專利名稱：經(jīng)修飾環(huán)孢菌素用于治療hcv疾病的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非免疫抑制性環(huán)孢菌素的新用途。
環(huán)孢菌素包含一類一般具有藥學(xué)，特別是免疫抑制和抗炎活性的結(jié)構(gòu)獨(dú)特、環(huán)狀的聚-N-甲基化十一肽。第一種分離的環(huán)孢菌素為天然存在真菌代謝物環(huán)孢素，也已知為環(huán)孢菌素A。
環(huán)孢菌素A通過阻斷IL-2的轉(zhuǎn)錄起始作用干擾T細(xì)胞活化過程已非常確實(shí)。已經(jīng)顯示環(huán)孢菌素A與稱為親環(huán)蛋白的17kD胞質(zhì)蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，親環(huán)蛋白在許多細(xì)胞類型中發(fā)生且顯示與參與蛋白質(zhì)折疊的一種酶肽基-脯氨酰順式-反式異構(gòu)酶相同。
然而，發(fā)現(xiàn)結(jié)合親環(huán)蛋白對免疫抑制活性是必需的但不是充分標(biāo)準(zhǔn)。環(huán)孢菌素A/親環(huán)蛋白復(fù)合體也可與屬于磷酸酶超家族的稱為鈣依賴磷酸酶(CN)的細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)合。該結(jié)合消除了它的磷酸酶活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-AT的沉默。CN/NF-AT途徑的抑制是環(huán)孢菌素A介導(dǎo)的免疫抑制的基本機(jī)制。
已經(jīng)鑒定與親環(huán)蛋白強(qiáng)烈結(jié)合但不具有免疫抑制的環(huán)孢菌素。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中一種環(huán)孢菌素的活性為環(huán)孢菌素A的不超過5％，優(yōu)選不超過2％時，認(rèn)為該環(huán)孢菌素為非免疫抑制的?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)通過T.Meo在“Immunological Methods”L.Lefkovits和B.Peris，Eds.，Academic Press，N.Y.pp.227-239(1979)中進(jìn)行描述。來自Balb/c小鼠(雌性，8-10周)的脾細(xì)胞(0.5×106)與0.5×106個經(jīng)照射(2000拉德(rad))或經(jīng)絲裂霉素C處理的來自CBA小鼠(雌性，8-10周)的脾細(xì)胞共孵育5天。經(jīng)照射的同種異體細(xì)胞在Balb/c脾細(xì)胞中誘導(dǎo)增殖反應(yīng)，所述增殖反應(yīng)可通過經(jīng)標(biāo)記前體摻入到DNA中進(jìn)行測定。由于刺激細(xì)胞是經(jīng)照射的(或經(jīng)絲裂霉素C處理的)，它們對Balb/c細(xì)胞增殖不反應(yīng)但保持它們的抗原性。在平行實(shí)驗(yàn)中，在MLR中檢測化合物的IC50與平行實(shí)驗(yàn)中環(huán)孢菌素A的IC50進(jìn)行比較。此外，非免疫抑制性環(huán)孢菌素缺乏抑制CN及下游NF-AT途徑的能力。
EP 0 484 281 A1公開了非免疫抑制性環(huán)孢菌素在治療AIDS或AIDS相關(guān)疾病中用途。
現(xiàn)在令人驚訝的發(fā)現(xiàn)與親環(huán)蛋白結(jié)合的非免疫抑制性環(huán)孢菌素對丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制作用。
已認(rèn)為已鑒定為非甲、非乙型肝炎的主要病因的HCV的持續(xù)感染與肝病如慢性肝炎、肝硬化或肝細(xì)胞癌密切相關(guān)。這些肝病的發(fā)展是主要的公共衛(wèi)生問題。有效的抗HCV治療限制在用干擾素或干擾素與利巴韋林組合的治療。然而，由于不能自約半數(shù)用這些已知活性劑治療的HCV患者中清除病毒，所以仍強(qiáng)烈需要備選抗HCV活性劑。
因此，本發(fā)明提供了非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素在預(yù)防或治療丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)疾病中的用途。
丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)疾病為例如慢性肝炎、肝硬化和肝癌，例如肝細(xì)胞癌。非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素也可作為例如預(yù)防性治療HCV感染母親所生新生兒或暴露于所述病毒的衛(wèi)生保健人員應(yīng)用，或預(yù)防性治療移植受者，例如器官或組織移植受者，例如肝移植受者應(yīng)用以清除移植后可能的HCV感染的再次發(fā)生。
如果在通過Quesniaux在Eur.J.Immunol.1987 17 1359-1365中描述的競爭ELISA試驗(yàn)中，環(huán)孢菌素與人重組親環(huán)蛋白結(jié)合為環(huán)孢菌素A與親環(huán)蛋白結(jié)合的至少五分之一，那么認(rèn)為環(huán)孢菌素結(jié)合親環(huán)蛋白。在這個試驗(yàn)中，在親環(huán)蛋白與經(jīng)包被的BSA-環(huán)孢菌素A孵育期間，加入欲進(jìn)行試驗(yàn)的環(huán)孢菌素且計(jì)算無競爭劑時得到對照反應(yīng)的50％抑制的濃度(IC50)。結(jié)果以結(jié)合率(BR)表達(dá)，所述BR為測試化合物的IC50與環(huán)孢菌素A自身的同時進(jìn)行試驗(yàn)中IC50比率的以10為底數(shù)的對數(shù)。因此BR為1.0表明測試化合物對人親環(huán)蛋白的結(jié)合為環(huán)孢菌素A的十分之一，且負(fù)值表明結(jié)合強(qiáng)于環(huán)孢菌素A。對HCV具有活性的環(huán)孢菌素的BR為0.7以下，優(yōu)選等于或低于零。
非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素的實(shí)例包括例如式I的化合物。
其中W為MeBmt、二氫-MeBmt、8’-羥基-MeBmt或O-乙酰基-MeBmt1；X為αAbu、Val、Thr、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R為Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙酰基)；Y為MeLeu、硫代MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeaIle或MeaThr；N-乙基Val、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙?；?；Z為Val、Leu、MeVal或MeLeu，Q為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeAla或Pro，T1為(D)Ala或Lys，T2為MeLeu或γ-羥基-MeLeu，T3為MeLeu或MeAla。
優(yōu)選的式I的化合物為例如式Ia的化合物 其中W’為MeBmt、二氫-MeBmt或8’-羥基-MeBmt；X為αAbu、Val、Thr、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0thr)；R’為Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?；Y’為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla，MeaIle或MeaThr；N-乙基Val、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙酰基)；Z為Val、Leu、MeVal或MeLeu；且Q’為MeLeu、γ-羥基-MeLeu或MeAla。
基團(tuán)W’、X、Y’、Z、Q’及R’獨(dú)立地具有以下優(yōu)選重要性W’優(yōu)選W”其中W”為MeBmt或二氫-MeBmt；X優(yōu)選X’其中X’為αAbu或Nva，更優(yōu)選X”其中X”為αAbu；R’優(yōu)選R”其中R”為Sar；Y’優(yōu)選Y”其中Y”為γ-羥基-MeLeu、MeVal、MeThr、MeIle、N-乙基Ile或N-乙基Val；Z優(yōu)選Z’其中Z’為Val或MeVal；且Q’優(yōu)選Q”其中Q”為MeLeu；式Ia化合物的優(yōu)選基團(tuán)為W’為其中W”、X為X’、Y’為Y”、Z為Z’、Q’為Q”且R’為R”的基團(tuán)。
式Ia的優(yōu)選化合物的實(shí)例為例如a)[二氫-MeBmt]1-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢菌素；BR*＝0.1；IR＜1％b)[MeVal]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.1；IR＜1％c)[MeIle]4-環(huán)孢菌素；BR＝-0.2；IR＜1％d)[MeThr]4-環(huán)孢菌素；e)[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.4；IR＜1％f)[乙基-Ile]4-環(huán)孢菌素；BR＝0.1；IR＜2％g)[乙基-Val]4-環(huán)孢菌素；BR＝0；IR＜2％h)[Nva]2-[γ-羥基-MeLeu]4-環(huán)孢菌素；i)[γ-羥基-MeLeu]4-[γ-羥基-MeLeu]6-環(huán)孢菌素；j)[MeVal]5-環(huán)孢菌素；BR＝0.4；IR＝5.3％k)[MeOThr]2-[(D)MeAla]3-[MeVal]5-環(huán)孢菌素；l)[8’-羥基-MeBmt]1-環(huán)孢菌素；BR＝0.35；IR＝1.8％m)[MeAla]6-環(huán)孢菌素；BR＝-0.4；IR＝3.2n)[(γ-羥基-MeLeu]9-環(huán)孢菌素；BR＝0.15；IR＝2.9IR＝免疫抑制比率，以相對于環(huán)孢菌素A的活性百分?jǐn)?shù)表示。非免疫抑制性環(huán)孢菌素的其他實(shí)例為在WO 98/28330、WO 98/28329及WO 98/28328中公開的化合物，其內(nèi)容文中引用作為參考，例如式II的化合物 其中Wa為 其中Ra為式Ic或Id的殘基-CH2-CH＝CH-CH2-R4Ic 或-CH2-SH-R′4Id其中R4為C1-4烷硫基、氨基C1-4烷硫基、C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、二C1-4烷基氨基-C1-4烷硫基、嘧啶硫基、噻唑硫基，N-C1-4烷基咪唑硫基、羥基C1-4烷基苯硫基、羥基C1-4烷基苯氧基、硝基苯基氨基或2-氧代嘧啶-1-基，且R’4為C1-4烷基；Xa為Abu；Ra為-NMe-CH(Rb)-CO-其中Rb為H或-S-Alk-R0其中Alk-R0為甲基；或Alk為直鏈或支鏈C2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且R0為H；OH；COOH；C2-5烷氧基-羰基；NR1R2，其中每個R1及R2獨(dú)立地選自H、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C3-6環(huán)烷基及苯基，其每個任選由鹵素、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、C1-4烷基氨基和/或二C1-4烷基-氨基取代，及芐基和雜環(huán)基，所述芐基及雜環(huán)基為飽和或不飽和的并且含有5個或6個環(huán)成員和1至3個雜原子，或R1和R2一起與它們所連接的氮原子形成4-6元雜環(huán)，其可以含有選自氮、氧及硫的另一雜原子，且任選由C1-4烷基、苯基或芐基取代；或每個R1及R2獨(dú)立地為式Ib的基團(tuán)
其中R1及R2如上定義，R3為H或C1-4烷基且n為自2至4的整數(shù)；Ya為MeLeu或γ-羥基-MeLeu；Za為Val；且Qa為MeLeu，條件為當(dāng)Ya為MeLeu時，Rb不為H，或其可藥用鹽。
在式II中，當(dāng)R1和/或R2為雜環(huán)殘基時，它可為吡啶基、四氫吡啶基、哌啶基、咪唑基、唑基或噻唑基。例如，當(dāng)R1及R2與它們連接的氮原子形成雜環(huán)殘基時，雜環(huán)殘基可選自氮雜環(huán)丁烷基、哌啶基、哌嗪基、N-甲基-哌嗪基、N-苯基哌嗪基、N-芐基哌嗪基、吡啶基、咪唑基、嗎啉代、硫代嗎啉代、四氫吡啶基、甲基四氫吡啶基(例如4-甲基-四氫吡啶基)或苯基四氫吡啶基(例如，4-苯基四氫吡啶基)。
式I、Ia或II的化合物可以以多種方法獲得，所述方法可分為1)發(fā)酵2)生物轉(zhuǎn)化3)衍生4)部分合成5)全合成例如在EP 0 484 281 A1、WO 00/01715、WO 98/28330、WO 98/28329或WO 98/28328中公開的，其內(nèi)容此處引用作為參考。
在一系列進(jìn)一步特定或備選實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了1.1用于預(yù)防或治療需要其的受試者中丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)疾病的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物。
根據(jù)本發(fā)明，非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素可以以減輕或清除丙型肝炎的一種或多種病征或癥狀的有效量施用，例如有效降低受試者血清樣本中測定的HCV-RNA。
1.2用于抑制培養(yǎng)基中HCV復(fù)制的方法，其包括向這個培養(yǎng)基應(yīng)用有效量非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物。
1.3用于在需要其的患者中抑制HCV復(fù)制的方法，其包括向這個患者施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物。
1.4用于在需要其的移植受者中預(yù)防HCV感染再次發(fā)生的方法，其包括向所述受者施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物。
2.非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物的用途，用于制備用于如上定義的任意方法中使用的藥物組合物。
3.用于在如上定義的任意方法中應(yīng)用的藥物組合物，其包含非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物，以及一種或多種可藥用稀釋劑或載體。
非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素(下文稱“本發(fā)明的環(huán)孢菌素”)在治療如上文說明的疾病及狀況中的效用可在標(biāo)準(zhǔn)動物或臨床試驗(yàn)中，例如根據(jù)下文描述的方法證實(shí)。
A.體外細(xì)胞培養(yǎng)Huh-7及MH-14細(xì)胞、HCV復(fù)制子細(xì)胞在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s修飾的Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。PH5CH8細(xì)胞在添加100ng/ml表皮生長因子、10μ/ml胰島素、0.36μg/ml氫化可的松、5μg/ml運(yùn)鐵蛋白、5μg/ml亞油酸、20ng/ml硒、4μg/ml胰高血糖素、10ng/ml催乳素、10μg/ml慶大霉素、200μg/ml卡那霉素及2％FBS的DMEM與F12培養(yǎng)基的1∶1混合物中培養(yǎng)。
免疫印跡分析如通過K.Watashi等人，Virology 2001，286，391-402描述的進(jìn)行免疫印跡分析。在這個實(shí)驗(yàn)中使用的一級抗體為抗NS5A、抗NS5B及抗β-肌動蛋白(Sigma)抗體。
間接免疫熒光分析如通過K.Watashi，同上描述的進(jìn)行間接免疫熒光分析。在這個實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的一級為抗NS5A及抗PDI(StressGen)抗體。
反轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)分析如通過生產(chǎn)商推薦的，用Sepasol-RNA I Super(nacalai tesque)對培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA進(jìn)行分離。根據(jù)生產(chǎn)商說明，用一步RNA PCR試劑盒(Takara)進(jìn)行RT-PCR分析。用于檢測2’，5’-寡腺苷酸合成酶及依賴雙鏈RNA的蛋白激酶的mRNA的引物分別為5’-CCGTGAAGTTTGAGGTCCAG-3’、5’-GACTAATTCCAAGACCGTCCG-3’及5’-TGGCCGCTAAACTTGCATATC-3’、5’-GCGAGTGTGCTGGTCACTAAAG-3’。
Northern印跡分析如通過H.Kishine等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2002，47，119-125描述的進(jìn)行Nothern印跡分析。在這個實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的與NS5B序列互補(bǔ)的探針由H.Kishine，同上描述。
實(shí)時RT-PCR分析HCV基因組RNA的5’-UTR如通過T.Takeuchi等人，Gastroenterology，1999，116，636-642描述的用ABI PRISM 7700序列檢測儀(AppliedBiosystems)進(jìn)行定量。在這個實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的正向及反向引物分別為5’-CGGGAGAGCCATAGTGG-3’及5’-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3’。熒光探針為5’-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3’。作為內(nèi)部對照，核糖體RNA也用TaqMan核糖體RNA對照試劑(Applied Biosystems)進(jìn)行定量。
體外HCV感染實(shí)驗(yàn)體外HCV感染實(shí)驗(yàn)基本如通過N.Kato等人，Jpn.J.Cancer Res.1996，87，787-792和M.Ikada等人，Virus Res.，1998，56，157-167描述的進(jìn)行。PH5CH8細(xì)胞(1×105)用自HCV陽性血液供者制備的血漿1B-2(等價(jià)于104至105個HCV RNA拷貝)感染。接種后24小時，將細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌三次并用新鮮培養(yǎng)基維持。
轉(zhuǎn)染及報(bào)道基因測定根據(jù)生產(chǎn)商的方法，轉(zhuǎn)染到MH-14及H9細(xì)胞中分別用FuGENE 6(Roche)及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)進(jìn)行。報(bào)道基因測定如通過K.Watashi，同上描述的進(jìn)行。在這個研究中應(yīng)用的報(bào)道基因質(zhì)粒為pNFAT-Luc、pAP1-Luc、pNFKB-Luc(PathDetectReporter System；Stratagene)及pRL-TK(雙-螢光素酶報(bào)道基因測定系統(tǒng)；Promega)。
用MH-14細(xì)胞研究本發(fā)明的多種環(huán)孢菌素對HCV基因組復(fù)制的影響，在MH-14細(xì)胞中如在

圖1中顯示的HCV亞基因組復(fù)制子自主復(fù)制。用本發(fā)明的環(huán)孢菌素例如，1μg/ml的[MeIle]4-環(huán)孢菌素以及用作陽性對照的100U/mlIFNα處理7天，將HCV NS5A及NS5B蛋白質(zhì)的量降低到通過免疫印跡不可檢測到水平。間接免疫熒光分析顯示在用1μg/ml本發(fā)明的環(huán)孢菌素處理的所有細(xì)胞中，NS5A蛋白質(zhì)產(chǎn)生降低，而作為內(nèi)部對照的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)蛋白質(zhì)水平在這個條件下不變化。在這個測定中，本發(fā)明的環(huán)孢菌素降低HCV復(fù)制子細(xì)胞中HCV蛋白質(zhì)表達(dá)。
在用或不用本發(fā)明的環(huán)孢菌素或IFNα處理7天的MH-14細(xì)胞中，通過northern印跡分析對復(fù)制子RNA進(jìn)行分析。用例如1μg/ml本發(fā)明的環(huán)孢菌素，例如[MeIle]4-環(huán)孢菌素處理降低復(fù)制子RNA至不可檢測的水平。用100U/ml IFNα處理產(chǎn)生相似作用。另外，滴度逐漸降低且在第7天HCV RNA水平降低至原來的約1/400。對于用IFNα共同處理的情況，與用環(huán)孢菌素或IFNα的單一處理相比，在任意檢查時間點(diǎn)(第3、第5及第7天)，用IFNα共處理進(jìn)一步降低用環(huán)孢菌素及IFNα處理7天比單獨(dú)用IFNα處理的MH-14細(xì)胞中復(fù)制子RNA水平顯著降低。
此外，PH5CH8細(xì)胞(非贅生性肝細(xì)胞系)用HCV陽性血漿處理并隨后通過實(shí)時RT-PCR分析對接種后多個時間點(diǎn)的HCV RNA基因組滴度進(jìn)行定量。與第一天相比，在接種后第5天細(xì)胞中HCV RNA基因組滴度升高約10倍，而用本發(fā)明的環(huán)孢菌素，例如[MeIle]4-環(huán)孢菌素或IFNα連續(xù)處理的細(xì)胞中，在這些時間點(diǎn)沒有觀察到HCV RNA基因組滴度顯著增加。本發(fā)明的環(huán)孢菌素抑制經(jīng)HCV感染的培養(yǎng)肝細(xì)胞的復(fù)制。
結(jié)果在圖2E、2F及2G中顯示免疫印跡分析(2E)、間接免疫熒光分析(2F)及實(shí)時RT-PCR分析(2G)用[MeIle]4-環(huán)孢菌素(■)或非親環(huán)蛋白結(jié)合的環(huán)孢菌素(●)，例如6-[[R-(E)]-6，7-二脫氫-N，4-二甲基-3-氧-L-2-氨基辛酸]-7-L-纈氨酸-環(huán)孢菌素A處理的MH-14細(xì)胞進(jìn)行。A.2E及2F(第一排)中的對照，未處理；2E中的CysA，1μg/ml；2E(■)及2F(■)中的[MeIle]4-環(huán)孢菌素，1μg/ml；2E(●)及2F(●)中的非親環(huán)蛋白結(jié)合的環(huán)孢菌素，1μg/ml。
B.臨床試驗(yàn)總共15位慢性丙型肝炎感染患者參加了為期2周的研究。每位患者以7至15mg/kg p.o劑量接受本發(fā)明的環(huán)孢菌素，例如[MeIle]4-環(huán)孢菌素。在第0天及第14天測定每位患者中丙型肝炎抗原血清水平。
遭受丙型肝炎感染特別是慢性HCV感染的人可表現(xiàn)以下一種或多種病征或癥狀(a)ALT升高，(b)對抗HCV抗體檢測陽性，(c)通過對HCV-RNA檢測陽性確定HCV的存在，(d)慢性肝病的臨床特征，(e)肝細(xì)胞損害。此類標(biāo)準(zhǔn)可不僅用于診斷丙型肝炎，也可用于評估患者對藥物治療的反應(yīng)。
已知在不受控制的丙型肝炎中發(fā)生血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)升高，且對治療的完全反應(yīng)一般定義為這些血清酶，特別是ALT的正常化(Davis等人，1989，New Eng.J.Med.3211501-1506)。ALT為肝細(xì)胞受到破壞時釋放的酶且可表明HCV感染。
為了跟蹤受試者中HCV復(fù)制對藥物治療反應(yīng)的過程，可通過，例如嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)用來自HCV基因組N53及N54非結(jié)構(gòu)基因區(qū)的兩組引物測定血清樣本中HCV RNA。Farci等人，1991，New Eng.J.Med.32598-104。Ulrich等人，1990，J.Clin.Invest.，861609-1614。
肝臟活組織檢查樣本的組織學(xué)檢查可用第二種評估標(biāo)準(zhǔn)，參見，例如，Knodell等人，1981，Hepatology 1431-435，它的組織學(xué)活性指數(shù)(肝門發(fā)炎、碎片壞死或橋接壞死、小葉損傷及纖維樣變性)提供了疾病活性的記分法。
實(shí)施本發(fā)明的方法需要的日劑量將取決于例如，應(yīng)用的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素、宿主、施用方式、待治療疾病的嚴(yán)重度而變化。優(yōu)選的日劑量范圍為約每天自1至50mg/kg作為單次劑量或分份劑量。用于患者的合適日劑量為例如，1至20mg/kg p.o或靜脈內(nèi)注射。用于經(jīng)口施用的合適單位劑型包含大約0.25至10mg/kg活性成分，例如，[MeIle]4-環(huán)孢菌素，以及一種多種可藥用稀釋劑或載體。
本發(fā)明的環(huán)孢菌素可通過任意常規(guī)途徑施用，特別是經(jīng)腸施用，例如以用于飲用的溶液、片劑或膠囊形式經(jīng)口或，例如以可注射溶液劑或混懸劑形式腸胃外施用。優(yōu)選的藥物組合物可為例如，如在UK 2,222,770A中描述的基于微乳劑的藥物組合物。
本發(fā)明的環(huán)孢菌素可作為唯一成分或與其他藥物一起施用，所述其他藥物為例如具有抗HCV活性的藥物，例如干擾素，例如干擾素-α-2a或干擾素-α-2b，例如IntronRA、RoferonR、AvonexR、RebifR或BetaferonR，與水溶性聚合體或與人白蛋白結(jié)合的干擾素，例如albuferon，抗病毒劑，例如利巴韋林、拉米夫定、NV08或NM283，HCV編碼的因子如NS3/4A蛋白酶、解旋酶或RNA聚合酶的抑制劑或此種抑制劑的前體藥物，抗纖維變性劑，例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物，例如imatinib，免疫調(diào)節(jié)劑，例如霉酚酸、其鹽或前體藥物，例如霉酚酸鈉或霉酚酸酯或S1P受體激動劑，例如FTY720或任選磷酸化的其類似物，例如在EP627406A1、EP778263A1、EP1002792A1、WO02/18395、WO02/76995、WO02/06268、JP2002316985、WO03/29184、WO03/29205、WO03/62252及WO03/62248中公開的那些。
干擾素與水溶性聚合物的綴合物物表示特別包括與聚環(huán)氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物的綴合物。作為基于聚環(huán)氧烷聚合物的備選方案，可應(yīng)用有效非抗原性物質(zhì)如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等等。此類干擾素-聚合物綴合物在美國專利號4,766,106、4,917,888，歐洲專利申請?zhí)? 236 987、歐洲專利申請?zhí)? 510 356及國際申請公開號WO95/13090中描述。由于聚合修飾足可降低抗原性反應(yīng)，所以外來干擾素不必完全為自體的。用于制備聚合物綴合物的干擾素可自哺乳動物提取物，如人、反芻動物或牛干擾素制備，或重組產(chǎn)生。優(yōu)選的為干擾素與聚乙二醇的綴合物，也稱為聚乙二醇化干擾素。
特別優(yōu)選的干擾素綴合物為聚乙二醇化α-干擾素，例如聚乙二醇化干擾素-α-2a、聚乙二醇化干擾素-α-2b；聚乙二醇化共有干擾素或經(jīng)聚乙二醇化純化干擾素-α產(chǎn)物。聚乙二醇化干擾素-α-2a在歐洲專利593,868中描述且例如以商品名稱PEGASYS(Hoffmann-La Roche)可商業(yè)獲得。聚乙二醇化干擾素-α-2b例如在歐洲專利975,369中描述且例如以商品名稱PEG-INTRON A(Schering Plough)可商業(yè)獲得。聚乙二醇化共有干擾素在WO 96/11953中描述。優(yōu)選的聚乙二醇化α-干擾素為聚乙二醇化干擾素-α-2a及聚乙二醇化干擾素-α-2b。聚乙二醇化共有干擾素也是優(yōu)選的。
對于所用共同活性劑的日劑量取決于例如應(yīng)用的化合物、宿主、施用方式及欲進(jìn)行治療的疾病的嚴(yán)重度變化。例如拉米夫定可以日劑量100mg施用。聚乙二醇化干擾素可每周一至三次腸胃外施用，優(yōu)選每周一次，周總劑量為2百萬至1千萬國際單位(IU)，更優(yōu)選5百萬至1千萬國際單位，最優(yōu)選8百萬至1千萬國際單位。
根據(jù)上述內(nèi)容，本發(fā)明進(jìn)一步提供了以下方面4.藥物組合物，其包含a)第一種活性劑，其為非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物，和b)共同活性劑，例如，用于如上定義的任意方法的如上定義的第二種藥物。
5.如上定義的方法，所述方法包含例如相伴或順序共同施用治療有效量的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如式I、Ia或II的化合物和共同活性劑，例如以上定義的第二種藥劑。
如文中應(yīng)用的術(shù)語“共同施用”或“組合施用”等等表示包含對一名患者施用經(jīng)選擇的治療劑且欲包括治療方案，其中活性劑不必通過相同施用途徑或在相同時間施用。
本發(fā)明的藥物組合的施用與僅僅應(yīng)用它的藥物活性成分中一種的單一治療相比產(chǎn)生有益效果，例如協(xié)同治療效果。優(yōu)選的協(xié)同組合為非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素與任選綴合聚合物的干擾素的組合。
進(jìn)一步優(yōu)選的組合物為非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素與霉酚酸、其鹽或前體藥物，或與S1P受體激動劑，例如FTY720的組合。4-環(huán)孢菌素或[MeVal]4-環(huán)孢菌素是根據(jù)本發(fā)明應(yīng)用的優(yōu)選的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素。
權(quán)利要求
1.環(huán)孢菌素在制備用于預(yù)防或治療丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)的疾病的藥物組合物中的用途，其中所述環(huán)孢菌素(i)以0.7以下的結(jié)合比率(BR)結(jié)合人重組親環(huán)蛋白，BR為在競爭ELISA試驗(yàn)中測定的環(huán)孢菌素IC50與環(huán)孢菌素A在同時發(fā)生的試驗(yàn)中IC50比率的以10為底數(shù)的對數(shù)；和(ii)在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中活性不超過環(huán)孢菌素A的5％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素的用途，用于制備用于抑制HCV復(fù)制的藥物組合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素的用途，用于制備用于在移植受者中預(yù)防HCV感染再次發(fā)生的藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的用途，其中所述環(huán)孢菌素為式I的化合物 其中W為MeBmt、二氫-MeBmt、8’-羥基-MeBmt或O-乙?；?MeBmt1；X為αAbu、Val、Thr、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0Thr)；R為Pro、Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?；Y為MeLeu、硫代MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeaIle或MeaThr；N-乙基Val、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙?；?；Z為Val、Leu、MeVal或MeLeu，Q為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeAla或Pro，T1為(D)Ala或Lys，T2為MeLeu或γ-羥基-MeLeu，T3為MeLeu或MeAla；式Ia化合物 其中W’為MeBmt、二氫-MeBmt或8’-羥基-MeBmt；X為αAbu、Val、Thr、Nva或0-甲基蘇氨酸(Me0thr)；R’為Sar、(D)-MeSer、(D)-MeAla或(D)-MeSer(O乙?；?；γ’為MeLeu、γ-羥基-MeLeu、MeIle、MeVal、MeThr、MeAla、MeaIle或MeaThr；N-乙基Val、N-乙基Ile、N-乙基Thr、N-乙基Phe、N-乙基Tyr或N-乙基Thr(O乙?；?；Z為Val、Leu、MeVal或MeLeu；Q’為MeLeu、γ-羥基-MeLeu或MeAla；或式II的化合物 其中Wa為 其中Ra為式Ic或Id的殘基-CH2-CH＝CH-CH2-R4Ic 或-CH2-SH-R′4Id其中R4為C1-4烷硫基、氨基C1-4烷硫基、C1-4烷基氨基C1-4烷硫基、二C1-4烷基氨基-C1-4烷硫基、嘧啶硫基、噻唑硫基，N-C1-4烷基咪唑硫基、羥基C1-4烷基苯硫基、羥基C1-4烷基苯氧基、硝基苯基氨基或2-氧代嘧啶-1-基，R’4為C1-4烷基，Xa為Abu；Ra為-NMe-CH(Rb)-CO-其中Rb為H或-S-Alk-R0其中Alk-R0為甲基；或Alk為直鏈或支鏈C2-6亞烷基或C3-6環(huán)亞烷基且R0為H；OH；COOH；C2-5烷氧基-羰基；NR1R2，其中每個R1及R2獨(dú)立地選自H、C1-4烷基、C2-4鏈烯基、C3-6環(huán)烷基及苯基，其每個任選由鹵素、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、C1-4烷基氨基和/或二C1-4烷基-氨基取代，及芐基和雜環(huán)基，所述芐基及雜環(huán)基為飽和或不飽和的并且含有5個或6個環(huán)成員和1至3個雜原子，或R1和R2一起與它們所連接的氮原子形成4-6元雜環(huán)，其可以含有選自氮、氧及硫的另一雜原子，且任選由C1-4烷基、苯基或芐基取代；或每個R1及R2獨(dú)立地為式Ib的基團(tuán) 其中R1及R2為如上定義，R3為H或C1-4烷基且n為2至4的整數(shù)；Ya為MeLeu或γ-羥基-MeLeu；Za為Val；Qa為MeLeu、條件為當(dāng)Ya為MeLeu時，Rb不為H，或其可藥用鹽。
5.用于預(yù)防或治療丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)的疾病的藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素與一種或多種可藥用稀釋劑或載體。
6.藥物組合，其包含a)第一種活性劑，其為根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素，和b)具有抗HCV性質(zhì)的共同活性劑。
7.用于預(yù)防或治療丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)的疾病的藥物組合，其包含a)第一種活性劑，其為根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素，和b)選自具有抗HCV性質(zhì)的活性劑、抗纖維變性活性劑、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動劑的共同活性劑。
8.預(yù)防或治療需要其的受試者中丙型肝炎感染或HCV誘導(dǎo)的疾病的方法，其包括向所述受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
9.抑制培養(yǎng)基中HCV復(fù)制的方法，其包括向該培養(yǎng)基應(yīng)用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
10.抑制需要其的患者中HCV復(fù)制的方法，其包括向該受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
11.預(yù)防需要其的移植受者中HCV感染再發(fā)生的方法，其包括向所述受者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的環(huán)孢菌素。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11任意一項(xiàng)的方法，其包括相伴或順序共同施用治療有效量的如權(quán)利要求1定義的環(huán)孢菌素和選自具有抗HCV性質(zhì)的活性劑、抗纖維變性劑、免疫調(diào)節(jié)劑或S1P受體激動劑的共同活性劑。
全文摘要
公開了在預(yù)防或治療丙型肝炎感染中具有有用性質(zhì)的非免疫抑制性結(jié)合親環(huán)蛋白的環(huán)孢菌素，例如文中定義的式I、Ia或II的環(huán)孢菌素。
文檔編號A61P31/14GK1842343SQ200480024604
公開日2006年10月4日 申請日期2004年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月3日
發(fā)明者土方誠, 下遠(yuǎn)野邦忠, 渡士幸一 申請人:諾瓦提斯公司