專利名稱：造血干細(xì)胞及其治療新生血管性眼疾的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)源于骨髓的分離的、哺乳動(dòng)物的、譜系陰性的造血干細(xì)胞(Lin-HSC)及其應(yīng)用。更特別地，本發(fā)明涉及含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的分離的、哺乳動(dòng)物的、譜系陰性的造血干細(xì)胞(Lin-HSC)群。本發(fā)明還涉及通過(guò)施用Lin-HSC與轉(zhuǎn)染的Lin-HSC群至眼部來(lái)治療眼血管疾病。
背景技術(shù)：
遺傳性視網(wǎng)膜變性影響了多達(dá)1/3500的人，其特征是進(jìn)行性夜盲、視野缺損、視神經(jīng)萎縮、小動(dòng)脈變細(xì)、血管透性改變及通常會(huì)發(fā)展為全盲的視野中心缺損(Heckenlively，J.R.，editor，1988；RetinitisPigmentosa，PhiladelphiaJB Lippincott Co.)。這些疾病的分子遺傳學(xué)分析在超過(guò)110種不同的基因中識(shí)別出突變，但這些基因僅能對(duì)已知受疾病困擾的個(gè)體中相對(duì)較小比例做出解釋(Humphries等.，1992，Science 256804-808；Farrar等.2002，EMBO J.21857-864.)。這些突變中很多都與包括視紫紅質(zhì)、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白及RPE65在內(nèi)的光轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的酶與結(jié)構(gòu)組分相聯(lián)系。盡管具有這些觀察資料，但仍沒有減緩或逆轉(zhuǎn)這些視網(wǎng)膜變性疾病進(jìn)一步發(fā)展的有效治療手段。在將野生型的轉(zhuǎn)基因傳遞到攜帶特定突變的動(dòng)物光感受器或視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)時(shí)，基因治療上的新進(jìn)展已實(shí)現(xiàn)了小鼠中rds(Ali等.2000，Nat.Genet.25306-310)及rd(Takahashi等.1999，J.Virol.737812-7816)表型與狗中RPE65表型(Acland等.2001，Nat.Genet.2892-95)的成功逆轉(zhuǎn)。
年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)與糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是工業(yè)化國(guó)家中視力損害的主要原因，它們由異常的視網(wǎng)膜新生血管導(dǎo)致。由于視網(wǎng)膜由各層結(jié)構(gòu)清晰的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)與血管這些元件組成，因此諸如血管增生或水腫這樣相對(duì)微小的紊亂都會(huì)導(dǎo)致視覺功能的顯著喪失。遺傳性視網(wǎng)膜變性，例如色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，也與諸如動(dòng)脈狹窄及血管萎縮之類的血管異常相關(guān)。雖然在確定那些促進(jìn)及抑制血管新生的因子方面已取得了顯著進(jìn)展，但目前仍沒有專門治療眼血管疾病的有效治療手段。
多年來(lái)已知在正常成人循環(huán)系統(tǒng)與骨髓中存在一個(gè)干細(xì)胞群。這些細(xì)胞可按照造血譜系陽(yáng)性(Lin+)或譜系陰性(Lin-)兩個(gè)譜系區(qū)分為不同的亞群。此外，近來(lái)表明譜系陰性的造血干細(xì)胞(HSC)群體含有能夠在體外和體內(nèi)形成血管的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)(參見Asahara等.1997，Science 275964-7)。這些細(xì)胞能夠參與正常的和病理的出生后血管新生(參見Lyden等.2001 Nat.Med.7，1194-201；Kalka等.2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.973422-7；及Kocher等.2001，Nat.Med.7430-6)并分化成包括肝細(xì)胞(參見Lagasse等.2000，Nat.Med.61229-34)、小膠質(zhì)細(xì)胞(參見Priller等.2002 Nat.Med.71356-61)、心肌細(xì)胞(參見Orlic等.2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9810344-9)及上皮細(xì)胞(參見Lyden等.2001，Nat.Med.71194-1201)在內(nèi)的多種非內(nèi)皮細(xì)胞類型。盡管這些細(xì)胞已經(jīng)應(yīng)用在血管新生的數(shù)個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，但EPC作用于新生血管的機(jī)制仍不清楚，尚無(wú)法確定能夠有效增加針對(duì)特定血管的細(xì)胞數(shù)目的策略。
來(lái)源于骨髓的造血干細(xì)胞是目前唯一一種普遍用于治療用途的干細(xì)胞。骨髓HSC在移植上已經(jīng)應(yīng)用了40多年。目前，正在研究可獲得純化的干細(xì)胞的先進(jìn)方法以發(fā)展出針對(duì)白血病、淋巴瘤及遺傳性血液疾病的治療手段。已在有限數(shù)目的患者中進(jìn)行了干細(xì)胞在人體中臨床糖尿病及晚期腎癌治療方面的應(yīng)用的研究。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的、哺乳動(dòng)物的、不在細(xì)胞表面表達(dá)譜系表面抗原(Lin)的造血干細(xì)胞(HSCs)群，即譜系陰性的造血干細(xì)胞(Lin-HSCs)。本發(fā)明的Lin-HSC群含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，也稱內(nèi)皮前體細(xì)胞，可以在經(jīng)玻璃體內(nèi)注射至眼中后選擇性地作用于活化的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞。本發(fā)明的Lin-HSCs優(yōu)選地來(lái)源于成體哺乳動(dòng)物骨髓，更優(yōu)選地來(lái)源于成人骨髓。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的Lin-HSC群通過(guò)抽取一只成體哺乳動(dòng)物的骨髓、從骨髓中分離多種單核細(xì)胞、使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體標(biāo)記這些單核細(xì)胞，除去譜系表面抗原陽(yáng)性的單核細(xì)胞然后回收含EPCs的Lin-HSCs群的方式，來(lái)進(jìn)行分離。優(yōu)選地，單核細(xì)胞使用針對(duì)選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a(血型糖蛋白A)的一種或多種譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明分離的Lin-HSC群中至少約20％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
本發(fā)明Lin-HSC群中的EPC′s廣泛地整合到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管中，并持續(xù)穩(wěn)定地整合至眼新生血管。使用本發(fā)明分離的Lin-HSC群可在哺乳動(dòng)物中恢復(fù)并穩(wěn)定變性中的視網(wǎng)膜血管，從而拯救神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而推動(dòng)缺血組織的修復(fù)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的Lin-HSC群中的細(xì)胞使用治療上有用的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。例如，細(xì)胞可使用能編碼選擇性作用于新生血管并抑制新血管形成、卻不影響已存在血管的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑或者抗血管新生試劑的多聚核苷酸，通過(guò)一種基于細(xì)胞的基因治療方式來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的Lin-HSC群含有一種編碼血管新生抑制肽的基因。血管新生抑制的Lin-HSCs在調(diào)節(jié)諸如ARMD、DR及與異常血管相關(guān)聯(lián)的某些視網(wǎng)膜變性疾病中的異常血管生長(zhǎng)方面具有功效。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明分離的Lin-HSC群含有編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)肽的基因。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的Lin-HSCs在包括諸如青光眼、視網(wǎng)膜色素變性及其它類似與視神經(jīng)變性相關(guān)的眼疾中的促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)方面具有功效。
使用本發(fā)明分離的Lin-HSC群治療眼疾的一個(gè)特殊優(yōu)點(diǎn)，是在使用Lin-HSCs進(jìn)行玻璃體內(nèi)治療的眼中觀察到血管營(yíng)養(yǎng)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的修復(fù)效果。在使用本發(fā)明分離的Lin-HSCs處理過(guò)的眼中，視網(wǎng)膜神經(jīng)元及光感受器得到保護(hù)，視覺功能也得以維持。本發(fā)明提供了一種包括施用從骨髓中分離的Lin-HSC細(xì)胞來(lái)治療視網(wǎng)膜變性的方法，該Lin-HSC細(xì)胞含有能選擇性作用于活化的視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞，其中至少50％的分離的Lin-HSCs表達(dá)表面抗原CD31并且至少50％的分離的Lin-HSCs表達(dá)表面抗原CD 117(c-kit)。
本發(fā)明還提供一種從成體哺乳動(dòng)物骨髓中，優(yōu)選地是從成人骨髓中分離含內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性造血干細(xì)胞群的方法。此外，可以從用于視網(wǎng)膜血管再生或修復(fù)性治療以及用于治療或改善視網(wǎng)膜神經(jīng)組織變性的人Lin-HSCs中獲得遺傳上一致的細(xì)胞系(即無(wú)性繁殖系)。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1(a與b)描述的是小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育示意圖。(a)原發(fā)叢的發(fā)育。(b)視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。GCL，節(jié)細(xì)胞層；IPL，內(nèi)網(wǎng)層；INL；內(nèi)核層；OPL，外網(wǎng)層；ONL，外核層；RPE，視網(wǎng)膜色素上皮；ON，視神經(jīng)；P，外周部。
圖1c描述的是來(lái)源于骨髓的Lin+HSC與Lin-HSC分離細(xì)胞的流式細(xì)胞儀特征圖。頂行非抗體標(biāo)記細(xì)胞的二維點(diǎn)圖分布，其中R1表示陽(yáng)性PE-染色可定量的區(qū)域；R2表示GFP-陽(yáng)性；中間行Lin-HSC(C57B/6)與底行Lin+HSC(C57B/6)細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞系使用針對(duì)Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-聯(lián)接抗體進(jìn)行標(biāo)記。Tie-2數(shù)據(jù)由Tie-2-GFP小鼠中獲得。百分比表示在整個(gè)Lin-HSC與Lin+HSC群中陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。
圖2描述的是Lin-HSCs進(jìn)入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的植入過(guò)程。(a)在注射4天后(P6)玻璃體內(nèi)注射的eGFP+Lin-HSC細(xì)胞在視網(wǎng)膜上附著并分化(b)Lin-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，使用β-抗體染色)在使用膠原蛋白IV抗體染色的血管(星號(hào)表示血管頂端)前面定植。(c)在注射后4天(P6)絕大多數(shù)Lin+HSC細(xì)胞(eGFP+)不能分化。(d)注射后4天(P6)腸系膜eGFP+鼠的EC。(e)注射入成體小鼠眼中的Lin-HSCs(eGFP+)。(f)在GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠中定位并沿著已存在的星型膠質(zhì)細(xì)胞模板分化的eGFP+Lin-HSCs(箭頭處)的低倍放大。(g)Lin-細(xì)胞(eGFP)與其下面的星型膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭處)之間聯(lián)接的較高倍數(shù)放大。(h)沒有注射GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因的對(duì)照。(i)注射后4天(P6)，eGFP+Lin-HSCs遷至更深處的神經(jīng)叢區(qū)域并在此進(jìn)行分化。左圖在一個(gè)視網(wǎng)膜全樣載片中記錄到Lin-HSC活性；右圖表示的是視網(wǎng)膜中(頂部是玻璃體一側(cè)，底部是鞏膜一側(cè))Lin-細(xì)胞(箭頭處)的位置。(j)使用α-CD31-PE及α-GFP-alexa 488抗體進(jìn)行雙標(biāo)記。注射后7天，所注射的Lin-HSC(eGFP，紅色)整合到血管中(CD31)。箭頭指明整合區(qū)域。(k)eGFP+Lin-HSC細(xì)胞在注射后14天(P17)形成血管。(l與m)心內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖表明該血管完整無(wú)缺，在原發(fā)叢(l)與深處的血管叢(m)中均有功能。
圖3(a與b)表示的是eGFP+Lin-HSC細(xì)胞定位在成熟視網(wǎng)膜中由激光(a)與機(jī)械(b)損傷(星號(hào)表明損傷位點(diǎn))所誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)增生部位(由表達(dá)GFAP的星型膠質(zhì)細(xì)胞表示，最左圖)。最右圖是一幅較高倍數(shù)放大圖，表示的是Lin-HSCs與星型膠質(zhì)細(xì)胞的緊密聯(lián)系。刻度尺＝20μM。
圖4顯示的是Lin-HSC細(xì)胞修復(fù)視網(wǎng)膜變性小鼠的血管。(a-d)注射后27天(P33)使用膠原蛋白IV染色的視網(wǎng)膜；(a)與(b)，使用Lin+HSC細(xì)胞(Balb/c)注射的視網(wǎng)膜與普通FVB小鼠在血管系統(tǒng)沒有表現(xiàn)出差異；(c)與(d)使用Lin-HSCs細(xì)胞(Balb/c)注射的視網(wǎng)膜表現(xiàn)出與野生型小鼠同源的豐富的血管網(wǎng)絡(luò)；(a)與(c)使用DAPI染色的完整視網(wǎng)膜(頂部是玻璃體一側(cè)，底部是鞏膜一側(cè))的冰凍切片；(b)與(d)視網(wǎng)膜所有數(shù)量的深層血管叢；(e)以圖例說(shuō)明在注射了Lin-HSC細(xì)胞的視網(wǎng)膜中，形成深層血管叢的血管分布有所增加的條線圖(n＝6)。深層視網(wǎng)膜血管形成的程度通過(guò)計(jì)算每幅圖像中血管的總長(zhǎng)度來(lái)定量。比較了Lin-HSC、Lin+HSC或者對(duì)照的視網(wǎng)膜中血管平均總長(zhǎng)度/高倍視野(以微米為單位)。(f)使用來(lái)源于rd/rd小鼠的Lin-HSC細(xì)胞(R，右眼)或者Lin+HSC細(xì)胞(L，左眼)進(jìn)行注射后深層血管叢長(zhǎng)度的比較。給出了6只無(wú)關(guān)系的小鼠的結(jié)果(一種顏色代表一種小鼠)。(g)與(h)Lin-HSC細(xì)胞(Balb/c)在注射至P15眼中時(shí)還修復(fù)了rd/rd血管。給出了注射至視網(wǎng)膜的Lin-HSC細(xì)胞(G)或者Lin+HSC細(xì)胞(H)的中間及深層血管叢。
圖5描述的是小鼠視網(wǎng)膜組織的顯微照片。(a)視網(wǎng)膜全樣載片(rd/rd小鼠)的深層，使用eGFP+Lin-HSCs注射后五天(P11)可見(灰色部分)。(b)與(c)于P6時(shí)接受Balb/c Lin-細(xì)胞(b)或者Lin+HSC細(xì)胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60時(shí)刻視網(wǎng)膜血管。在(b)和(c)的左圖中只有內(nèi)源內(nèi)皮細(xì)胞(GFP-染色)是可見的。(b)和(c)的中圖是使用CD31抗體進(jìn)行染色的，箭頭表明使用CD31而不用GFP染色的血管，(b)和(c)的右圖顯示的是同時(shí)使用GFP與CD31染色。(d)注射Lin-HSC(左圖)與對(duì)照視網(wǎng)膜(右圖)的α-SMA染色。
圖6顯示的是T2-TrpRS-轉(zhuǎn)染的Lin-HSCs抑制小鼠視網(wǎng)膜血管的發(fā)育。(a)人TrpRS、T2-TrpRS以及在氨基末端帶有Igk信號(hào)序列的T2-TrpRS的示意圖。(b)注射了使用T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin-HSC的視網(wǎng)膜，在體內(nèi)表達(dá)T2-TrpRS蛋白。(1)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(2)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(3)在大腸桿菌中產(chǎn)生的重組T2-TrpRS；(4)對(duì)照視網(wǎng)膜；(5)注射Lin-HSC+pSecTag2A(只是載體)的視網(wǎng)膜；(6)注射Lin-HSC+pKLel35(在pSecTag中有Igk-T2-TrpRS)的視網(wǎng)膜。(a)內(nèi)源TrpRS。(b)重組T2-TrpRS。(c)注射入視網(wǎng)膜中的Lin-HSC的T2-TrpRS。(c-f)注射后7天，接受注射的視網(wǎng)膜中具有代表性的原發(fā)(表層的)與次級(jí)(深層的)血管叢；(c)與(d)使用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Lin-HSC進(jìn)行注射的眼發(fā)育正常；(e)與(f)使用T2-TrpRS-轉(zhuǎn)染的Lin-HSC進(jìn)行注射的眼，多數(shù)表現(xiàn)出深層血管叢受到抑制；(c)與(e)原發(fā)(表層的)血管叢；(d)與(f)次級(jí)(深層的)血管叢。在(f)中觀察到的較弱的血管輪廓是(e)中原發(fā)網(wǎng)絡(luò)血管的“相互滲透”圖像。
圖7顯示的是編碼His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的DNA序列，SEQ IDNO1。
圖8顯示的是His6-標(biāo)記的T2-TrpRS的氨基酸序列，SEQ ID NO2。
圖9所示的是使用本發(fā)明中Lin-HSC以及Lin+HSC(對(duì)照)進(jìn)行眼內(nèi)注射的小鼠視網(wǎng)膜顯微照片與視網(wǎng)膜電圖(ERG)。
圖10描述的統(tǒng)計(jì)圖表明使用Lin-HSC進(jìn)行治療的rd/rd小鼠眼中中間(Int.)及深層血管層的神經(jīng)元修復(fù)(y-軸)與血管修復(fù)(x-軸)之間存在相關(guān)關(guān)系。
圖11描述的統(tǒng)計(jì)圖表明使用Lin+HSC進(jìn)行治療的rd/rd小鼠眼中神經(jīng)元修復(fù)(y-軸)與血管修復(fù)(x-軸)之間沒有相關(guān)關(guān)系。
圖12是一幅在注射后1個(gè)月(1M)、2個(gè)月(2M)以及6個(gè)月(6M)的時(shí)間點(diǎn)上，使用Lin-HSC對(duì)rd/rd小鼠眼進(jìn)行治療(暗條)以及未對(duì)rd/rd小鼠眼進(jìn)行治療(亮條)且以任意相對(duì)的單位給出的血管長(zhǎng)度(y-軸)的條線圖。
圖13包括3個(gè)在注射后1個(gè)月(1M)、2個(gè)月(2M)及6個(gè)月(6M)的rd/rd小鼠外核層(ONR)中核數(shù)目的條線圖，并表明相對(duì)于使用Lin+HSC進(jìn)行治療的對(duì)照眼(亮條)，使用Lin-HSC進(jìn)行治療的眼(暗條)中核的數(shù)目有顯著增長(zhǎng)。
圖14描述的是在單個(gè)rd/rd小鼠中，在1個(gè)月(1M)、2個(gè)月(2M)及6個(gè)月(6M)的時(shí)間點(diǎn)(注射后)上，右眼(R，使用Lin-HSC治療)與左眼(L，使用Lin+HSC治療的對(duì)照眼)相比較，表示其中外核層中核數(shù)目的點(diǎn)；在給定點(diǎn)上的每條線比較的是同一個(gè)小鼠的左右眼。
圖15描述的是在rd1/rd1小鼠(C3H/HeJ，左圖)或野生型小鼠(C57BL/6，右圖)中視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)細(xì)胞的變化。給出了同一個(gè)視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜全樣載片(紅色膠原蛋白IV，綠色CD31)及切片(紅色DAPI，綠色CD31，下圖)中，中間(上圖)或者深層(中圖)血管叢的視網(wǎng)膜血管(P出生后天數(shù))(GCL節(jié)細(xì)胞層；INL內(nèi)核層；ONL外核層)。
圖16表示的是注射Lin-HSC修復(fù)rd/rd小鼠中神經(jīng)細(xì)胞的變性。A、B與C，在P30(A)、P60(B)及P180(C)時(shí)，中間(int.)或者深層血管叢的視網(wǎng)膜血管以及注射Lin-HSC的眼(右圖)與對(duì)側(cè)的注射對(duì)照細(xì)胞(CD31-)的眼(左圖)的切片，D，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)及P180(右圖，n＝6)時(shí)使用Lin-HSC注射或者使用對(duì)照細(xì)胞(CD31-)注射的視網(wǎng)膜中血管的平均總長(zhǎng)度(+或者-平均值的標(biāo)準(zhǔn)差)。分別給出中間(Int.)與深層血管叢的數(shù)據(jù)(Y軸血管的相對(duì)長(zhǎng)度)。E，在使用對(duì)照細(xì)胞(CD31-)進(jìn)行注射或者使用Lin-HSC進(jìn)行注射的視網(wǎng)膜中，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)及P180(右圖，n＝6)時(shí)ONL中細(xì)胞核的平均數(shù)(Y軸ONL中細(xì)胞核的相對(duì)數(shù)目)。F，在P30(左圖)、P60(中圖)及P180(右圖)時(shí)使用Lin-HSC注射或者使用對(duì)照細(xì)胞(CD31-)注射的視網(wǎng)膜中，血管長(zhǎng)度(X軸)與ONL中細(xì)胞核數(shù)目(Y軸)之間的線性相關(guān)。
圖17表示的是通過(guò)注射Lin-HSC修復(fù)了視網(wǎng)膜的功能。使用視網(wǎng)膜電圖(ERG)記錄來(lái)測(cè)量注射到視網(wǎng)膜中的Lin-HSC或?qū)φ占?xì)胞(CD31-)的功能。A與B，注射后2個(gè)月得到恢復(fù)的與未恢復(fù)的視網(wǎng)膜的典型例子。給出了同一只動(dòng)物中，注射了Lin-HSC的右眼(A)與注射了CD31-對(duì)照細(xì)胞的左眼(B)的視網(wǎng)膜切片(綠色使用CD31染色的血管，紅色使用DAPI染色的核)。C，A與B中所示的同一只動(dòng)物的EPG結(jié)果。
圖18所示的是人骨髓細(xì)胞群能夠在rd1小鼠中修復(fù)變性的視網(wǎng)膜(A-C)。在rd10——小鼠另一個(gè)視網(wǎng)膜變性模型中，也觀察到這種修復(fù)(D-K)。A，使用綠色染料標(biāo)記的人Lin-HSCs(hLin-HSCs)能夠在玻璃體內(nèi)注射到C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠后分化為視網(wǎng)膜血管細(xì)胞。B與C，注射后1.5個(gè)月時(shí)，在使用Lin-HSC注射的眼(B)或?qū)?cè)的對(duì)照眼(C)中的視網(wǎng)膜血管(左圖上中間血管叢，下深層血管叢)與神經(jīng)細(xì)胞(右圖)。D-K，使用Lin-HSCs對(duì)rd10小鼠的修復(fù)(在P6時(shí)注射)。給出了在P21(DLin-HSCs，H對(duì)照細(xì)胞)、P30(ELin-HSCs，I對(duì)照細(xì)胞)、P60(FLin-HSCs，J對(duì)照細(xì)胞)及P105(GLin-HSCs，K對(duì)照細(xì)胞)時(shí)具代表性的視網(wǎng)膜(在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，獲得治療的眼與對(duì)照眼均來(lái)自同一只動(dòng)物)。視網(wǎng)膜血管(每幅圖的上圖為中間血管叢；每幅圖的中圖為深層血管叢)使用CD31(綠色)與膠原蛋白IV(紅色)染色。每幅圖的下圖顯示的是同一個(gè)視網(wǎng)膜的橫切面(紅色DAPI，綠色CD31)。
圖19顯示的是在使用Lin-HSCs治療后，晶體蛋白αA在修復(fù)的外核層細(xì)胞中表現(xiàn)出正調(diào)節(jié)，而在使用對(duì)照細(xì)胞處理的對(duì)側(cè)眼中沒有這種現(xiàn)象。左圖修復(fù)的視網(wǎng)膜中的IgG對(duì)照，中圖修復(fù)的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA，右圖在未修復(fù)的視網(wǎng)膜中的晶體蛋白αA。
圖20包含在使用本發(fā)明Lin-HSCs進(jìn)行治療的鼠類視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出正調(diào)節(jié)的基因的表格。(A)在使用鼠Lin-HSCs進(jìn)行治療的鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)量增加3倍的基因。(B)在使用鼠Lin-HSCs進(jìn)行治療的鼠視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出正調(diào)節(jié)的晶體蛋白基因。(C)在使用人Lin-HSCs進(jìn)行治療的鼠視網(wǎng)膜中表達(dá)量增加2倍的基因。(D)在使用人Lin-HSCs進(jìn)行治療的鼠視網(wǎng)膜中表現(xiàn)出正調(diào)節(jié)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或者生長(zhǎng)因子的基因。
圖21所示的是在本發(fā)明的CD133陽(yáng)性(DC133+)以及CD133陰性(CD133-)的人Lin-HSC群中，CD31與整聯(lián)蛋白α6的分布圖。
圖22所示的是在出生后的P0直至P30期間，于常規(guī)氧水平(含氧量正常)進(jìn)行飼養(yǎng)的野生型C57/B16小鼠出生后視網(wǎng)膜的發(fā)育。
圖23所示的是于P7至P12期間在高氧水平(含氧量高；75％氧)進(jìn)行飼養(yǎng)，隨后于P12至P17在含氧量正常情況下進(jìn)行飼養(yǎng)的野生型C57/B16小鼠中氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型。
圖24所示的是在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中通過(guò)使用本發(fā)明的Lin-HSC群來(lái)進(jìn)行治療的血管修復(fù)。
優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述干細(xì)胞可通過(guò)細(xì)胞表面抗原的分布來(lái)明確識(shí)別(詳細(xì)的討論參見《干細(xì)胞科學(xué)進(jìn)展與未來(lái)趨勢(shì)》，National Institutes of Health，Officeof Science Poiicy于2001年六月制定的報(bào)告，附錄E干細(xì)胞標(biāo)記，引入本文作為參考。
造血干細(xì)胞是能夠發(fā)育成多種血細(xì)胞類型的干細(xì)胞，例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板及紅細(xì)胞。譜系表面抗原是一組作為成熟血細(xì)胞譜系標(biāo)記的細(xì)胞表面蛋白，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-l(CD11bCD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)以及CD235a(血型糖蛋白A)。不在顯著水平上表達(dá)這些抗原的造血干細(xì)胞一般稱為譜系陰性(Lin-)。人造血干細(xì)胞一般表達(dá)其它諸如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133這樣的表面抗原。鼠造血干細(xì)胞一般表達(dá)其它諸如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1這樣的表面抗原。
本發(fā)明提供細(xì)胞表面不顯著表達(dá)“譜系表面抗原”(Lin)的分離的造血干細(xì)胞。這種細(xì)胞在本文中用來(lái)指“譜系陰性”或者“Lin-”造血干細(xì)胞。特別地，本發(fā)明提供了含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的Lin-造血干細(xì)胞群(Lin-HSCs)，它能夠整合到發(fā)育中的血管然后分化形成血管內(nèi)皮細(xì)胞。優(yōu)選地，分離的Lin-HSC群置于譬如磷酸緩沖鹽溶液(PBS)這樣的培養(yǎng)基中。
在本文以及附加的權(quán)利要求中，用語(yǔ)“成熟的”骨髓，包括出生后分離的骨髓，也就是與胚胎相對(duì)，從幼年及成體個(gè)體中分離的骨髓。術(shù)語(yǔ)“成體哺乳動(dòng)物”既指幼年的也指完全成熟的哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明提供含內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的分離的、哺乳動(dòng)物的、譜系陰性的造血干細(xì)胞(Lin-HSC)群。本發(fā)明分離的Lin-HSC群優(yōu)選地由其中至少約20％的細(xì)胞能夠表達(dá)表面抗原CD31，通常存在于內(nèi)皮細(xì)胞上的哺乳動(dòng)物細(xì)胞所組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少約50％，更優(yōu)選的是約65％，最優(yōu)選的是至少75％的細(xì)胞表達(dá)CD31。優(yōu)選地，本發(fā)明Lin-HSC群中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6抗原。
在一個(gè)優(yōu)選的鼠Lin-HSC群的實(shí)施例中，至少約50％的細(xì)胞表達(dá)CD31抗原，至少約50％的細(xì)胞表達(dá)CD117(c-kit)抗原。優(yōu)選地，至少約75％，更優(yōu)選約81％的Lin-HSC細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。在另一個(gè)優(yōu)選的鼠的實(shí)施例中，至少約65％，更優(yōu)選約70％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例是一個(gè)其中約50％至85％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31并且約70％至75％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117的鼠Lin-HSCs群。
另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是其中細(xì)胞為CD133陰性、至少約50％的細(xì)胞表達(dá)CD31表面抗原并且至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6抗原的人Lin-HSC群。而另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是其中細(xì)胞為CD133陽(yáng)性、少于約30％的細(xì)胞表達(dá)CD31表面抗原并且少于約30％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6抗原的人Lin-HSC群。
本發(fā)明中分離的Lin-HSC群在玻璃體內(nèi)注射到諸如小鼠或人這樣的哺乳動(dòng)物物種的眼中時(shí)，可選擇性地作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞并且整合到視網(wǎng)膜新生血管中，從其中分離細(xì)胞。
本發(fā)明中分離的Lin-HSC群含有能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞并在視網(wǎng)膜內(nèi)形成血管結(jié)構(gòu)的內(nèi)皮祖細(xì)胞。特別地，本發(fā)明的Lin-HSC群在治療視網(wǎng)膜新生血管與視網(wǎng)膜血管變性疾病方面具有用處，并能修復(fù)視網(wǎng)膜血管損傷。本發(fā)明的Lin-HSC細(xì)胞促進(jìn)視網(wǎng)膜中神經(jīng)元的修復(fù)并促進(jìn)抗細(xì)胞凋亡基因的正調(diào)節(jié)。一個(gè)不可思議的發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明中的成熟Lin-HSC細(xì)胞甚至能夠在患有視網(wǎng)膜變性的惡性復(fù)合免疫缺陷(SCID)小鼠中抑制視網(wǎng)膜變性。此外，Lin-HSC群能夠在諸如由氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變或者早熟性視網(wǎng)膜病變傷害的初生哺乳動(dòng)物眼中用來(lái)治療視網(wǎng)膜缺陷。
本發(fā)明還提供了一種在哺乳動(dòng)物中治療眼疾的方法，其包括由從哺乳動(dòng)物骨髓中分離含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群、以及將分離到的干細(xì)胞以足以抑制疾病的量玻璃體內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物眼中。本發(fā)明可以在初生的、幼年的或者完全成體的哺乳動(dòng)物中用來(lái)治療諸如視網(wǎng)膜變性疾病、視網(wǎng)膜血管變性疾病、局部缺血性視網(wǎng)膜病變、血管出血、血管滲漏及脈絡(luò)膜病變這樣的眼疾。這些疾病的實(shí)施例包括年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、擬眼組織胞漿菌病(POHS)、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病(ROP)、鐮狀細(xì)胞貧血與色素性視網(wǎng)膜炎，以及視網(wǎng)膜損傷。
注射到眼中的干細(xì)胞的數(shù)目應(yīng)該足以抑制眼睛的疾病狀態(tài)。例如，細(xì)胞的數(shù)目能夠有效修復(fù)眼視網(wǎng)膜損傷、穩(wěn)定視網(wǎng)膜新生血管、成熟視網(wǎng)膜新生血管并防止或者修復(fù)血管滲漏與血管出血。
可以使用諸如編碼基于細(xì)胞進(jìn)行基因治療的、用于眼中的抗血管新生蛋白的基因、以及編碼增強(qiáng)神經(jīng)元修復(fù)效果的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑的基因這樣的治療上有用的基因來(lái)轉(zhuǎn)染本發(fā)明中Lin-HSC群的細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以包括任何能用于治療視網(wǎng)膜障礙的治療上有用的基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中轉(zhuǎn)染的Lin-HSCs含有可操作地編碼抗血管新生肽的基因，該肽包括蛋白、或者諸如TrpRS或其抗血管新生的片段，例如在共同未決的美國(guó)專利申請(qǐng)No.10/080,839中所詳細(xì)描述的TrpRS的T1與T2片段，其公開所公開的內(nèi)容引入本申請(qǐng)作為參考。本發(fā)明中編碼抗血管新生肽的轉(zhuǎn)染的Lin-HSCs在治療諸如糖尿病視網(wǎng)膜病變及其它類似疾病這樣的與異常血管發(fā)育相關(guān)的視網(wǎng)膜疾病方面是有益的。Lin-HSCs優(yōu)選地是人細(xì)胞。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明中轉(zhuǎn)染的Lin-HSCs含有可操作地編碼諸如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以及其它類似的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑的基因。這類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的Lin-HSCs在促進(jìn)諸如青光眼與色素性視網(wǎng)膜炎、治療視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷等視網(wǎng)膜神經(jīng)變性疾病中的神經(jīng)元修復(fù)方面是有益的。已有報(bào)道植入睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可作為色素性視網(wǎng)膜炎的有效治療手段(參見Kirby等.2 001，Mol Ther.3(2)241-8；Farrar等.2002，EMBO Journal21857-864)。據(jù)報(bào)道腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可在受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)中調(diào)節(jié)與基因相關(guān)的生長(zhǎng)(參見Fournier，等.，1997，J.Neurosci.Res.47561-572)。據(jù)報(bào)道神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在色素性視網(wǎng)膜炎中能延緩光感受器的變性(參見McGee等.2001，Mol Ther.4(6)622-9)。
本發(fā)明還提供了一種從哺乳動(dòng)物骨髓中分離含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟(a)從成體哺乳動(dòng)物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細(xì)胞；(c)使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞，優(yōu)選地譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠的)、TER-119(鼠的)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細(xì)胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)；(d)從多種類型單核細(xì)胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并回收含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群，優(yōu)選地其中至少20％的細(xì)胞表達(dá)CD31。
當(dāng)從成人骨髓中分離Lin-HSC時(shí)，優(yōu)選地，使用針對(duì)譜系表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。當(dāng)從成體小鼠骨髓中分離Lin-HSC時(shí)，優(yōu)選地，使用針對(duì)譜系表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選的方法中，從成人骨髓中分離細(xì)胞并通過(guò)CD133譜系進(jìn)一步分離。一個(gè)優(yōu)選的分離人Lin-HSCs的方法包括使用生物素偶聯(lián)的CD133抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞及回收CD133陽(yáng)性的Lin-HSC群的額外步驟。典型地，少于約30％的此類細(xì)胞表達(dá)CD31并且少于約30％的此類細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6。本發(fā)明中CD133陽(yáng)性的人Lin-HSC群在注射到未發(fā)生血管新生的眼中時(shí)能夠作用于外周局部缺血所引發(fā)的新生血管的位點(diǎn)。
分離人Lin-HSC的另一個(gè)優(yōu)選方法包括使用生物素偶聯(lián)的CD133抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞、除去CD133陽(yáng)性的細(xì)胞并回收CD133陰性的Lin-HSC群的額外步驟。典型地，至少約50％的此類細(xì)胞表達(dá)CD31并且至少約50％的此類細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6。本發(fā)明中CD133陰性的人Lin-HSC群在注射到發(fā)生血管新生的眼中時(shí)能夠整合到發(fā)育中的血管中。
本發(fā)明還提供通過(guò)施用本發(fā)明中轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細(xì)胞、并將這些細(xì)胞玻璃體內(nèi)注射至眼中來(lái)治療眼血管新生疾病的方法。這些轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細(xì)胞包括能夠編碼抗血管新生或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)基因產(chǎn)物的治療上有用的基因轉(zhuǎn)染的Lin-HSC。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細(xì)胞是人細(xì)胞。
優(yōu)選地，至少約1×105個(gè)Lin-HSC細(xì)胞或者轉(zhuǎn)染的Lin-HSC細(xì)胞通過(guò)玻璃體內(nèi)注射至患有視網(wǎng)膜變性疾病的哺乳動(dòng)物眼中的方式來(lái)施用。所注射細(xì)胞的數(shù)目可依據(jù)視網(wǎng)膜變性的嚴(yán)重程度、哺乳動(dòng)物的年齡以及在治療視網(wǎng)膜變性領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的其它因素。在一個(gè)時(shí)期內(nèi)，Lin-HSC可以以單劑量或多劑量施用的方式施用，這由負(fù)責(zé)治療的臨床醫(yī)生決定。
本發(fā)明的Lin-HSCs在治療與傳導(dǎo)阻滯相關(guān)視網(wǎng)膜損傷與視網(wǎng)膜缺陷、或者視網(wǎng)膜血管變性或視網(wǎng)膜神經(jīng)變性這些方面是有益的。人Lin-HSC也能夠用來(lái)產(chǎn)生遺傳上相同的細(xì)胞系，即無(wú)性繁殖系，可以用在視網(wǎng)膜血管的再生性或修復(fù)性治療中，也可用于視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的改善治療。
方法實(shí)施例1.細(xì)胞分離與富集鼠Lin-HSC群A與B的制備常規(guī)步驟.所有體內(nèi)評(píng)估均依照《NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看護(hù)與使用指南》執(zhí)行，并且所有評(píng)估程序均獲得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動(dòng)物看護(hù)與使用委員會(huì)的認(rèn)可。從B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或者Balb/cBYJ成體小鼠(TheJackson Laboratory，ME)中提取骨髓細(xì)胞。
通過(guò)使用HISTOPAQUE蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度離心來(lái)分離單核細(xì)胞，并使用在小鼠中用于Lin-選擇的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體(CD45、CD3、Ly-6G、CD 11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)來(lái)標(biāo)記這些單核細(xì)胞。使用磁分離設(shè)備(AUTOMACSTMsorter，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)從Lin-HSC中分離譜系陽(yáng)性(Lin+)細(xì)胞并除去。所獲得的含內(nèi)皮祖細(xì)胞的Lin-HSC群使用下述抗體，PE-聯(lián)接的-Sca-1、c-kit、KDR及CD31(Pharmingen，San Diego，CA)利用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BectonDickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)來(lái)進(jìn)一步鑒定。Tie-2-GFP骨髓細(xì)胞被用來(lái)鑒定Tie-2。
為了獲得成體小鼠內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)外科手術(shù)從ACTbEGFP小鼠中分離腸系膜組織并置于膠原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化組織，然后使用45μm過(guò)濾器過(guò)濾。收集流通濾液并用內(nèi)皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Clonetics，San Diego，CA)溫育。通過(guò)觀察形態(tài)上鵝卵石樣外觀、使用CD31 mAb(Pharmingen)染色以及檢查培養(yǎng)物在MATRIGELTMmatrix(Beckton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)中形成管腔樣結(jié)構(gòu)，來(lái)確認(rèn)內(nèi)皮的性狀。
鼠Lin-HSC群A.通過(guò)上述的常規(guī)步驟從ACTbEGFP小鼠中提取骨髓細(xì)胞。Lin-HSC細(xì)胞通過(guò)FACS流式細(xì)胞儀來(lái)鑒定CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1與Tie-2細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。結(jié)果如圖1c所示。約81％的Lin-HSC顯示出CD31標(biāo)記，約70.5％的Lin-HSC顯示出c-kit標(biāo)記，約4％的Lin-HSC顯示出Sca-1標(biāo)記，約2.2％的Lin-HSC顯示出Flk-1標(biāo)記，約0.91％的Lin-HSC顯示出Tie-2標(biāo)記。相反，從這些骨髓細(xì)胞中分離的Lin+HSC具有顯著不同的細(xì)胞標(biāo)記圖譜(即，CD3137.4％；c-kit20％；Sca-12.8％；Flk-0.05％)。
鼠Lin-HSC群B.通過(guò)上述的常規(guī)步驟從Balb/C、ACTbEGFP及C3H小鼠中提取骨髓細(xì)胞。分析Lin-HSC細(xì)胞中存在的細(xì)胞表面抗原(Sca-1、KDR、c-kit、CD34、CD31及多種整聯(lián)蛋白αl、α2、α3、α4、α5、α6、αM、αV、αX、αIIb，，β1、β4、β3、β4、β5及β7)結(jié)果如表1所示。
表1.Lin-HSC群B的特征描述


實(shí)施例2.在鼠模型中玻璃體內(nèi)施用細(xì)胞使用鋒利的刀片在小鼠的眼瞼中割去一份眼瞼組織使得P2至P6期間眼球暴露在外。然后使用33號(hào)(Hamilton，Reno，NV)針頭注射器玻璃體內(nèi)注射本發(fā)明的譜系陰性的HSC群A(在約0.5μl至約1μl細(xì)胞培養(yǎng)基中大約有105個(gè)細(xì)胞)。
實(shí)施例3.EPC轉(zhuǎn)染根據(jù)廠商的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，利用FuGENETM6轉(zhuǎn)染試劑(Roche，Indianapolis，IN)，使用編碼TrpRS的T2片段且含有His6標(biāo)簽(SEQID NO1，圖7)的DNA轉(zhuǎn)染鼠Lin-HSC(群A)。Lin-HSC細(xì)胞(大約每ml 106細(xì)胞)懸浮在含有干細(xì)胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培養(yǎng)基中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然后加入DNA(約1μg)與FuGENE試劑(約3μl)，混合物于約37℃溫育約18小時(shí)。溫育后，清洗并收集細(xì)胞。經(jīng)FACS分析確認(rèn)該系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率大約為17％。T2產(chǎn)物利用Western印跡確認(rèn)。帶有His6標(biāo)簽的T2-TrpRS的氨基酸序列如圖8中SEQ ID NO2所示。
實(shí)施例4.免疫組織化學(xué)及共聚焦分析在多個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)收集小鼠視網(wǎng)膜，用來(lái)制備全樣載片或者冰凍切片。若制備全樣載片，視網(wǎng)膜使用4％的低聚甲醛固定，在50％胎牛血清蛋白(FBS)及20％普通羊血清中于室溫下封閉一小時(shí)。視網(wǎng)膜經(jīng)一抗處理后用二抗檢測(cè)。使用的一抗有抗膠原蛋白IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)，抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的二抗聯(lián)接了Alexa 488或者594熒光標(biāo)記(Molecular Probes，Eugene，OR)。利用MRC 1024共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA)獲取圖像。利用LASERSHARP軟件(Bio-Rad)創(chuàng)建三維圖像以檢查在視網(wǎng)膜全樣載片中三個(gè)不同血管層的發(fā)育。由共聚焦顯微鏡所辨別出的增強(qiáng)GFP(eGFP)小鼠與GFAP/wtGFP小鼠間GFP點(diǎn)密度的差異用來(lái)創(chuàng)建3D圖像。
實(shí)施例5.小鼠中體內(nèi)視網(wǎng)膜血管新生的定量檢驗(yàn)為了分析T2-TrpRS，從小鼠視網(wǎng)膜三維圖像重建了原發(fā)與深層血管叢。原發(fā)叢分為兩類正常發(fā)育，或者中斷的血管形成。深度血管發(fā)育抑制的分類是依據(jù)血管抑制的百分比建立的，包括以下標(biāo)準(zhǔn)深層血管叢形成受到完全抑制標(biāo)記為“完全”，正常血管發(fā)育(含少于25％的抑制)標(biāo)記為“正?！?，其余的標(biāo)記為“部分”。對(duì)于rd/rd小鼠的修復(fù)數(shù)據(jù)，使用10×透鏡記錄每個(gè)視網(wǎng)膜全樣載片中更深層血管叢的四個(gè)分開的區(qū)域。計(jì)算每幅圖像中血管的總長(zhǎng)，完成后在組間進(jìn)行比較。為了獲得精確的信息，將Lin-HSC注射到小鼠的一只眼中而將Lin+HSC注射到同一只小鼠的另一只眼中。未進(jìn)行注射用作對(duì)照的視網(wǎng)膜取自同一窩幼仔。
實(shí)施例6.成體視網(wǎng)膜損傷小鼠模型使用二極管激光(150mW，1秒，50mm)或者用27號(hào)針機(jī)械刺破小鼠視網(wǎng)膜建立激光及創(chuàng)傷模型。傷后5天，利用玻璃體內(nèi)方法注射細(xì)胞。5天后從小鼠中收集眼睛。
實(shí)施例7.視網(wǎng)膜變性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)由成體鼠骨髓獲得的譜系陰性的造血干細(xì)胞(Lin-HSC)在小鼠視網(wǎng)膜變性模型中具有血管營(yíng)養(yǎng)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)效果。玻璃體內(nèi)注射約0.5毫升含有約105個(gè)本發(fā)明的Lin-HSC至10天齡小鼠的右眼中，2個(gè)月后估算視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)層核數(shù)目。同一只小鼠的左眼使用大約相同數(shù)目的Lin+HSC注射作為對(duì)照，并進(jìn)行類似估算。如圖9所示，在使用Lin-HSC進(jìn)行治療的眼中，視網(wǎng)膜血管幾乎正常，內(nèi)核層基本正常，外核層(ONL)有約3至4層核。相反，對(duì)側(cè)使用Lin+HSC處理的眼其中視網(wǎng)膜血管層明顯萎縮，外視網(wǎng)膜血管層完全萎縮；內(nèi)核層明顯萎縮且外核層完全消失。在小鼠3與小鼠5的圖例中這種情況尤為明顯。在小鼠1中，未見修復(fù)效果，這種情況存在于大約15％接受注射的小鼠中。
使用視網(wǎng)膜電流圖(ERG)評(píng)定視覺功能時(shí)，當(dāng)觀測(cè)到血管與神經(jīng)修復(fù)(小鼠3與5)時(shí)可觀察到陽(yáng)性ERG的恢復(fù)。當(dāng)沒有血管與神經(jīng)修復(fù)(小鼠1)時(shí)，觀察不到陽(yáng)性ERG。施用本發(fā)明的Lin-HSC的rd/rd小鼠眼中血管與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)的關(guān)系通過(guò)回歸作圖形式在圖10中給出。在中間血管類型(r＝0.45)及深層血管(r＝0.67)中觀察到神經(jīng)元(y-軸)與血管(x-軸)之間的相關(guān)關(guān)系。
圖11所示的是施用Lin+HSC在血管與神經(jīng)元修復(fù)之間沒有任何統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)關(guān)系。對(duì)血管修復(fù)進(jìn)行量化，數(shù)據(jù)在圖12中給出。圖12中所示的注射后1個(gè)月(1M)、2個(gè)月(2M)及6個(gè)月(6M)的小鼠的數(shù)據(jù)，表明使用本發(fā)明的Lin-HSC進(jìn)行治療的眼中血管長(zhǎng)度(暗條)，與同一只小鼠未治療的眼中的血管長(zhǎng)度(亮條)相比，有了顯著增加，特別是在注射后1個(gè)月與2個(gè)月時(shí)更明顯。在注射Lin-HSC或者Lin+HSC約兩個(gè)月后通過(guò)計(jì)算內(nèi)外核層中神經(jīng)核的數(shù)目可以對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)效果進(jìn)行定量。結(jié)果如圖13與14所示。
實(shí)施例8.人Lin-HSC群通過(guò)上述常規(guī)步驟從健康成人志愿者中提取骨髓細(xì)胞。然后單核細(xì)胞通過(guò)使用HISTOPAQUE蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度離心進(jìn)行分離。為了從人骨髓單核細(xì)胞中分離Lin-HSC群，將下述生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體用于磁分離體系(AUTOMACSTMsorter，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。
基于CD133表達(dá)將人Lin-HSC群進(jìn)一步分為兩個(gè)亞群。細(xì)胞使用生物素偶聯(lián)的CD133抗體標(biāo)記并分為CD133陽(yáng)性與CD133陰性亞群。
實(shí)施例9在視網(wǎng)膜變性鼠模型中玻璃體內(nèi)施用人與鼠細(xì)胞C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID與rd10小鼠品系用作視網(wǎng)膜變性模型。C3H/HeJ與C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(TheJackson Laboratory，Maine)在導(dǎo)致早期發(fā)生嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性的視網(wǎng)膜變性1(rd1)突變上是同型的。該突變位于編碼桿狀光感受器cGMP磷酸二酯酶β亞基的Pde6b基因的外顯子7部分。已經(jīng)在常染色體隱性的色素性視網(wǎng)膜炎(RP)的人患者中發(fā)現(xiàn)了該基因的這個(gè)突變。C3SnSmu.CB17-Prkdc SCID小鼠在惡性復(fù)合免疫缺陷自發(fā)突變(Prkdc SCID)上也是同型的，且被用在人細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中。rd10小鼠中視網(wǎng)膜變性是由Pde6b基因的外顯子13中的突變導(dǎo)致的。這也是后期發(fā)作的與臨床有關(guān)的RP模型，而且是比rd1/rd1更輕微的視網(wǎng)膜變性。所有評(píng)估均依照《NIH實(shí)驗(yàn)動(dòng)物看護(hù)與使用指南》來(lái)執(zhí)行，并且所有的評(píng)估過(guò)程均獲得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動(dòng)物看護(hù)與使用委員會(huì)的認(rèn)可。
使用鋒利的刀片在小鼠的眼瞼中割去一份眼瞼組織使得P2至P6期間眼球暴露在外。然后使用33-號(hào)(Hamilton，Reno，NV)針頭注射器玻璃體內(nèi)注射鼠群A或者人群C的譜系陰性的HSC細(xì)胞(在約0.5μl至約1μl細(xì)胞培養(yǎng)基中大約有105個(gè)細(xì)胞)至小鼠眼中。為了使所注射的人細(xì)胞可見，在注射前使用染料(Cell tracker green CMFDA，Molecular Probes)標(biāo)記細(xì)胞。
在多個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)收集視網(wǎng)膜并用4％的低聚甲醛(PFA)與甲醇固定，接著在50％FBS/20％NGS中于室溫封閉一小時(shí)。為了給視網(wǎng)膜血管染色，使用抗CD31(Pharmingen)及抗膠原蛋白IV(Chemicon)之后接著用Alexa 488或594聯(lián)接的二抗(MolecularProbes，Eugene，Oregon)溫育視網(wǎng)膜。按四個(gè)徑向上減緩切口的方式平放視網(wǎng)膜以獲得全樣載片標(biāo)本。中間或深層血管叢(參見Dorrell等.2002 Invest Ophthalmol.Vis.Sci.433500-3510)中的血管圖像利用MP2100共聚焦顯微鏡及LASERSHARP軟件(Biorad，Hercules，Califomia)獲得。為了量化血管，從中間或深層血管層的中間部分隨機(jī)選擇四個(gè)獨(dú)立的區(qū)域(900μm×900μm)，使用LASERPIX分析軟件(Biorad)測(cè)量血管的總長(zhǎng)。同一個(gè)血管叢中這四個(gè)區(qū)域的總長(zhǎng)度被用來(lái)做進(jìn)一步的分析。
重新包埋壓片的視網(wǎng)膜用于冰凍切片。視網(wǎng)膜置于4％PFA中過(guò)夜然后用20％的蔗糖溫育。視網(wǎng)膜包埋在最佳切割溫度化合物(OCTTissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中。冰凍切片(10μm)在含有核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中再次水合。通過(guò)共聚焦顯微鏡獲得含有視神經(jīng)頭部及整個(gè)周邊視網(wǎng)膜的單個(gè)切片中三個(gè)不同區(qū)域(280μm寬，無(wú)偏采樣)的DAPI標(biāo)記的核圖像。對(duì)位于一個(gè)切片三個(gè)獨(dú)立區(qū)域ONL中的核的數(shù)目進(jìn)行計(jì)算并求和以進(jìn)行分析。執(zhí)行簡(jiǎn)單的線性回歸分析以檢測(cè)在深層血管叢中血管長(zhǎng)度與ONL中細(xì)胞核數(shù)目之間的關(guān)系。
經(jīng)過(guò)整夜的暗適應(yīng)后，通過(guò)腹膜內(nèi)注射15μg/gm克氯胺酮與7μg/gm甲苯噻嗪來(lái)麻痹小鼠。使用金箔角膜電極，并將參考電極放置口中，接地電極與尾相連，在瞳孔擴(kuò)大(散瞳)后(1％硫酸阿托品)從每只眼的角膜表面記錄視網(wǎng)膜電流圖(ERGs)。使用固定在高反射空視野拱頂外面的Grass Photic Stimulator(PS33 Plus，GrassInstruments，Quincy，MA)產(chǎn)生刺激。根據(jù)直至光刺激器(0.668cd-s/m2)所允許的最大亮度的范圍內(nèi)短波長(zhǎng)(Wratten 47A；λmax＝470nm)閃光來(lái)記錄視桿細(xì)胞反應(yīng)。反應(yīng)信號(hào)被放大(CP511 ACamplifier，Grass Instruments)、數(shù)字化處理(PCI-1200，NationalInstruments，Austin，TX)、然后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。對(duì)于來(lái)自治療的及未治療的眼中的ERGs記錄，每只小鼠均可作為自己的內(nèi)標(biāo)。將多達(dá)100次的掃描進(jìn)行平均用作最弱信號(hào)。從治療眼的應(yīng)答中減去未治療眼的平均應(yīng)答，信號(hào)中的這個(gè)差值可用作功能性恢復(fù)指數(shù)。
使用微陣列分析來(lái)評(píng)估Lin-HSC中視網(wǎng)膜基因表達(dá)。使用Lin-或者CD31-HSCs注射P6時(shí)的rd/rd小鼠。注射后40天(在注射后的這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，明顯可見視網(wǎng)膜血管及光感受器層的修復(fù))將這些小鼠的視網(wǎng)膜剝離到?jīng)]有Rnase的培養(yǎng)基中。通過(guò)全樣載片分析每個(gè)視網(wǎng)膜的一個(gè)扇型部分，以確保正常的HSC作用以及血管與神經(jīng)保護(hù)均已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。取自注射成功的視網(wǎng)膜中的RNA通過(guò)TRIzol(LifeTechnologies，Rockville，MD)、酚/氯仿RNA分離方案進(jìn)行純化。RNA雜交到Affymetrix Mu74Av2芯片上，使用GENESPRING軟件(SiliconGenetics，Redwood City，CA)分析基因表達(dá)。純化的人或小鼠HSCs玻璃體內(nèi)注射至P6小鼠。在P45時(shí)剝離視網(wǎng)膜并收集1)注射了人HSC、并修復(fù)了的小鼠視網(wǎng)膜，2)注射了人HSC、未修復(fù)的小鼠視網(wǎng)膜，及3)注射了小鼠HSC、并修復(fù)了的小鼠視網(wǎng)膜的片段，用來(lái)純化RNA并雜交到人特異性的U133A Affymetrix芯片上。使用GENESPRING軟件鑒定表達(dá)水平在背景值以上并且在使用人HSC修復(fù)的視網(wǎng)膜中具有更高表達(dá)量基因。然后單獨(dú)分析這些基因中每個(gè)基因的探針對(duì)表達(dá)圖譜，并與使用dChip的正常人U133A微芯片實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行比較，以確認(rèn)人的特異性雜交并消除由于跨物種雜交造成的假陽(yáng)性。
當(dāng)CD133陽(yáng)性與CD133陰性的亞群通過(guò)玻璃體內(nèi)注射到初生SCID小鼠的眼中時(shí)，在表達(dá)CD31及整聯(lián)蛋白α6表面抗原的CD133陰性亞群(參見圖21，下圖)中觀察到其與發(fā)育中血管的最大程度整合。不表達(dá)CD31及整聯(lián)蛋白α6的CD133陽(yáng)性亞群(圖21，上圖)看上去作用于外周局部缺血所導(dǎo)致的新生血管靶位點(diǎn)，不過(guò)在注射到處于血管新生的眼中時(shí)并非如此。
實(shí)施例10.在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性鼠模型中玻璃體內(nèi)施用鼠細(xì)胞在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜變性(OIR)模型中，將出生后P7至P12期間的新生野生型小鼠C57B16小鼠暴露于高氧環(huán)境(75％氧)中。圖22所示的是從P0至P30期間C57B16小鼠中正常的初生后血管發(fā)育。在P0時(shí)只在視神經(jīng)盤周圍觀察到剛開始發(fā)育的表層血管。接下來(lái)幾天后，原發(fā)的表層網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)展至外圍，在P10時(shí)到達(dá)遠(yuǎn)處外圍。在P7與P12期間，次級(jí)(深層)血管叢開始發(fā)育。至P17時(shí)，已呈現(xiàn)出一個(gè)廣泛的表層與深層血管網(wǎng)絡(luò)(圖22，插圖)。在隨后的時(shí)間，同血管的第三(中間)層一起進(jìn)行重塑，直至在約P21時(shí)形成成熟結(jié)構(gòu)為止。
相反，在OIR模型中，在于P7-P12暴露于75％氧之后，事件的正常順序被劇烈打斷(圖23)。本發(fā)明的成體鼠Lin-HSC群于P3時(shí)注射到隨后會(huì)經(jīng)歷OIR的小鼠的一只眼中，另一只眼注射PBS或者CD31陰性細(xì)胞用作對(duì)照。圖24所示的是本發(fā)明的Lin-HSC群能夠在處于發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜中逆轉(zhuǎn)高氧水平的變性效果，在P17經(jīng)處理的眼中可觀察到完全發(fā)育的表面及深層視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)而在對(duì)照眼中表現(xiàn)出的是在大血管區(qū)域?qū)嶋H上沒有沒有深層血管(圖24)。在OIR模型中觀察了約100只小鼠眼睛。在58％使用本發(fā)明Lin-HSC治療的眼中觀察到正常血管形成，比較而言，12％使用CD31-細(xì)胞處理的對(duì)照眼及3％使用PBS處理的對(duì)照眼也有此現(xiàn)象。
結(jié)果鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育眼血管新生模型小鼠眼睛為諸如人視網(wǎng)膜血管發(fā)育這樣的哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜血管發(fā)育提供了一種公認(rèn)的模型。在鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育期間，局部缺血誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管與以星型膠質(zhì)細(xì)胞緊密聯(lián)接的方式發(fā)育。這些神經(jīng)膠質(zhì)元件從視神經(jīng)盤沿節(jié)細(xì)胞層移至人胎兒或者新生嚙齒類動(dòng)物妊娠末三個(gè)月時(shí)的視網(wǎng)膜上，并呈放射狀伸展。當(dāng)鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞利用這個(gè)已經(jīng)存在的星型膠質(zhì)細(xì)胞模板來(lái)確定視網(wǎng)膜血管的模式(參見圖1a與b)。圖1(a與b)描述的是小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育示意圖。圖1a描述的是疊加在星型膠質(zhì)細(xì)胞模板(淺線)上原發(fā)叢(圖中上左的暗線)的發(fā)育，圖1b描述的是視網(wǎng)膜血管形成的第二階段。在圖中，GCL代表神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL代表內(nèi)網(wǎng)層；INL代表內(nèi)核層；OPL代表外網(wǎng)層；ONL代表外核層，RPE代表視網(wǎng)膜色素上皮；ON代表視神經(jīng)；P代表外周部。
在出生時(shí)，視網(wǎng)膜血管實(shí)際上不存在。至出生后14天(P14)，視網(wǎng)膜已經(jīng)發(fā)育成同視覺形成相符的復(fù)雜的視網(wǎng)膜血管原發(fā)(表層的)與次級(jí)(深處的)層。最初，輻條狀的外周乳突血管在已存在的星型膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)上向外周快速生長(zhǎng)，通過(guò)形成毛細(xì)血管叢使其連接日益增多。這些血管于直至P10期間在神經(jīng)纖維內(nèi)部作為一個(gè)單層生長(zhǎng)(圖1a)。在P7-P8期間側(cè)枝開始由原發(fā)叢長(zhǎng)出，并刺入視網(wǎng)膜至外網(wǎng)層在那里形成次級(jí)或深層視網(wǎng)膜血管叢。至P21時(shí)，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)一進(jìn)行了廣泛重塑，第三個(gè)或中間血管叢在內(nèi)核層內(nèi)表面形成(圖1b)。
從多個(gè)理由可以認(rèn)為初生小鼠視網(wǎng)膜血管新生模型在研究眼血管新生期間HSC的作用是非常有用的。在這個(gè)與生理學(xué)有關(guān)的模型中，在內(nèi)源血管出現(xiàn)之前已經(jīng)存在一個(gè)大的星型膠質(zhì)細(xì)胞模板，這可以用來(lái)評(píng)估新血管形成過(guò)程期間細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的功用。此外，已知這個(gè)一貫的且可重復(fù)的初生視網(wǎng)膜血管形成過(guò)程是低氧引發(fā)的，在這個(gè)方面它與許多已知的由局部缺血在其中起作用的視網(wǎng)膜疾病具有相似性。
從骨髓中富集內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)
盡管細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)已經(jīng)廣泛用于評(píng)估所制備HSC中的EPC群，但專一識(shí)別EPC的標(biāo)記仍然未確定。為了富集EPC，造血譜系標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞(Lin+)，即B淋巴細(xì)胞(CD45)、T淋巴細(xì)胞(CD3)、粒細(xì)胞(Ly-6G)、單核細(xì)胞(CD11)和紅細(xì)胞(TER-119)，從小鼠骨髓單核的細(xì)胞中除去。用Sca-1抗原來(lái)進(jìn)一步富集EPC。玻璃體內(nèi)注射等量的Lin-Sca-1-細(xì)胞或者Lin-細(xì)胞的結(jié)果進(jìn)行比較，在兩個(gè)組中沒有發(fā)現(xiàn)差異。實(shí)際上，當(dāng)注射Lin-Sca-1-細(xì)胞時(shí)，觀察到與發(fā)育中血管在更大程度上的整合。
根據(jù)功能測(cè)定，本發(fā)明的Lin-HSC群同EPCs一起富集。進(jìn)一步地，Lin+HSC群與Lin-HSC群功能表現(xiàn)完全不同。對(duì)通常用于鑒定EPC各組分(基于先前報(bào)道的體外特征研究)的抗原決定簇也進(jìn)行了評(píng)估。然而這些標(biāo)記沒有哪個(gè)是與Lin-組分專一聯(lián)系的，同Lin+HSC組合物相比，所有標(biāo)記在Lin-HSC中增加約70至約1800％(圖1c)。圖1c描述的是來(lái)源于骨髓的Lin+HSC與Lin-HSC分離細(xì)胞的流式細(xì)胞儀特征圖。圖1c的頂行所示的是造血干細(xì)胞中非抗體標(biāo)記細(xì)胞的二維點(diǎn)圖分布，R1表示陽(yáng)性PE-染色的可定量區(qū)域；R2表示GFP-陽(yáng)性；在中間行給出了Lin-HSC的二維點(diǎn)圖，在底行給出了Lin+HSC的二維點(diǎn)圖。C57B/6細(xì)胞使用針對(duì)Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-聯(lián)接抗體進(jìn)行標(biāo)記。Tie-2數(shù)據(jù)由Tie-2-GFP小鼠中獲得。在二維點(diǎn)圖角上的百分比表示在整個(gè)Lin-HSC或Lin+HSC群中陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。有趣的是，公認(rèn)的EPC標(biāo)記，譬如Fik-1/KDR、Tie-2及Sca-1都是弱表達(dá)，因此沒有用于進(jìn)一步的分離。
玻璃體內(nèi)注射的HSC Lin-細(xì)胞含有作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞的EPC并整合到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管為了判定是否玻璃體內(nèi)注射Lin-HSC能夠作用于視網(wǎng)膜的特定細(xì)胞類型、利用星型膠質(zhì)細(xì)胞模板并參與視網(wǎng)膜血管新生，取自本發(fā)明Lin-HSC組合物的約105個(gè)細(xì)胞或者取自成體小鼠(GFP或者LacZ轉(zhuǎn)基因)骨髓的的Lin+HSC細(xì)胞(對(duì)照，約105個(gè)細(xì)胞)注射到出生后2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，來(lái)源于GFP或者LacZ轉(zhuǎn)基因小鼠的本發(fā)明Lin-HSC組合物中的很多細(xì)胞，粘著在視網(wǎng)膜上并具有內(nèi)皮細(xì)胞典型伸長(zhǎng)的外觀(圖2a)。圖2描述的是Lin-HSCs進(jìn)入發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜的植入過(guò)程。如圖2a所示，注射后四天(P6)玻璃體內(nèi)注射的eGFP+Lin-HSC在視網(wǎng)膜上附著并分化。
在視網(wǎng)膜的很多區(qū)域，GFP表達(dá)細(xì)胞以一種能與下面星型膠質(zhì)細(xì)胞相一致的方式排列，類似于血管。這些熒光細(xì)胞在內(nèi)源的、發(fā)育中的血管網(wǎng)絡(luò)之前被觀察到(圖2b)。相反，只有少數(shù)Lin+HSC(圖2c)或者成體小鼠腸系膜內(nèi)源細(xì)胞(圖2d)附著在視網(wǎng)膜表面。為了確認(rèn)是否來(lái)自所注射Lin-HSC群的細(xì)胞也能夠附著在已經(jīng)形成血管的視網(wǎng)膜上，我們注射Lin-HSC組合物到成熟的眼中。有趣的是，沒有觀察到細(xì)胞附著在視網(wǎng)膜上或整合到已形成的、正常的視網(wǎng)膜血管中(圖2e)。這表明本發(fā)明的Lin-HSC組合物不破壞已正常發(fā)育完成的血管，不會(huì)在正常發(fā)育完成的視網(wǎng)膜中引發(fā)異常的血管形成。
為了判定本發(fā)明中所注射的Lin-HSC組合物與視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系，使用了能夠表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP，星型膠質(zhì)細(xì)胞的一種標(biāo)記)與由啟動(dòng)子促發(fā)的綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)使用來(lái)自eGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的Lin-HSC進(jìn)行注射的這些GFAP-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的視網(wǎng)膜進(jìn)行檢查，表明所注射的eGFPEPC與已存在的星型膠質(zhì)細(xì)胞共同定位(圖2f-h，箭頭處)。觀察到eGFP+Lin-HSC的突起與下面的星型膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)一致(箭頭，圖2g)。對(duì)這些眼的檢查表明所注射的標(biāo)記了的細(xì)胞僅附著于星型膠質(zhì)細(xì)胞上；在視網(wǎng)膜外周仍沒有內(nèi)源血管的P6小鼠視網(wǎng)膜中，觀察到所注射的細(xì)胞附著在位于那些仍未血管化區(qū)域的星型膠質(zhì)細(xì)胞上。有趣的是，在視網(wǎng)膜更深層處正常視網(wǎng)膜血管將隨后發(fā)育的精確位點(diǎn)上觀察到所注射的標(biāo)記了的細(xì)胞(圖2i，箭頭)。
為了判定所注射的本發(fā)明中的Lin-HSC是否能穩(wěn)定整合到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管，在幾個(gè)稍后的時(shí)間點(diǎn)上檢查視網(wǎng)膜血管。早在P9時(shí)(注射后七天)，Lin-HSC已整合至CD31+結(jié)構(gòu)(圖2j)。到P16(注射后14天)時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)廣泛整合至視網(wǎng)膜中類血管的結(jié)構(gòu)中(圖2k)。在處死動(dòng)物之前心內(nèi)注射羅丹明-葡聚糖(以鑒定具有功能的視網(wǎng)膜血管)，多數(shù)Lin-HSC與未閉合的血管排在一起(圖2l)。觀察到標(biāo)記細(xì)胞分布的兩種模式(1)在一個(gè)模式中，細(xì)胞在未標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞間沿血管散布；以及(2)另一個(gè)模式顯示血管完全由所標(biāo)記的細(xì)胞組成。所注射的細(xì)胞也整合到深層血管叢的血管中(圖2m)。雖然以前曾報(bào)道過(guò)來(lái)源于Lin-HSC的EPC零散結(jié)合到新生血管中，但本文是首次報(bào)道血管網(wǎng)絡(luò)完全由這些細(xì)胞組成。這表明本發(fā)明中玻璃體內(nèi)注射的來(lái)源于骨髓的Lin-HSC群中的細(xì)胞能夠有效整合到形成中的視網(wǎng)膜血管叢的任何一層。
玻璃體內(nèi)注射后對(duì)非視網(wǎng)膜組織(例如，腦、肝臟、心臟、肺、骨髓)進(jìn)行5或10天的組織學(xué)檢查，沒有發(fā)現(xiàn)存在任何GFP陽(yáng)性細(xì)胞。這表明Lin-HSC組合物中某個(gè)亞群的細(xì)胞選擇性地作用于視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞并穩(wěn)定整合到發(fā)育中的視網(wǎng)膜血管中。由于這些細(xì)胞具有許多內(nèi)皮細(xì)胞的特征(同視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)聯(lián)、細(xì)長(zhǎng)的形態(tài)、穩(wěn)定整合到未閉合的血管并且在沒有血管的部位不存在)，這些細(xì)胞表明在Lin-HSC群中存在EPC。所作用的星型膠質(zhì)細(xì)胞與在許多缺氧性視網(wǎng)膜病變中觀察到的是相同類型?，F(xiàn)已充分了解神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是DR與其它類型的視網(wǎng)膜損傷中所觀察到的新血管葉(neovascularfronds)的主要組分。在活性神經(jīng)膠質(zhì)增生及局部缺血引發(fā)的血管新生的條件下，活性星型膠質(zhì)細(xì)胞增生、產(chǎn)生細(xì)胞因子并上調(diào)GFAP，與包括人在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物物種在初生視網(wǎng)膜血管模板形成階段所觀察到的現(xiàn)象相仿。
本發(fā)明的Lin-HSC群會(huì)象在初生眼中那樣作用于成體小鼠眼中的活性星型膠質(zhì)細(xì)胞，將Lin-HSC細(xì)胞注射到由于光致凝結(jié)(圖3a)或針尖(圖3b)導(dǎo)致視網(wǎng)膜損傷的成熟的眼中。在兩個(gè)模型中，只是在損傷位點(diǎn)周圍觀察到顯著的GFAP染色的細(xì)胞群(圖3a與b)。來(lái)自所注射Lin-HSC組合物的細(xì)胞位于損傷位點(diǎn)并與GFAP陽(yáng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞保持特異聯(lián)系。在這些位點(diǎn)上，還觀察到Lin-HSC細(xì)胞以與深層視網(wǎng)膜血管初生形成階段相似的水平移至視網(wǎng)膜的更深層。視網(wǎng)膜未損傷的部分不含有Lin-HSC細(xì)胞，這與當(dāng)Lin-HSC注射到正常的、未受傷的成熟視網(wǎng)膜中時(shí)所觀察到的相一致(圖2e)。這些數(shù)據(jù)表明Lin-HSC組合物能夠選擇性地與神經(jīng)膠質(zhì)增生作用于受傷的成熟視網(wǎng)膜中的活性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及正在形成血管的初生視網(wǎng)膜。
玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC能夠修復(fù)并穩(wěn)定變性的血管由于玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC組合物作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞并整合到正常的視網(wǎng)膜血管中，這些細(xì)胞也可以穩(wěn)定由于局部缺血或者與神經(jīng)膠質(zhì)增生及血管變性相聯(lián)系的變性視網(wǎng)膜疾病中的變性血管。出生后一個(gè)月內(nèi)的rd/rd小鼠是用于顯示光感受器深度變性及視網(wǎng)膜血管層的視網(wǎng)膜變性的模型。這些小鼠中視網(wǎng)膜血管正常發(fā)育至P16，此時(shí)較深的血管叢退化；到P30時(shí)絕大多數(shù)小鼠中深層與中間的血管叢幾乎完全變性。
為了判定是否HSC能夠修復(fù)退化的血管，將Lin+或Lin-HSC(來(lái)自Balb/c小鼠)于P6時(shí)玻璃體內(nèi)注射到rd/rd小鼠。至P33時(shí)，使用Lin+HSC注射后，視網(wǎng)膜最深層的血管幾乎完全消失(圖4c和b)。相反，至P33時(shí)絕大多數(shù)注射了Lin-HSC的視網(wǎng)膜具有幾乎正常的具有3個(gè)平行的、良好成型的血管層的視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)(圖4c和d)。該效應(yīng)的量化結(jié)果表明注射了Lin-的rd/rd眼中深層血管叢的平均長(zhǎng)度幾乎比未處理或注射Lin+細(xì)胞處理的眼高3倍(圖4e)。令人驚訝的是，注射來(lái)源于rd/rd成體小鼠(FVB/N)骨髓的Lin-HSC組合物也能夠修復(fù)變性的rd/rd初生小鼠的視網(wǎng)膜血管(圖4f)。早在出生后2-3周便觀察到rd/rd小鼠眼中血管的變性。遲至P15時(shí)注射Lin-HSC也可使rd/rd小鼠中變性的血管能在至少一個(gè)月的時(shí)間里維持部分穩(wěn)定(圖4g和4h)。
注射至較年幼(譬如，P2)的rd/rd小鼠中的Lin-HSC組合物也整合到發(fā)育中的表層血管中。至P11時(shí)，觀察到這些細(xì)胞移至深層血管叢的層面并形成與在野生型外部視網(wǎng)膜血管層中所觀察到的一致的模式(圖5a)。為了更清晰描述所注射的Lin-HSC組合物中細(xì)胞整合至并且穩(wěn)定rd/rd小鼠中變性的視網(wǎng)膜血管的方式，將來(lái)源于Balb/c小鼠的Lin-HSC組合物注射到Tie-2-GFP FVB小鼠眼中。FVB具有rd/rd基因型，并且由于他它們表達(dá)融合蛋白Tie-2-GFP，所有的內(nèi)源血管都是熒光顯色的。
當(dāng)來(lái)自Lin-HSC組合物的未標(biāo)記細(xì)胞注射到初生的Tie-2-GFPFVB眼中并隨后整合到發(fā)育中的血管時(shí)，在內(nèi)源的、Tie-2-GFP標(biāo)記的血管中應(yīng)該存在未標(biāo)記的間斷(gap)，Tie-2-GFP標(biāo)記的對(duì)應(yīng)于所注射的已整合的、未標(biāo)記的Lin-HSC。隨后使用另一種血管標(biāo)記(譬如，CD-31)進(jìn)行的染色可以顯示出整個(gè)血管，可以用來(lái)判定非內(nèi)源的內(nèi)皮細(xì)胞是否是血管的一部分。注射后兩個(gè)月，在使用Lin-HSC組合物注射的眼視網(wǎng)膜中觀察到CD-31陽(yáng)性、Tie-2-GFP陰性的血管(圖5b)。有趣的是，多數(shù)修復(fù)的血管含有Tie-2-GFP陽(yáng)性細(xì)胞(圖5c)。如同平滑肌肌動(dòng)蛋白染色所測(cè)定的那樣，不管是否有血管修復(fù)，周細(xì)胞的分布并沒有因?yàn)樽⑸銵in-HSC而發(fā)生改變(圖5d)。這些數(shù)據(jù)清晰的表明了玻璃體內(nèi)所注射的本發(fā)明的Lin-HSC組合物可移至視網(wǎng)膜，參與正常視網(wǎng)膜血管的形成，并在遺傳缺陷的小鼠中穩(wěn)定內(nèi)源的變性血管。
通過(guò)注射來(lái)自Lin-HSC的轉(zhuǎn)染細(xì)胞抑制視網(wǎng)膜血管新生多數(shù)視網(wǎng)膜血管疾病涉及異常的血管增生而不是變性?？梢允褂米饔糜谛切湍z質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞釋放一種抗血管新生蛋白并抑制血管新生。使用T2色氨酰-轉(zhuǎn)移核糖核酸合成酶(T2-TrpRS)轉(zhuǎn)染來(lái)自Lin-HSC組合物的細(xì)胞。T2-TrpRS是可有效抑制視網(wǎng)膜血管新生的TrpRS的一個(gè)43kD的片段(圖6a)。在P12時(shí)，于P2時(shí)刻使用作為對(duì)照的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物進(jìn)行注射的眼視網(wǎng)膜具有正常的原發(fā)(圖6c)與次級(jí)(圖6d)視網(wǎng)膜血管叢。使用本發(fā)明的T2-TrpRS轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物注射到P2時(shí)的眼中并在10天后進(jìn)行評(píng)估，原發(fā)網(wǎng)絡(luò)明顯異常(圖6e)并且深層視網(wǎng)膜血管的形成幾乎完全被抑制(圖6f)。在這些眼中觀察到的很少量的血管明顯被血管間的大段間隔所削弱。分泌T2-TrpRS的Lin-HSC的抑制范圍在表2中詳述。
在體外Lin-HSC組合物中的細(xì)胞產(chǎn)生并分泌T2-TrpRS，將這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞注射到玻璃體后，在視網(wǎng)膜中觀察到一條30kD的T2-TrpRS片段(圖6b)。僅在使用本發(fā)明中轉(zhuǎn)染的Lin-HSC注射的視網(wǎng)膜中可特異觀察到這條30kD的片段，而且相對(duì)于重組或體外合成蛋白，這種表觀分子量的降低可能是由于T2-TrpRS在體內(nèi)進(jìn)行了加工或降解。這些數(shù)據(jù)表明Lin-HSC組合物可以通過(guò)作用于活性星型膠質(zhì)細(xì)胞將表達(dá)血管抑制分子的基因這樣的在功能上有作用的基因遞送至視網(wǎng)膜血管。雖然所觀察到的血管抑制效果可能是由于細(xì)胞介導(dǎo)的活性所致，不過(guò)由于使用同樣的、只是沒有T2轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物進(jìn)行治療的眼具有正常的視網(wǎng)膜血管，因此這種可能性極低。
表2分泌T2-TrpRS的Lin-HSCs對(duì)血管的抑制


玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC群定位于視網(wǎng)膜星型膠質(zhì)細(xì)胞，整合至血管中，并能用于治療多種視網(wǎng)膜疾病。當(dāng)絕大多數(shù)注射的HSC組合物附著于星型膠質(zhì)細(xì)胞模板時(shí)，少量細(xì)胞移至視網(wǎng)膜深層，定植于深層血管網(wǎng)絡(luò)隨后將發(fā)育的區(qū)域。即使在出生后42天之前沒有在這一區(qū)域觀察到GFAP陽(yáng)性的星型膠質(zhì)細(xì)胞，也不能排除GFAP陰性的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)存在并提供Lin-HSC定位信號(hào)的可能性。以前的研究已經(jīng)表明許多疾病同活化的神經(jīng)膠質(zhì)增生相關(guān)聯(lián)。特別地，在DR中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及其胞外基質(zhì)同病理性血管新生有關(guān)聯(lián)。
由于所注射的Lin-HSC組合物中的細(xì)胞特異性地附著于表達(dá)GFAP的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，因此不管什么類型的損傷，均可使用本發(fā)明的Lin-HSC組合物作用于視網(wǎng)膜中將發(fā)生血管新生的病灶。例如，在諸如糖尿病這樣的局部缺血的視網(wǎng)膜病變中，新血管的形成是對(duì)缺氧的一種應(yīng)答。通過(guò)用Lin-HSC組合物作用于病理性新生血管位點(diǎn)，可以穩(wěn)定發(fā)育中的新生血管從而防止諸如出血或水腫(同DR相關(guān)的視覺喪失的原因)這樣的新生血管異常并能潛在地緩解最初刺激新生血管形成的缺氧癥。異常血管能夠回復(fù)到正常狀態(tài)。此外，可以通過(guò)使用轉(zhuǎn)染的Lin-HSC組合物以及激光誘導(dǎo)的星型膠質(zhì)細(xì)胞的活化將諸如T2-TrpRS這樣的血管抑制蛋白傳遞到病理性血管新生的位點(diǎn)。由于激光凝固普遍應(yīng)用在臨床眼科學(xué)上，該方法在許多視網(wǎng)膜疾病上都有應(yīng)用。這些基于細(xì)胞的方法已經(jīng)用于癌癥治療的研究，由于眼內(nèi)注射使得將大量細(xì)胞直接注入發(fā)病位點(diǎn)成為可能，這些方法在眼疾上的用途更為有利。
Lin-HSC的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)與血管營(yíng)養(yǎng)修復(fù)MACS用于分離來(lái)自上述的增強(qiáng)綠色熒光蛋白(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠骨髓中的Lin-HSC。取自這些小鼠的含EPC的Lin-HSC通過(guò)玻璃體內(nèi)注射至P6時(shí)的C3H或FVB小鼠眼中。在注射后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上(1個(gè)月、2個(gè)月及6個(gè)月)收集視網(wǎng)膜。通過(guò)使用針對(duì)CD31的抗體染色后利用掃描激光共聚焦顯微鏡、以及使用DAPI進(jìn)行核染色后的視網(wǎng)膜組織學(xué)，來(lái)對(duì)血管進(jìn)行分析。還使用取自不同時(shí)間點(diǎn)上的視網(wǎng)膜中的mRNA的微陣列基因表達(dá)分析來(lái)鑒定潛在地同這種效應(yīng)相關(guān)的那些基因。
至P21時(shí)rd/rd小鼠的眼睛患有神經(jīng)感覺細(xì)胞及視網(wǎng)膜血管深度變性。于P6時(shí)使用Lin-HSC進(jìn)行治療的rd/rd小鼠的眼睛維持正常的視網(wǎng)膜血管結(jié)構(gòu)達(dá)6個(gè)月之久；在所有時(shí)間點(diǎn)上(1M、2M與6M)與對(duì)照相比較，深層與中間層都有顯著改善(參見圖12)。此外，我們觀察到使用Lin-HSC治療的視網(wǎng)膜要更厚一些(1M；1.2倍，2M；1.3倍，6M；1.4倍)，而且與作為對(duì)照的使用Lin+HSC進(jìn)行處理的眼相比，在外核層具有更多數(shù)目的細(xì)胞(1M；2.2倍，2M；3.7倍，6M；5.7倍)。同對(duì)照(未處理或者未用Lin-處理)rd/rd視網(wǎng)膜相比，對(duì)“修復(fù)的”視網(wǎng)膜(例如，Lin-HSC)所進(jìn)行的大規(guī)模基因組分析表明編碼sHSPs(小熱激蛋白)的基因，以及包括編碼圖20中插圖A與B中蛋白的基因在內(nèi)的、同血管與神經(jīng)修復(fù)相關(guān)的特異的生長(zhǎng)因子的基因，都有明顯上調(diào)。
本發(fā)明中來(lái)源于骨髓的Lin-HSC群明顯且可重復(fù)地促使正常血管的維持，并顯著增加rd/rd小鼠中光感受器及其它神經(jīng)細(xì)胞層。這種同小熱激蛋白的顯著上調(diào)相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)效果提供了探索目前無(wú)法治愈的視網(wǎng)膜變性病癥的治療方法。
Rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜表現(xiàn)出深度血管及神經(jīng)變性小鼠中正常的出生后視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)發(fā)育已有詳細(xì)描述，與在末三個(gè)月時(shí)的人類胎兒中所觀察到的類似(Dorrell等.，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.433500-3510)。Rd1基因?yàn)榧兒献拥男∈缶哂泻芏嗳艘暰W(wǎng)膜變性的特征(Frasson等.，1999，Nat.Med.51183-1187)，并表現(xiàn)出同由于編碼PR cGMP磷酸二酯酶的基因突變所導(dǎo)致的與急性血管萎縮并發(fā)的快速光感受器(PR)喪失(Bowes等.1990，Nature347677-680)。為了檢查視網(wǎng)膜發(fā)育中的血管及其隨后的變性，使用作為成熟血管的胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的抗膠原蛋白IV(CIV)的抗體，以及內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物CD31(PECAM-1)(圖15)。直至大概出生后8天，含光感受器的外核層(ONL)開始變性時(shí)，rd1/rd1(C3H/HeJ)的視網(wǎng)膜一直正常發(fā)育。ONL快速變性，細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞凋亡而死亡，至P20時(shí)僅余下一個(gè)單個(gè)的核層。使用抗體CIV及CD31對(duì)視網(wǎng)膜全樣載片進(jìn)行雙染色，顯示了rd1/rd1小鼠中血管變性的細(xì)節(jié)同其他人所描述的相似(Blanks等.，1986，J.Comp.Neurol.254543-553)。盡管在P12之后沒有CD31著色證明了內(nèi)皮細(xì)胞快速損失，但原發(fā)和深層視網(wǎng)膜血管層看起來(lái)仍發(fā)育正常。CD31陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞在直至P12期間一直以正常分布狀態(tài)存在，但在此之后快速消失，CIV陽(yáng)性染色在所檢查的時(shí)間點(diǎn)始終存在，說(shuō)明血管及相關(guān)的ECM正常形成，但在P13——至這個(gè)時(shí)間沒有CD31陽(yáng)性細(xì)胞被觀察到——之后僅有基質(zhì)。(圖15，中圖)。中間血管叢在P21之后也變性，但進(jìn)度要慢于在深層中所觀察到的(圖15，上圖)。給出了正常小鼠的視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)細(xì)胞層以同rd1/rd1小鼠進(jìn)行比較(右圖，圖15)。
來(lái)源于骨髓的Lin-HSC在rd1/rd1小鼠中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)玻璃體內(nèi)注射的Lin-HSC整合到內(nèi)源視網(wǎng)膜血管全部三層血管叢中，防止血管變性。有趣的是，所注射的細(xì)胞實(shí)際上在外核層中從未觀察到過(guò)。這些細(xì)胞或整合到形成中的視網(wǎng)膜血管，或在這些血管附近被觀察到。小鼠Lin-HSCs(來(lái)自C3H/HeJ)于變性剛要開始前的P6時(shí)刻玻璃體內(nèi)注射到C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼中。至P30時(shí)，使用對(duì)照細(xì)胞(CD31-)注射的眼表現(xiàn)出典型的rd1/rd1表型，也就是說(shuō)，在每一個(gè)檢查的視網(wǎng)膜中均觀察到深層血管叢及ONL幾乎完全變性。使用Lin-HSCs注射的眼則維持了看上去正常的中間及深層血管叢。令人驚訝的是，在使用Lin-HSC注射的眼的內(nèi)核層(INL)與ONL中，同作為對(duì)照的注射了細(xì)胞的眼(圖16A)相比，明顯觀察到更多的細(xì)胞。Lin-HSCs的這種修復(fù)效應(yīng)可以在注射后2個(gè)月時(shí)觀察到(圖16B)，并持續(xù)長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月(圖16C)。當(dāng)修復(fù)的與未修復(fù)的眼進(jìn)行比較時(shí)，在所有進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)上都發(fā)現(xiàn)注射了Lin-HSC的眼中中間與深層血管叢中的血管、以及含有神經(jīng)細(xì)胞的INL與ONL，其中差異非常明顯(圖16B與C)。通過(guò)測(cè)量血管的總長(zhǎng)度(圖16D)并對(duì)ONL中觀察到的DAPI陽(yáng)性細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖16E)來(lái)對(duì)這種效應(yīng)進(jìn)行量化。利用所有時(shí)間點(diǎn)上的數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的線性回歸分析。
在注射Lin-HSC的眼中(圖16F)，P30(p＜0.024)及P60(p＜0.034)時(shí)的血管修復(fù)與神經(jīng)(例如，ONL厚度)修復(fù)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的相關(guān)。當(dāng)P180時(shí)比較注射Lin-HSC的視網(wǎng)膜與作為對(duì)照的注射了細(xì)胞的視網(wǎng)膜，盡管不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性(p＜0.14)，其相關(guān)性還是很高的。相反，作為對(duì)照的注射了細(xì)胞的視網(wǎng)膜在任何時(shí)間點(diǎn)上的血管與ONL維持之間沒有表現(xiàn)出顯著的相關(guān)(圖16F)。這些數(shù)據(jù)表明玻璃體內(nèi)注射Lin-HSC導(dǎo)致rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜中伴發(fā)的視網(wǎng)膜血管及神經(jīng)修復(fù)。在ONL中或者其它位于視網(wǎng)膜血管內(nèi)部或臨近視網(wǎng)膜血管的任何地方，都沒有觀察到注射的細(xì)胞。
注射Lin-HSC的rd/rd視網(wǎng)膜的功能性修復(fù)對(duì)注射對(duì)照細(xì)胞或者鼠Lin-HSCs(圖17)兩個(gè)月后的小鼠做視網(wǎng)膜電流圖(ERGs)。ERG記錄后對(duì)每只眼進(jìn)行免疫組織化學(xué)與顯微分析，以確認(rèn)已發(fā)生血管及神經(jīng)修復(fù)。來(lái)自治療的、修復(fù)的以及對(duì)照的、未修復(fù)的眼中的具代表性的ERG記錄顯示，在修復(fù)的眼中，數(shù)字基底信號(hào)(治療的減去未治療的眼)產(chǎn)生一個(gè)8-10微伏幅度的可清晰檢測(cè)的信號(hào)(圖17)。毫無(wú)疑問，來(lái)自兩個(gè)眼睛的信號(hào)是非常不同的。然而，從使用Lin-HSC治療的眼中可記錄到一致的可檢測(cè)的ERGs。在所有例子中，來(lái)自對(duì)照眼的ERG是無(wú)法檢測(cè)的。雖然修復(fù)眼中的信號(hào)幅度遠(yuǎn)低于正常眼，但無(wú)論何時(shí)只要是組織修復(fù)就可以始終觀察到信號(hào)，而且信號(hào)與其他人報(bào)道的基于基因修復(fù)的研究中的幅度是一類的。所有的這些結(jié)果證實(shí)了使用本發(fā)明Lin-HSCs進(jìn)行治療的眼中在某種程度上的功能性修復(fù)。
來(lái)自人骨髓(hBM)的Lin-HSCs也可以修復(fù)變性的視網(wǎng)膜從人骨髓中分離的Lin-HSCs與鼠Lin-HSCs具有相似的作用。從捐贈(zèng)人那里收集骨髓，除去Lin+HSCs，從而產(chǎn)生人Lin-HSCs(hLin-HSCs)群。
這些細(xì)胞使用先體內(nèi)后體外地用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，然后注射至C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠眼中。注射的Lin-HSCs以與注射鼠Lin-HSCs時(shí)相同的方式移至并作用于視網(wǎng)膜血管新生的位點(diǎn)(圖18A)。除了所作用的血管外，人Lin-HSCs對(duì)rd/rd小鼠的血管及神經(jīng)細(xì)胞層也提供了一種有力的修復(fù)效果(圖18B與C)。這個(gè)觀察證實(shí)了在人骨髓中存在能夠作用于視網(wǎng)膜血管并防止視網(wǎng)膜變性的細(xì)胞。
Lin-HSCs在rd10/rd10小鼠中具有血管及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效果雖然rd1/rd1小鼠是應(yīng)用最為廣泛的、描述最詳盡的用于視網(wǎng)膜變性的模型(Chang等.2002，Vision Res.42517-525)，但變性非常迅速，在這點(diǎn)上與通常在人疾病中觀察到的更慢時(shí)間過(guò)程不同。在這個(gè)品系中，光感受器細(xì)胞在視網(wǎng)膜血管仍在快速延伸的P8時(shí)刻左右開始變性(圖15)。與在絕大多數(shù)患有這種疾病的人中所觀察到的不同，即便在中間血管叢還在形成時(shí)仍發(fā)生后續(xù)的深層視網(wǎng)膜血管變性，這樣，rd1/rd1小鼠的視網(wǎng)膜永遠(yuǎn)無(wú)法徹底發(fā)育。一個(gè)具有更慢時(shí)間的變性過(guò)程以及更類似人視網(wǎng)膜變性狀態(tài)的rd10小鼠模型，被用來(lái)研究Lin-HSC介導(dǎo)的血管修復(fù)。在rd10小鼠中，光感受器細(xì)胞于P21左右開始變性，其后不久便開始血管變性。
在正常感覺神經(jīng)的視網(wǎng)膜發(fā)育至P21大體完成之后，觀察到變性在視網(wǎng)膜徹底分化后便開始發(fā)生，而且以這種方式進(jìn)行的變性比rd1/rd1小鼠模型更接近人視網(wǎng)膜變性。將來(lái)自rd10小鼠的Lin-HSCs或?qū)φ占?xì)胞注射至P6眼中，在不同時(shí)間點(diǎn)上對(duì)視網(wǎng)膜進(jìn)行評(píng)估。在P21時(shí)，來(lái)自注射了Lin-HSC及對(duì)照細(xì)胞的眼的視網(wǎng)膜都表現(xiàn)正常，所有的血管層都完全發(fā)育，INL與ONL也正常發(fā)育(圖18D與18H)。在約P21時(shí)視網(wǎng)膜變性開始發(fā)生并隨時(shí)間加劇。至P30時(shí)，注射對(duì)照細(xì)胞的視網(wǎng)膜表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管及神經(jīng)變性(圖18I)，而注射Lin-HSC的視網(wǎng)膜保持幾乎正常的血管層與光感受器細(xì)胞(圖18E)。修復(fù)的與未修復(fù)的眼之間的不同在后面的時(shí)間點(diǎn)上更加顯著(對(duì)比一下圖18F及18G與18J及18K)。在對(duì)照處理的眼中，通過(guò)CD31與膠原蛋白IV的免疫組織化學(xué)染色可以十分清楚地觀察到血管變性的發(fā)展(圖18I-K)。對(duì)照處理的眼幾乎完全是CD31陰性，但膠原蛋白陽(yáng)性血管的“軌跡”仍然明顯，表明發(fā)生的是血管退化，而不是未完成的血管形成。相反，Lin-HSC治療的眼同時(shí)具有與正常的、野生型的眼非常相似的CD31及膠原蛋白IV陽(yáng)性血管(對(duì)比一下圖18F與18I)。
使用Lin-HSC治療后rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的基因表達(dá)分析使用大量基因組(微陣列分析)分析修復(fù)的與未修復(fù)的視網(wǎng)膜，以識(shí)別神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)中可能的介質(zhì)。使用Lin-HSCs治療的rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜中的基因表達(dá)與未注射的視網(wǎng)膜以及使用對(duì)照細(xì)胞(CD31-)進(jìn)行注射的視網(wǎng)膜進(jìn)行比較。這些比較每個(gè)都是一式三份。在所有三份樣品中，要求基因的表達(dá)水平至少要比背景水平高出2倍，才可認(rèn)定其存在。Lin-HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜同對(duì)照中注射了細(xì)胞的及未注射的rd/rd小鼠視網(wǎng)膜相比，其中上調(diào)了3倍的基因如圖20中插圖A與B所示。許多顯著上調(diào)的基因，包括MAD及Ying Yang-1(YY-1)，編碼功能與保護(hù)細(xì)胞避免細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白。使用Lin-HSC治療的視網(wǎng)膜中，與已知參與應(yīng)激時(shí)保護(hù)細(xì)胞的熱激蛋白具有序列同源性和相似功能的許多晶體蛋白基因也被上調(diào)。α晶體蛋白的表達(dá)通過(guò)免疫組織化學(xué)分析定位在ONL(圖19)。
將使用人Lin-HSCs修復(fù)的來(lái)自rd1/rd1小鼠視網(wǎng)膜的信使RNA雜交到人特異性的Affymetrix U133A微陣列芯片上。經(jīng)嚴(yán)緊分析后，發(fā)現(xiàn)了許多基因，其mRNA的表達(dá)是人特異性的、高于背景、而且與鼠Lin-HSC修復(fù)的視網(wǎng)膜及人對(duì)照的注射了細(xì)胞但未修復(fù)的視網(wǎng)膜相比，在人Lin-HSC修復(fù)的視網(wǎng)膜中明顯更高(圖20，插圖C)。一種表達(dá)在原生的及最新分化的CD34+造血干細(xì)胞表面的細(xì)胞粘連分子CD6，與另一個(gè)由造血干細(xì)胞表達(dá)的基因干擾素α13，是通過(guò)微陣列生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的，驗(yàn)證了評(píng)估方案的有效性。此外，人Lin-HSC修復(fù)的小鼠視網(wǎng)膜樣品中幾個(gè)生長(zhǎng)因子及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)高于背景(圖20，插圖D)。
討論使用譜系定型的造血細(xì)胞標(biāo)記來(lái)負(fù)選擇來(lái)源于骨髓的含EPC的Lin-HSC群。雖然可用作EPC的來(lái)源于骨髓的Lin-HSC亞群未被經(jīng)常用的細(xì)胞表面標(biāo)記所表征，但這些細(xì)胞在發(fā)育中或受損視網(wǎng)膜血管中的行為與在Lin+或成熟內(nèi)皮細(xì)胞群中觀察到的完全不同。這些細(xì)胞選擇性地作用于視網(wǎng)膜血管新生的位點(diǎn)并參與新血管的形成。
遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病通常伴發(fā)視網(wǎng)膜血管損傷。對(duì)這類疾病進(jìn)行有效治療要求功能恢復(fù)以及維持復(fù)雜組織構(gòu)造。最近幾項(xiàng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用營(yíng)養(yǎng)因子或者干細(xì)胞本身，或二者的組合這樣的基于細(xì)胞的傳遞可能是必須的。例如，使用生長(zhǎng)因子療法去治療視網(wǎng)膜變性疾病，會(huì)導(dǎo)致血管發(fā)生當(dāng)正常視網(wǎng)膜組織構(gòu)造受到嚴(yán)重破壞時(shí)才出現(xiàn)的血管不受控制的過(guò)渡生長(zhǎng)。使用神經(jīng)或視網(wǎng)膜干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病可能會(huì)重建神經(jīng)功能，但具有功能的血管也是維持視網(wǎng)膜功能完整性所必需的。整合到rd/rd小鼠視網(wǎng)膜血管的來(lái)自本發(fā)明中Lin-HSCs的細(xì)胞在不破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的情況下可穩(wěn)定變性的血管。當(dāng)細(xì)胞注射到P15時(shí)的rd/rd小鼠時(shí)也觀察到這種修復(fù)效果。自從rd/rd小鼠中于P16時(shí)開始發(fā)生血管變性后，這個(gè)觀察結(jié)果開啟了使用Lin-HSC進(jìn)行有效治療的窗口。在注射了本發(fā)明的Lin-HSC的眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)元與光感受器得以保存，視覺功能得以維持。
來(lái)源于成熟骨髓的Lin-HSCS在玻璃體內(nèi)注射至患有視網(wǎng)膜變性疾病的小鼠中時(shí)，會(huì)導(dǎo)致復(fù)雜的血管及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)。在完全的視網(wǎng)膜變性之前(指在通常至出生后30天便表現(xiàn)出完全的視網(wǎng)膜變性的小鼠中，從出生至出生后16天的這段時(shí)間)注射Lin-HSCs，修復(fù)效應(yīng)在治療后能持續(xù)多達(dá)6個(gè)月而且大多數(shù)都有效。在兩個(gè)視網(wǎng)膜變性的小鼠模型中觀察到這種修復(fù)，而且不尋常的是，當(dāng)受體是免疫缺陷且患有視網(wǎng)膜變性的嚙齒類動(dòng)物時(shí)(譬如，SCID小鼠)，或者供體是患有視網(wǎng)膜變性的小鼠時(shí)，來(lái)源于成人骨髓的HSCs能夠完成這種修復(fù)。雖然最近幾個(gè)報(bào)道描述了利用野生型基因的基于病毒的基因修復(fù)在患有視網(wǎng)膜變性的小鼠中或狗中的部分表型修復(fù)(Ali等2000，Nat Genet25306-310；Takahashi等.1999，J.Virol.737812-7816；Aeland等.2001，Nat.Genet.2892-95.)，但本發(fā)明仍是第一個(gè)通過(guò)血管修復(fù)而獲得的基于細(xì)胞的基因治療的效應(yīng)。因此，這樣一個(gè)能夠治療具共有超過(guò)100個(gè)已知相關(guān)突變的一組疾病的方法，其潛在應(yīng)用要比創(chuàng)建針對(duì)每個(gè)已知突變的單個(gè)基因療法更具實(shí)用價(jià)值。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)效應(yīng)的確切的分子基礎(chǔ)還不清楚，但只有當(dāng)存在伴發(fā)的血管穩(wěn)定/修復(fù)時(shí)才觀察得到。存在注射的干細(xì)胞本身并不足以產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)，在外核層中明顯不存在來(lái)源于干細(xì)胞的神經(jīng)元排除了所注射的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)楣飧惺芷鞯目赡苄浴Ｓ晌㈥嚵谢虮磉_(dá)分析獲得的數(shù)據(jù)表明已知具有抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)的基因明顯上調(diào)。由于在視網(wǎng)膜中觀察到的絕大多數(shù)神經(jīng)死亡是通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式進(jìn)行的，這種保護(hù)也許在延長(zhǎng)光感受器以及其它在這些疾病中威脅到視覺功能的神經(jīng)元的壽命方面具有重大療效。C-myc是一種通過(guò)上調(diào)多種下游細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的因子來(lái)參與細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄因子。C-myc的表達(dá)在rd/rd小鼠中超過(guò)野生型，增加了4.5倍，表明它可能參與在rd/rd小鼠中觀察到的光感受器變性。已知兩個(gè)在Lin-HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中顯著上調(diào)的基因Madl與YY-1(圖20，插圖A)，可以抑制c-myc的活性，從而抑制c-myc誘導(dǎo)的凋亡。
Madl的過(guò)量表達(dá)也表現(xiàn)出抑制Fas誘導(dǎo)的另一種細(xì)胞凋亡途徑的危險(xiǎn)組分caspase-8的活性。這兩種分子的上調(diào)可以通過(guò)防止rd/rd小鼠中通常會(huì)導(dǎo)致變性的細(xì)胞凋亡的引發(fā)，從而在保護(hù)視網(wǎng)膜不發(fā)生血管及神經(jīng)變性方面發(fā)揮作用。
另一組在Lin-HSC保護(hù)的視網(wǎng)膜中被大量上調(diào)的基因包括晶體蛋白家族的成員(圖20，插圖B)。與熱激蛋白及其它應(yīng)激誘導(dǎo)的蛋白相似，晶體蛋白可以被視網(wǎng)膜應(yīng)激激活，并提供防止細(xì)胞凋亡的保護(hù)效應(yīng)。在視網(wǎng)膜營(yíng)養(yǎng)失調(diào)的鼠模型中，αA-晶體蛋白的異常低表達(dá)同光感受器損傷相關(guān)，最近一個(gè)rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明晶體蛋白上調(diào)的誘導(dǎo)是對(duì)視網(wǎng)膜變性的應(yīng)答。根據(jù)我們的EPC修復(fù)的rd/rd小鼠視網(wǎng)膜的微陣列數(shù)據(jù)，晶體蛋白的上調(diào)看起來(lái)在EPC介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)方面起重要作用。
諸如c-my、Madl、Yx-1及晶體蛋白這樣的基因，可能是神經(jīng)修復(fù)的下游介質(zhì)。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)試劑能夠調(diào)節(jié)抗細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)，盡管我們的使用小鼠干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行修復(fù)的視網(wǎng)膜的微陣列分析并未表明已知的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在增強(qiáng)水平上的誘導(dǎo)。在另一方面，使用人特異性芯片對(duì)來(lái)源于人骨髓的干細(xì)胞所介導(dǎo)的修復(fù)進(jìn)行分析，表明多個(gè)生長(zhǎng)因子基因的表達(dá)雖然低，但仍有顯著增加。
上調(diào)的基因包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的幾個(gè)成員與otoferlin。在otoferlin基因中的突變與遺傳紊亂相關(guān)，會(huì)導(dǎo)致由于聽覺神經(jīng)疾病的耳聾。可能是由于注射了Lin-HSCs，otoferlin的產(chǎn)量也有助于視網(wǎng)膜神經(jīng)疾病的預(yù)防。在歷史上，很長(zhǎng)時(shí)間都認(rèn)為在視網(wǎng)膜變性的病人及動(dòng)物中觀察到的血管變化，是由于光感受器死亡所導(dǎo)致新陳代謝需求減少的間接結(jié)果。本文數(shù)據(jù)表明，至少對(duì)于患有遺傳性視網(wǎng)膜變性的小鼠，保持正常的血管也可以幫助維持外核層的組分。近來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道支持組織特異性血管具有比預(yù)想的簡(jiǎn)單為血管提供“養(yǎng)份”更強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)這種觀念。例如，在VEGFR1激活后，肝內(nèi)皮細(xì)胞能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生在面臨肝損傷時(shí)緊急應(yīng)對(duì)肝細(xì)胞再生與維持的生長(zhǎng)因子(LeCouter等.2003，Science 299890-893)。
已報(bào)道在功能性血管形成之前，血管內(nèi)皮細(xì)胞與鄰近的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的相似指示作用與肝器官形成有關(guān)。在發(fā)生視網(wǎng)膜變性的個(gè)體中內(nèi)源視網(wǎng)膜血管可能不會(huì)促進(jìn)如此劇烈的修復(fù)，但如果該含有來(lái)源于骨髓干細(xì)胞群的內(nèi)皮祖先的血管是板狀的，它們會(huì)使血管對(duì)變性具有更強(qiáng)抗性，同時(shí)會(huì)促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)以及血管的存活。在患有視網(wǎng)膜變性的人中，推遲完全視網(wǎng)膜變性的起始時(shí)間，可提供超出預(yù)期多年的視覺能力。使用本發(fā)明Lin-HSCs治療的動(dòng)物明顯維持了足以支撐其視力的ERG。
在臨床上，光感受器與其它神經(jīng)元受到真正損傷而視覺功能卻仍能保持將會(huì)受到廣泛重視。在某些狀況下，關(guān)鍵的閾值交織在一起，從而喪失視覺。由于幾乎所有的人遺傳性視網(wǎng)膜變性發(fā)病早，但過(guò)程緩慢，因此通過(guò)鑒定視網(wǎng)膜變性的個(gè)體、使用玻璃體內(nèi)注射自體的骨髓干細(xì)胞移植物來(lái)治療變性、進(jìn)而延遲與視覺損傷伴發(fā)的視網(wǎng)膜變性，是非常可能的。為了增強(qiáng)這些干細(xì)胞的尋靶與整合，需要存在有活性的星型膠質(zhì)細(xì)胞。這在存在相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)增生時(shí)可通過(guò)早期治療來(lái)實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)使用激光刺激活性星型膠質(zhì)細(xì)胞局部增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的Lin-HSC群含有能夠通過(guò)作用于活性星型膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)促進(jìn)血管新生并在沒有破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的情形下整合到已存在模板中的EPC群。本發(fā)明的Lin-HSC群在患有視網(wǎng)膜變性的眼中還提供了一種不尋常的長(zhǎng)期神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)修復(fù)效應(yīng)。此外，遺傳上改進(jìn)的、自體含EPC的Lin-HSC組合物能夠接種至局部缺血或者發(fā)生異常血管形成的眼中，并能穩(wěn)定整合到新血管中，并且在很長(zhǎng)時(shí)間周期內(nèi)局部持續(xù)釋放治療分子。這些局部釋放的基因，能以生理學(xué)上有意義的劑量來(lái)表達(dá)藥理學(xué)的物質(zhì)，它們?yōu)橹委熌壳盁o(wú)法治愈的眼疾提供了一個(gè)新的范例。
上述實(shí)施例中的眾多變化及修飾在不背離本發(fā)明新特征的精神與范圍時(shí)是有效的。關(guān)于本文給出的特殊實(shí)施例，不是，也不應(yīng)推斷為對(duì)本發(fā)明的限制。
序列表<110>The Scripps Research InstituteFriedlander，MartinOtani，AtsushiDaSilva，KarenMoreno，Stacey(Hanekamp)<120>造血干細(xì)胞及其治療新生血管性眼疾的方法<130>TSRI-988.1PC<150>10/628,783<151>2003-07-25<150>60/467,051<151>2003-05-02<150>60/398,522<151>2002-07-25<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>4742<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼His-標(biāo)記的人T2-TrpRS的DNA<400>1tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac 3360tatagggaga ccacaacggt ttccctctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga 3420tatacatatg agtgcaaaag gcatagacta cgataagctc attgttcggt ttggaagtag 3480taaaattgac aaagagctaa taaaccgaat agagagagcc accggccaaa gaccacacca 3540cttcctgcgc agaggcatct tcttctcaca cagagatatg aatcaggttc ttgatgccta 3600tgaaaataag aagccatttt atctgtacac gggccggggc ccctcttctg aagcaatgca 3660tgtaggtcac ctcattccat ttattttcac aaagtggctc caggatgtat ttaacgtgcc 3720cttggtcatc cagatgacgg atgacgagaa gtatctgtgg aaggacctga ccctggacca 3780ggcctatggc gatgctgttg agaatgccaa ggacatcatc gcctgtggct ttgacatcaa 3840caagactttc atattctctg acctggacta catggggatg agctcaggtt tctacaaaaa 3900tgtggtgaag attcaaaagc atgttacctt caaccaagtg aaaggcattt tcggcttcac 3960tgacagcgac tgcattggga agatcagttt tcctgccatc caggctgctc cctccttcag 4020caactcattc ccacagatct tccgagacag gacggatatc cagtgcctta tcccatgtgc 4080cattgaccag gatccttact ttagaatgac aagggacgtc gcccccagga tcggctatcc 4140
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<220>人工序列<223>His-標(biāo)記的人T2-TrpRS<400>2Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly1 5 10 15Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr20 25 30Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His35 40 45Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe50 55 60Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly65 70 75 80His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn85 90 95Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys100 105 110Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys115 120 125Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser130 135 140Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val145 150 155 160Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly165 170 175Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln180 185 190Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg195 200 205Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr210 215 220Phe Arg Mer Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro225 230 235 240Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr245 250 255
Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr260 265 270Aia Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly275 280 285Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val290 295 300Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys305 310 315 320Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly325 330 335Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu340 345 350His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe355 360 365Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala370 375 380Leu Glu His His His His His His385 390
權(quán)利要求
1.一種分離的、哺乳動(dòng)物的、譜系陰性的造血干細(xì)胞群，它含有造血干細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中至少約20％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
3.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
4.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中至少約75％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
5.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原。
6.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中細(xì)胞來(lái)源于成熟骨髓。
7.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是鼠的細(xì)胞。
8.權(quán)利要求7的分離的干細(xì)胞群，其中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31，并且至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。
9.權(quán)利要求7的分離的干細(xì)胞群，其中至少約65％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。
10.權(quán)利要求7的分離的干細(xì)胞群，其中至少約80％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31，并且至少約70％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。
11.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的分離的干細(xì)胞群，其中細(xì)胞為CD133陰性，至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原，并且至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
13.權(quán)利要求11的分離的干細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞為CD133陽(yáng)性，少于約30％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原，并且少于約30％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
14.權(quán)利要求1的分離的干細(xì)胞群，其進(jìn)一步包括一種細(xì)胞培養(yǎng)基。
15.一種分離來(lái)源于成熟骨髓的、含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群的方法，其包括以下步驟(a)從成體哺乳動(dòng)物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細(xì)胞；(c)使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞，所述譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a；(d)從多種類型單核細(xì)胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并回收含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群。
16.權(quán)利要求15中的方法，其中哺乳動(dòng)物是小鼠。
17.權(quán)利要求15中的方法，其中哺乳動(dòng)物是小鼠并且在步驟(c)中，使用針對(duì)CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。
18.權(quán)利要求15中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
19.權(quán)利要求15中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人并且在步驟(c)中，使用針對(duì)CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86和CD235a的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。
20.權(quán)利要求18中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人并且該方法包括使用生物素偶聯(lián)的CD133抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞及回收CD133陽(yáng)性的譜系陰性的造血干細(xì)胞的額外步驟。
21.權(quán)利要求18中的方法，其中哺乳動(dòng)物是人并且該方法包括使用生物素偶聯(lián)的CD133抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞、除去CD133陽(yáng)性的細(xì)胞并回收CD133陰性的譜系陰性的造血干細(xì)胞的額外步驟。
22.一種分離的、哺乳動(dòng)物的、來(lái)源于成熟骨髓并譜系陰性的造血干細(xì)胞群，它含有內(nèi)皮祖細(xì)胞，并通過(guò)以下步驟產(chǎn)生(a)從成體哺乳動(dòng)物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細(xì)胞；(c)使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞，所述譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a；(d)從多種類型單核細(xì)胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并回收含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群；其中至少20％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
23.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
24.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原。
25.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中哺乳動(dòng)物為小鼠，并且至少約80％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31細(xì)胞標(biāo)記，至少約70％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。
26.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中哺乳動(dòng)物為小鼠，至少約50％至約85％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31，并且至少約70％至約75％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD117。
27.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中哺乳動(dòng)物為人，細(xì)胞為CD133陰性，至少約50％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原，并且至少約50％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
28.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中哺乳動(dòng)物為人，細(xì)胞為CD133陽(yáng)性，少于約30％的細(xì)胞表達(dá)整聯(lián)蛋白α6表面抗原，并且少于約30％的細(xì)胞表達(dá)表面抗原CD31。
29.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中細(xì)胞為鼠細(xì)胞，并且在步驟(c)中，使用針對(duì)CD3、CD 11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。
30.權(quán)利要求22的分離的干細(xì)胞群，其中細(xì)胞為人細(xì)胞，并且在步驟(c)中，使用針對(duì)CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86和CD235a的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。
31.一種增強(qiáng)哺乳動(dòng)物中視網(wǎng)膜新生血管形成的方法，其包括將權(quán)利要求1的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射到需要視網(wǎng)膜新生血管形成的哺乳動(dòng)物眼中，其中干細(xì)胞來(lái)源于和眼中注射了細(xì)胞的哺乳動(dòng)物物種相同的哺乳動(dòng)物的骨髓。
32.權(quán)利要求31的方法，其中干細(xì)胞來(lái)源于眼中注射了細(xì)胞的同一個(gè)哺乳動(dòng)物的骨髓。
33.權(quán)利要求31的方法，其中哺乳動(dòng)物是小鼠。
34.權(quán)利要求31的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
35.一種在哺乳動(dòng)物中治療眼疾的方法，包括通過(guò)以下步驟從哺乳動(dòng)物骨髓中分離含內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群(a)從患有眼疾的哺乳動(dòng)物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細(xì)胞；(c)使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞，所述譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a；(d)從多種類型單核細(xì)胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并回收含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群；隨后將分離到的干細(xì)胞以足以改善疾病的量玻璃體內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物眼中。
36.權(quán)利要求35中的方法，其中干細(xì)胞的數(shù)量可有效修復(fù)哺乳動(dòng)物眼中的視網(wǎng)膜損傷。
37.權(quán)利要求35中的方法，其中干細(xì)胞的數(shù)量可有效穩(wěn)定哺乳動(dòng)物眼中的視網(wǎng)膜血管形成。
38.權(quán)利要求35中的方法，其中干細(xì)胞的數(shù)量可有效促進(jìn)哺乳動(dòng)物眼中視網(wǎng)膜血管形成的成熟。
39.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是視網(wǎng)膜變性疾病。
40.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是視網(wǎng)膜血管變性疾病。
41.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是局部缺血性視網(wǎng)膜病變。
42.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是血管出血。
43.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是血管滲漏。
44.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是脈絡(luò)膜病變。
45.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是年齡相關(guān)性黃斑變性。
46.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是糖尿病視網(wǎng)膜病變。
47.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是擬眼組織胞漿菌病。
48.權(quán)利要求35中的方法，其中哺乳動(dòng)物是初生的哺乳動(dòng)物。
49.權(quán)利要求48中的方法，其中疾病是早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。
50.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是鐮狀細(xì)胞貧血。
51.權(quán)利要求35中的方法，其中疾病是色素性視網(wǎng)膜炎。
52.轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群，其包含使用可操作地編碼治療上有用的肽的基因轉(zhuǎn)染的權(quán)利要求1的干細(xì)胞群。
53.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中治療上有用的肽是抗血管新生肽。
54.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中抗血管新生肽是蛋白片段。
55.權(quán)利要求54的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中蛋白片段是TrpRS的抗血管新生片段。
56.權(quán)利要求45的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中TrpRS的片段為T2-TrpRS。
57.權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中治療上有用的肽是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑。
58.權(quán)利要求57的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑選自神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-4、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-5、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、視網(wǎng)膜色素上皮衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
59.一種抑制哺乳動(dòng)物眼中視網(wǎng)膜血管新生的方法，包括將權(quán)利要求53的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物眼中。
60.一種抑制哺乳動(dòng)物眼中視網(wǎng)膜神經(jīng)變性的方法，包括將權(quán)利要求57的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射到哺乳動(dòng)物眼中。
61.通過(guò)以下步驟來(lái)制備轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群(a)從成體哺乳動(dòng)物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細(xì)胞；(c)使用針對(duì)CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞；(d)從多種類型單核細(xì)胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并回收含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的譜系陰性的造血干細(xì)胞群；以及(e)使用可操作地編碼治療上有用的肽的寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染步驟(d)中收集到的譜系陰性的造血干細(xì)胞。
62.權(quán)利要求61的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中治療上有用的肽是抗血管新生肽。
63.權(quán)利要求61的轉(zhuǎn)染的干細(xì)胞群，其中治療上有用的肽是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑。
64.一種將轉(zhuǎn)基因傳遞到哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜血管的方法，包括將權(quán)利要求52的轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
65.一種將轉(zhuǎn)基因傳遞到哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜血管的方法，包括將權(quán)利要求61的轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
66.一種修復(fù)哺乳動(dòng)物眼中神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法，包括將權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
67.一種修復(fù)哺乳動(dòng)物眼中血管的方法，包括將權(quán)利要求1的轉(zhuǎn)染的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
68.一種在哺乳動(dòng)物眼中刺激抗血管新生基因上調(diào)的方法，包括將權(quán)利要求1的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
69.一種在哺乳動(dòng)物眼中修復(fù)局部缺血的組織的方法，包括將權(quán)利要求1的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
70.一種使干細(xì)胞定向傳遞到哺乳動(dòng)物眼中星型膠質(zhì)細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求1的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
71.一種使轉(zhuǎn)基因定向傳遞到哺乳動(dòng)物眼中星型膠質(zhì)細(xì)胞的方法，包括將權(quán)利要求52的譜系陰性的造血干細(xì)胞群玻璃體內(nèi)注射至哺乳動(dòng)物眼中。
全文摘要
分離的、哺乳動(dòng)物的、來(lái)源于成熟骨髓的、含有內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的譜系陰性的造血干細(xì)胞群(Lin－HSCs)能夠修復(fù)眼中的視網(wǎng)膜血管與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。優(yōu)選地，分離的Lin－HSCs中至少約20％的細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD31。分離的Lin－HSC群對(duì)治療眼血管疾病具有用處。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Lin－HSC群通過(guò)抽取一只成體哺乳動(dòng)物的骨髓、從骨髓中分離多種單核細(xì)胞、使用針對(duì)一個(gè)或多個(gè)譜系表面抗原的生物素偶聯(lián)的譜系群體抗體標(biāo)記這些單核細(xì)胞；從多種單核細(xì)胞中除去譜系表面抗原陽(yáng)性的單核細(xì)胞，然后回收含EPCs的Lin－HSCs群的方式，來(lái)進(jìn)行分離。還提供了使用治療上有用的基因來(lái)轉(zhuǎn)染的分離的Lin－HSCs，用于在基于細(xì)胞的基因治療中將基因傳遞至眼中。還描述了制備本發(fā)明中分離的干細(xì)胞群的方法，以及治療眼疾與眼損傷的方法。
文檔編號(hào)A61K35/28GK1816281SQ200480018990
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2004年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月2日
發(fā)明者M·弗里德蘭德, A·奧塔尼, K·達(dá)西爾瓦, S·哈內(nèi)坎普 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院