn)品中常用海藻酸鹽或膠原衍生物材料。由于各個(gè)蛋白質(zhì)片段中存在的S磺基的量不同，SIFP和SHSP蛋白質(zhì)的組合可在一定程度上控制粉末的吸收能力和吸收材料上形成的凝膠性質(zhì)。
由于蛋白質(zhì)的完整性質(zhì)，以及因極性S-磺化基團(tuán)的存在而使材料具有的水溶性，S-磺化角蛋白片段，尤其是角蛋白中間絲狀蛋白片段易于形成多種基質(zhì)，這些基質(zhì)的物理性質(zhì)可使它們?cè)趥诃h(huán)境中提供有用的物理作用。并且，重建形成薄膜、纖維或海綿后，還可化學(xué)處理這些材料，以除去材料內(nèi)的S-磺化官能團(tuán)并產(chǎn)生二硫化交聯(lián)，類似于天然角蛋白中所存在的那樣。處理方法如NZ/PCT/00169所述。當(dāng)用該方法處理時(shí)，角蛋白基質(zhì)在傷口環(huán)境中吸收較少且維持其結(jié)構(gòu)。它適用于將生物活性劑如抗菌劑、生長(zhǎng)因子、抗生素、培養(yǎng)細(xì)胞或其它藥物遞送至傷口部位。
傷口敷料或治愈膜的物理化學(xué)性質(zhì)可容易地通過多種方法改進(jìn)。一種方法涉及用還原劑，如pH＝7.0的巰基醋酸銨溶液處理1小時(shí)，以除去S-磺化角蛋白的磺化官能團(tuán)并引入二硫化胱氨酸作為交聯(lián)。這可明顯改善機(jī)械性質(zhì)，尤其是膜材料的濕強(qiáng)度。通過傅里葉變換-紅外(FT-IR)光譜試驗(yàn)證實(shí)化學(xué)轉(zhuǎn)化，因?yàn)橛^察到當(dāng)S-磺基與上述還原劑接觸時(shí)，在1022cm-1處有強(qiáng)且窄的吸收的S-磺化基團(tuán)的吸收峰消失。
一種改善角蛋白水凝膠生物材料的物理化學(xué)強(qiáng)度的方法是增加角蛋白鏈間或角蛋白與其它聚合物如聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮之間的水凝膠結(jié)合網(wǎng)絡(luò)。這可通過在構(gòu)建水凝膠薄片期間采用凍融過程來實(shí)現(xiàn)。這可通過使用該方法形成的水凝膠的不溶性增加來證實(shí)。
制備化學(xué)交聯(lián)水凝膠生物材料是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式。通過使用化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛，使角蛋白鏈間形成化學(xué)交聯(lián)，可改善溶脹狀態(tài)的物理性質(zhì)如不溶性和強(qiáng)度。
而且，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)交聯(lián)方法，包括使用典型的化學(xué)交聯(lián)劑如戊二醛、甲醛、碳二亞胺如1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺、2，5-己二酮、二酰亞胺如二甲基辛酰亞胺、或雙丙烯酰胺如N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺，可增加基于膜和水凝膠的角蛋白的物理性質(zhì)。
體外試驗(yàn)由傷口治愈和免疫反應(yīng)中的相關(guān)細(xì)胞，尤其是成纖維細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，體外測(cè)定上述材料的生物反應(yīng)。
表3體外測(cè)定角蛋白材料。
羊成纖維細(xì)胞圖2顯示與只有細(xì)胞介質(zhì)(對(duì)照)相比，不同角蛋白基質(zhì)對(duì)羊皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)三個(gè)平行樣品(n＝3)。
羊成纖維細(xì)胞在大多數(shù)角蛋白基質(zhì)上的增殖動(dòng)力學(xué)相類似。開始時(shí)每孔接種約10,000個(gè)細(xì)胞(0小時(shí))。接種后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)，培養(yǎng)物經(jīng)歷時(shí)滯，如細(xì)胞數(shù)量的降低所證明。這種現(xiàn)象在進(jìn)行的所有分析物中發(fā)生，不僅在那些含試驗(yàn)物質(zhì)的孔，而且在對(duì)照孔中觀察到降低。另一個(gè)較短時(shí)間的試驗(yàn)表明，時(shí)滯持續(xù)小于12小時(shí)(數(shù)據(jù)未示出)，并且在該點(diǎn)開始指數(shù)生長(zhǎng)期。大約每24-48小時(shí)數(shù)量倍增，接近融合(約80％融合率)，表明對(duì)數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束。這也是試驗(yàn)時(shí)間的結(jié)束(5天或120小時(shí))。較長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)表明，上述培養(yǎng)物完全融合后即進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)平臺(tái)期。這時(shí)，接觸抑制和營(yíng)養(yǎng)物的耗竭是限制生長(zhǎng)速率的關(guān)鍵因素，單層培養(yǎng)物顯示細(xì)胞死亡的信號(hào)(即喪失膜完整性，細(xì)胞數(shù)量降低，單個(gè)細(xì)胞空泡化)。
羊成纖維細(xì)胞在大多數(shù)生物聚合物底物，尤其是薄膜和海綿樣品上的生長(zhǎng)顯示上述動(dòng)力學(xué)。
根據(jù)各個(gè)基質(zhì)類型，進(jìn)行以下觀察薄膜具有二硫化學(xué)結(jié)構(gòu)的薄膜最令人滿意地支持羊成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)(材料D)。薄膜材料C顯示的第二種S-磺酸鈉鹽結(jié)構(gòu)較低程度地支持細(xì)胞生長(zhǎng)，且在培養(yǎng)物中傾向于溶脹。這些薄膜上的細(xì)胞顯示鋪展良好的典型多極或雙極伸長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞形態(tài)。
海綿多孔海綿材料B(二硫化結(jié)構(gòu))上成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)可媲美一些較好的薄膜。試驗(yàn)期間，觀察到細(xì)胞與海綿的上表面結(jié)合。由光學(xué)顯微鏡發(fā)現(xiàn)，與非基質(zhì)對(duì)照物相比，所有底物上的這些細(xì)胞的形態(tài)外觀類似。
粉末制備一系列角蛋白粉末修飾物，結(jié)果如表中材料E所示。該結(jié)果代表濃度為2mg/ml時(shí)觀察到的生長(zhǎng)曲線。比此濃度更高的溶液得到同一曲線，較低的濃度顯示出比對(duì)照物稍高的細(xì)胞增殖。提取試驗(yàn)說明，角蛋白粉末本身在足夠的濃度下能促進(jìn)羊成纖維細(xì)胞的有絲分裂。
人成纖維細(xì)胞圖3顯示與僅僅細(xì)胞介質(zhì)(對(duì)照)相比，不同角蛋白基質(zhì)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
對(duì)應(yīng)于角蛋白底物的人成纖維細(xì)胞數(shù)據(jù)或多或少地表現(xiàn)在羊細(xì)胞株的觀察結(jié)果中。同樣建立120小時(shí)的典型生長(zhǎng)曲線，但120小時(shí)后對(duì)照孔中達(dá)到100％的融合。120小時(shí)，大多數(shù)試驗(yàn)物質(zhì)的存在下，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到83-89％融合。
羊淋巴細(xì)胞圖4顯示有或沒有角蛋白，10天內(nèi)ConA刺激對(duì)T細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。將氚化胸腺嘧啶計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化為每個(gè)試驗(yàn)組每孔(同樣有一系列標(biāo)準(zhǔn))中的細(xì)胞數(shù)量。
結(jié)果分析表明1.240小時(shí)實(shí)驗(yàn)中ConA刺激與非活化羊T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量間存在顯著差異。240小時(shí)，對(duì)照(不存在角蛋白生物聚合物下生長(zhǎng))細(xì)胞數(shù)量在未刺激和刺激細(xì)胞間顯示6倍差異。不存在ConA下的細(xì)胞生長(zhǎng)在第10天達(dá)到濃度50000細(xì)胞/孔，而具有ConA補(bǔ)充物的對(duì)照細(xì)胞在該時(shí)間點(diǎn)超過300000細(xì)胞/孔。達(dá)到這種高濃度是因?yàn)榧?xì)胞維持在懸浮培養(yǎng)基中，降低的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)而不是表面區(qū)域需求成為限制因素。
2.樣品(存在基質(zhì))與對(duì)照(沒有基質(zhì))孔之間的細(xì)胞增殖速率存在極小差異。刺激細(xì)胞和未刺激細(xì)胞中都可發(fā)現(xiàn)這種作用。換言之(a)在基質(zhì)存在下生長(zhǎng)的未刺激細(xì)胞的增殖程度與僅在組織培養(yǎng)對(duì)照孔上生長(zhǎng)相同。這就表明，雖然角蛋白生物材料有一定的免疫原性，但它們看上去似乎是惰性的。如果沒有免疫原性，接觸生物材料的淋巴細(xì)胞應(yīng)無增殖。如果是惰性的，細(xì)胞增殖速率應(yīng)類似于對(duì)照的增殖速率。
(b)在基質(zhì)存在下生長(zhǎng)的刺激細(xì)胞的增殖速率類似或稍高于對(duì)照孔(不含角蛋白基質(zhì))。這表明，活化T細(xì)胞不以任何方式被基質(zhì)本身或該短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的任何降解副產(chǎn)物所抑制。試驗(yàn)生物材料不能抑制活化T細(xì)胞表明，產(chǎn)物不干擾正常細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。
圖5顯示72小時(shí)、多種基質(zhì)的存在下，ConA刺激對(duì)T-淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)的影響?？傆?jì)數(shù)反映了胸腺嘧啶核苷攝取和摻入DNA的水平，用作增殖定量手段(見上圖)。認(rèn)為72小時(shí)培養(yǎng)是比較處理組間差異的最佳測(cè)定時(shí)間，這時(shí)細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期。
結(jié)果表示為柱形圖，刺激和未刺激處理一一對(duì)應(yīng)。誤差線表示±SD(n＝3)。未刺激孔計(jì)數(shù)(未標(biāo)記)的變化非常小，誤差很小。刺激細(xì)胞的總計(jì)數(shù)可變性相對(duì)較大，雖然student T檢驗(yàn)分析表明，只有材料C與對(duì)照之間具有顯著性差異(p＝0.075)。
在有或沒有基質(zhì)存在下，未預(yù)致敏T細(xì)胞的增殖速率相同。這就表明，生物材料不是非免疫原性，而是惰性的。沒有一個(gè)試驗(yàn)基質(zhì)相對(duì)于對(duì)照(無基質(zhì)孔系列)有任何程度的正常免疫反應(yīng)。
活化的T細(xì)胞保持在培養(yǎng)物中，角蛋白基質(zhì)以類似或大于對(duì)照(無基質(zhì))的速率增殖。這就表明，生物材料與刺激的T細(xì)胞是生物相容的，一定程度上促進(jìn)有絲分裂，最重要地，不干擾正常免疫反應(yīng)。任何基質(zhì)或其副產(chǎn)物都不抑制活化的T細(xì)胞。
總之，試驗(yàn)基質(zhì)不干擾身體的細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，并且與羊T淋巴細(xì)胞生物相容。
體內(nèi)試驗(yàn)采用動(dòng)物模型，在傷口環(huán)境中測(cè)定角蛋白基質(zhì)的作用。
對(duì)各組具有切除傷口的大鼠施加4種樣品，進(jìn)行隨機(jī)試驗(yàn)。每組有6只雄性大鼠。在每只大鼠的背部沿中線切開兩個(gè)傷口(直徑8mm)。一個(gè)傷口用作施加介質(zhì)或鹽水的對(duì)照，試驗(yàn)材料應(yīng)用于另一個(gè)傷口。用常規(guī)照片監(jiān)測(cè)治愈率。每2天拍攝傷口照片，量化治愈傷口面積。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定變化百分比(％)，測(cè)定每只大鼠試驗(yàn)與對(duì)照傷口相比的相對(duì)治愈率。然后計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的平均差，如表4所示。
試驗(yàn)的敷料有KP-U角蛋白膜傷口敷料(實(shí)施例1)，KP-T角蛋白膜傷口敷料(實(shí)施例3)，HG-GL角蛋白水凝膠(實(shí)施例4)，HG-O角蛋白水凝膠(實(shí)施例2)，HG-C市售水凝膠傷口敷料產(chǎn)品。
試驗(yàn)中使用了24只大鼠，且試驗(yàn)進(jìn)行到治愈終點(diǎn)。
基于傷口治愈率的結(jié)果總結(jié)如下i)HG-GL傷口敷料明顯加速治愈，最顯著的差異發(fā)生在治愈早期。
ii)KP-T傷口敷料對(duì)治愈率有一定改善，尤其是在第3-5天。
表4施加各種傷口敷料后傷口部位所占的面積。KP-U角蛋白膜傷口敷料(實(shí)施例1)，KP-T角蛋白膜傷口敷料(實(shí)施例3)，HG-GL角蛋白水凝膠(實(shí)施例4)，HG-O角蛋白水凝膠(實(shí)施例2)，HG-C市售水凝膠傷口敷料產(chǎn)品。
實(shí)施例現(xiàn)在將以實(shí)施例的方式描述制備各種形式角蛋白的方法。
實(shí)施例1制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的角蛋白膜機(jī)械攪拌下，2小時(shí)內(nèi)將1M NaOH逐漸加入到S-磺化角蛋白中間絲蛋白粉末的蒸餾水溶液中，制備10％的S-磺化角蛋白中間絲蛋白(SIFP)溶液。pH保持在8.0-9.5，最終調(diào)節(jié)至8.5。27000g下將該角蛋白溶液離心10分鐘，以除去任何氣泡和未溶解的物質(zhì)。將所得角蛋白溶液澆鑄入培養(yǎng)皿中，室溫下蒸發(fā)溶劑，留下角蛋白膜。溶劑也可包含一定百分比的易溶于水的有機(jī)溶劑，如醇。
實(shí)施例2制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的角蛋白水凝膠10％S-磺化角蛋白中間絲蛋白(SIFP)溶液的制備如實(shí)施例1所述。然后將該溶液與水溶性聚合物如含20％固體的聚乙烯醇(PVA)和含10％固體的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)緊密混合，達(dá)到最佳流變性和最佳組成，即SIFP∶PVA∶PVP＝100∶60∶40(w/w，％)，用于制備水凝膠。然后，澆鑄混合溶液，凍融循環(huán)硬化，得到基于角蛋白的水凝膠。該過程涉及在-80℃凍干1小時(shí)，23℃融化1小時(shí)。重復(fù)該凍融循環(huán)7次，得到水凝膠。用蒸餾水沖洗所得水凝膠多次，以除去任何未反應(yīng)的角蛋白和聚合物。
實(shí)施例3制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的交聯(lián)角蛋白膜為提高實(shí)施例1所述方法制備的材料的物理強(qiáng)度和機(jī)械性質(zhì)，用還原劑處理膜以誘導(dǎo)化學(xué)交聯(lián)。將膜浸漬在pH7.0、濃度0.25M巰基醋酸銨溶液中60分鐘，以從S-磺化角蛋白蛋白質(zhì)(SIFP)中除去磺酸基團(tuán)，并形成二硫鍵(-S-S-)。用蒸餾水多次沖洗所得的膜，以除去任何殘留的反應(yīng)試劑。
實(shí)施例4制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的化學(xué)交聯(lián)角蛋白水凝膠如實(shí)施例2所述制備角蛋白后，PVA、PVP溶液后，將0.05％-0.1％的戊二醛交聯(lián)劑加入到混合液中。然后澆鑄混合液，凍融循環(huán)硬化，得到基于角蛋白的水凝膠。該過程涉及-80℃凍干1小時(shí)和23℃融化1小時(shí)。重復(fù)該凍融循環(huán)7次，得到水凝膠。用蒸餾水多次沖洗所得水凝膠，以除去任何未反應(yīng)的角蛋白和聚合物，以及未反應(yīng)的戊二醛殘留物。物理觀察顯示其尺寸穩(wěn)定性和強(qiáng)度明顯改善。緊密混合角蛋白和聚合物的水性溶液(即水)后，水凝膠在該水性溶液中的不溶解行為也證實(shí)了上述特征。
實(shí)施例5制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的二硫化交聯(lián)角蛋白膜10％S-磺化角蛋白中間絲蛋白(SIFP)溶液的制備如實(shí)施例1所述。然后將該溶液與1％0.25M的巰基醋酸鹽銨溶液(NH4TG)緊密混合，組成為SIFP∶NH4TG＝99∶1(w/w，％)。然后將混合液澆鑄入培養(yǎng)皿中，室溫下蒸發(fā)溶劑，得到二硫化交聯(lián)角蛋白膜。用蒸餾水多次沖洗所得的膜，以除去任何殘留的NH4TG。
實(shí)施例6制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的二硫化交聯(lián)角蛋白水凝膠10％S-磺化角蛋白中間絲蛋白(SlFP)溶液的制備如實(shí)施例1所述。然后將該溶液與1％0.25M的巰基醋酸鹽銨溶液(NH4TG)緊密混合，組成為SIFP∶NH4TG＝99∶1(w/w，％)。然后澆鑄混合液，凍融循環(huán)硬化，得到二硫化交聯(lián)角蛋白水凝膠。該過程涉及-80℃凍干1小時(shí)和23℃融化1小時(shí)。重復(fù)凍融循環(huán)7次，以得到化學(xué)交聯(lián)的水凝膠。
實(shí)施例7制備用于傷口護(hù)理產(chǎn)品的非交聯(lián)角蛋白水凝膠10％S-磺化角蛋白中間絲蛋白(SIFP)溶液的制備如實(shí)施例1所述。然后澆鑄該溶液，凍融循環(huán)硬化，得到基于角蛋白的水凝膠。該過程涉及-80℃凍干1小時(shí)和23℃融化1小時(shí)。重復(fù)凍融循環(huán)7次，以得到角蛋白水凝膠。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明將用于多種傷口護(hù)理產(chǎn)品。這些產(chǎn)品通過在傷口部位周圍提供誘導(dǎo)治愈的生物化學(xué)環(huán)境，有助于治愈和提高傷口治愈速度。
權(quán)利要求
1.一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白片段是完整的。
2.一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白片段來自中間絲蛋白家族。
3.一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白片段來自高硫蛋白家族。
4.一種包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白片段是S-磺化的。
5.如權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)所述的包含角蛋白片段的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白片段是水解的。
6.如權(quán)利要求1、2、3或5中任一項(xiàng)所述的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是S-磺化的。
7.如權(quán)利要求1、4或5中任一項(xiàng)所述的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白質(zhì)來自高硫蛋白家族。
8.如權(quán)利要求1或4-5中任一項(xiàng)所述的用于處理傷口的材料，其特征在于，所述蛋白質(zhì)是中間絲蛋白。
9.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的材料，其特征在于，所述材料選白纖維、薄膜、泡沫和水凝膠。
10.一種制備傷口護(hù)理產(chǎn)品的方法，所述方法包括a)制備10％的角蛋白溶液；b)混合角蛋白與水溶性聚合物，形成緊密混合物；c)澆鑄所得水性混合物；和d)按順序凍融，形成水凝膠。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，通過引入交聯(lián)劑以形成二硫鍵并除去磺化官能團(tuán)從而改善生物材料的物理-機(jī)械性能。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，用作還原劑的所述交聯(lián)劑是硫醇或巰基醋酸鹽。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述物理-機(jī)械性能是濕強(qiáng)度或干強(qiáng)度。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述巰基醋酸鹽是巰基醋酸銨溶液。
15.如權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述角蛋白是S-磺化的。
16.如權(quán)利要求10-15中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述角蛋白是蛋白片段。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述蛋白片段是完整的。
18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述角蛋白來自中間絲蛋白家族。
19.如權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述水溶性聚合物選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等。
20.一種改善根據(jù)權(quán)利要求10-19中任一項(xiàng)所述的方法通過加入交聯(lián)劑而制備的傷口護(hù)理產(chǎn)品濕強(qiáng)度特性的方法。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑是醛。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑選自甲醛、乙二醛、戊二醛等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種傷口護(hù)理產(chǎn)品，該產(chǎn)品提供傷口周圍的生物化學(xué)環(huán)境以促進(jìn)傷口愈合。該傷口護(hù)理產(chǎn)品包含角蛋白片段材料，其中，蛋白片段是完整的，來自中間絲蛋白家族或高硫蛋白家族，并且所述蛋白片段是S－磺化的。本發(fā)明還描述了制備傷口護(hù)理產(chǎn)品的方法。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1997408SQ200480038103
公開日2007年7月11日 申請(qǐng)日期2004年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者R·J·凱利, A·D·羅迪克-蘭齊洛塔, M·A·阿里 申請(qǐng)人:凱瑞泰克有限公司