專利名稱：多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外膜蛋白及其診斷和治療用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性涉及腸螺旋體病領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及命名為Bpmp-72的多毛結(jié)腸短螺旋體(Brachyspira Pilosicoli)新72kDa外膜蛋白的氨基酸序列以及編碼它的核苷酸序列。更具體而言，本發(fā)明涉及這些序列在動(dòng)物物種(包括鳥(niǎo)類)和人中針對(duì)多毛結(jié)腸短螺旋體感染(腸螺旋體病)的預(yù)防(“接種疫苗”)和治療方法的用途。本發(fā)明還涉及基于血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷被多毛結(jié)腸短螺旋體定居的動(dòng)物和人。最后，本發(fā)明涉及來(lái)自本申請(qǐng)中所述核苷酸和氨基酸序列的預(yù)防、治療和診斷組合物。
背景技術(shù)：
腸螺旋體病(IS)(也稱為結(jié)腸螺旋體病或螺旋體腹瀉)是限制豬以及成年蛋雞和肉種雞產(chǎn)量的重要疾病。IS由大腸感染腸螺旋體多毛結(jié)腸短螺旋體(以前的蛇狀螺旋體(Serpulina))引起。該螺旋體還感染大量其他動(dòng)物物種，包括狗和人類。其相關(guān)疾病在豬中的了解和研究最多。
澳大利亞養(yǎng)豬業(yè)中感染的患病率并不明確，但在歐洲和斯堪地那維亞(Scandinavia)的研究顯示30％或更多的豬群發(fā)生感染。相關(guān)疾病為具有間歇性腹瀉的結(jié)腸炎/盲腸炎和生長(zhǎng)率降低。該疾病在豬中的經(jīng)濟(jì)重要性尚不清楚，但可能很重要，因?yàn)楸M管它比豬痢疾的病癥輕，但是一般發(fā)病率要高得多。
多毛結(jié)腸短螺旋體還普遍感染成雞。在澳大利亞最近的調(diào)查中，從43％的肉種雞群和68％的蛋雞群中回收到了腸螺旋體，多毛結(jié)腸短螺旋體是與這些菌群中44％的亞群相關(guān)的螺旋體。感染群排泄物的濕度平均比未感染群高14％。用從該研究中分離的多毛結(jié)腸短螺旋體實(shí)驗(yàn)性感染肉種雞引起產(chǎn)蛋起始的顯著延后和蛋產(chǎn)量的持續(xù)降低。除了蛋雞以外，肉種雞群中蛋產(chǎn)量的損失可對(duì)整個(gè)肉雞業(yè)產(chǎn)生相當(dāng)?shù)钠茐?。這些問(wèn)題的代價(jià)難以預(yù)計(jì)，但該工業(yè)在澳大利亞非常重要。雞肉業(yè)生產(chǎn)零售價(jià)25億美元的肉，而蛋業(yè)生產(chǎn)價(jià)值3.4億美元的蛋。
多毛結(jié)腸短螺旋體作為狗和其他動(dòng)物病原體的角色尚未完全證實(shí)，盡管其似乎能夠取決于大量其他因素而在較大或較小的程度上影響健康。多毛結(jié)腸短螺旋體還感染大量發(fā)展中國(guó)家人口。在發(fā)達(dá)國(guó)家中，感染主要局限于無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體和同性戀男性中。它已被記錄為老人和/或無(wú)免疫應(yīng)答的個(gè)體中螺旋體血癥的病因。多毛結(jié)腸短螺旋體對(duì)這些人群的致病影響的完整程度仍有爭(zhēng)論。
很少嘗試研發(fā)控制多毛結(jié)腸短螺旋體感染的方法。當(dāng)豬舍中鑒定出IS問(wèn)題時(shí)，例行用抗菌劑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行治療，盡管該疾病易于在撤除治療后復(fù)發(fā)。然而，在雞中對(duì)該疾病的了解并不深入，養(yǎng)雞業(yè)尚未具體嘗試控制感染。
在豬中控制IS的疫苗的用途僅有一項(xiàng)有記錄的研究，且該自身菌苗沒(méi)能提供保護(hù)(Hampson DJ，Robertson ID、La T，Oxberry SL和Pethick DW(2000)Influences of diet and vaccination on colonization of pigs by theintestinal spirochaete Brachyspira(Serpulina)pilosicoli.VeterinaryMicrobiology 7475-84)。盡管如此，由于螺旋體對(duì)大腸粘膜具有特異性的末端粘附，可能可以通過(guò)適當(dāng)?shù)囊呙缢T導(dǎo)的免疫來(lái)減弱或阻止定居。
本發(fā)明提供先前未鑒定過(guò)的新多毛結(jié)腸短螺旋體氨基酸序列及編碼它的多核苷酸序列。
發(fā)明概述我們已鑒定了本文中稱為多毛結(jié)腸短螺旋體膜蛋白72(Bpmp-72)的新氨基酸序列及其特別適于與腸道螺旋體病相關(guān)的診斷、預(yù)防和治療目的的氨基酸片段。我們還鑒定了編碼Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸序列。
因此，本發(fā)明提供Bpmp-72氨基酸序列，其含有SEQ ID NO2中所展示序列或與其基本同源的氨基酸序列或SEQ ID NO2氨基酸序列片段。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中提供了選自SEQ ID NO3至SEQ ID NO22的Bpmp-72氨基酸序列片段。
本發(fā)明還提供Bpmp-72多核苷酸序列(SEQ ID NO1)或其同源物。Bpmp-72多核苷酸序列優(yōu)選選自(a)含有SEQ ID NO1中公開(kāi)的多核苷酸序列或其片段的多核苷酸序列；(b)含有能與SEQ ID NO1中公開(kāi)的多核苷酸序列或其片段選擇性雜交的核苷酸序列的多核苷酸序列；(c)由于遺傳密碼與(a)或(b)中定義的序列簡(jiǎn)并的多核苷酸序列，或(d)與(a)、(b)或(c)的序列互補(bǔ)的多核苷酸序列。
還提供了可與本發(fā)明多核苷酸序列雜交的可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸序列，包括可與Bpmp-72多核苷酸序列的編碼或非編碼區(qū)雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供如SEQ ID NO24和SEQ ID NO27至SEQ ID NO37中公開(kāi)的用于擴(kuò)增編碼Bpmp-72的多毛結(jié)腸短螺旋體基因組DNA的寡核苷酸引物。
本發(fā)明提供的載體含有本發(fā)明的Bpmp-72多核苷酸序列。優(yōu)選地，載體為克隆或表達(dá)載體。當(dāng)載體為表達(dá)載體時(shí)，其優(yōu)選含有與表達(dá)控制序列有效連接的Bpmp-72多核苷酸序列。
還提供了用本發(fā)明的多核苷酸序列或上文所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或組織培養(yǎng)中的豬細(xì)胞。
本發(fā)明還提供制備Bpmp-72氨基酸序列的方法，所述方法包括(a)在提供表達(dá)Bpmp-72氨基酸序列的條件下培養(yǎng)如上文所述的細(xì)胞；和(b)回收表達(dá)的Bpmp-72氨基酸序列。該程序還可以伴隨以下步驟(c)在Ni螯合柱上層析氨基酸序列；和(d)通過(guò)凝膠過(guò)濾純化氨基酸序列。
本發(fā)明還提供對(duì)本發(fā)明的氨基酸序列具有特異性的標(biāo)記和非標(biāo)記的單克隆和多克隆抗體，以及產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的永生細(xì)胞系。本發(fā)明的抗體制備包括(a)將Bpmp-72氨基酸序列與載體蛋白綴合；(b)將步驟(a)的Bpmp-72氨基酸片段-載體蛋白綴合物與佐劑混合來(lái)免疫動(dòng)物；和(c)從免疫的宿主動(dòng)物獲得Bpmp-72特異性抗體。
本發(fā)明還提供檢測(cè)生物樣品中短螺旋體(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體(B.hyodysenteriae)、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)存在與否的方法，所述方法包括(a)在適當(dāng)?shù)碾s交條件下使生物樣品與含有本發(fā)明Bpmp-72多核苷酸序列的探針或引物接觸；和(b)檢測(cè)探針或引物與樣品中核苷酸序列之間形成的任何雙鏈體。
本發(fā)明提供測(cè)定樣品中存在的Bpmp-72氨基酸序列的方法，包括(a)在允許形成反應(yīng)復(fù)合物的條件下使懷疑含有Bpmp-72氨基酸序列的樣品與特異性結(jié)合Bpmp-72氨基酸序列的抗體接觸；和(b)檢測(cè)反應(yīng)復(fù)合物的形成，其中檢出形成的反應(yīng)復(fù)合物表示樣品中存在Bpmp-72氨基酸序列。
本發(fā)明還提供檢測(cè)生物樣品中腸螺旋體病抗體的方法，其中包括(a)提供Bpmp-72氨基酸序列或其片段；(b)在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下將生物樣品與所述氨基酸序列孵育；和(c)檢測(cè)所述抗體-抗原復(fù)合物。
相應(yīng)地提供了評(píng)估生物樣品中Bpmp-72氨基酸序列水平的體外方法，包括(a)根據(jù)上文提到的方法檢測(cè)生物樣品中形成的反應(yīng)復(fù)合物；和(b)評(píng)估形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，其量對(duì)應(yīng)于生物樣品中Bpmp-72氨基酸序列的水平。
另外，還提供了監(jiān)控動(dòng)物宿主中與短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)相關(guān)疾病的治療方法的體外方法，所述方法包含如上文所述評(píng)估在不同時(shí)間點(diǎn)取自接受該治療方法的動(dòng)物宿主的一系列生物樣品中Bpmp-72氨基酸序列的水平。
本發(fā)明還公開(kāi)了本發(fā)明的多核苷酸序列以及可與編碼本發(fā)明Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸雜交的反義核酸序列在生產(chǎn)調(diào)控與短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)相關(guān)疾病的藥物中的用途。
另外，本發(fā)明提供藥物或治療組合物或試劑(包括但不僅限于預(yù)防、改善或治療與包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體的短螺旋體物種相關(guān)的腸螺旋體病的疫苗)，其包含(a)至少一段本文所述的Bpmp-72氨基酸序列或至少一段本文所述的核苷酸序列或與上述序列之一特異性結(jié)合的抗體；和(b)一種或多種可藥用載體和/或賦形劑。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的多核苷酸、氨基酸序列和/或抗體在療法中的用途。還提供治療由腸螺旋體病表征的疾病的方法，其方法包括對(duì)需要治療的動(dòng)物施用有效劑量的本發(fā)明多核苷酸、氨基酸序列或抗體。另外，本發(fā)明提供預(yù)防性治療動(dòng)物以阻止腸螺旋體病或至少使其降到最低的方法，所述方法包括以下步驟對(duì)動(dòng)物施用有效量的多核苷酸、多肽、抗體或含有一種或多種這些生物分子的藥物組合物。
另外，本發(fā)明提供篩選能夠通過(guò)與Bpmp-72核苷酸或氨基酸序列直接或間接相互作用來(lái)調(diào)控短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)生物活性的藥物的方法。通過(guò)這些方法鑒定出的物質(zhì)可以用于治療腸螺旋體病的方法中。
本發(fā)明還提供用于篩選懷疑感染短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)的動(dòng)物或確認(rèn)動(dòng)物已感染短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的試劑盒，所述試劑盒至少含有與使用說(shuō)明書(shū)一起包裝于適當(dāng)容器內(nèi)的與Bpmp-72多核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列。在另一種形式中，本發(fā)明提供用于(a)篩選懷疑感染短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的宿主動(dòng)物或(b)確認(rèn)宿主動(dòng)物已感染短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的試劑盒，所述試劑盒至少含有包裝于適當(dāng)容器內(nèi)的Bpmp-72氨基酸序列或其片段或與上述序列結(jié)合的抗體及其使用說(shuō)明書(shū)。
綜述以下說(shuō)明并參考以下的闡釋性附圖，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述

圖1用多毛結(jié)腸短螺旋體外膜蛋白對(duì)吸收的超免疫豬血清(AHPS)進(jìn)行Western印跡分析。泳道1，分子量標(biāo)記物；泳道2，多毛結(jié)腸短螺旋體95/1000。箭頭指示72kDa蛋白(Bpmp-72)。
圖2用表達(dá)截短的多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外膜蛋白的大腸桿菌細(xì)胞對(duì)吸收的超免疫豬血清(AHPS)進(jìn)行Western印跡分析。泳道1-分子量標(biāo)記物；泳道2-AHP1；泳道3-AHP2；泳道4-AHP3；泳道5-AHP4；泳道6-AHP5；泳道7-AHP6；泳道8-多毛結(jié)腸短螺旋體95/1000外膜蛋白。箭頭指示34kDa截短蛋白。
圖3Bpmp-72的核苷酸序列。
圖4克隆進(jìn)pTrcHis大腸桿菌表達(dá)載體的Bpmp-72基因(圖中標(biāo)為Omp-72)的多個(gè)區(qū)域的載體圖。pTrc-Bpmp-72(A；6081bp)、pTrc-Bpmp-72N(B；5518bp)和pTrc-bpmp-72C(C；5171bp)構(gòu)建體分別表達(dá)全長(zhǎng)Bpmp-72、Bpmp-72的N端部分和Bpmp-72的C端部分。所有載體構(gòu)建自同一載體主鏈并僅在克隆進(jìn)表達(dá)盒的Bpmp-72區(qū)存在差異。
圖5天然Bpmp-72(圖中標(biāo)為Omp-72)和重組Bpmp-72C端部分(His6-Bpmp-72C)的Western印跡分析。泳道1-分子量標(biāo)記物；泳道2-純化的His6-Bpmp-72C；泳道3-來(lái)自多毛結(jié)腸短螺旋體95/1000的天然Bpmp-72C；泳道4-來(lái)自多毛結(jié)腸短螺旋體Csp1的天然Bpmp-72C，箭頭指示天然和重組的Bpmp-72蛋白。
圖6使用N-NTA層析純化的不同批次的重組His6-Bpmp-72的SDS-PAGE分析。使用同一方法表達(dá)和純化所有批次的重組蛋白。泳道1-分子量標(biāo)記物；泳道2到9-純化的His6-Bpmp-72C批次1-6。箭頭指示重組的His6-Bpmp-72C蛋白。
圖7用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊前后未接種雞針對(duì)重組His6-Bpmp-72C的全身抗體效價(jià)(ELISA)。使用純化的His6-Bpmp-72C作為包被抗原用ELISA檢測(cè)循環(huán)抗體。
圖8用重組His6-Bpmp-72C接種雞，并隨后用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊后的全身抗體效價(jià)(ELISA)。對(duì)所有禽肌內(nèi)給予100μg蛋白質(zhì)并之后通過(guò)口服1mg進(jìn)行加強(qiáng)。用純化的His6-Bpmp-72C作為包被抗原用ELISA檢測(cè)循環(huán)抗體。
圖9用重組His6-Bpmp-72C接種雞，并隨后用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊后的全身抗體效價(jià)(ELISA)。對(duì)所有禽肌內(nèi)給予1mg蛋白質(zhì)并之后通過(guò)口服1mg進(jìn)行加強(qiáng)。用純化的His6-Bpmp-72C作為包被抗原用ELISA檢測(cè)循環(huán)抗體。
圖10取自肌內(nèi)給予100μg重組His6-Bpmp-72C隨后口服1mg蛋白質(zhì)的雞的混合血清的Western印跡分析。在每個(gè)采樣時(shí)間混合取自三只雞的血清。使用的抗原為攻擊所使用多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的全細(xì)胞提取物。泳道1-實(shí)驗(yàn)A1的接種雞(陽(yáng)性對(duì)照)；泳道2-4-為21-23號(hào)雞；泳道5-7-為24-26號(hào)雞；泳道8-10-為27-29號(hào)雞；泳道11-13-為30-32號(hào)雞；泳道14-16-為33-35號(hào)雞。每個(gè)三份包括在接種前、攻擊前和攻擊后連續(xù)采樣的血清。分子量標(biāo)記物以kDa顯示。箭頭指示多毛結(jié)腸短螺旋體天然72kDa蛋白質(zhì)。
圖11取自肌內(nèi)給予1mg重組His6-Bpmp-72C隨后口服1mg蛋白質(zhì)的雞的混合血清的Western印跡分析。在每個(gè)采樣時(shí)間混合取自三只雞的血清。使用的抗原為攻擊所使用多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的全細(xì)胞提取物。泳道1-實(shí)驗(yàn)A1的接種雞(陽(yáng)性對(duì)照)；泳道2-4-為36-38號(hào)雞；泳道5-7-為39-41號(hào)雞；泳道8-10-為42-44號(hào)雞；泳道11-13-為45-47號(hào)雞；泳道14-16-為48-50號(hào)雞。每個(gè)三份包括在接種前、攻擊前和攻擊后連續(xù)采樣的血清。分子量標(biāo)記物以kDa顯示。箭頭指示多毛結(jié)腸短螺旋體天然72kDa蛋白質(zhì)(Bpmp-72)。
圖12用重組His6-Bpmp-72C接種并隨后用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊后雞的小腸和結(jié)腸粘膜抗體效價(jià)(ELISA)。1-19號(hào)禽未接種，21-35號(hào)禽肌內(nèi)給予100μg蛋白質(zhì)隨后口服1mg蛋白質(zhì)，36-50號(hào)禽肌內(nèi)給予1mg蛋白質(zhì)隨后口服1mg。以純化的His6-Bpmp-72C作為包被抗原用ELISA檢測(cè)循環(huán)抗體。
圖13用重組His6-Bpmp-72C接種并用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊的雞的粘膜抗體Western印跡分析。使用的抗原為攻擊所使用多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的全細(xì)胞提取物。泳道1-3-小腸抗體；泳道4-17-結(jié)腸抗體泳道1-為27號(hào)雞；泳道2-為40號(hào)雞；泳道3-為48號(hào)雞；泳道4-5-為23-24號(hào)雞；泳道6-為27號(hào)雞；泳道7-9-為34-36號(hào)雞；泳道10-13-為38-41號(hào)雞；泳道14-15-為43-44號(hào)雞；泳道16-為48號(hào)雞；泳道17-為50號(hào)雞；泳道18-實(shí)驗(yàn)A1中接種的雞(陽(yáng)性對(duì)照)。21-35號(hào)雞肌內(nèi)給予100μg蛋白質(zhì)隨后口服1mg蛋白質(zhì)。36-50號(hào)雞肌內(nèi)給予1mg蛋白質(zhì)隨后口服1mg蛋白質(zhì)。分子量標(biāo)記物以kDa顯示。箭頭指示多毛結(jié)腸短螺旋體天然72kDa蛋白質(zhì)(Bpmp-72)。
本發(fā)明詳細(xì)的公開(kāi)內(nèi)容一般描述本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，本文所述的發(fā)明可以進(jìn)行除具體描述以外的改變和修飾。應(yīng)該理解，本發(fā)明包括所有這些改變和修飾。本發(fā)明還單獨(dú)或共同包括說(shuō)明書(shū)中涉及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物以及任意兩種或更多步驟或特征的任意和全部組合。
本文所述的具體實(shí)施例僅用于示例目的，而非限制本發(fā)明的范圍。如本文所述，功能性等價(jià)產(chǎn)物、組合物和方法明確包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本說(shuō)明書(shū)中包括的包含核苷酸和氨基酸序列信息的序列標(biāo)識(shí)號(hào)(SEQID NO)集中于本說(shuō)明書(shū)的末尾，所述序列標(biāo)識(shí)號(hào)使用PatentIn程序3.2版制訂。在序列表中每一核苷酸和氨基酸序列通過(guò)數(shù)字指示<210>后的序列標(biāo)識(shí)進(jìn)行標(biāo)識(shí)(如<210>1、<210>2等等)。每一核苷酸或氨基酸序列的長(zhǎng)度、序列類型和來(lái)源生物分別通過(guò)數(shù)字<211>、<212>和<213>中提供的信息進(jìn)行標(biāo)示。說(shuō)明書(shū)中指出的核苷酸和氨基酸序列通過(guò)數(shù)字指示區(qū)<400>之后的序列標(biāo)識(shí)(如<400>1、<400>2等等)中提供的信息進(jìn)行定義。
本文引用的所有出版物(包括專利、專利申請(qǐng)、雜志文章、實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)、書(shū)籍或其他文件)的完整公開(kāi)內(nèi)容在本文中引為參考文獻(xiàn)。并不承認(rèn)任何參考文獻(xiàn)構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)或本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍常識(shí)部分。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“衍生”和“來(lái)自”應(yīng)理解為表示可以從特定來(lái)源中獲得(盡管不必需直接從該來(lái)源獲得)的具體事物。
在本說(shuō)明書(shū)中，除非其上下文另有要求，術(shù)語(yǔ)“含有”應(yīng)理解為指包含所述事物或事物組，但不排除其他事物或事物組。
本文中選擇使用的術(shù)語(yǔ)的其他定義可見(jiàn)于本發(fā)明的詳細(xì)描述中，并可應(yīng)用于整篇申請(qǐng)中。除非另外定義，本文使用的所有其他科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所普遍理解的相同含義。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及鑒定Bpmp-72氨基酸序列，包括其變體和片段以及編碼所述序列的多核苷酸序列。
通過(guò)篩選多毛結(jié)腸短螺旋體λ噬菌體基因組文庫(kù)，從多毛結(jié)腸短螺旋體中分離Bpmp-72氨基酸序列。通過(guò)該篩選方法發(fā)現(xiàn)了六個(gè)克隆，命名為Ahp 1-6。這些克隆均產(chǎn)生表觀分子量為34kDa的普通蛋白質(zhì)，所有這些蛋白質(zhì)均與吸收的超免疫的豬血清強(qiáng)烈反應(yīng)。對(duì)一個(gè)克隆的測(cè)序鑒定出了具有29.4kDa編碼容量的783個(gè)堿基對(duì)的局部開(kāi)放讀碼框(ORF)。該局部ORF可能編碼多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外膜蛋白的羧基端部分。
對(duì)Bpmp-72進(jìn)行SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫(kù)同源性檢索鑒定出該蛋白質(zhì)與蝕瘡潰瘍密螺旋體(Treponema phagedenis)和蒼白密螺旋體(Treponemapallidum)的密螺旋體膜蛋白B(TmpB)之間具有約5％的同源性(表1)。這些蛋白質(zhì)與外膜相關(guān)，并可能作為孔蛋白或大分子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。用GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Bpmp-72核苷酸序列進(jìn)行比較未顯示出與其他細(xì)菌基因的強(qiáng)同源性。
表1

對(duì)Bpmp-72多核苷酸序列的分析揭示了多毛結(jié)腸短螺旋體基因組DNA的1009個(gè)堿基對(duì)的插入物(圖3)。插入DNA的序列分析顯示了從堿基1到783的783個(gè)堿基對(duì)的潛在局部ORF，所述潛在局部ORF具有推定的ATG起始密碼子和TAA終止密碼子。對(duì)剩余基因的進(jìn)一步克隆和測(cè)序表明Bpmp-72的編碼序列大小為1692個(gè)核苷酸。在ATG起始密碼子的上游鑒定出了潛在的Shine-Dalgarno核糖體結(jié)合位點(diǎn)(AGGAG)和推定的-10(TAATAT)及-35(TTGAAA)啟動(dòng)子區(qū)。編碼72kDa外膜蛋白的基因序列命名為72kDa分子量的外膜蛋白(Bpmp-72)。
翻譯的多肽由564個(gè)氨基酸(aa)殘基組成，預(yù)測(cè)分子量為62.1kDa(圖4)。推導(dǎo)出的大小與天然Bpmp-72蛋白的Western印跡中看到的存在顯著差異。Bpmp-72的假想編碼容量和天然Bpmp-72外膜蛋白之間分子量的差異原因可能是翻譯后修飾，如酰化、甲基化、乙?；?、磷酸化和硫酸化。
氨基酸序列的分析顯示在翻譯多肽的C端存在與保守的賴氨酸基序(LysM)結(jié)構(gòu)域同源的118個(gè)殘基的區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域是廣泛分布的蛋白質(zhì)模塊，最初在降解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶中鑒定，盡管已經(jīng)顯示它也存在于許多其他細(xì)菌蛋白質(zhì)中。LysM結(jié)構(gòu)域是細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白中最普遍的模塊之一。具有LysM結(jié)構(gòu)域的其他細(xì)菌蛋白質(zhì)(如Staphlococci IgG結(jié)合蛋白和大腸桿菌親密素)與細(xì)菌致病相關(guān)。
Bpmp-72氨基酸序列本發(fā)明提供的全長(zhǎng)Bpmp-72氨基酸序列具有約564個(gè)氨基酸(aa)殘基并編碼多毛結(jié)腸短螺旋體外膜蛋白。推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)分子量為62,081Da。
本發(fā)明的Bpmp-72氨基酸序列包括具有本文公開(kāi)的氨基酸序列(如SEQ ID NO2到22)的氨基酸序列。它們還包括用保守性氨基酸替代修飾的Bpmp-72氨基酸序列及其類似物、片段和衍生物。
在本發(fā)明的優(yōu)選形式中提供了如本文所述的分離的Bpmp-72氨基酸序列。更希望以基本純化的形式提供Bpmp-72氨基酸序列。
術(shù)語(yǔ)“分離的”用于描述已與天然狀態(tài)中與其伴隨的組分分開(kāi)的Bpmp-72氨基酸序列。另外，當(dāng)至少60％到75％的樣品顯示為單一Bpmp-72氨基酸序列時(shí)，Bpmp-72氨基酸序列為“基本純化的”。基本純化的Bpmp-72氨基酸序列一般含有Bpmp-72氨基酸序列樣品的約60％到90％W/W，更通常約為95％，并優(yōu)選高于99％的純度?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的大量方法顯示蛋白質(zhì)的純度或同質(zhì)性，如對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并在染膠后顯示為單一的Bpmp-72氨基酸序列條帶。對(duì)于某些目的，可以使用HPLC或本其應(yīng)用領(lǐng)域熟知的其他方法提供更高的分辨率。
優(yōu)選的本發(fā)明Bpmp-72氨基酸序列具有天然全長(zhǎng)Bpmp-72氨基酸序列的一種或多種生物特性(如體內(nèi)或體外或免疫特性)。由于非功能型Bpmp-72氨基酸序列可能是有用的(如作為Bpmp-72的拮抗劑)，因此它們也包括于本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)如生物測(cè)定來(lái)檢測(cè)類似物、片段或衍生物相對(duì)于野生型的生物特性。
可以合成(如使用熟知的固相或液相肽合成技術(shù))制備Bpmp-72氨基酸序列，包括類似物、片段和衍生物。優(yōu)選使用固相合成技術(shù)。另外，可以如下文所述使用熟知的基因工程技術(shù)制備本發(fā)明的Bpmp-72氨基酸序列。在另一實(shí)施方案中，可以從取自動(dòng)物(包括豬、雞、人和狗、馬、牛、綿羊和魚(yú))的生物流體(例如但不僅限于血漿、排泄物、血清或尿液)中純化Bpmp-72氨基酸序列。
Bpmp-72氨基酸序列類似物Bpmp-72氨基酸序列類似物包括具有其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸用另一氨基酸進(jìn)行替代的氨基酸序列的類似物，所述替代不顯著改變分子的生物活性。
在本發(fā)明上下文中，類似物序列包括在至少20、50、100或200個(gè)氨基酸上與SEQ ID NO2中公開(kāi)的序列在氨基酸水平具有至少60％、70％、80％或90％同源性、優(yōu)選至少95％或98％同源性的Bpmp-72氨基酸序列。具體而言，一般應(yīng)該考慮已知為蛋白質(zhì)功能所必需的序列區(qū)域的同源性，而不是非必需的鄰近序列的同源性。特別優(yōu)選的本發(fā)明氨基酸序列含有與SEQ ID NO3到22中所示的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列具有高于60％或70％同源性、優(yōu)選高于80％或90％同源性的連續(xù)序列。
盡管同源性可以考慮相似性(即氨基酸殘基具有相似的化學(xué)特性/功能)，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選將同源性表達(dá)為序列同一性。在論及Bpmp-72氨基酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同源”或“基本同一”指目的Bpmp-72氨基酸序列與完全天然存在的Bpmp-72氨基酸序列或其部分表現(xiàn)出至少約70％的同一性，一般為至少約80％的同一性并優(yōu)選至少90％或95％的同一性。
在高度優(yōu)選的本發(fā)明形式中，Bpmp-72氨基酸序列類似物與SEQ IDNO2中所公開(kāi)的Bpmp-72氨基酸序列或SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中所示的序列具有80％或更高的氨基酸序列同一性。本發(fā)明范圍內(nèi)的Bpmp-72氨基酸序列類似物的實(shí)例包括SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中(a)用谷氨酸替代了一個(gè)或多個(gè)天冬氨酸殘基；(b)用亮氨酸替代了一個(gè)或多個(gè)異亮氨酸殘基；(c)用丙氨酸替代了一個(gè)或多個(gè)甘氨酸或纈氨酸殘基；(d)用組氨酸替代了一個(gè)或多個(gè)精氨酸殘基；或(e)用色氨酸替代了一個(gè)或多個(gè)酪氨酸或苯丙氨酸殘基。
篩選Bpmp-72類似物本領(lǐng)域公知篩選多肽類似物的多種篩選技術(shù)。有多種化學(xué)品文庫(kù)可供使用。因此，本發(fā)明考慮篩選這些文庫(kù)(如經(jīng)多年研究后產(chǎn)生的合成化合物文庫(kù)、天然化合物文庫(kù)和組合文庫(kù)，如下文所詳細(xì)描述)以得到Bpmp-72氨基酸序列的類似物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮篩選這些文庫(kù)以得到與Bpmp-72特異性抗體結(jié)合的類似物。
Bpmp-72氨基酸序列片段除了類似物以外，本發(fā)明還考慮Bpmp-72氨基酸序列的片段。Bpmp-72氨基酸序列片段是一段至少約5到7個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸殘基，常為至少約7到9個(gè)連續(xù)氨基酸，一般為至少9到13個(gè)連續(xù)氨基酸，且最優(yōu)選至少約20到30或更多個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選的Bpmp-72氨基酸序列片段包括如SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中所示的序列。
在高度優(yōu)選的本發(fā)明形式中，片段表現(xiàn)Bpmp-72氨基酸序列的配體結(jié)合、免疫活性和/或其他生物活性特征。更優(yōu)選的，片段具有與存在于天然Bpmp-72氨基酸序列上的一致的免疫表位。
本文使用的“表位”指多肽的抗原決定簇。表位可以含有表位特有的空間構(gòu)象中的三個(gè)氨基酸。表位一般由至少5個(gè)氨基組成，更通常由至少8-10個(gè)氨基酸組成。測(cè)定這些氨基酸的空間構(gòu)象的方法為本領(lǐng)域公知。
Bpmp-72氨基酸序列衍生物本發(fā)明提供“Bpmp-72氨基酸序列衍生物”，其包括一級(jí)結(jié)構(gòu)基本同源但含有化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾或非常見(jiàn)氨基酸的Bpmp-72氨基酸序列、其類似物或片段。這些修飾包括如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的乙?；?、羧基化、磷酸化、糖基化、泛素化、標(biāo)記(如使用放射性核苷酸)和多種酶修飾。
在本發(fā)明的一種形式中，適于衍生的化學(xué)部分選自水溶性多聚體。所選擇的多聚體應(yīng)為水溶性的，以便其附著的蛋白質(zhì)不會(huì)在水性環(huán)境(如生理環(huán)境)中沉淀。優(yōu)選地，對(duì)于終產(chǎn)物制品的用于治療用途時(shí)，多聚體是可藥用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于各種因素選擇所需的多聚體，如多聚體/蛋白質(zhì)綴合物是否用于治療，以及用于治療時(shí)的所需劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白酶解的抗性和其他因素。對(duì)于本發(fā)明的蛋白質(zhì)和肽，可以使用本文提供的方法確定這些因素。
水溶性多聚體可以選自如聚乙二醇、乙二醇/丙烯共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊烷、聚-1，3，6-三烷、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、聚氨基酸(同聚物或隨機(jī)共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚丙烯氧/乙烯氧共聚物、聚氧乙烯多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛肟由于其在水中的穩(wěn)定性而在制造業(yè)中具有優(yōu)勢(shì)。
在本發(fā)明的另一形式中，可以修飾氨基酸序列以產(chǎn)生在宿主動(dòng)物中較長(zhǎng)的半衰期，例如將一個(gè)或多個(gè)抗體片段(如Fc片段)與Bpmp-72氨基酸序列的氨基或羧基末端融合。
當(dāng)Bpmp-72氨基酸序列將以標(biāo)記的形式提供時(shí)，多種標(biāo)記氨基酸序列的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括放射性同位素(如32P)、與標(biāo)記的反配體(antiligand)(如抗體)結(jié)合的配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、可作為標(biāo)記的配體的結(jié)合對(duì)成員的酶和反配體。標(biāo)記的選擇取決于所需的靈敏度、穩(wěn)定性需求和可用的設(shè)備。標(biāo)記氨基酸序列的方法為本領(lǐng)域所熟知(參閱如Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)和Ausubel，F(xiàn).，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.《Current protocols in molecular biology》.Greene Publishing Assosiates/Wiley Intersciences，New York(2001))。
如果本發(fā)明的Bpmp-72氨基酸序列為可溶性的，其可以與固相支持物偶聯(lián)，所述固相支持物如硝酸纖維素、尼龍、柱填充材料(如Sepharose珠)、磁珠、玻璃絲、塑料、金屬、聚合物凝膠、細(xì)胞或其他基質(zhì)。這些支持物可以為珠、孔、片或膜的形式。
本發(fā)明還提供含有Bpmp-72氨基酸序列和片段的融合多肽。因此Bpmp-72氨基酸序列可以是兩個(gè)或多個(gè)Bpmp-72氨基酸序列之間或Bpmp-72氨基酸序列和相關(guān)蛋白質(zhì)之間的融合物。類似的，可以構(gòu)建表現(xiàn)衍生蛋白質(zhì)的特性或活性組合的異源融合物。例如，配體結(jié)合或其他結(jié)構(gòu)域在不同的融合多肽或片段之間“交換”。這些同源或異源融合多肽可以表現(xiàn)出如改變的結(jié)合強(qiáng)度或特異性。融合配偶體包括免疫球蛋白、細(xì)菌β-半乳糖苷酶、trpE、A蛋白、β-內(nèi)酰胺酶、α淀粉酶、醇脫氫酶和酵母α交配因子。
可以使用常規(guī)技術(shù)合成修飾的氨基酸序列，或其由修飾的多核苷酸序列編碼并使用重組核酸方法產(chǎn)生。也可以使用常規(guī)技術(shù)制備修飾的多核苷酸序列。一般通過(guò)重組核酸方法或化學(xué)合成制備融合蛋白。
Bpmp-72多核苷酸根據(jù)本發(fā)明提供了分離或基本純凈的多核苷酸序列，所述序列編碼Bpmp-72氨基酸序列或其類似物、片段或衍生物。優(yōu)選的本發(fā)明Bpmp-72多核苷酸序列含有SEQ ID NO1中所列的序列或其片段。
“Bpmp-72多核苷酸序列”指單鏈形式或雙螺旋的核糖核苷(腺苷、鳥(niǎo)苷、尿苷或胸苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥(niǎo)苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA”分子)的磷酸酯多聚體形式。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。在討論具體的雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時(shí)，本文中的序列描述按常規(guī)僅給出沿DNA非轉(zhuǎn)錄鏈(即具有與mRNA同源序列的鏈)5’到3’方向的序列。
“分離的”或“基本純凈的”Bpmp-72多核苷酸是與天然多毛結(jié)腸短螺旋體基因組序列天然共存的其他細(xì)胞組分基本分開(kāi)的多核苷酸。該術(shù)語(yǔ)包括從其天然存在環(huán)境中取出的Bpmp-72多核苷酸序列，也包括重組或克隆的Bpmp-72多核苷酸序列分離物和化學(xué)合成的變體或異源系統(tǒng)生物合成的變體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于表達(dá)Bpmp-72氨基酸序列的Bpmp-72多核苷酸序列。更具體而言，Bpmp-72多核苷酸序列選自(a)SEQID NO1中公開(kāi)的多核苷酸序列或其片段；(b)與(a)中定義的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列或其可雜交片段；和(c)編碼表達(dá)由任何上述多核苷酸序列所編碼的氨基酸序列的多核苷酸序列。
同源Bpmp-72多核苷酸序列本發(fā)明的Bpmp-72多核苷酸序列包括來(lái)自Bpmp-72多核苷酸序列或與Bpmp-72多核苷酸序列基本相似或與天然Bpmp-72多核苷酸序列或其部分具有顯著同源性的序列。在與另一多核苷酸序列(或其互補(bǔ)序列)進(jìn)行(帶有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔У?最優(yōu)比對(duì)時(shí)，如果在至少約60％的核苷酸堿基、通常至少約70％、更通常至少約80％、優(yōu)選至少約90％并最優(yōu)選至少約95％-98％的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性，則Bpmp-72多核苷酸序列與另一序列“基本同源”(或“基本相似”)。
另外，當(dāng)Bpmp-72多核苷酸序列或其片段在選擇性雜交條件下與另一Bpmp-72多核苷酸(或其互補(bǔ)鏈)雜交時(shí)，也存在基本同源性或同一性?？梢栽诘?、中或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行選擇性雜交，但優(yōu)選在高嚴(yán)格條件下進(jìn)行。一般在至少約14個(gè)核苷酸的序列上至少約55％、優(yōu)選至少約65％、更優(yōu)選至少約75％并最優(yōu)選至少約90％的同一性時(shí)發(fā)生選擇性雜交。如所述的同源性比較的長(zhǎng)度可以在更長(zhǎng)的序列上進(jìn)行，在某些實(shí)施方案中，可以在至少約9個(gè)核苷酸、通常至少約20個(gè)核苷酸、更通常至少24個(gè)核苷酸，一般至少約28個(gè)核苷酸、更一般至少約32個(gè)核苷酸且優(yōu)選至少約36或更多核苷酸的序列上進(jìn)行。
因此，本發(fā)明的核苷酸序列優(yōu)選與本文序列表中所示序列具有至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％的同源性。更優(yōu)選至少95％、更優(yōu)選至少98％的同源性?？梢园聪挛乃鲇糜诙嚯牡谋容^來(lái)進(jìn)行核苷酸同源性比較。優(yōu)選的序列比較程序?yàn)镚CG Wisconsin Bestfit程序。
在本發(fā)明上下文中，同源序列包括與SEQ ID NO1中公開(kāi)的核苷酸序列的至少20、50、100、200、300、500或819個(gè)核苷酸具有至少60％、70％、80％或90％同一性的核苷酸序列。具體而言，一般應(yīng)該考慮編碼已知為蛋白質(zhì)功能所必需的連續(xù)氨基酸序列(而不是非必需鄰近序列)的序列區(qū)域的同源性。
其他優(yōu)選的本發(fā)明Bpmp-72多核苷酸序列包括與編碼SEQ ID NO3至SEQ ID NO22中一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列的核苷酸序列具有高于50％、60％或70％同源性、更優(yōu)選高于80％、90％、95％或97％同源性的連續(xù)序列。
Bpmp-72多核苷酸序列片段本發(fā)明的Bpmp-72多核苷酸序列片段優(yōu)選長(zhǎng)度至少為15個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)度至少為20、30、40、50、100或200個(gè)核苷酸。一般而言，多核苷酸序列的長(zhǎng)度越短，得到選擇性雜交所需的同源性越高。因此，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸序列由少于30個(gè)核苷酸組成時(shí)，與本文的序列表中公開(kāi)的多核苷酸序列相比，優(yōu)選同一性百分比高于75％，優(yōu)選高于90％或95％。相反，當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸序列由例如多于50或100個(gè)核苷酸組成時(shí)，與本文的序列表中公開(kāi)的多核苷酸序列相比的同一性百分比可以較低，如高于50％，優(yōu)選高于60％或75％。
Bpmp-72探針序列本發(fā)明范圍內(nèi)還考慮來(lái)自Bpmp-72多核苷酸序列的探針序列，所述探針序列可以從本文公開(kāi)的特定序列中便利地制備。探針可以是任何適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度，所述探針跨越Bpmp-72多核苷酸序列的全部或部分并能夠與該序列特異性雜交。
同源性程度越高，就可以使用越嚴(yán)格的雜交條件。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選設(shè)計(jì)探針以使用低嚴(yán)格雜交條件鑒定同源Bpmp-72多核苷酸序列。在另一實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)探針以使用中嚴(yán)格雜交條件。更優(yōu)選使用高嚴(yán)格雜交條件。如本文實(shí)驗(yàn)所示的，Bpmp-72探針序列與SEQ ID NO1中所述的多核苷酸序列在中嚴(yán)格條件下雜交，更優(yōu)選地，在高嚴(yán)格條件下雜交。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，除了本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到的堿基組成、互補(bǔ)鏈長(zhǎng)度和雜交核酸之間錯(cuò)配的核苷酸堿基數(shù)目以外，雜交條件的嚴(yán)格性還被如鹽濃度、溫度或有機(jī)溶劑等多種條件影響。嚴(yán)格溫度條件一般包括高于30℃的溫度，一般高于37℃并優(yōu)選高于45℃。嚴(yán)格鹽條件通常低于1000mM，一般低于500mM并優(yōu)選低于200mM。然而，參數(shù)的組合遠(yuǎn)比任何單個(gè)參數(shù)的值重要。嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例為65℃和0.1×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl、0.015M乙酸鈉，pH7.0)。
優(yōu)選地，探針序列具有來(lái)自SEQ ID NO1的至少約8個(gè)連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，或優(yōu)選至少約15個(gè)連續(xù)核苷酸，或更優(yōu)選至少約25個(gè)核苷酸，且可以具有至少約40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。特別優(yōu)選地，檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列的寡核苷酸探針包括SEQ ID NO3至SEQ ID NO18及實(shí)施例中所公開(kāi)的寡核苷酸序列。
本發(fā)明的探針可以包括分離的多核苷酸，所述多核苷酸附著于標(biāo)記或報(bào)告分子，并可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法用于分離序列類似的其他多核苷酸序列。制備和標(biāo)記探針的技術(shù)參閱如上文的Sambrook等，(1989)或上文的Ausubel等，(2001)。
含有本發(fā)明的合成寡核苷酸或其他多核苷酸序列的探針還可以來(lái)自天然存在或重組的單鏈或雙鏈多核苷酸，或進(jìn)行化學(xué)合成?？梢酝ㄟ^(guò)切口平移、Klenow補(bǔ)平反應(yīng)或本領(lǐng)域已知的其他方法標(biāo)記探針。
Bpmp-72引物序列本發(fā)明還提供Bpmp-72引物序列。為得到最高的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增反應(yīng)中使用的引物優(yōu)選為單鏈，但也可以為雙鏈。若為雙鏈，可以在用于制備延伸產(chǎn)物之前首先處理引物以分離鏈。引物的長(zhǎng)度應(yīng)在存在聚合反應(yīng)誘導(dǎo)劑時(shí)可有效起始Bpmp-72延伸產(chǎn)物的合成。引物的準(zhǔn)確長(zhǎng)度取決于許多因素，包括溫度、緩沖液和核苷酸組成。
寡核苷酸引物一般含有12-20個(gè)或更多核苷酸(盡管也可含有更少的核苷酸)。優(yōu)選地，引物選自SEQ ID NO3至SEQ ID NO18中所述序列。
可以使用任何合適的方法制備寡核苷酸引物，如常規(guī)磷酸三酯和磷酸二酯方法或其自動(dòng)化實(shí)施方案。在一個(gè)這樣的自動(dòng)化實(shí)施方案中，使用二乙基亞磷酰胺作為起始物質(zhì)并如Beaucage等(1981)Tetrahedron Letters，221859-1862所述進(jìn)行合成。U.S.專利No.4,458,066中描述了在改良的固體支持物上合成寡核苷酸的一種方法。
反義核酸和核酶本發(fā)明還擴(kuò)展到制備可用于在翻譯水平干擾Bpmp-72氨基酸序列表達(dá)的反義核苷酸和核酶。該方法使用反義核酸和核酶通過(guò)用反義核酸屏蔽mRNA或用核酶切割mRNA來(lái)阻斷特定mRNA的翻譯。
反義核酸為與特定分子的至少一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子(參閱Weintraub，(1990)Sci.Am.，26240-46；Marcus-Sekura，(1988)Anal.Biochem.，172289-295)。在細(xì)胞中，它們與mRNA雜交形成雙鏈分子。細(xì)胞不翻譯這種雙鏈形式的mRNA復(fù)合物。因此，反義核酸干擾mRNA表達(dá)成蛋白質(zhì)。由于易于合成并且在將其引入轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)較少出現(xiàn)問(wèn)題，約15個(gè)核苷酸的寡聚體并與AUG起始密碼子雜交的分子特別高效。已經(jīng)使用反義方法體外抑制許多基因的表達(dá)(Hambor等，(1988)J.Exp.Med.，1681237-1245)。
核酶為具有以某種程度上與DNA限制性內(nèi)切酶類似的方式特異性切割其他單鏈RNA分子的能力的RNA分子。核酶發(fā)現(xiàn)于某些mRNA具有切除其自身內(nèi)含子的能力的觀察中。通過(guò)修飾這些RNA的核苷酸序列，研究者已經(jīng)能夠設(shè)計(jì)識(shí)別RNA分子中特定核苷酸序列并對(duì)其切割的分子(Cech，(1988)J.Am.Med.Assoc.，2603030-3034)。由于它們是序列特異性的，因此只能抑制具有特定序列的mRNA。
研究者已經(jīng)鑒定出兩種類型的核酶，四膜蟲(chóng)型和“錘頭”型。四膜蟲(chóng)型核酶識(shí)別四堿基序列，而“錘頭”型識(shí)別十一到十八個(gè)堿基序列。識(shí)別序列越長(zhǎng)，越有可能只在靶mRNA種類中出現(xiàn)。因此，就失活特定的mRNA種類而言，錘頭型核酶優(yōu)于四膜蟲(chóng)型核酶，且十八堿基識(shí)別序列優(yōu)先于較短的識(shí)別序列。
因此本文所述的Bpmp-72多核苷酸序列可以用于制備針對(duì)的Bpmp-72反義分子和切割Bpmp-72氨基酸序列的mRNA的核酶，從而抑制Bpmp-72多核苷酸序列的表達(dá)。
Bpmp-72多核苷酸序列的分離可使用任何多毛結(jié)腸短螺旋體樣品(純化的或非純化的形式)作為分離Bpmp-72多核苷酸序列的起點(diǎn)。這些樣品優(yōu)選通過(guò)例如Maniatis等在《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor，N.Y.，280-281頁(yè)，(1982)所述的多種技術(shù)提取自動(dòng)物樣品(例如血液、組織材料或糞便等)。
如果提取的樣品未被純化，在分離Bpmp-72多核苷酸序列前可將其用大量有效打開(kāi)樣品細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞膜的試劑處理以暴露和/或分離核酸的鏈。
當(dāng)多毛結(jié)腸短螺旋體的基因組材料釋放后，有許多方法可擴(kuò)增和/或分離Bpmp-72多核苷酸序列。這些方法的詳細(xì)描述可得自上文的Sambrook等，(1989)或上文的Ausubel等(2001)。
PCR可能是可用于最初擴(kuò)增Bpmp-72多核苷酸序列的更常規(guī)的方法之一，并優(yōu)選在本發(fā)明中使用。特異的待擴(kuò)增的Bpmp-72多核苷酸序列可為較大分子的一個(gè)片段或可最初以分離的分子存在(從而特異序列構(gòu)成了整個(gè)核酸)。待擴(kuò)增的序列不必要最初以純化的形式存在；其可為復(fù)雜混合物的較小級(jí)分，例如包含在整個(gè)多毛結(jié)腸短螺旋體DNA中的。
根據(jù)PCR方法，與引物一起或單獨(dú)向合成混合物中添加足量的脫氧核糖核苷酸三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，在約1到10分鐘(優(yōu)選1到4分鐘)內(nèi)將產(chǎn)生的溶液加熱至大約90℃-100℃。加熱期后，優(yōu)選為引物雜交而冷卻溶液。向冷卻的混合物中添加合適的用于影響引物延伸反應(yīng)的試劑(文中稱為“聚合劑”)，且允許反應(yīng)在本領(lǐng)域已知的條件下進(jìn)行。聚合劑還可與其他熱穩(wěn)定的試劑一起添加。該合成(或擴(kuò)增)反應(yīng)可在室溫到室溫之上(該溫度下聚合劑不再作用)反應(yīng)。因此，例如如果使用DNA聚合酶作為聚合劑，溫度通常不大于40℃。最適宜反應(yīng)發(fā)生在室溫。
在上述雜交條件下，新合成的Bpmp-72鏈及其互補(bǔ)核酸鏈會(huì)形成雙鏈分子，且該雜合體用于該方法的后續(xù)步驟。
變性、退火和延伸產(chǎn)物合成可根據(jù)需要重復(fù)以擴(kuò)增目的Bpmp-72多核苷酸序列至檢測(cè)需要的程度。產(chǎn)生的特異的Bpmp-72多核苷酸序列的數(shù)量會(huì)以指數(shù)形式累積。這些擴(kuò)增反應(yīng)更詳細(xì)描述于《PCR.A PracticalApproach》，ILR Press，M.J.McPherson，P.Quirke和G.R.Taylor編，1992。
Bpmp-72多核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)Southern印跡分析(不使用放射性探針的)。在該方法中，例如包含非常低水平的Bpmp-72多核苷酸序列核酸序列的DNA少量樣品被擴(kuò)增并通過(guò)Southern印跡技術(shù)分析或類似的使用斑點(diǎn)印跡分析。高水平的擴(kuò)增信號(hào)促進(jìn)了非放射性探針或標(biāo)簽的使用。另外，如本文所述，用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的探針可直接或間接地可檢測(cè)性標(biāo)記。
通過(guò)本發(fā)明方法擴(kuò)增的序列在溶液中或結(jié)合在固體支持物上后，可通過(guò)通常用于檢測(cè)特異DNA序列的方法如PCR、寡聚體限制性酶切(Saiki等(1985)，Bio/Technology，31008-1012)、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)探針?lè)治?Conner等(1983)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80278)、寡核苷酸連接測(cè)定(OLAS)(Landgren等(1988)，Science，2411007)等進(jìn)一步評(píng)估、檢測(cè)、克隆、測(cè)序等。
另外的擴(kuò)增方法已被描述并也可用于本發(fā)明。這類其它的擴(kuò)增體系包括但不僅限于自動(dòng)維持的序列復(fù)制和基于核酸序列的擴(kuò)增(使用反轉(zhuǎn)錄和T7RNA聚合酶并摻入兩個(gè)引物以靶向其循環(huán)方案)。另外，Bpmp-72多核苷酸序列可通過(guò)連接激活的轉(zhuǎn)錄或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或修復(fù)鏈反應(yīng)核酸擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增。
Bpmp-72多核苷酸構(gòu)建體及載體根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供用于制備Bpmp-72氨基酸序列的方法，包括步驟(a)在使得Bpmp-72氨基酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)本文所述細(xì)胞；(b)回收表達(dá)的Bpmp-72序列。該方法還可伴有步驟(c)使用本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法層析氨基酸序列；和/或(d)將氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。
為了產(chǎn)生能夠表達(dá)Bpmp-72氨基酸序列的細(xì)胞，優(yōu)選將本發(fā)明的多核苷酸序列整合進(jìn)重組載體，然后將其引入宿主原核或真核細(xì)胞。
本發(fā)明提供的載體通常將包含編碼需要的氨基酸序列的Bpmp-72多核苷酸序列，并優(yōu)選轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列與氨基酸編碼序列有效連接。這類表達(dá)載體的實(shí)例描述于上文的Sambrook等(1989)或上文的Ausubel等(2001)。許多有用的載體為本領(lǐng)域已知并可獲得自如Stratagene、NewEngland Biolabs、Promega Biotech和其他的廠商。
表達(dá)載體還可包括例如復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列以及表達(dá)調(diào)控序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和必須的加工信息位點(diǎn)，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止子序列和mRNA穩(wěn)定序列。適當(dāng)時(shí)也可包含來(lái)自相同或相關(guān)種類的分泌多肽的分泌信號(hào)，其允許蛋白質(zhì)跨越和/或嵌入細(xì)胞膜，并因此獲得其功能拓?fù)鋵W(xué)，或從細(xì)胞分泌。這些載體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知并在例如上文的Sambrook等(1989)或上文的Ausubel等(2001)中討論的標(biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)制備。
選擇能夠在宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的適當(dāng)啟動(dòng)子和其他必須的載體序列，且適當(dāng)時(shí)可包括與外膜脂蛋白基因天然相關(guān)的那些。
如trp、lac和噬菌體啟動(dòng)子、tRNA啟動(dòng)子和糖酵解酶啟動(dòng)子之類的啟動(dòng)子可用于原核宿主。有用的酵母啟動(dòng)子包括金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(如烯醇酶或甘油醛-3-磷酸脫氫酶、負(fù)責(zé)利用麥芽糖和半乳糖的酶)的啟動(dòng)子區(qū)及其他啟動(dòng)子區(qū)。適合用于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子進(jìn)一步描述于Hitzeman等，EP 73,675A。適合的非天然哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子可包括來(lái)自SV40的早期或晚期啟動(dòng)子，或來(lái)自鼠莫洛尼白血病病毒、鳥(niǎo)肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳頭瘤病毒或多瘤的啟動(dòng)子。另外，該構(gòu)建體可與可擴(kuò)增的基因(例如DHFR)連接，從而可產(chǎn)生多拷貝的該基因。適當(dāng)?shù)脑鰪?qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控序列。
當(dāng)這些表達(dá)載體可自主復(fù)制時(shí)，它們還可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法插入宿主細(xì)胞的基因組而復(fù)制。
表達(dá)和克隆載體可能會(huì)包含選擇性標(biāo)記，編碼該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長(zhǎng)必須的蛋白質(zhì)的基因。該基因的存在確保了只有表達(dá)插入物的宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。通常的選擇基因編碼a)給予對(duì)抗生素或其他毒性物質(zhì)例如氨芐西林、新霉素、甲氨蝶呤等的抗性；b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷的不足，或c)提供不能得自復(fù)合培養(yǎng)基的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物(例如編碼用于細(xì)菌的D-丙氨酸消旋酶的基因)的蛋白質(zhì)。適當(dāng)?shù)倪x擇性標(biāo)記的選擇將依賴于宿主細(xì)胞，適用于不同宿主細(xì)胞的適當(dāng)標(biāo)記為本領(lǐng)域熟知。
包含Bpmp-72多核苷酸序列的載體可體外轉(zhuǎn)錄，且產(chǎn)生的RNA通過(guò)熟知的方法(例如通過(guò)注射)引入宿主細(xì)胞，或載體可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法直接引入宿主細(xì)胞，這些方法根據(jù)細(xì)胞宿主的類型變化，包括電穿孔法、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、侵染(其中載體為侵染劑，如逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組)和其他方法。Bpmp-72多核苷酸序列引入宿主細(xì)胞可通過(guò)任何本領(lǐng)域已知的方法完成，這些方法尤其包括上述的。
本發(fā)明還提供用Bpmp-72多核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括酵母、絲狀真菌、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物、鳥(niǎo)類、細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的人細(xì)胞。用作說(shuō)明的是，這些宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、假單胞菌(Pseudomonas)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈霉菌(Streptomyces)、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS 1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10和Sf9細(xì)胞。
可通過(guò)在合適的原核或真核宿主細(xì)胞中的載體或其他表達(dá)載體中表達(dá)Bpmp-72多核苷酸序列或其部分而制備大量本發(fā)明的Bpmp-72多核苷酸序列。最常用的原核宿主為大腸桿菌菌株，盡管也可使用其他的原核細(xì)胞，例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或假單胞菌。常用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系實(shí)例為VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和WI38、BHK、COS細(xì)胞系，盡管技術(shù)人員將明白其他的細(xì)胞系可是合適的。
還提供了含有通過(guò)同源重組事件體外修飾的Bpmp-72多核苷酸序列的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以使得Bpmp-72氨基酸序列更高表達(dá)，所述同源重組事件由在Bpmp-72氨基酸序列編碼序列中插入與之功能近似的表達(dá)調(diào)節(jié)序列組成。
Bpmp-72氨基酸序列的抗體根據(jù)本發(fā)明，可使用重組或化學(xué)合成產(chǎn)生的Bpmp-72氨基酸序列和片段或其其他衍生物或類似物(包括融合蛋白)作為免疫原，以產(chǎn)生識(shí)別Bpmp-72氨基酸序列的抗體。這些抗體包括但不僅限于多克隆、單克隆、嵌合體、單鏈、Fab片段和Fab表達(dá)文庫(kù)。
當(dāng)能夠與免疫系統(tǒng)的抗原識(shí)別分子(例如免疫球蛋白(抗體)或T細(xì)胞抗原受體)特異相互作用時(shí)，分子是“抗原性的”。抗原性氨基酸序列包含至少5個(gè)，并優(yōu)選至少大約10個(gè)氨基酸。分子的抗原部分可以是對(duì)抗體或T細(xì)胞受體識(shí)別免疫顯性的部分，或可以是通過(guò)將抗原性部分與用于免疫的載體分子綴合而產(chǎn)生針對(duì)該分子的抗體的部分。
“抗體”為任何免疫球蛋白，包括抗體及其與特異表位結(jié)合的片段。該術(shù)語(yǔ)包括多克隆、單克隆和嵌合抗體(所述最后者更詳細(xì)描述于U.S.專利No.4,816,397和4,816,567)，以及抗體的抗原結(jié)合部分，包括Fab、F(ab′)2和F(v)(包括單鏈抗體)。因此，“抗體分子”是指完整的免疫球蛋白分子和包含抗體結(jié)合位點(diǎn)的免疫球蛋白分子免疫活性部分?！翱贵w結(jié)合位點(diǎn)”為由輕鏈和重鏈可變區(qū)和特異結(jié)合抗原的高變區(qū)組成的抗體分子的結(jié)構(gòu)部分。
示范的抗體分子為完整的免疫球蛋白分子，基本上完整的免疫球蛋白分子和包含互補(bǔ)位的免疫球蛋白分子部分，包括本領(lǐng)域已知的部分，如Fab、Fab′、F(ab′)2和F(v)，這些部分在文中所述治療方法中優(yōu)選使用。
抗體分子的Fab和F(ab′)2部分分別通過(guò)木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)基本上完整的抗體分子通過(guò)熟知方法的蛋白水解反應(yīng)制備。見(jiàn)例如Theofilopolous等人的U.S.專利No.4,342,566。Fab′抗體分子部分也是眾所周知的，并且是通過(guò)用巰基乙醇還原F(ab′)2部分中連接兩個(gè)重鏈部分的二硫鍵，然后用例如碘乙酰胺的試劑烷基化產(chǎn)生的蛋白質(zhì)硫醇而產(chǎn)生。本文優(yōu)選包含完整抗體分子的抗體。
短語(yǔ)“單克隆抗體”是指只有一種能與特定抗原免疫反應(yīng)的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體。單克隆抗體因而通常顯示對(duì)與其免疫反應(yīng)的任何抗原的單一結(jié)合親和力。因此單克隆抗體可包含具有多種各自對(duì)不同抗原免疫專一的抗體結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子(例如雙重特異性抗體)。
術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指增強(qiáng)對(duì)抗原免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑可作為緩慢釋放抗原的組織儲(chǔ)藏所作用，并還可作為非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣系統(tǒng)激活劑作用[Hood等《Immunology》中384頁(yè)，第二版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，California(1984)]。通常，沒(méi)有佐劑時(shí)抗原單獨(dú)的原初攻擊不能引起體液或細(xì)胞的免疫反應(yīng)。佐劑包括但不僅限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇(pluronic polyols)、聚陰離子、肽、油或碳?xì)浠衔锶閯⒊卓组恃{(lán)蛋白、二硝基酚和潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。優(yōu)選佐劑為可藥用的。
本領(lǐng)域已知的多種方法可用于產(chǎn)生Bpmp-72氨基酸序列或其片段、衍生物或類似物的多克隆抗體。產(chǎn)生抗體時(shí)，可通過(guò)注射Bpmp-72氨基酸序列或其衍生物(例如片段或融合蛋白質(zhì))免疫多種宿主動(dòng)物，包括但不僅限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個(gè)實(shí)施方案中，Bpmp-72氨基酸序列或其片段可與免疫原性載體綴合，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔槭血藍(lán)蛋白(KLH)?？墒褂枚喾N佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答，基于宿主種類包括但不僅限于弗氏(完全和不完全)、礦物膠(如氫氧化鋁)、表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔槭血藍(lán)蛋白、二硝基酚和可能有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。
為了制備直接針對(duì)Bpmp-72氨基酸序列或其片段、類似物或衍生物的單克隆抗體，可使用任何提供的用于從培養(yǎng)的連續(xù)細(xì)胞系中產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)。這些技術(shù)包括但不僅限于最初由Kohler等(1975)Nature，256495-497發(fā)展的雜交瘤技術(shù)、三源雜交瘤技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)[Kozbor等(1983)《Immunology Today》，472]和產(chǎn)生人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)[Cole等(1985)在《Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy》中，77-96頁(yè)，Alan R.Liss，Inc.]。永生化的、產(chǎn)抗體的細(xì)胞系可通過(guò)融合之外的技術(shù)產(chǎn)生，例如用致癌DNA直接轉(zhuǎn)化B淋巴細(xì)胞，或用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)染。見(jiàn)例如U.S.專利No.4,341,761；4,399,121；4,427,783；4,444,887；4,451,570；4,466,917；4,472,500；4,491,632和4,493,890。
在另一本發(fā)明的實(shí)施方案中，可使用最近的技術(shù)從無(wú)菌動(dòng)物中產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明，可使用雞或豬抗體并可使用雞或豬雜交瘤或通過(guò)用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化B細(xì)胞而獲得。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明，可使用發(fā)展用于通過(guò)剪接來(lái)自小鼠特異性針對(duì)Bpmp-72氨基酸序列的抗體分子的基因和來(lái)自有適當(dāng)生物學(xué)活性的抗體分子的基因而產(chǎn)生“嵌合抗體”的技術(shù)[Morrison等(1984)J.Bacteriol.，159-870；Neuberger等(1984)Nature，312604-608；Takeda等，(1985)Nature，314452-454]；這些抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因?yàn)榕c異體的抗體相比該抗體自身更少可能引起免疫應(yīng)答，特別是過(guò)敏反應(yīng)，這些嵌合抗體優(yōu)選用于治療腸疾病或紊亂(下述)。
根據(jù)本發(fā)明，用于產(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(U.S.專利4,946,778)可適用于產(chǎn)生Bpmp-72氨基酸序列特異的單鏈抗體。本發(fā)明的另一實(shí)施方案使用構(gòu)建Fab表達(dá)文庫(kù)的技術(shù)(Huse等，(1989)Science，2461275-1281)以允許快速和簡(jiǎn)單鑒定具有需要的對(duì)Bpmp-72氨基酸序列或其衍生物或類似物特異性的單克隆Fab片段。
包含抗體分子獨(dú)特型的抗體片段可通過(guò)已知技術(shù)產(chǎn)生。例如，這些片段包括但不僅限于可通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab′)2片段；可通過(guò)還原F(ab′)2片段二硫鍵產(chǎn)生的Fab′片段和可通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
制備抗體時(shí)，可通過(guò)本領(lǐng)域已知技術(shù)篩選所需抗體，例如放射免疫測(cè)定、ELISA、“夾層”免疫測(cè)定、免疫放射測(cè)定、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測(cè)定、原位免疫測(cè)定(例如使用膠體金、酶或放射性同位素標(biāo)簽)、Western印跡、沉淀反應(yīng)、凝集測(cè)定(例如凝膠凝集測(cè)定、血細(xì)胞凝集測(cè)定)、補(bǔ)體結(jié)合測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、A蛋白測(cè)定和免疫電泳測(cè)定等。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)第一抗體上的標(biāo)簽檢測(cè)抗體結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)第二抗體或試劑與第一抗體的結(jié)合檢測(cè)第一抗體。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記第二抗體。本領(lǐng)域已知許多用于免疫測(cè)定的檢測(cè)方法并包含在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，為了選擇識(shí)別Bpmp-72氨基酸序列的特異表位的抗體，可測(cè)定產(chǎn)生的雜交瘤以找到結(jié)合包含該表位的Bpmp-72氨基酸序列片段的產(chǎn)物。為了選擇對(duì)來(lái)自具體種類動(dòng)物的Bpmp-72氨基酸序列特異的抗體，可基于與該種動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的或分離自該種動(dòng)物細(xì)胞的Bpmp-72氨基酸序列的陽(yáng)性結(jié)合進(jìn)行選擇。
診斷根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明提供使用Bpmp-72氨基酸序列和/或來(lái)自于其的抗體和/或Bpmp-72多核苷酸序列檢測(cè)短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)的存在的診斷和預(yù)后方法。
通常使用得自動(dòng)物(如雞或豬)的生物樣品實(shí)施診斷和預(yù)后方法。“樣品”指取自動(dòng)物的懷疑含有短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)多核苷酸或多肽的組織或流體樣品，包括但不僅限于如血漿、血清、糞便樣品、組織和體外細(xì)胞培養(yǎng)物組分的樣品。
基于多肽/抗體的診斷本發(fā)明提供檢測(cè)樣品中Bpmp-72氨基酸序列的存在的方法，包括(a)在允許形成含有抗體和Bpmp-72氨基酸序列的反應(yīng)復(fù)合物的條件下使懷疑含有Bpmp-72氨基酸序列的樣品(優(yōu)選與固體支持物結(jié)合)與特異性結(jié)合Bpmp-72氨基酸序列的抗體接觸；和(b)檢測(cè)樣品中形成的含有抗體和Bpmp-72氨基酸序列的反應(yīng)復(fù)合物，其中檢出形成反應(yīng)復(fù)合物表示樣品中存在Bpmp-72氨基酸序列。
優(yōu)選地，本方法中使用的抗體來(lái)自親和純化的多克隆抗體，并更優(yōu)選單克隆抗體。另外，本文中使用的抗體分子優(yōu)選為Fab、Fab’、F(ab’)2或F(v)部分的形式或完整抗體分子的形式。
特別優(yōu)選的基于以上方法檢測(cè)短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的方法包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、放射免疫測(cè)定、免疫放射測(cè)定和免疫酶測(cè)定，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾層方法。
特別有用的三種這樣的方法方便利用了標(biāo)記可檢測(cè)標(biāo)記的Bpmp-72氨基酸序列(或其片段)、標(biāo)記可檢測(cè)標(biāo)記的Ab1抗體或標(biāo)記可檢測(cè)標(biāo)記的Ab2抗體?？梢杂靡韵碌仁礁爬ㄟ@些方法，其中星號(hào)表示該部分是標(biāo)記的，“AA”代表Bpmp-72氨基酸序列A.AA*+Ab1＝AA*Ab1B.AA+Ab*1＝AA Ab1*C.AA+Ab1+Ab2*＝Ab1AA Ab2*本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些方法及其應(yīng)用，因此可以在本發(fā)明范圍內(nèi)使用這些方法。“競(jìng)爭(zhēng)性”方法(方法A)描述于U.S.專利No.3654090和3850752。方法B代表熟知的競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定技術(shù)。方法C(“夾層”方法)描述于U.S.專利No.RE31006和4016043。還已知其他方法，如“雙抗體”或“DASP”方法。
在每種情況下，Bpmp-72氨基酸序列與一個(gè)或多個(gè)抗體或結(jié)合配偶體形成復(fù)合物，并用可檢測(cè)標(biāo)記對(duì)復(fù)合物的一個(gè)成員進(jìn)行標(biāo)記?？梢酝ㄟ^(guò)適用于檢測(cè)標(biāo)記的方法測(cè)定形成復(fù)合物這一事實(shí)，并在需要時(shí)檢測(cè)其數(shù)量。
從上文中可以看出，Ab2的特征性質(zhì)是其與Ab1反應(yīng)。這是因?yàn)樵诓溉閯?dòng)物物種中產(chǎn)生的Ab1在另一物種中作為抗原用于產(chǎn)生抗體Ab2。例如，可以用兔抗體作為抗原在山羊中產(chǎn)生Ab2。從而Ab2為山羊中產(chǎn)生的抗兔抗體。就本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)而言，Ab1指第一抗體，Ab2指第二抗體或抗Ab1抗體。
這些研究中最普遍使用的標(biāo)記為放射性元素、酶、在暴露于紫外光時(shí)發(fā)光的化學(xué)品等等。
大量的熒光材料是已知的并可作為標(biāo)記使用。它們包括如熒光素、羅丹明和金胺。具體的檢測(cè)材料為在山羊中制備并通過(guò)異硫氰酸酯與熒光素綴合的抗兔抗體。
也可以用放射性元素或酶標(biāo)記氨基酸序列或其結(jié)合配偶體?？梢杂媚壳翱捎玫娜魏渭夹g(shù)流程檢測(cè)放射性標(biāo)記。優(yōu)選的同位素可以選自3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
可以類似的使用酶標(biāo)記，并用目前使用的任何色度法、分光光度法、熒光分光光度法、電流法或氣體定量技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)與橋接分子如碳二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛等反應(yīng)將酶與選擇的顆粒綴合。許多可用于這些方法的酶是已知并可利用的。優(yōu)選的酶為過(guò)氧化物酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶加過(guò)氧化物酶，以及堿性磷酸酶。參考U.S.專利No.3654090、3850752和4016043作為公開(kāi)了其他標(biāo)記材料和方法的實(shí)例。
本發(fā)明還提供檢測(cè)生物樣品中腸螺旋體病抗體的方法，包括(a)提供Bpmp-72氨基酸序列或其片段；(b)在允許形成抗體-抗原復(fù)合物的條件下將生物樣品與所述氨基酸序列孵育；和(c)檢測(cè)是否形成了含有所述氨基酸序列的抗體-抗原復(fù)合物。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中提供了評(píng)估生物樣品中Bpmp-72抗體水平的體外方法，包括(a)根據(jù)上文提到的方法檢測(cè)生物樣品中形成的反應(yīng)復(fù)合物；和(b)評(píng)估形成的反應(yīng)復(fù)合物的量，其中復(fù)合物的量對(duì)應(yīng)于生物樣品中Bpmp-72抗體的水平。
另外還提供了篩選動(dòng)物宿主中與短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)相關(guān)疾病的治療方法的體外方法，包括如上文所述評(píng)估一系列生物樣品中Bpmp-72氨基酸序列的水平，所述生物樣品在不同時(shí)間點(diǎn)取自接受該治療方法的動(dòng)物宿主。
基于核酸的診斷本發(fā)明還提供檢測(cè)生物樣品中短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)存在與否的方法，所述方法包括以下步驟(a)在適當(dāng)?shù)碾s交條件下使生物樣品與含有本發(fā)明Bpmp-72多核苷酸序列的探針或引物接觸；和(b)檢測(cè)探針或引物和樣品中的核酸形成的任何雙鏈體。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，可以使用已知技術(shù)直接擴(kuò)增來(lái)自生物樣品的Bpmp-72多核苷酸序列并隨后檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列的存在來(lái)檢測(cè)短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)。
在本發(fā)明的一種形式中，通過(guò)PCR擴(kuò)增靶核酸序列并使用上文提到的任何具體方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列的存在的其他有用的診斷技術(shù)包括但不僅限于1)等位基因特異性PCR；2)單鏈形成測(cè)定；3)變性梯度凝膠電泳；4)核糖核酸酶保護(hù)測(cè)定；5)使用識(shí)別核苷酸錯(cuò)配的蛋白質(zhì)，如大腸桿菌mutS蛋白；6)等位基因特異性寡核苷酸；和7)熒光原位雜交。
除了上述方法以外，還可以使用常規(guī)探針技術(shù)檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列。當(dāng)用探針檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列的存在時(shí)，需要時(shí)可以處理待分析的生物樣品(如血液或血清)以提取核酸。可以用多種方法制備樣品多核苷酸序列以便于檢測(cè)靶序列，如變性、限制性消化、電泳或斑點(diǎn)印跡。通常樣品多核苷酸序列的靶區(qū)域必須至少部分是單鏈的，以便與探針的尋靶序列形成雜交體。如果序列是天然單鏈的，則不需要變性。然而，如果序列是雙鏈的，序列很可能需要變性。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行變性。
在促進(jìn)探針中的靶序列和樣品中假定的Bpmp-72多核苷酸序列形成穩(wěn)定雜交體的條件下孵育樣品多核苷酸序列和探針。優(yōu)選地，使用高嚴(yán)格條件以防止假陽(yáng)性。
如果進(jìn)行檢測(cè)的話，通常使用標(biāo)記的探針檢測(cè)得到的雜交體。另外，探針可以是未標(biāo)記的，但是可以通過(guò)與標(biāo)記的配體直接或間接的特異性結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)。合適的標(biāo)記及標(biāo)記探針和配體的方法為本領(lǐng)域已知，包括如可以通過(guò)已知技術(shù)(如切口平移、隨機(jī)引物或激酶)摻入的放射性標(biāo)記、生物素、熒光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(如二氧雜環(huán)丁烷，特別是觸發(fā)的二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體等等。該基本方案的變化為本領(lǐng)域公知，包括便于從外來(lái)材料中分離待檢測(cè)的雜交體和/或增強(qiáng)來(lái)自標(biāo)記部分的信號(hào)的變化。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還考慮在本發(fā)明的核酸探針測(cè)定法中使用能夠檢測(cè)Bpmp-72多核苷酸序列的核酸探針的混合物。因此，在檢測(cè)細(xì)胞樣品中Bpmp-72多核苷酸序列的存在的實(shí)例中，使用了多于一種的與Bpmp-72多核苷酸序列互補(bǔ)的探針，不同探針的數(shù)目具體可以是2、3或5種不同的核酸探針序列。
核酸陣列——“DNA芯片”技術(shù)還可以將(優(yōu)選為探針形式的)Bpmp-72多核苷酸序列固定于固相支持物來(lái)檢測(cè)短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)?；蛘連pmp-72多核苷酸序列可以形成DNA分子文庫(kù)的一部分，所述文庫(kù)可用于同時(shí)檢測(cè)來(lái)自短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的大量不同基因。在本發(fā)明的另一種形式中，可以將Bpmp-72多核苷酸序列與其他(如來(lái)自其他細(xì)菌或病毒的)多核苷酸序列固定于固體支持物上，其中以允許鑒定結(jié)合于固體支持物上的短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)和/或任何其他多核苷酸序列的存在的方式進(jìn)行固定。
本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了產(chǎn)生DNA分子文庫(kù)的技術(shù)。通常多數(shù)現(xiàn)有技術(shù)描述使用如掩蔽技術(shù)在固體基質(zhì)的多個(gè)離散位置建立多種序列變換來(lái)合成單鏈核酸分子文庫(kù)。U.S.專利No.5873832描述了基于極大規(guī)模集成技術(shù)產(chǎn)生固定于硅基質(zhì)的DNA陣列的改進(jìn)方法。具體而言，U.S.專利No.5873832描述了稱為“貼片(tilling)”的策略，在可用于產(chǎn)生本發(fā)明的固化DNA文庫(kù)的基質(zhì)空間的特定位置合成特定的探針組。U.S.專利No.5873832還提供可以使用的早期技術(shù)的參考。因此可以在基質(zhì)表面原位合成多核苷酸序列探針。
另外，可以脫離固體基質(zhì)合成單鏈分子，并將每一預(yù)制的序列應(yīng)用于固體基質(zhì)的離散位置。例如，可以使用裝備了pin或pizo電子裝置的自動(dòng)裝置直接將多核苷酸序列印在基質(zhì)上。
文庫(kù)序列通常固定于固體基質(zhì)上或固體基質(zhì)的離散部分?；|(zhì)可以是疏松的(以在基質(zhì)內(nèi)進(jìn)行固定)或基本非疏松的，在這種情況下文庫(kù)序列一般固定于基質(zhì)的表面。固體基質(zhì)可以由多肽可直接或間接結(jié)合的材料制成。合適的固體基質(zhì)的實(shí)例包括平板玻璃、硅晶片(silicon wafer)、云母、陶瓷和有機(jī)多聚體如塑料(包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯)。還可以使用半透膜，如廣泛使用的硝酸纖維素或尼龍膜?？梢詫胪改ぐ裨趫?jiān)硬的固體(如玻璃)表面?？梢匀芜x地用金屬(如金、鉑或其他過(guò)渡金屬)層覆蓋表面。合適的固體基質(zhì)的具體實(shí)例為市售的BiaCoreTM芯片(Pharmacia Biosensers)。
優(yōu)選的，固體基質(zhì)通常為具有硬或半硬表面的材料。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基質(zhì)的至少一個(gè)表面應(yīng)基本是平的，盡管在一些實(shí)施方案中可能需要以如隆起的區(qū)域或蝕刻槽將不同多聚體的合成區(qū)物理上分開(kāi)。還優(yōu)選固體基質(zhì)適于一般從50到100μm的離散區(qū)中的DNA序列高密度應(yīng)用，給定10000到40000點(diǎn)/cm-2的密度。
固體基質(zhì)可便利地分成切片。這可通過(guò)如光刻等技術(shù)或應(yīng)用疏水墨如基于特氟隆(telflon)的墨(Cel-line，USA)實(shí)現(xiàn)。
文庫(kù)中每一不同成員定位的離散位置可以是任何方便的形狀，如環(huán)形、矩形、橢圓形、楔形等等。
可以通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)方法將多核苷酸序列附著于基質(zhì)。多核苷酸序列可以通過(guò)文庫(kù)序列結(jié)合的分子層附著于基質(zhì)。例如，可以用生物素標(biāo)記多核苷酸序列并用抗生物素蛋白和/或鏈霉抗生物素包被基質(zhì)。使用生物素化的多核苷酸序列的一個(gè)便利的特征是與固體基質(zhì)的偶聯(lián)效率容易測(cè)定。由于多核苷酸序列可能與一些固體基質(zhì)不充分結(jié)合，所以提供固體基質(zhì)(如玻璃)和核苷酸序列之間的化學(xué)界面經(jīng)常是必要的。合適的化學(xué)界面的實(shí)例包括乙二醇。另一實(shí)例是使用包被聚賴氨酸的玻璃，然后使用標(biāo)準(zhǔn)程序化學(xué)修飾聚賴氨酸以便引入親和配體。使用偶聯(lián)劑將分子附著于固體基質(zhì)表面的其他方法為本領(lǐng)域公知，參閱如WO98/49557。
可以通過(guò)多種方法測(cè)定互補(bǔ)多核苷酸序列與固化的核酸文庫(kù)的結(jié)合，如所結(jié)合多核苷酸序列光學(xué)特性的變化(即通過(guò)使用溴化乙啶)或通過(guò)使用標(biāo)記的核酸如用熒光基團(tuán)標(biāo)記的多肽。無(wú)需使用標(biāo)記的其他檢測(cè)技術(shù)包括光學(xué)技術(shù)如光聲學(xué)(optoacoustics)、反射劑測(cè)量法、橢圓對(duì)稱法和表面等離子共振(參閱WO97/49989)。
因此，本發(fā)明提供其上固定了至少一種本發(fā)明的多核苷酸(優(yōu)選兩種或多種本發(fā)明的不同序列)的固體基質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中固體基質(zhì)另外含有來(lái)自非Bpmp-72多核苷酸序列的基因的多核苷酸序列。
治療用途本發(fā)明還可用于預(yù)防劑和治療劑，所述預(yù)防劑和治療劑用于刺激動(dòng)物(如雞和豬)中體液和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，從而提供對(duì)短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)定居的保護(hù)。短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的天然感染誘導(dǎo)針對(duì)Bpmp-72的循環(huán)抗體效價(jià)。因此，Bpmp-72氨基酸序列或其部分可能形成全身或口服給藥的預(yù)防劑或治療劑的基礎(chǔ)，以提供對(duì)腸螺旋體病的保護(hù)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供了以治療有效劑量與可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合的Bpmp-72氨基酸序列或其片段或與所述氨基酸序列結(jié)合的抗體或本文描述的多核苷酸序列。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”指足以使動(dòng)物宿主的活性、功能和應(yīng)答的臨床顯著缺乏減少至少約15％、優(yōu)選至少50％、更優(yōu)選至少90％并最優(yōu)選完全阻止的量。另外，治療有效劑量足以在動(dòng)物宿主中引起臨床顯著癥狀的改善。
術(shù)語(yǔ)“可藥用”指分子實(shí)體和綴合物是生理耐受的，并且在施用于動(dòng)物時(shí)一般不產(chǎn)生過(guò)敏或類似的不良反應(yīng)如心嘈等。術(shù)語(yǔ)“載體”指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或運(yùn)載體。這些藥物載體可以是無(wú)菌液體如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來(lái)源的油如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。優(yōu)選使用水或鹽溶液和葡萄糖水和甘油溶液作為載體，特別是用于可注射溶液。合適的藥物載體描述于Martin《Remington’sPharmaceutical Sciences》，第十八版，Mack Publishing Co.，Easton，PA，(1990)。
在本發(fā)明的另一種形式中提供了藥物組合物，所述藥物組合物與可藥用稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體一起含有治療有效劑量的Bpmp-72氨基酸序列或其類似物、片段或衍生物或抗體。這些組合物包含多種緩沖容量、pH和離子強(qiáng)度的稀釋劑(如Tris-鹽酸、乙酸、磷酸)和添加劑，如洗滌劑和增溶劑(如吐溫80、聚山梨酯80)、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉)、防腐劑(如thimersol、苯甲醇)和填充物質(zhì)(如半乳糖、甘露醇)。材料可摻入多聚體化合物(如聚乳酸、聚乙醇酸)的粉粒制劑中或裝入脂質(zhì)體中。這些組合物可以影響本發(fā)明蛋白質(zhì)和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放的速率和體內(nèi)清除的速率。參閱如本文中引入作為參考文獻(xiàn)的Martin《Remington’s Pharmaceutical Sciences》，第十八版，(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712頁(yè)。組合物可以液體形式或干粉形式(如凍干的形式)制備。
給藥應(yīng)該理解，可以以本領(lǐng)域已知的任何方法施用本發(fā)明提供的組合物。優(yōu)選地，通過(guò)注射、經(jīng)口或經(jīng)肺或鼻途徑施用待施用的藥物組合物。更優(yōu)選通過(guò)靜脈、動(dòng)脈、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥途徑遞送得到的氨基酸序列或抗體。另外，可以通過(guò)鼻或口腔給藥施用得到的(通常為配制的)Bpmp-72氨基酸序列或抗體。
基于多核苷酸的療法本發(fā)明還提出本發(fā)明的多核苷酸序列以及可與編碼本發(fā)明Bpmp-72氨基酸序列的多核苷酸序列雜交的反義和核酶多核苷酸序列用于生產(chǎn)調(diào)控多毛結(jié)腸短螺旋體相關(guān)疾病的藥劑的用途。
編碼治療方法中使用的反義構(gòu)建體或核酶的多核苷酸序列需要以裸核酸構(gòu)建體形式直接施用?？赏ㄟ^(guò)若干已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如包括使用轉(zhuǎn)染劑)增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)裸核酸構(gòu)建體的攝取。這些轉(zhuǎn)染劑的實(shí)例包括陽(yáng)離子試劑(如磷酸鈣和DEAE-葡聚糖)和脂質(zhì)體(如lipofectamTM和transfectamTM)。一般將核酸構(gòu)建體與轉(zhuǎn)染劑混合產(chǎn)生組合物。
另外反義構(gòu)建體或核酶可以與可藥用載體或稀釋劑組合產(chǎn)生藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲鹽溶液，如磷酸緩沖鹽水。可以將組合物配制來(lái)用于胃腸外、肌內(nèi)、靜脈、皮下、口腔或皮膚施用。
由于熟練的從業(yè)者能夠容易地對(duì)任何具體動(dòng)物和疾病決定最優(yōu)給藥途徑和任何劑量，因此所描述的給藥途徑僅作為指導(dǎo)。
藥物篩選測(cè)定本發(fā)明還提供適于鑒定與Bpmp-72氨基酸序列結(jié)合的物質(zhì)的測(cè)定法。另外，還提供了適于鑒定干擾Bpmp-72氨基酸序列的物質(zhì)的測(cè)定法。還提供了測(cè)試候選物質(zhì)功效的測(cè)定法，此候選物質(zhì)在全細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中于完整細(xì)胞上進(jìn)行的初級(jí)體外測(cè)定中被鑒定。
鑒定與Bpmp-72氨基酸序列結(jié)合的物質(zhì)的一種測(cè)定法類型涉及將固定于固體支持物上的Bpmp-72氨基酸序列與候選物質(zhì)接觸，并測(cè)定Bpmp-72氨基酸序列與候選物質(zhì)是否和/或以何種程度互相結(jié)合。另外，可以固定候選物質(zhì)而不固定Bpmp-72氨基酸序列。
在優(yōu)選的測(cè)定方法中，Bpmp-72氨基酸序列固定于珠(如瓊脂糖珠)上。為達(dá)到該目的，一般在細(xì)菌、酵母或高等真核細(xì)胞系中將組分表達(dá)為GST融合蛋白并使用谷胱甘肽-瓊脂糖珠從粗細(xì)胞提取物中純化GST-融合蛋白。然后測(cè)定候選物質(zhì)與固定的Bpmp-72氨基酸序列的結(jié)合。這種類型的測(cè)定法在本領(lǐng)域中稱為GST pulldown測(cè)定法。同樣，可以固定候選物質(zhì)而不固定Bpmp-72氨基酸序列。
還可以使用固定一種組分(如Ni-NTA瓊脂糖和六組氨酸標(biāo)簽組分)的不同的親和純化系統(tǒng)進(jìn)行這種類型的測(cè)定法。
可以通過(guò)多種本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定Bpmp-72氨基酸序列與候選物質(zhì)的結(jié)合。例如，可以(用如放射性標(biāo)記、表位標(biāo)簽或酶-抗體綴合物)標(biāo)記非固定的組分。另外，可以通過(guò)免疫檢測(cè)技術(shù)測(cè)定結(jié)合。例如，可以對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行Western印跡并用檢測(cè)非固定組分的抗體檢測(cè)印跡。還可以使用ELISA技術(shù)。
通常以1到1000nmol/ml的終濃度加入候選物質(zhì)，更優(yōu)選1到100nmol/ml。對(duì)于抗體的情況，一般使用從100到500μg/ml的終濃度，更優(yōu)選從200到300μg/ml。
因此，本發(fā)明提供篩選藥物的方法，所述方法包括使該試劑與Bpmp-72氨基酸序列或其片段接觸，并通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定(i)試劑和Bpmp-72氨基酸序列或片段的復(fù)合物的存在，或(ii)Bpmp-72氨基酸序列或其片段和配體之間的復(fù)合物的存在。在這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法中，通常標(biāo)記Bpmp-72氨基酸序列或片段。將游離的Bpmp-72氨基酸序列或片段與蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復(fù)合物中存在的Bpmp-72氨基酸序列或片段中分開(kāi)，游離(非復(fù)合物)的標(biāo)記量是對(duì)測(cè)試試劑與Bpmp-72氨基酸序列的結(jié)合或其對(duì)Bpmp-72氨基酸序列配體結(jié)合干擾的測(cè)量。
藥物篩選的另一種技術(shù)提供高通量篩選對(duì)Bpmp-72氨基酸序列具有合適的結(jié)合親和力的化合物，并描述于1984年9月13日出版的Geysen，PCT公布申請(qǐng)WO 84/03564。簡(jiǎn)言之，在固體基質(zhì)(如塑料針或其他表面)上合成大量不同的小肽測(cè)試化合物。使肽測(cè)試化合物與Bpmp-72氨基酸序列反應(yīng)并洗滌。通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法檢測(cè)結(jié)合的Bpmp-72氨基酸序列。
本發(fā)明還考慮使用競(jìng)爭(zhēng)性藥物篩選測(cè)定法，其中能夠特異性結(jié)合Bpmp-72氨基酸序列的抗體與測(cè)試化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Bpmp-72氨基酸序列或其片段?？梢砸赃@種方式使用抗體檢測(cè)分享一個(gè)或多個(gè)Bpmp-72氨基酸序列的抗原決定簇的任何肽的存在。
試劑盒本發(fā)明還提供篩選懷疑感染短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的動(dòng)物或確認(rèn)動(dòng)物感染了短螺旋體物種(如多毛結(jié)腸短螺旋體)的試劑盒，所述試劑盒至少包含與Bpmp-72多核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列，其包裝于合適的容器中并帶有使用說(shuō)明書(shū)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以制備適于專業(yè)人員使用的試劑盒以在懷疑感染的動(dòng)物中測(cè)定短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)是否存在或定量測(cè)量短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)感染。根據(jù)上文討論的測(cè)試技術(shù)，取決于所選擇方法(如“競(jìng)爭(zhēng)性”、“夾層”、“DASP”等等)，一類這種試劑盒至少含有標(biāo)記的Bpmp-72氨基酸序列或其結(jié)合配偶體(如其特異性抗體)和說(shuō)明書(shū)。試劑盒還可以含有輔助試劑，如緩沖液、穩(wěn)定劑等。
因此，可以制備試劑盒用于證明短螺旋體物種(包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體)的存在，所述試劑盒包含(a)預(yù)決定量的至少一種標(biāo)記的免疫化學(xué)反應(yīng)性組分，所述組分通過(guò)將本發(fā)明Bpmp-72氨基酸序列或其特異性結(jié)合配偶體直接或間接附著于可檢測(cè)標(biāo)記得到；(b)其他試劑；和(c)所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
更具體而言，診斷試劑測(cè)試盒可以包含(a)已知量的上文所述的Bpmp-72氨基酸序列(或結(jié)合配偶體)，一般與固相結(jié)合形成免疫吸附劑或者與適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽結(jié)合，或者存在多種這樣的終產(chǎn)物等；(b)(必要時(shí)存在)其他試劑；和(c)所述試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)。
在另一種變化中，可以制備所述試劑盒并用于上文所提到的目的，所述試劑盒根據(jù)預(yù)確定的方案(如“競(jìng)爭(zhēng)性”、“夾層”、“雙抗體”等等)操作，并含有(a)通過(guò)將Bpmp-72氨基酸序列與可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)得到的標(biāo)記組分；
(b)一種或多種額外的免疫化學(xué)試劑，其中至少一種試劑為配體或固定的配體，配體選自(i)能與標(biāo)記組分(a)結(jié)合的配體(ii)能與標(biāo)記組分(a)的結(jié)合配偶體結(jié)合的配體；(iii)能與至少一種待測(cè)組分結(jié)合的配體；(iv)能與至少一種待測(cè)組分的至少一種結(jié)合配偶體結(jié)合的配體；和(c)實(shí)施檢測(cè)和/或測(cè)定Bpmp-72氨基酸序列與其特異性結(jié)合配偶體之間的免疫化學(xué)反應(yīng)中一種或多種組分的操作的說(shuō)明書(shū)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳模式在以下的非限制性實(shí)施例中更詳細(xì)的描述了本發(fā)明的其他特征。然而應(yīng)當(dāng)理解，該詳細(xì)描述僅包含示例本發(fā)明的目的。不應(yīng)以任何方式理解為限制如上文公開(kāi)的本發(fā)明的寬泛描述。
在以下實(shí)施例中未明確描述的分子克隆、免疫和蛋白質(zhì)化學(xué)方法報(bào)道于文獻(xiàn)中，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。描述本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)的一般教材包括如Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)、Glover編，《DNA CloningA Practical Approach》，I和II卷，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.(1985)和F.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhl，K.《Current protocols in molecularbiology》.Greene Publishing Associates/Wiley I ntersciences，New York(2001)。
實(shí)施例1編碼多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外包膜蛋白的基因的鑒定和表征方法產(chǎn)生用于篩選的多克隆抗體(AHPS)
將取自用多毛結(jié)腸短螺旋體菌株1648超免疫的豬的血清(1.0ml)加入含有1012個(gè)豬痢疾短螺旋體B78T、Brachyspira intemedia PWS/AT、良性短螺旋體(Brachyspira innocens)B256T、Brachyspira murdochii 56-150T、Brachyspira aalborgi 513T和大腸桿菌JM109細(xì)胞的細(xì)胞懸液(9.0ml)中。將漿體在4℃連續(xù)首尾(end-to-end)混合孵育過(guò)夜。通過(guò)在4℃以5000×g離心20分鐘取下吸收到細(xì)胞上的抗體。取出上清液并用于重懸含有1012個(gè)豬痢疾短螺旋體B78T、Brachyspira intemedia PWS/AT、良性短螺旋體B256T、Brachyspira murdochii 56-150T、Brachyspira aalborgi 513T和大腸桿菌JM109細(xì)胞的混合細(xì)胞沉淀。將漿體在4℃連續(xù)首尾混合孵育過(guò)夜。通過(guò)在4℃以5000×g離心20分鐘再次移出吸收到細(xì)胞上的抗體。將吸收過(guò)程再重復(fù)兩次。終吸收后，將吸收的超免疫豬血清(AHPS)分成(50μl的)等分式樣并保存于-80℃。
篩選基因組文庫(kù)通過(guò)將局部限制性酶切的高分子量DNA(2-3kb)連接進(jìn)λ噬菌體臂并使用Gigapack II提取物(Stratagene)包裝噬菌體顆粒，產(chǎn)生多毛結(jié)腸短螺旋體P43/6/78基因組文庫(kù)。在大腸桿菌中擴(kuò)增得到的噬菌體文庫(kù)并使用標(biāo)準(zhǔn)plaque-lift方法用稀釋的AHPS免疫篩選。在的三輪免疫篩選后將4個(gè)克隆(命名為AHP1-4)切割進(jìn)質(zhì)粒中。
在大腸桿菌中表達(dá)編碼72kDa外包膜蛋白(Bpmp-72)的基因?qū)⑷菁{了重組質(zhì)粒的大腸桿菌克隆劃線到添加了卡那霉素(50mg/L)的LB瓊脂平板上并在37℃孵育過(guò)夜。將單克隆接種到添加了卡那霉素(50mg/l)、PMSF(1mM)和IPTG(1mM)的LB液體培養(yǎng)基(10ml)。在37℃將液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物振蕩孵育12小時(shí)。將每一培養(yǎng)物的等分式樣(1.0ml)以2500×g離心15分鐘并洗滌三次。將洗滌過(guò)的細(xì)胞沉淀重懸于PBS(100μl)中準(zhǔn)備用于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡。
Bpmp-72蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析涉及使用不連續(xù)Tris-甘氨酸緩沖液系統(tǒng)的電泳分離。將蛋白質(zhì)樣品的等分式樣(30μl)與10μl 4×樣品處理緩沖液(250mM Tris-鹽酸(pH 6.0)、8％(v/v)SDS、200mM DTT、40％(v/v)甘油和0.04％(v/v)溴酚藍(lán))混合。在將樣品(10μl)裝入凝膠的孔中之前將樣品煮5分鐘。凝膠包含積層膠(125mM Tris-鹽酸ph 6.8、4％(w/v)的丙烯酰胺、0.15％(w/v)的雙丙烯酰胺和0.1％(w/v)的SDS)和分離膠(375mMTris-鹽酸ph 8.8、12％(w/v)的丙烯酰胺、0.31％(w/v)的雙丙烯酰胺和0.1％(w/v)的SDS)。通過(guò)加入0.1％(v/v)TEMED和0.05％(w/v)的新制備的硫酸銨溶液使膠聚合并倒入雙板槽(Bio-Rad)中。室溫(RT)下以150V電泳樣品直至溴酚藍(lán)染料前端到達(dá)凝膠底部。將預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)與樣品平行電泳以估計(jì)分子量。電泳后，立即將膠電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上用于Western印跡。
Western印跡分析使用Towbin轉(zhuǎn)移緩沖系統(tǒng)將分開(kāi)的蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。電泳后，將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％(v/v)甲醇，pH 8.3)中平衡15分鐘。使用mini-Protean轉(zhuǎn)移印跡設(shè)備(Bio-Rad)將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)裝配凝膠固定器后，在4℃以30V轉(zhuǎn)移過(guò)夜。在室溫下用含有5％(w/v)的脫脂乳粉的10ml Tris緩沖鹽溶液(TBS)封閉含有分離蛋白質(zhì)的新轉(zhuǎn)移硝酸纖維素膜1小時(shí)。用TBS(0.1％(v/v)吐溫20(TBST))洗滌膜后，在室溫下將膜與10mL 5000倍稀釋的山羊抗豬IgG(全分子)-HRP孵育1小時(shí)。用10mL DAB底物溶液(0.5mg/ml 3，3’-二氨基聯(lián)苯、0.003％過(guò)氧化氫、TBS)使膜顯色。用蒸餾水洗滌膜終止顯色反應(yīng)。使膜干燥并掃描用于展示。
測(cè)序多毛結(jié)腸短螺旋體插入片段選擇AHP1質(zhì)粒用于使用ABI 373A DNA測(cè)序儀(PE AppliedBiosystems)直接測(cè)序多毛結(jié)腸短螺旋體基因組插入片段。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen)從大腸桿菌中純化噬菌粒。使用與插入物末端任一側(cè)的載體區(qū)退火的市售T3和T7寡核苷酸得到起始插入序列。基于上游插入序列的3’-OH設(shè)計(jì)剩余的寡核苷酸(表2)。“TA”表示使用該寡核苷酸的PCR的優(yōu)化退火溫度。
表2

以等分式樣(10μl)的噬菌粒(300ng)、引物(4pmol)和ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE AppliedBiosystems)進(jìn)行每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)。循環(huán)條件包括96℃2分鐘的變性步驟，隨后是96℃變性10秒、于引物解鏈溫度(表2)退火5秒和60℃引物延伸4分鐘的25個(gè)循環(huán)。用含有120mM乙酸鈉(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去殘余的染料終止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA測(cè)序儀分析測(cè)序產(chǎn)物。
完成Bpmp-72序列將基因組DNA片段克隆進(jìn)測(cè)序載體用HinDIII將來(lái)自多毛結(jié)腸短螺旋體的純化的染色體DNA完全消化。簡(jiǎn)言之，在37℃分別將染色體DNA(2μg)和pTrcHis質(zhì)粒(1μg)(Invitrogen)在含有20U的HinDIII(New England Biolabs)的1×HinDIII緩沖液中孵育過(guò)夜。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用UltraClean PCR Clean-up試劑盒(MoBio Laboratories)純化限制性產(chǎn)物。在14℃下將線性化pTrcHis載體(100ng)的等分式樣與限制性多毛結(jié)腸短螺旋體基因組DNA(100ng)在含有1U T4DNA連接酶(Promega)的30mM Tris-鹽酸(pH 7.8)、10mM MgCl2、10mMDTT和1mM ATP中孵育16小時(shí)。該連接反應(yīng)的產(chǎn)物命名為pTrc-PIL。還包括了作為載體重新環(huán)化陰性對(duì)照的不含基因組DNA的同一連接反應(yīng)。以總體積20μl進(jìn)行所有的連接反應(yīng)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增連接的DNA使用的引物為與pTrcHis HinDIII克隆位點(diǎn)側(cè)翼的互補(bǔ)序列退火的pTrcHis-F(5′-CAATTTATCAGACAATCTGTGTG-3′)(SEQ ID NO26)和與多毛結(jié)腸短螺旋體局部ORF 5’端互補(bǔ)序列退火的AHP-Rev(5′-TCGCTTGCAGTTTGAGGAGTG-3′)(SEQ ID NO27)。使用TaqDNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl總體積通過(guò)PCR擴(kuò)增連接的DNA。擴(kuò)增混合物由1×PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物對(duì)(pTrcHis-F、AHP-Rev)和pTrc-PIL(2μl)組成。循環(huán)條件包括94℃5分鐘的起始模板變性步驟和隨后的94℃變性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸4分鐘的30個(gè)循環(huán)。在1×TAE緩沖液(40mM Tris-乙酸、1mM EDTA)中將PCR產(chǎn)物置于1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光觀察。
測(cè)序Bpmp-72的ORF延伸按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用UltraClean PCR Clean-up試劑盒純化pTrc-PIL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。使用pTrcHis-F和AHP-Rev重復(fù)測(cè)序PCR產(chǎn)物。以由PCR產(chǎn)物(50ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE Applied Biosystems)組成的10μl體積進(jìn)行每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)。循環(huán)條件包括96℃2分鐘的變性步驟和隨后的96℃變性10秒、55℃引物退火5秒和60℃引物延伸4分鐘的25個(gè)循環(huán)。用含有120mM乙酸鈉(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去殘余的染料終止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA測(cè)序儀分析測(cè)序產(chǎn)物。用SeqEdv1.0.3和Vector NTI第6版編輯、匯編和比較測(cè)序結(jié)果。
測(cè)序剩余的Bpmp-72ORF
如上文重復(fù)pTrc-PIL的PCR擴(kuò)增。使用的引物為pTrcHis-F和AHP-Rev2(5’-TGGATTTTGAAGCTATTGCTC-3’)(SEQ ID NO28)。SEQ ID NO28與延伸的Bpmp-72 ORF 5’端的互補(bǔ)序列退火。使用pTrcHis-F和AHP-Rev2引物如前述進(jìn)行Bpmp-72 ORF剩余位置區(qū)域的測(cè)序。使用ABI 373A DNA測(cè)序儀分析測(cè)序產(chǎn)物。用SeqEd v1.0.3和VectorNTI第6版編輯、匯編和比較測(cè)序結(jié)果。
分析假想的Bpmp-72 ORF使用SeqEd v1.0.3(PE Applied Biosystems)編輯和匯編測(cè)序結(jié)果。使用Vector NTI第6版(InforMax)和University of Wisconsin GeneticsComputer Group程序分析核苷酸序列。用推定的假想開(kāi)放讀碼框(ORF)在國(guó)家生物信息中心(NCBI)可供使用的所有數(shù)據(jù)庫(kù)搜索同源性。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分析短螺旋體屬中的Bpmp-72設(shè)計(jì)并優(yōu)化了與Bpmp-72 ORF的913bp和1692bp區(qū)退火的兩種引物用于PCR檢測(cè)來(lái)自82種短螺旋體基因組DNA的編碼72kDa外膜蛋白的基因48株豬痢疾短螺旋體、18株多毛結(jié)腸短螺旋體、12株B.intermedia、8株B.murdochii、4株良性短螺旋體、2株“犬短螺旋體”、1株Brachyspiraalvinipulli和1株B.aalborgi。使用的引物為與多毛結(jié)腸短螺旋體ORF側(cè)翼互補(bǔ)序列退火的AHP-F4(5’-CAAGTAATAGCTAAAGGTGATG-3’)(SEQ ID NO29)和AHP-R783(5′-TTACTGTTGTGCTTGAGTAGTG-3′)(EQ ID NO30)。使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl總體積通過(guò)PCR擴(kuò)增基因。擴(kuò)增混合物由1×PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物對(duì)(AHP-F4、AHP-R783)和2.5μl純化的染色體模板DNA組成。循環(huán)條件包括94℃5分鐘的起始模板變性步驟和隨后的94℃變性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)。在1×TAE緩沖液(40mMTris-乙酸、1mM EDTA)中將PCR產(chǎn)物置于1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光觀察。
測(cè)序其他多毛結(jié)腸短螺旋體菌株中存在的Bpmp-72來(lái)自多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的Bpmp-72的PCR設(shè)計(jì)并優(yōu)化了用于PCR擴(kuò)增Bpmp-72以獲得測(cè)序模板的兩種引物與Bpmp-72ORF上游98堿基對(duì)退火的AHP-98F(CGTTTAGCTGAACTTGAAGCTATG-3′)(SEQ ID NO31)和與ORF下游178堿基對(duì)退火的AHP-1890R(5′-GTAATGCTCTGTCTTAATCAT-3′)(SEQ ID NO32)。使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以50μl總體積通過(guò)PCR擴(kuò)增基因。擴(kuò)增混合物由1×PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2)、0.5U Taq DNA聚合酶、0.05U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(Amersham Pharmacia Biotech)、0.5μM引物對(duì)(AHP-L1、AHP-R1)和2.5μl純化的染色體模板DNA組成。循環(huán)條件包括94℃5分鐘的起始模板變性步驟和隨后的94℃變性30秒、55℃退火15秒和68℃引物延伸4分鐘的30個(gè)循環(huán)。在1×TAE緩沖液(40mM Tris-乙酸、1mM EDTA)中將PCR產(chǎn)物置于1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光觀察。
測(cè)序來(lái)自多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的Bpmp-72按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用UltraClean PCR Clean-up試劑盒純化來(lái)自六株多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的PCR產(chǎn)物。使用AHP-98F、AHP+1890R和AHP+1012R(5’-TATCGCTTGCAGTTTGAGGAG-3’)(SEQ ID NO33)重復(fù)測(cè)序PCR產(chǎn)物。以由PCR產(chǎn)物(50ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE AppliedBiosystems)組成的10μl體積進(jìn)行每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)。循環(huán)條件包括96℃2分鐘的變性步驟和隨后的96℃變性10秒、55℃引物退火5秒和60℃引物延伸4分鐘的25個(gè)循環(huán)。用含有120mM乙酸鈉(pH 4.6)的95％乙醇沉淀從測(cè)序產(chǎn)物中除去殘余的染料終止子，并真空干燥。使用ABI 373A DNA測(cè)序儀分析測(cè)序產(chǎn)物。用SeqEd v1.0.3、Vector NTI第6版和ClustalX編輯、匯編和比較測(cè)序結(jié)果。
結(jié)果在大腸桿菌中分離和表征編碼72kDa外膜蛋白的重組噬菌粒如上文所述用短螺旋體屬(除了多毛結(jié)腸短螺旋體以外的)全細(xì)胞和大腸桿菌全細(xì)胞吸收來(lái)自用多毛結(jié)腸短螺旋體菌苗超免疫的豬的血清。吸收血清(AHPS)針對(duì)多毛結(jié)腸短螺旋體外包膜提取物的Western印跡顯示AHP主要與表觀分子量72kDa的蛋白質(zhì)反應(yīng)(圖1)。篩選多毛結(jié)腸短螺旋體λZAP基因組文庫(kù)產(chǎn)生六株克隆，命名為AHP1-6。這些克隆都產(chǎn)生表觀分子量34kDa的普通蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)均與AHPS強(qiáng)烈反應(yīng)(圖2)。對(duì)一個(gè)克隆測(cè)序鑒定出了編碼容量29.4kDa的783堿基對(duì)局部ORF。認(rèn)為該局部ORF編碼多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外膜蛋白的羧基端。
開(kāi)放讀碼框的序列分析基序和保守結(jié)構(gòu)域使用表2列出的引物對(duì)AHP1質(zhì)粒測(cè)序顯示多毛結(jié)腸短螺旋體基因組DNA的1009堿基對(duì)的插入片段。插入DNA的序列分析顯示了從堿基1到783的帶有推定的ATG起始密碼子和TAA終止密碼子的783堿基對(duì)的可能的局部ORF(圖3)。進(jìn)一步對(duì)剩余基因進(jìn)行克隆和測(cè)序顯示Bpmp-72的編碼序列大小為1692個(gè)核苷酸。在ATG起始密碼子上游鑒定了可能的Shine-Dalgarno核糖體結(jié)合位點(diǎn)(AGGAG)和推定的-10(AGGAG)和-35(TTGAAA)啟動(dòng)子區(qū)。編碼72kDa外膜蛋白的基因序列命名為72kDa分子量的外膜蛋白(Bpmp-72)。
翻譯多肽由564個(gè)氨基酸(aa)殘基組成，預(yù)測(cè)分子量為62.1kDa。推導(dǎo)出的大小與天然Bpmp-72蛋白的Western印跡中看到的存在顯著差異。Bpmp-72的假想編碼容量和天然Bpmp-72外膜蛋白之間分子量的差異原因可能是翻譯后修飾，如?；?、甲基化、乙?；⒘姿峄土蛩峄?。氨基酸序列的分析顯示在翻譯多肽的C端存在與保守的賴氨酸基序(LysM)結(jié)構(gòu)域同源的118個(gè)殘基的區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域是廣泛分布的蛋白質(zhì)模塊，最初在降解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶中鑒定，盡管已經(jīng)顯示它也存在于許多其他細(xì)菌蛋白中。LysM結(jié)構(gòu)域是細(xì)菌表面蛋白中最普遍的模塊之一。具有LysM結(jié)構(gòu)域的其他細(xì)菌蛋白如Staphlococci IgG結(jié)合蛋白和大腸桿菌親密素與細(xì)菌致病相關(guān)。
測(cè)序短螺旋體物種中存在的Bpmp-72基因使用Bpmp-72特異性PCR擴(kuò)增了來(lái)自48株豬痢疾短螺旋體、18株多毛結(jié)腸短螺旋體、12株B.intermedia、8株B.murdochii、4株良性短螺旋體、2株“犬短螺旋體”、1株Brachyspira alvinipulli和1株B.aalborgi的基因組DNA。Bpmp-72基因存在于所有的多毛結(jié)腸短螺旋體中，但不存在于任何豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.murdochii、良性短螺旋體、“犬短螺旋體”、Brachyspira alvinipulli或B.aalborgi中。選擇6株多毛結(jié)腸短螺旋體用于測(cè)序存在的Bpmp-72基因。表3和表4概括了多毛結(jié)腸短螺旋體菌株Bpmp-72基因之間的同源性水平。
6種多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的Bpmp-72基因在核苷酸水平顯示出99.8％-100％的同源性(表3)。所有菌株具有翻譯成564個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的1692bp基因。多毛結(jié)腸短螺旋體不同菌株之間高水平的同源性提示Bpmp-72可能是在物種中高度保守的基因座。
表3

六種多毛結(jié)腸短螺旋體菌株的Bpmp-72基因在氨基酸水平顯示99.3-100％的同源性。所有菌株具有翻譯成564個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的1692個(gè)堿基對(duì)的基因。多毛結(jié)腸短螺旋體不同菌株之間高水平的同源性提示Bpmp-72可能是在物種中高度保守的基因座。
表4

實(shí)施例2克隆、表達(dá)和純化重組多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外包膜蛋白(Bpmp-72)方法質(zhì)粒提取從甘油儲(chǔ)藏庫(kù)中將帶有pTrcHis質(zhì)粒(Invitrogen)的大腸桿菌JM109克隆劃線到添加了氨芐青霉素(100mg/l)的Luria-Bertani(LB)瓊脂平板上，并在37℃孵育16小時(shí)。將單克隆接種到添加了氨芐青霉素(100mg/l)的LB液體培養(yǎng)基(10ml)中并將液體培養(yǎng)基在37℃振蕩孵育12小時(shí)。將過(guò)夜培養(yǎng)物整體以5000×g離心10分鐘，并按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen)提取細(xì)胞中含有的質(zhì)粒。使用Dynaquant DNA熒光計(jì)(Hoefer)定量純化的質(zhì)粒，并用TE緩沖液將DNA濃度調(diào)整到100μg/ml。純化的pTrcHis質(zhì)粒保存于-20℃。
載體制備以在100mM Tris-鹽酸(pH 7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mMDTT和100μl/mlBSA中含有5U EcoR1(New England Biolabs)和5U Xho1(New England Biolabs)的100μl總體積在37℃將純化的pTrcHis質(zhì)粒(1μg)消化過(guò)夜。通過(guò)在1×TAE緩沖液中的1％(w/v)的瓊脂糖凝膠中以90V電泳消化反應(yīng)物(2μl)1小時(shí)來(lái)確認(rèn)限制性載體。用溴化乙啶(1μg/ml)溶液使電泳的DNA染色并用紫外(UV)光觀察。
按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用UltraClean PCR Clean-up試劑盒(Mo BioLaboratories)提取線性化的pTrcHis載體。使用熒光計(jì)定量純化的線性化載體，并用TE緩沖液將DNA濃度調(diào)整到50μg/ml。純化的限制性載體保存于-20℃。
插入片段制備引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)了三對(duì)引物以擴(kuò)增Bpmp-72基因的不同部分。表5顯示了引物序列和克隆的所得基因部分。所有引物包含末端限制性酶切位點(diǎn)，以使得到的擴(kuò)增子可以以粘性末端連接進(jìn)線性化的pTrcHis載體中。正向引物的設(shè)計(jì)使得末端Xho1限制性酶切位點(diǎn)與pTrcHis的表達(dá)盒在框內(nèi)。反向引物的設(shè)計(jì)使得在連接進(jìn)pTrcHis載體的EcoR1克隆位點(diǎn)之后不產(chǎn)生過(guò)早的翻譯終止密碼子。用Amplify 1.2(威斯康辛大學(xué))測(cè)試引物，且理論擴(kuò)增子序列插入了pTrcHis載體中的正確位置。使用Vector NTI第6版(InforMax)進(jìn)行嵌合pTrcHis表達(dá)盒的推導(dǎo)翻譯，以確認(rèn)Bpmp-72插入片段插入正確的讀碼框。
表5

Bpmp-72插入片段的擴(kuò)增使用Taq DNA聚合酶(Biotech International)和Pfu DNA聚合酶(Promega)以100μl總體積通過(guò)PCR擴(kuò)增Bpmp-72插入片段。簡(jiǎn)言之，擴(kuò)增混合物由1×PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2)、1U Taq DNA聚合酶、0.1U Pfu DNA聚合酶、0.2mM每種dNTP(Amersham PharmaciaBiotech)、0.5μM適當(dāng)?shù)囊飳?duì)(AHP-F1-Xho1/AHP-R783-EcoR1、AHP-F1-Xho1/AHP-R223-EcoR1或AHP-F4-Xho1/AHP-R783-EcoR1)和2.5μl染色體模板DNA組成。通過(guò)將10μl冰凍多毛結(jié)腸短螺旋體菌株95/1000(從豬中分離的澳大利亞西部菌株)重懸于200μl TE并煮1分鐘來(lái)制備染色體DNA。煮過(guò)的細(xì)胞以20000×g離心5分鐘并收集上清液用作PCR模板。循環(huán)條件包括94℃5分鐘的起始模板變性步驟和隨后的94℃變性30秒、50℃退火15秒和68℃引物延伸2分鐘的30個(gè)循環(huán)。在1×TAE緩沖液中將PCR產(chǎn)物置于1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光觀察。
確認(rèn)存在正確大小的PCR產(chǎn)物之后，如前述用UltraClean PCRClean-up試劑盒純化PCR反應(yīng)物。
Bpmp-72插入片段的限制性內(nèi)切酶消化以在100mM Tris-鹽酸(pH 7.5)、50mM NaCl、10mM MgCl2、1mMDTT和100μl/mlBSA中含有1U EcoR1和1U Xho1的100μl總體積在37℃將純化的PCR產(chǎn)物(50μg)消化過(guò)夜。使用UltraClean PCR Clean-up試劑盒純化消化的插入片段DNA。用TE緩沖液從提純柱上洗脫純化的消化插入片段DNA，用熒光計(jì)定量，并用TE緩沖液稀釋將DNA濃度調(diào)整到20μg/ml。純化的限制性插入片段立即用于載體連接。
將Bpmp-72插入片段連接進(jìn)pTrcHis載體以總體積20μl進(jìn)行所有的連接反應(yīng)。在14℃下將Xho1/EcoR1線性化的pTrcHis載體(100ng)與Xho1/EcoR1限制性Bpmp-72插入片段(20ng)在含有1U T4DNA連接酶(Promega)的30mM Tris-鹽酸(pH 7.8)、10mMMgCl2、10mM DTT和1mM ATP中孵育16小時(shí)。還包括了作為載體重新環(huán)化陰性對(duì)照的不含Bpmp-72插入片段的同一連接反應(yīng)。
將pTrc-Bpmp-72連接體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞在冰上融化-80℃保存的感受態(tài)大腸桿菌BL21 StarTM(DE3)pLysOne Shot(Invitrogen)細(xì)胞，然后將細(xì)胞(50μl)轉(zhuǎn)移進(jìn)用冰預(yù)冷的含有5μl過(guò)夜連接產(chǎn)物反應(yīng)物的(等價(jià)于25ng pTrcHis載體)1.5ml微離心管中。在凳子上輕輕敲打管的底部混合，并置于冰上30分鐘。然后通過(guò)將管在42℃水浴中放置45秒隨后放回冰上2分鐘熱激細(xì)胞。在37℃下使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在LB液體培養(yǎng)基(1ml)中輕柔混合復(fù)蘇1小時(shí)。2500×g、5分鐘收獲復(fù)蘇的細(xì)胞并將細(xì)胞重懸于新鮮LB液體培養(yǎng)基(50μl)中。用無(wú)菌玻璃棒將重懸細(xì)胞整體(50μl)均勻涂到添加了氨芐青霉素(100mg/l)的LB瓊脂平板上。平板在37℃孵育16小時(shí)。
通過(guò)PCR檢測(cè)大腸桿菌中的pTrc-Bpmp-72插入片段將每種構(gòu)建體的12個(gè)單轉(zhuǎn)化體菌落劃線到含有氨芐青霉素(100mg/l)新鮮LB瓊脂平板上并在37℃孵育16小時(shí)。在TE緩沖液(50μl)中重懸每一轉(zhuǎn)化事件的單菌落并煮1分鐘。使用煮過(guò)的細(xì)胞的等分式樣(2μl)作為PCR模板。擴(kuò)增混合物由1×PCR緩沖液(含有1.5mM MgCl2)、1U TaqDNA聚合酶、0.2mM每種dNT、0.5μM pTrcHis-F引物(SEQ ID NO6)和0.5μM pTrcHis-R引物(5’-TGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCG-3’)(SEQ ID NO38)組成。循環(huán)條件包括94℃5分鐘的起始模板變性步驟和隨后的94℃變性30秒、60℃退火15秒和72℃引物延伸30秒的30個(gè)循環(huán)。在1×TAE緩沖液中將PCR產(chǎn)物置于1.5％(w/v)的瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙啶溶液(1μg/ml)染色并用UV光觀察。
通過(guò)直接序列分析證實(shí)pTrc-Bpmp-72讀碼框?qū)a(chǎn)生正確大小PCR產(chǎn)物的每一構(gòu)建體的兩個(gè)轉(zhuǎn)化體接種到含有氨芐青霉素(100mg/l)的LB液體培養(yǎng)基(10ml)中并在37℃振蕩孵育12小時(shí)。以5000×g離心全部過(guò)夜培養(yǎng)物10分鐘，并如前述用QIAgen SpinMiniprep試劑盒提取細(xì)胞中含有的質(zhì)粒。純化的質(zhì)粒用熒光計(jì)定量。
用pTrcHis-F和pTrcHis-R引物對(duì)純化的兩種質(zhì)粒進(jìn)行自動(dòng)化直接測(cè)序。以由質(zhì)粒DNA(200ng)、引物(2pmol)和ABI PRISMTMDye TerminatorCycle Sequencing Ready Reaction Mix(4μl)(PE Applied Biosystems)組成的10μl體積進(jìn)行每一個(gè)測(cè)序反應(yīng)。循環(huán)條件包括96℃2分鐘的變性步驟和隨后25個(gè)循環(huán)的96℃變性10秒、60℃4分鐘的組合的引物退火和延伸步驟。用含有120mM乙酸鈉(pH 4.6)的95％乙醇沉淀除去殘余的染料終止子并真空干燥。使用每一引物對(duì)質(zhì)粒重復(fù)測(cè)序。使用ABI 373A DNA測(cè)序儀(PE Applied Biosystems)分析測(cè)序產(chǎn)物。成功連接的質(zhì)粒命名為pTrc-Bpmp-72(全蛋白)、pTrc-Bpmp-72N(N端部分)和pTrc-Bpmp-72C(C端部分)。
大規(guī)模表達(dá)重組His6-Bpmp-72C選擇大規(guī)模產(chǎn)生重組34kDa的Bpmp-72C端部分并進(jìn)而用作疫苗。將大腸桿菌BL21中的pTrc-Bpmp-72C單菌落接種到250ml錐形瓶中含有氨芐青霉素(100mg/l)的LB液體培養(yǎng)基(50ml)中，并在37℃孵育16小時(shí)。將含有添加了氨芐青霉素(100mg/l)的LB液體培養(yǎng)基(1L)的2L錐形瓶與過(guò)夜培養(yǎng)物(10ml)在37℃孵育，直至細(xì)胞在600nm處的吸光度為0.5(約3-4個(gè)小時(shí))。然后通過(guò)加入終濃度1mM的IPTG來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并將細(xì)胞放回37℃振蕩。誘導(dǎo)5小時(shí)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到250ml離心瓶中，并使瓶在4℃以5000×g離心20分鐘。棄去上清液并用10ml Ni-NTA變性裂解緩沖液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-鹽酸、8M尿素，pH 8.0)重懸沉淀。將重懸細(xì)胞保存在-20℃。
大規(guī)模純化重組重組His6-Bpmp-72C將-20℃保存的細(xì)胞懸液取出并在冰上融化。然后在冰上30秒超聲破碎細(xì)胞3次，每輪超生之間冰上孵育1分鐘。在4℃以20000×g離心10分鐘使裂解液澄清，并將上清液轉(zhuǎn)移到含有1ml柱床體積Ni-NTA瓊脂糖樹(shù)脂(Qiagen)的15ml柱上。在4℃翻滾(end-over-end)混合使重組His6標(biāo)簽蛋白與樹(shù)脂結(jié)合1小時(shí)。用30ml Ni-NTA變性洗脫緩沖液(100mMNaH2PO4、10mM Tris-鹽酸、8M尿素，pH 4.5)洗脫之前，先用50ml Ni-NTA變性洗滌緩沖液(100mM NaH2PO4、10mM Tris-鹽酸、8M尿素，pH 6.3)洗滌樹(shù)脂。收集三個(gè)10ml的級(jí)分并保存于4℃。用4×樣品處理緩沖液(10μl)處理每一洗脫液的等分式樣(30μl)并煮5分鐘。樣品進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍(lán)G250(Sigma)染色。將染色膠在蒸餾水中平衡1小時(shí)并在兩個(gè)纖維素片中室溫干燥過(guò)夜。
透析和凍干純化的重組His6-Bpmp-72C合并洗脫的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移進(jìn)分子量截留(MWCO)為35000Da的含水透析管(Spectrum)中。取合并洗脫液的等分式樣(200μl)并根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)用Biorad Protein Assay(Biorad)定量。4℃下使蛋白質(zhì)對(duì)2l蒸餾水?dāng)嚢柰肝觥Ｒ?2小時(shí)的間隔將透析緩沖液更換8次。將透析過(guò)的蛋白從透析袋中轉(zhuǎn)移進(jìn)50ml離心管(40ml最大容積)中并將管置于-80℃。將管放進(jìn)MAXI凍干機(jī)(Heto)中凍干至干燥。用PBS將凍干的蛋白質(zhì)再水化至5mg/ml并保存于-20℃。
結(jié)果重組pTrc-Bpmp-72載體的結(jié)構(gòu)表6顯示在大腸桿菌中表達(dá)Bpmp-72不同部分的構(gòu)建體。表5中顯示用于產(chǎn)生克隆的插入序列的引物對(duì)。引物擴(kuò)增確定的Bpmp-72部分，導(dǎo)致表達(dá)完整的Bpmp-72、其N端部分或C端部分。將多種插入序列克隆進(jìn)pTrcHis表達(dá)載體產(chǎn)生大小分別為6081、5518和5171bp的重組載體pTrc-Bpmp-72、pTrc-Bpmp-72N和pTrc-Bpmp-72C。pTrcHis構(gòu)建體的核苷酸序列證實(shí)所有構(gòu)建體的表達(dá)盒在正確的框內(nèi)。PtrcHis表達(dá)載體的預(yù)測(cè)翻譯表明重組pHis6-Bpmp-72蛋白(66.3kDa)、pHis6-Bpmp-72N蛋白(46.9kDa)和pHis6-Bpmp-72C蛋白(34.6kDa)與天然Bpmp-72脂蛋白(62.1kDa)的推定氨基酸序列一致。PtrcHis構(gòu)建體的完整質(zhì)粒圖顯示于圖4。
表6

表達(dá)和純化重組Bpmp-72C大規(guī)模表達(dá)選定的含有pTrc-Bpmp-72C的重組克隆以產(chǎn)生足夠的重組蛋白用于接種。重組Bpmp-72C蛋白和六組氨酸(4kDa)融合產(chǎn)生表觀分子量34kDa的主要蛋白(圖5)。λ噬菌體基因組文庫(kù)的最初篩選中使用的AHPS與天然Bpmp-72和重組His6-Bpmp-72C均發(fā)生反應(yīng)(圖5)。
通過(guò)變性條件下的親和層析成功純化了His6-Bpmp-72重組抗原。六個(gè)重復(fù)批次大規(guī)模純化的His6-Bpmp-72C的SDS-PAGE顯示重組抗原純度超過(guò)90％且蛋白質(zhì)表達(dá)是一致的(圖6)。使用該表達(dá)程序可以穩(wěn)定的得到2mg/L的重組蛋白產(chǎn)量。在透析和凍干后成功產(chǎn)生了穩(wěn)定的重組His6-Bpmp-72C抗原。
實(shí)施例3用多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外包膜蛋白的重組羧基端部分接種雞方法用多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa蛋白的重組34kDa羧基端部分全身和經(jīng)口免疫兩個(gè)15只雞的組，然后用多毛結(jié)腸短螺旋體攻擊以檢測(cè)接種是否能防止多毛結(jié)腸短螺旋體定居。使用了第三組未接種的15只雞作為對(duì)照。全部45只禽置于一個(gè)房間中單獨(dú)的籠子中。三個(gè)組的命名為i)A組未接受接種；ii)B組與佐劑一起肌內(nèi)接受重組蛋白(100μg)，3周后經(jīng)嗉囊管接受1mg蛋白質(zhì)。
iii)C組與佐劑一起肌內(nèi)接受1mg重組蛋白，3周后經(jīng)嗉囊管接受1mg蛋白質(zhì)。
在第二次接種后兩周用多毛結(jié)腸短螺旋體的雞菌株(Csp1)經(jīng)口攻擊所有的禽。
雞和免疫方案用等體積的弗氏不完全佐劑乳化Bpmp-72的重組34kDa C端部分(His6-Bpmp-72C)，并注射進(jìn)B和C每一組的15只小母雞(ISA Brown產(chǎn)蛋小母雞每只雞約為18周齡，體重1.5kg)的胸肌中。B組中的每只雞接受1ml總體積中的100μg蛋白質(zhì)，C組中的每只雞接受1ml總體積中的1mg蛋白質(zhì)。A組中的雞不接受接種。第一次接種三周后，B和C組的所有雞接受直接進(jìn)入嗉囊的2ml磷酸緩沖液中的1mg蛋白質(zhì)。A組的雞不接受接種。經(jīng)口接種后兩周，對(duì)全部禽直接進(jìn)入嗉囊給予2ml指數(shù)對(duì)數(shù)期(～109細(xì)胞/ml)的多毛結(jié)腸短螺旋體。在連續(xù)的三天中重復(fù)攻擊。將禽關(guān)在各自的籠子中。
在第一次接種前、僅臨第二次接種前、第一天攻擊前和五周后通過(guò)從翅脈采血獲得血清。在ELISA中測(cè)試血清針對(duì)接種抗原的抗體，還在針對(duì)多毛結(jié)腸短螺旋體細(xì)胞提取物的Western印跡中進(jìn)行測(cè)試。每周取所有雞的排泄物三次并培養(yǎng)。用頸脫位法在實(shí)驗(yàn)性感染五周后將雞殺死。
在死后收集小腸和結(jié)腸碎屑并通過(guò)ELISA和Western印跡分析測(cè)試特異性免疫球蛋白的含量。
螺旋體培養(yǎng)將從排泄物中取到的樣品劃線到含有5％(v/v)去纖維綿羊血、大觀霉素(400μg/ml)、粘菌素(25μg/ml)和萬(wàn)古霉素(25μg/ml)的Trypticase Soy瓊脂平板上。在通風(fēng)環(huán)境中將這些平板在37℃孵育7天?；谌酽氯苎饔煤惋@微鏡形態(tài)學(xué)將短螺旋體鑒定為多毛結(jié)腸短螺旋體。傳代培養(yǎng)分離物的亞群并使用物種特異性PCR確定為多毛結(jié)腸短螺旋體。
(血清)ELISA用100μl碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)中純化的His6-Bpmp-72C(1μg/ml)包被微孔滴定板的孔并在4℃孵育過(guò)夜。在室溫下用150μl PBS-BSA(1％w/v)混合封閉平板1小時(shí)然后用150μl PBST(0.05％v/v)洗滌三次。
將雞血清200倍稀釋于100μl PBST-BSA(0.1％w/v)中并在室溫下混合孵育2小時(shí)。在加入以80,000倍稀釋于PBST中的100μl山羊抗雞IgG(完整分子)-HRP之前，(如上文)洗滌平板。室溫孵育1小時(shí)后，洗滌平板并加入100μl TMB底物。在室溫下顯色10分鐘，然后加入50μl 1M硫酸終止顯色。在450nm處讀出每一孔的光密度。
(粘膜)ELISA從小腸和結(jié)腸的15cm2切片中取得碎屑。將碎屑重懸于含有1％(w/v)的BSA、2mM PMSF、1mM EDTA和0.2％(w/v)的疊氮鈉的1ml PBS中。將懸液徹底混合并以20000×g離心10分鐘。取出上清液，用PBST稀釋2倍并取100μl用于ELISA。該ELISA按照血清ELISA進(jìn)行。
Western印跡分析將超聲處理并澄清了的多毛結(jié)腸短螺旋體懸液等分式樣(50mg)上樣到7cm預(yù)制的孔中，電泳經(jīng)過(guò)12.5％(w/v)的SDS-PAGE凝膠，并電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用TBS-脫脂乳(5％w/v)封閉膜并將膜裝配到多探針儀(Biorad)中?？着c100μl稀釋的混合雞血清(200倍)或粘膜上清液(2倍)在室溫下孵育2小時(shí)。用TBST(0.1％v/v)將孔洗滌三次，然后與100μl山羊抗雞IgG(全分子)-HRP(10000倍)在室溫下孵育1小時(shí)。從儀器中取出膜并用TBST洗滌三次。在10ml DAB溶液(5mg/ml、0.0003％(v/v)過(guò)氧化氫、TBS)中顯色，當(dāng)顯色充分時(shí)用自來(lái)水洗滌膜。使膜干燥并掃描用于展示。
結(jié)果對(duì)接種的血清學(xué)應(yīng)答雞的全身血清學(xué)(ELISA)應(yīng)答顯示于圖7-9。對(duì)照禽(A組)沒(méi)有循環(huán)抗體，且在實(shí)驗(yàn)性感染后也沒(méi)有產(chǎn)生(圖7)。實(shí)驗(yàn)性感染后循環(huán)抗體加強(qiáng)的缺乏也可見(jiàn)于多數(shù)(但不是全部)接種的禽中(圖8和圖9)。用100μg蛋白質(zhì)接種的禽(B組)中有6只顯示適度的初次應(yīng)答，而其他禽對(duì)疫苗顯示弱的應(yīng)答(圖8)。相反，在11只接種1mg蛋白質(zhì)的禽(C組)中可見(jiàn)良好的初次全身應(yīng)答，而該組中剩余的4只禽對(duì)接種僅顯示中度應(yīng)答。除3只以外的所有禽在經(jīng)口放大后都顯示提高的應(yīng)答(圖9)。
接種雞對(duì)多毛結(jié)腸短螺旋體提取物的Western印跡分析顯示于圖10和圖11。每一組中顯示了各取自3只禽的5組血清。Western印跡顯示了這些應(yīng)答對(duì)天然72kDa蛋白(盡管接種使用34kDa亞基)的特異性，并顯示C組禽(1mg)具有較B組禽(100μg)更強(qiáng)的應(yīng)答這一趨勢(shì)。
雞對(duì)接種和攻擊(死后采樣)的粘膜ELISA應(yīng)答顯示于圖12。盡管被感染，對(duì)照禽不顯示任何局部反應(yīng)。僅有1只來(lái)自100μg接種組(B組)的禽(27號(hào))在小腸和結(jié)腸都顯示良好的局部抗體反應(yīng)。該組中4只其他的禽(23、24、34和35號(hào))在結(jié)腸顯示中度局部反應(yīng)。來(lái)自1mg接種組(C組)的兩只禽(40和48號(hào))在小腸顯示良好的局部反應(yīng)，而6只禽(36、38、40、41、43和50號(hào))在結(jié)腸顯示良好的局部反應(yīng)。
圖13顯示具有較高抗體效價(jià)的禽粘膜提取物的Western印跡分析。所有禽的局部抗體應(yīng)答都針對(duì)天然72kDa蛋白。這些結(jié)果表明嗉囊的經(jīng)口接種(和隨后的實(shí)驗(yàn)性攻擊)能夠沿胃腸道向下誘導(dǎo)局部反應(yīng)。然而，經(jīng)口接種在結(jié)腸(和小腸)中成功誘導(dǎo)可檢測(cè)的局部反應(yīng)是矛盾的(inconsistent)。
針對(duì)多毛結(jié)腸短螺旋體定居的保護(hù)表7顯示三組禽中培養(yǎng)排泄物以獲得多毛結(jié)腸短螺旋體的概括結(jié)果。三個(gè)組中個(gè)體禽的結(jié)果分別展示于表8-10。傳代培養(yǎng)的全部分離物通過(guò)靶向16S rRNA基因的物種特異性PCR確定為多毛結(jié)腸短螺旋體。
表7


截至感染后(pi)9天，與兩個(gè)接種組中的7％和0％相比，對(duì)照組產(chǎn)生80％定居率(表6)。隨后，對(duì)照組中的定居率下降了，盡管在30天的時(shí)間段中保持了45％的平均率。相反，兩個(gè)接種組中的定居率都趨向于隨時(shí)間增加，B組在感染后30天出現(xiàn)最大的60％定居率，而C組在感染后25天出現(xiàn)最大的40％定居率。三個(gè)組在感染后30天的定居率相似。盡管如此，在整個(gè)時(shí)間段中對(duì)照組的定居率明顯高于兩個(gè)接種組。
表8顯示非接種雞在多毛結(jié)腸短螺旋體經(jīng)口攻擊后的個(gè)體定居結(jié)果。通過(guò)培養(yǎng)排泄物樣品確定定居。(-)符號(hào)代表培養(yǎng)物陰性而(+)代表培養(yǎng)物陽(yáng)性。表9顯示接種雞(100μg肌內(nèi)+1mg經(jīng)口)在多毛結(jié)腸短螺旋體經(jīng)口攻擊后的個(gè)體定居結(jié)果。通過(guò)培養(yǎng)排泄物樣品確定定居。(-)符號(hào)代表培養(yǎng)物陰性而(+)代表培養(yǎng)物陽(yáng)性。表10顯示接種雞(1mg肌內(nèi)+1mg經(jīng)口)在多毛結(jié)腸短螺旋體經(jīng)口攻擊后的個(gè)體定居結(jié)果。通過(guò)培養(yǎng)排泄物樣品確定定居。(-)符號(hào)代表培養(yǎng)物陰性而(+)代表培養(yǎng)物陽(yáng)性。
全部15只對(duì)照禽均發(fā)生定居，在實(shí)驗(yàn)時(shí)期的第3和6次采樣之間(在11個(gè)可能的采樣天數(shù)中平均為4.53)得到陽(yáng)性樣本。
B組結(jié)果顯示14只禽在某些點(diǎn)發(fā)生定居，第1和第3次采樣之間為陽(yáng)性(平均采樣天數(shù)為1.87)。在C組中，14只禽在某些點(diǎn)發(fā)生定居，第1和第5次采樣之間為陽(yáng)性(平均采樣天數(shù)為1.6)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)接種禽中感染總量小于對(duì)照禽，兩種疫苗方案對(duì)于防止定居產(chǎn)生相似的結(jié)果。
當(dāng)比較個(gè)體禽對(duì)定居的全身或結(jié)腸抗體應(yīng)答時(shí)，沒(méi)有得到一致的結(jié)果。對(duì)照禽對(duì)感染很少產(chǎn)生局部或全身抗體應(yīng)答?？紤]到B組中具有大于2天的定居的4只禽(21、24、29和30號(hào))，它們的抗體效價(jià)不低于該組中定居時(shí)間較短的其他禽。未發(fā)生定居的禽(26號(hào))具有與該組中其他相似的抗體效價(jià)。相反，在C組中，具有大于2天的定居的3只禽(37、46和49號(hào))確實(shí)具有弱的結(jié)腸抗體應(yīng)答。在這些禽中，37號(hào)禽具有良好的全身抗體應(yīng)答，而46和49號(hào)禽則不然。未發(fā)生定居的禽(40號(hào))具有中度全身抗體應(yīng)答，但具有良好的結(jié)腸應(yīng)答。在該接種組中，具有在較短定居的禽中發(fā)現(xiàn)較高的結(jié)腸抗體效價(jià)的趨勢(shì)。
總體而言，該實(shí)驗(yàn)提供了該接種方案可誘導(dǎo)針對(duì)Bpmp-72的特異性循環(huán)和結(jié)腸抗體效價(jià)的證據(jù)。就這方面而言，肌內(nèi)接種1mg蛋白質(zhì)給出比使用100μg更好的應(yīng)答。兩種接種流程都明顯推遲了多毛結(jié)腸短螺旋體定居，還降低了總體持續(xù)時(shí)間和定居的禽數(shù)(特別是與感染9天后對(duì)照組感染的高峰相比)。如果對(duì)照組中保持高定居率，還可以進(jìn)一步加大該差異。這些結(jié)果提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，以提示Bpmp-72可能發(fā)展為防止發(fā)生多毛結(jié)腸短螺旋體定居的雞以及其他動(dòng)物物種(包括豬、狗和人)的有效手段。

表8

表9

表10
序列表<110>莫道什大學(xué)<120>Bpmp-72新的核苷酸和氨基酸序列及它們的診斷和治療用途<130>110427<160>38<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>1750<212>DNA<213>多毛結(jié)腸短螺旋體<400>1atgagtactt taataaagaa aatcgtagct tatatagctt taatctcttt tagttttagc 60gtattacctg ctcaaactta tgatgatgcg gctagaatta ctggagaagc tgagacttta 120caaaatgacg gagaatacca aaagtcttat gataaatctc aagaggcttc tgactctata 180gataaaacta ctgtatcatt attttataga ttaatgaact taagaatagc taaagcaaaa 240aatgatgcaa ataagactat taatgaaata gaacaattag gtgcttctac tgataatgaa 300tttaaaacaa aatatcaaga agctctaaaa ttctttgaag aaggaaataa tagtattact 360aacttacctc cagaaccgca aactcctcct acagatgaag agtttactgc ttcttcaaac 420acattcacta cagtatataa ttctttcaac aatgctttac aatctgctaa cagtgtaaaa 480gaaggttatc ttaatagaga aagagcaata gcttcaaaat ccattaatga tgctagaaac 540aaatataaag cagaattagg caagagtgta aaagcaggcg atgctaatga tagaaatatt 600aatggtgctt taactagagc tgatgaagca cttagcaatg acaattttgc aagcgttcag 660cagaatgtat ctactgcatt agctggtata aataaagcta tagcagatgc taaggcgaaa 720gctgaggcag aagctaaagc aaaagctgct gctgaagcta aggcaagagc tgaagcagag 780gctaaagcga aagcagaagc tgctgctaaa gcaaaagctg aagcagaggc taaagcgaaa 840gcagatgcaa tagcaaaagc taaaaaagac atagaagatg cacaaaataa atataataat 900ttagttaatg atcaagtaat agctaaaggt gatgataatg ataaaaacgt atcaaaactt 960ttaactgatg ctaataatgc tttacaaaac actcctcaaa ctgcaagcga taaagcttta1020gaagcttcta aaactatgga taatatatta aacactgcta atcaattgaa aaaagaagaa1080gctgttaaaa atctagagca attaaaggca agaagagaca gacttataag cgaaggttat1140ttaactaaag acagcgaaga agaacaaaag ttatctcaaa ctattaaaga agctgaagat1200
gctttaaata acaatgatta tgttttagct gaccaaaaaa tgcaggaagc taatcttaac1260atgaatgcta tagaagagag aggacctatt gacggacaag ttatacctgg tgaaatgggc1320ggtaacgaaa ctggtcaaat aattgatgct actactggtc aagaagtaaa tacagaagga1380aaagttactg tattacctca atattatgtt gtagtaagaa gagtacctct aactgatgct1440ttatggagaa ttgctggata cagctacata tacaacaacc ctatagaatg gtacagaata1500tatgaagcta acagaaatgt acttagagac cctaataacc ctgatttaat acttcctggt1560caaagattaa taatacctag ccttaatggt gaagagagaa gcggtgatta taatcctgat1620ttagagtatt tgacttatga tgaggttatg cagttaagac agcaaaataa cactactcaa1680gcacaacagt aagaaataaa cttataaaat acaaaaggtc atgcatttaa tatgtatgac1740ctttttttgt 1750<210>2<211>564<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體<400>2Met Ser Thr Leu Ile Lys Lys Ile Val Ala Tyr Ile Ala Leu Ile Ser1 5 10 15Phe Ser Phe Ser Val Leu Pro Ala Gln Thr Tyr Asp Asp Ala Ala Arg20 25 30Ile Thr Gly Glu Ala Glu Thr Leu Gln Asn Asp Gly Glu Tyr Gln Lys35 40 45Ser Tyr Asp Lys Ser Gln Glu Ala Ser Asp Ser Ile Asp Lys Thr Thr50 55 60Val Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Met Asn Leu Arg Ile Ala Lys Ala Lys65 70 75 80Asn Asp Ala Asn Lys Thr Ile Asn Glu Ile Glu Gln Leu Gly Ala Ser85 90 95Thr Asp Asn Glu Phe Lys Thr Lys Tyr Gln Glu Ala Leu Lys Phe Phe100 105 110Glu Glu Gly Asn Asn Ser Ile Thr Asn Leu Pro Pro Glu Pro Gln Thr115 120 125
Pro Pro Thr Asp Glu Glu Phe Thr Ala Ser Ser Asn Thr Phe Thr Thr130 135 140Val Tyr Asn Ser Phe Asn Asn Ala Leu Gln Ser Ala Asn Ser Val Lys145 150 155 160Glu Gly Tyr Leu Asn Arg Glu Arg Ala Ile Ala Ser Lys Ser Ile Asn165 170 175Asp Ala Arg Asn Lys Tyr Lys Ala Glu Leu Gly Lys Ser Val Lys Ala180 185 190Gly Asp Ala Asn Asp Arg Asn Ile Asn Gly Ala Leu Thr Arg Ala Asp195 200 205Glu Ala Leu Ser Asn Asp Asn Phe Ala Ser Val Gln Gln Asn Val Ser210 215 220Thr Ala Leu Ala Gly Ile Asn Lys Ala Ile Ala Asp Ala Lys Ala Lys225 230 235 240Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Ala Arg245 250 255Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Lys260 265 270Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Ile Ala Lys Ala Lys275 280 285Lys Asp Ile Glu Asp Ala Gln Asn Lys Tyr Asn Asn Leu Val Asn Asp290 295 300Gln Val Ile Ala Lys Gly Asp Asp Asn Asp Lys Asn Val Ser Lys Leu305 310 315 320Leu Thr Asp Ala Asn Asn Ala Leu Gln Asn Thr Pro Gln Thr Ala Ser325 330 335Asp Lys Ala Leu Glu Ala Ser Lys Thr Met Asp Asn Ile Leu Asn Thr340 345 350Ala Asn Gln Leu Lys Lys Glu Glu Ala Val Lys Asn Leu Glu Gln Leu355 360 365Lys Ala Arg Arg Asp Arg Leu Ile Ser Glu Gly Tyr Leu Thr Lys Asp
370 375 380Ser Glu Glu Glu Gln Lys Leu Ser Gln Thr Ile Lys Glu Ala Glu Asp385 390 395 400Ala Leu Asn Asn Asn Asp Tyr Val Leu Ala Asp Gln Lys Met Gln Glu405 410 415Ala Asn Leu Asn Met Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Pro Ile Asp Gly420 425 430Gln Val Ile Pro Gly Glu Met Gly Gly Asn Glu Thr Gly Gln Ile Ile435 440 445Asp Ala Thr Thr Gly Gln Glu Val Asn Thr Glu Gly Lys Val Thr Val450 455 460Leu Pro Gln Tyr Tyr Val Val Val Arg Arg Val Pro Leu Thr Asp Ala465 470 475 480Leu Trp Arg Ile Ala Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Asn Asn Pro Ile Glu485 490 495Trp Tyr Arg Ile Tyr Glu Ala Asn Arg Asn Val Leu Arg Asp Pro Asn500 505 510Asn Pro Asp Leu Ile Leu Pro Gly Gln Arg Leu Ile Ile Pro Ser Leu515 520 525Asn Gly Glu Glu Arg Ser Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Leu Glu Tyr Leu530 535 540Thr Tyr Asp Glu Val Met Gln Leu Arg Gln Gln Asn Asn Thr Thr Gln545 550 555 560Ala Gln Gln Glx<210>3<211>32<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>3Lys Val Thr Val Leu Pro Gln Tyr Tyr Val Val Val Arg Arg Val Pro1 5 10 15
Leu Thr Asp Ala Leu Trp Arg Ile Ala Gly Tyr Ser Tyr Ile Tyr Asn20 25 30<210>4<211>22<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>4Leu Ile Lys Lys Ile Val Ala Tyr Ile Ala Leu Ile Ser Phe Ser Phe1 5 10 15Ser Val Leu Pro Ala Gln20<210>5<211>13<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>5Lys Thr Thr Val Ser Leu Phe Tyr Arg Leu Met Asn Leu1 5 10<210>6<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>6Asn Asp Gln Val Ile Ala Lys1 5<210>7<211>14<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>7Asp Leu Ile Leu Pro Gly Gln Arg Leu Ile Ile Pro Ser Leu1 5 10<210>8<211>8<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>8Asn Asp Tyr Val Ala Leu Asp Gln
15<210>9<211>18<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>9Phe Ala Ser Val Gln Gln Asn Val Ser Thr Ala Leu Ala Gly Ile Asn1 5 10 15Lys Ala<210>10<211>6<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>10Val Ser Lys Leu Leu Thr1 5<210>11<211>13<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>11Asp Leu Glu Tyr Leu Thr Tyr Asp Glu Val Met Gln Leu1 5 10<210>12<211>8<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>12Asn Ala Leu Gln Ser Ala Asn Ser1 5<210>13<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>13Asp Gly Gln Val Ile Pro Gly1 5
<210>14<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>14Val Lys Asn Leu Glu Gln Leu1 5<210>15<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>15Gly Lys Ser Val Lys Ala Gly1 5<210>16<211>6<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>16Gln Glu Ala Leu Lys Phe1 5<210>17<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>17Phe Thr Thr Val Tyr Asn Ser1 5<210>18<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>18Asn Leu Pro Pro Glu Pro Gln1 5<210>19<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段
<400>19Lys Ala Asp Ala Ile Ala Lys1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>20Lys Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala Lys1 5<210>21<211>7<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>21Lys Ala Lys Ala Ala Ala Glu1 5<210>22<211>6<212>PRT<213>多毛結(jié)腸短螺旋體mp-72蛋白片段<400>22Asp Lys Ala Leu Glu Ala1 5<210>23<211>20<212>DNA<213>T3<400>23taaccctcac taaagggaac 20<210>24<211>24<212>DNA<213>AHP-F1<400>24tgaatgctat agaagagaga ggac 24<210>25<211>22<212>DNA<213>T7
<400>25gtaatacgac tcactatagg gc22<210>26<211>23<212>DNA<213>pTrcHis-F<400>26caatttatca gacaatctgt gtg 23<210>27<211>21<212>DNA<213>AHP-Rev<400>27tcgcttgcag tttgaggagt g 21<210>28<211>21<212>DNA<213>AHP-Rev2<400>28tggattttga agctattgct c 21<210>29<211>22<212>DNA<213>AHP-F4<400>29caagtaatag ctaaaggtga tg22<210>30<211>22<212>DNA<213>AHP-R783<400>30ttactgttgt gcttgagtag tg22<210>31<211>24<212>DNA<213>AHP-98F<400>31cgtttagctg aacttgaagc tatg 24<210>32<211>21
<212>DNA<213>AHP+1890R<400>32gtaatgctct gtcttaatca t21<210>33<211>21<212>DNA<213>AHP+1012R<400>33tatcgcttgc agtttgagga g21<210>34<211>34<212>DNA<213>AHP-F1-Xho1<400>34agactcgaga gtactttaat aaagaaaatc gtag 34<210>35<211>31<212>DNA<213>AHP-R783-EcoR1<400>35gttgaattct tactgttgtg cttgagtagt g 31<210>36<211>31<212>DNA<213>AHP-R223-EcoR1<400>36taagaattcc ttataagtct gtctcttctt g 31<210>37<211>31<212>DNA<213>AHP-F4-Xho1<400>37ctactcgagc aagtaatagc taaaggtgat g 31<210>38<211>23<212>DNA<213>pTrcHis-R<400>38tgcctggcag ttccctactc tcg 2權(quán)利要求
1.分離的多肽，其包含(i)選自SEQ ID NO2至SEQ ID NO22的氨基酸序列；(ii)與來(lái)自(i)的氨基酸序列至少60％同源的氨基酸序列；(iii)與來(lái)自(i)的氨基酸序列至少80％一致的氨基酸序列；或(iv)任何(i)到(iii)的片段，其具有SEQ ID NO2所編碼多肽的生物活性。
2.分離的多核苷酸，其包含(i)編碼根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的核苷酸序列；(ii)SEQ ID NO1中所列的核苷酸序列；(iii)符合(i)或(ii)中所定義序列的簡(jiǎn)并形式的核苷酸序列；(iv)能與(i)到(iii)中的序列選擇性雜交的核苷酸序列；(v)與(i)到(iv)中任何序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(vi)適合作為引物或探針使用的(v)中序列的片段。
3.制備根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的方法，所述方法包括以下步驟(i)在提供多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有與啟動(dòng)子有效連接的根據(jù)權(quán)利要求2(i)到(iv)的多核苷酸的細(xì)胞；和(ii)回收表達(dá)的多肽。
4.權(quán)利要求3的方法，其中使用層析回收多肽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中層析包括使用Ni-螯合柱和/或凝膠過(guò)濾。
6.載體，其含有根據(jù)權(quán)利要求2的核苷酸序列的。
7.宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了根據(jù)權(quán)利要求6的載體。
8.抗體，其特異于根據(jù)權(quán)利要求1的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的抗體，其還含有可檢測(cè)標(biāo)記。
10.制備抗體的方法，所述方法包括步驟(i)將根據(jù)權(quán)利要求1的多肽與載體蛋白綴合；(ii)對(duì)動(dòng)物施用(i)的綴合物和佐劑；并(iii)從動(dòng)物中分離得到的抗體。
11.從樣品中篩選短螺旋體物種的方法，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體，所述方法包括以下步驟(i)在適當(dāng)?shù)碾s交條件下使樣品與根據(jù)權(quán)利要求2(vi)的多核苷酸接觸；和(ii)檢測(cè)多核苷酸和樣品中核苷酸序列之間形成的任何雙鏈體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中多核苷酸選自SEQ ID NO24和SEQ ID NO27至37。
13.篩選樣品中根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的方法，所述方法包括(i)在允許形成反應(yīng)復(fù)合物的條件下使樣品與根據(jù)權(quán)利要求8的抗體接觸；和(ii)檢測(cè)反應(yīng)復(fù)合物。
14.篩選樣品中根據(jù)權(quán)利要求8的抗體的方法，所述方法包括(i)在允許形成反應(yīng)復(fù)合物的條件下使樣品與根據(jù)權(quán)利要求1的多肽接觸；和(ii)檢測(cè)反應(yīng)復(fù)合物。
15.篩選樣品中短螺旋體物種的試劑盒，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體，所述試劑盒含有(i)根據(jù)權(quán)利要求2(vi)的多核苷酸；和(ii)檢測(cè)該多核苷酸和樣品中核苷酸序列之間形成的任何雙鏈體的手段。
16.篩選樣品中根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的試劑盒，所述試劑盒含有(i)根據(jù)權(quán)利要求8的抗體；(ii)檢測(cè)含有該抗體的反應(yīng)復(fù)合物的手段。
17.篩選樣品中根據(jù)權(quán)利要求8的抗體的試劑盒，所述試劑盒含有(i)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽；(ii)檢測(cè)含有該多肽的反應(yīng)復(fù)合物的手段。
18.治療動(dòng)物中與短螺旋體物種相關(guān)的疾病的方法，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體，所述方法包括對(duì)動(dòng)物施用有效劑量的選自以下的組合物(i)含有根據(jù)權(quán)利要求2(i)到(iv)的多核苷酸序列的組合物，所述多核苷酸序列采取適于引起表達(dá)該多核苷酸所編碼多肽的形式；(ii)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽；或(iii)與佐劑共存的(i)或(ii)。
19.治療動(dòng)物中與短螺旋體物種相關(guān)的疾病的方法，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體，所述方法包括對(duì)動(dòng)物施用有效劑量的含有根據(jù)權(quán)利要求2(v)的多核苷酸的組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的治療疾病的方法，其中疾病為腸螺旋體病。
21.使動(dòng)物對(duì)與短螺旋體物種相關(guān)的疾病免疫的方法，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體，所述方法包括施用致免疫劑量的選自以下的組合物(i)含有根據(jù)權(quán)利要求2(i)到(iv)的多核苷酸序列的組合物，所述多核苷酸序列采取適于引起表達(dá)該多核苷酸所編碼多肽的形式；(ii)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽；或(iii)與佐劑共存的(i)或(ii)。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中疾病為腸螺旋體病。
23.根據(jù)權(quán)利要求18到22中任一項(xiàng)的方法，其中動(dòng)物選自豬、雞、狗、馬、牛、綿羊、魚(yú)和人。
24.含有載體和(i)根據(jù)權(quán)利要求1的多肽；(ii)根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸；或(iii)根據(jù)權(quán)利要求8的抗體的組合物。
25.用于篩選的試劑盒，所述試劑盒至少含有與Bpmp-72編碼多核苷酸序列的一部分互補(bǔ)的多核苷酸序列、合適的容器及其使用說(shuō)明書(shū)。
26.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求2的多肽的用途，用于制造治療或預(yù)防與短螺旋體物種相關(guān)的疾病的藥物，其中短螺旋體物種包括但不僅限于豬痢疾短螺旋體、B.intermedia、B.alvinipulli、B.aalborgi和多毛結(jié)腸短螺旋體。
全文摘要
本發(fā)明涉及多毛結(jié)腸短螺旋體72kDa外膜蛋白(Bpmp－72)及其氨基酸和核苷酸序列。本發(fā)明還涉及這些序列在多毛結(jié)腸短螺旋體感染(腸螺旋體病)的預(yù)防(接種)和治療中的用途。
文檔編號(hào)A61P1/12GK1898385SQ200480038092
公開(kāi)日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者D·J·漢普森, T·拉 申請(qǐng)人:莫道什大學(xué), 諾瓦提斯公司