專利名稱：：預(yù)防和治療血管新生的小分子多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種新型的、預(yù)防和治療血管新生的小分子多肽，稱之為AU6。本發(fā)明還涉及所述多肽的制法和應(yīng)用以及含所述多肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：血管新生即在己有的血管系統(tǒng)中長(zhǎng)出新生毛細(xì)血管的過(guò)程，是胚胎發(fā)育、傷口愈合、組織再生和修復(fù)所必需的生理變化，但同時(shí)也是多種全身和局部疾病的病理基礎(chǔ)，前者包括新生血管性眼病、腫瘤新生血管、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病等。血管新生涉及一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、侵蝕及管腔形成等。血管新生受到促血管因子和抑血管因子平衡的嚴(yán)格調(diào)控，這種平衡被打破可啟動(dòng)血管生成的細(xì)胞信號(hào)，從而導(dǎo)致病理性新生血管發(fā)生。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是這--復(fù)雜的血管新生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心誘導(dǎo)介質(zhì)，并且特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。人類VEGF基因由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成，長(zhǎng)約14kb。由于RNA剪切方式的不同，VEGF家族至少包含4個(gè)成員，分別為VEGFm、VEGF165、VEGF，禾卩VEGF2()6，其中VEGF165是最主要的異構(gòu)體。新生血管性眼病是一類具有廣泛破壞性的、可累及整個(gè)眼球的致盲性眼疾，發(fā)病率高，包括老年性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、角膜感染和新生血管性青光眼等。繼發(fā)于眼部新生血管的出血、滲出和纖維化等病變還嚴(yán)重影響了患病個(gè)體的視覺(jué)質(zhì)量和生活質(zhì)量。然而，目前該類疾病治療的方法仍然十分有限，效果欠理想，安全性尚有待進(jìn)一步認(rèn)定。。在開(kāi)發(fā)有效的血管新生抑制劑時(shí)，應(yīng)充分考慮到眼科用藥的特殊性。第一，眼部存在多個(gè)解剖性和功能性的屏障。全身給藥常常由于血-房水屏障和血-視網(wǎng)膜屏障而無(wú)法在眼組織局部達(dá)到足夠的藥物濃度；局部給藥，如玻璃體腔注射，大于76.5kDa的大分子在理論上很難穿透視網(wǎng)膜作用于視網(wǎng)膜和4脈絡(luò)膜新生血管。第二，藥物在親水的淚液、房水、玻璃體液中溶解的程度與其有效性呈正相關(guān)。第三，基于上述主要原因，眼科用藥的生物利用度很低；要使之提高，可加大給藥的濃度。用于治療腫瘤新生血管的化合物毒副作用較為明顯，全身和局部均無(wú)法高劑量給藥。第四，目前雖然已經(jīng)有一系列相對(duì)安全的內(nèi)源性血管新生抑制劑被先后證實(shí)，如血管抑素(angiostatin)，它由纖溶酶原Kringle結(jié)構(gòu)域1-4(plasminogenKrmglel-4)組成，可明顯抑制血管依賴性腫瘤的生長(zhǎng)，但由于其分子量較大且空間構(gòu)象復(fù)雜，故在制備過(guò)程中存在重組表達(dá)純化工藝繁瑣和內(nèi)毒素殘留等不足。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種適于眼球組織的有效安全的小分子新生血管抑制劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種適于眼球組織的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽-AU6多肽以及其片段、類似物和衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供含所述多肽的制法和應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]—[Xaa7](I)式中，Xaa0是無(wú)，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；Xaal是選自下組的氨基酸Tyr或Phe;Xaa2是選自下組的氨基酸Arg或Lys;Xaa3是選自下組的氨基酸Gly或Ala;Xaa4是選自下組的氨基酸Lys或Arg;Xaa5是選自下組的氨基酸Lys或Arg;Xaa6是選自下組的氨基酸Ala、Val、Leu、或Ile;Xaa7是無(wú)，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。在另一優(yōu)選例中，XaaO和Xaa7為無(wú)。在另一優(yōu)選例中，Xaa2為Arg，Xaa4為L(zhǎng)ys和Xaa5為L(zhǎng)ys。在另一優(yōu)選例中，所述多肽選自下組(a)具有YRGKKA(SEQIDNO:l)所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQIDN0:l所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)l-2個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。本發(fā)明還提供了抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚體和多聚體形式。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發(fā)明上述的多肽。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有(a)本發(fā)明上述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在另一優(yōu)選例中，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑(如眼周和眼內(nèi)注射液)、眼用凝膠或眼藥膏。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為緩釋劑型。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明所述多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，它們被用于制備用于抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的與血管新生相關(guān)疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動(dòng)脈硬化、閉塞性動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈栓塞、動(dòng)脈血栓、Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥或肉瘤狀病等。在另一優(yōu)選例中，所述的新生血管性眼病包括累及脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、角膜或虹膜，包括老年性黃斑變性、增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜血管阻斷性疾病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、角膜感染、新生血管性青光眼等。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種抑制哺乳動(dòng)物血管新生的方法，包括步驟給需要的對(duì)象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是人。在另一優(yōu)選例中，所述的血管新生是與新生血管性眼病相關(guān)的血管新生。下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示了AU6多肽對(duì)雞胚尿囊膜血管新生的影響。A.PBS組尿囊膜血管新生情況。B.50pgAU6干預(yù)組尿囊膜血管新生情況。C.各組雞胚尿囊膜微血管數(shù)，n=9-15，"p<0.01vsPBS組。圖2顯示了AU6多肽對(duì)VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜血管新生的影響。A.VEGF誘導(dǎo)角膜新生血管情況。B.2.0pgAU6干預(yù)后角膜新生血管情況。C.各組角膜新生血管最長(zhǎng)血管長(zhǎng)度、累及鐘點(diǎn)數(shù)和面積，n=10,**p<0.01vs對(duì)照組。圖3顯示了AU6多肽對(duì)缺氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜血管新生的影響。A.給氧組視網(wǎng)膜血管造影鋪片。B.lOpgAU6處理組視網(wǎng)膜血管造影鋪片。C.各組突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)，n=10，*p<0.05，**p<0.01vs給氧組。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次制備了一種具有抑制血管新生功能的，分子量小于lkD(如僅約720D)的小分子多肽。具體而言，本發(fā)明人應(yīng)用生物信息學(xué)的方法，基于同源性分析和生物學(xué)特性等分析，選定了數(shù)個(gè)候選序列，采用固相法將其合成后，再經(jīng)雞胚尿囊膜血管模型、VEGF誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管模型和缺氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管模型篩選，獲得了一類新型的、具有預(yù)防和治療血管新生功能的小分子多肽，即AU6。本發(fā)明的小肽AU6的分子量小，可透過(guò)各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；安全性高，對(duì)生物組織毒副作用??；眼局部用藥生物利用度高，可減少劑量，從而減小全身副作用。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明?；钚远嚯脑诒景l(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明多肽"、"AU6多肽"、"AU6小肽"、"短肽AU6"或"肽AU6"可互換使用，都指具有血管新生抑制活性的肽AU6氨基酸序列(SEQIDNO:l)的蛋白或多肽。此外，所述術(shù)語(yǔ)還包括具有抑制血管新生功能的、SEQIDNO:l序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)1-5個(gè)(通常為l-4個(gè)，較佳地l-3個(gè)，更佳地l-2個(gè)，最佳地l個(gè))氨基酸的缺失、插入以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為5個(gè)以內(nèi)，較佳地為3個(gè)以內(nèi)，更佳地為2個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。此外，所述術(shù)語(yǔ)還包括單體和多聚體形式本發(fā)明多肽。本發(fā)明還包括AU6多肽的活性片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)AU6多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(與前導(dǎo)序列、分泌序列或6ffis等標(biāo)簽序列融合而形成的然后蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。一類優(yōu)選的活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個(gè)，較佳地至多3個(gè)，更佳地至多2個(gè)，最佳地l個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。一類特別優(yōu)選的衍生多肽的序列如SEQIDNO:3所示。表I最初的殘基代表性的取代優(yōu)選的取代Ala(A)Val;Leu;lieValArg(R)Lys;Gin;AsnLysAsn(N)Gin;His;Lys;ArgGinAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGin(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)Pro;AlaAlaHis(H)Asn;Gin;Lys;ArgArglie(I)Leu;Val;Met;Ala;PheLeu8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>發(fā)明還提供AU6多肽的類似物。這些類似物與天然AU6多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。本發(fā)明多肽還可以以由藥學(xué)上或生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來(lái)酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的"前體藥物"的形式。編碼序列本發(fā)明還涉及編碼AU6多肽的多核苷酸。一種優(yōu)選的編碼序列是TACCGGGGCAAGAAGGCA(SEQIDNO:2)。本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQIDNO:2所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。如本文所用，"簡(jiǎn)并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQIDNO:l序列的蛋白質(zhì)，但與SEQIDNO:2中相應(yīng)編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。本發(fā)明的AU6核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或AU6多肽編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)AU6DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明多肽可以是重組多肽或合成多肽。本發(fā)明的多肽可以是化學(xué)合成的，或重組的。相應(yīng)地，本發(fā)明多肽可用常規(guī)方法人工合成，也可用重組方法生產(chǎn)。一種優(yōu)選的方法是使用液相合成技術(shù)或固相合成技術(shù)，如Boc固相法、Fmoc固相法或是兩種方法聯(lián)合使用。固相合成可快速獲得樣品，可根據(jù)目的肽的序列特征選用適當(dāng)?shù)臉?shù)脂載體及合成系統(tǒng)。例如，F(xiàn)moc系統(tǒng)中優(yōu)選的固相載體如連接有肽中C端氨基酸的Wang樹(shù)脂，Wang樹(shù)脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-烷氧基芐醇；用25%六氫吡啶/二甲基甲酰胺室溫處理20分鐘，以除去Fmoc保護(hù)基團(tuán)，并按照給定的氨基酸序列由C端逐個(gè)向N端延伸。合成完成后，用含4%對(duì)甲基苯酚的三氟乙酸將合成的胰島素原相關(guān)肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)并除去保護(hù)基，可過(guò)濾除樹(shù)脂后乙醚沉淀分離得到粗肽。將所得產(chǎn)物的溶液凍干后，用凝膠過(guò)濾和反相高壓液相層析法純化所需的肽。當(dāng)使用Boc系統(tǒng)進(jìn)行固相合成時(shí)，優(yōu)選樹(shù)脂為連接有肽中C端氨基酸的PAM樹(shù)脂，PAM樹(shù)脂結(jié)構(gòu)為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-羥甲基苯乙酰胺；在Boc合成系統(tǒng)中，在去保護(hù)、中和、偶聯(lián)的循環(huán)中，用TFA/二氯甲垸(DCM)除去保護(hù)基團(tuán)Boc并用二異丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用含對(duì)甲苯酚(5-l(T/。)的氟化氫(HF),在(TC下處理1小時(shí)，將肽鏈從樹(shù)脂上切下，同時(shí)除去保護(hù)基團(tuán)。以50-80%乙酸(含少量巰基乙醇)抽提肽，溶液凍干后進(jìn)一步用分子篩SephadexG10或Tsk-40f分離純化，然后再經(jīng)高壓液相純化得到所需的肽?？梢允褂秒幕瘜W(xué)領(lǐng)域內(nèi)已知的各種偶聯(lián)劑和偶聯(lián)方法偶聯(lián)各氨基酸殘基，例如可使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，羥基苯駢三氮唑(HOBt)或l，l，3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)進(jìn)行直接偶聯(lián)。對(duì)于合成得到的短肽，其純度與結(jié)構(gòu)可用反相高效液相和質(zhì)譜分析進(jìn)行確證。在一優(yōu)選例中，本發(fā)明多肽AU6，按其序列，采用固相合成的方法制備，行高效液相色譜純化，獲得高純度目的肽凍干粉，-2(TC貯存。另一種方法是用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明多肽。通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的AU6多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼AU6多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。由于本發(fā)明多肽較短，因此可以考慮將多個(gè)多肽串聯(lián)在一起，重組表達(dá)后獲得多聚體形式的表達(dá)產(chǎn)物，然后通過(guò)酶切等方法形成所需的小肽。藥物組合物和施用方法另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有(a)安全有效量的本發(fā)明多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明多肽的數(shù)量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。為了本發(fā)明的目的，有效的劑量為給予個(gè)體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發(fā)明多肽。此外，本發(fā)明的多肽可以單用，也可與其他治療劑一起使用(如配制在同一藥物組合物中)。藥物組合物還可含有藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受該組合物的個(gè)體有害的抗體，且給藥后沒(méi)有過(guò)分的毒性。這些載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N丄1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑及其組合。治療性組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。一旦配成本發(fā)明的組合物，可將其通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)眼表、眼周、眼內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或局部給藥。待預(yù)防或治療的對(duì)象可以是動(dòng)物；尤其是人。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，可根據(jù)使用情況而采用各種不同劑型的藥物組合物。較佳地，可以例舉的有眼藥水、針劑、眼用凝膠和眼藥這些藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法通過(guò)混合、稀釋或溶解而進(jìn)行配制，并且偶爾添加合適的藥物添加劑，如賦形劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑、稀釋劑、緩沖劑、等滲劑(isotonicities)、防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑、穩(wěn)定劑和助溶劑，而且該配制過(guò)程可根據(jù)劑型用慣常方式進(jìn)行。例如，眼藥水的配制可這樣進(jìn)行將短肽AU6或其藥學(xué)上可接受的鹽與基本物質(zhì)一起溶解于無(wú)菌水(在無(wú)菌水中溶解有表面活性劑)中，調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿度至生理狀態(tài)，并可任意地加入合適的藥物添加劑如防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、等滲劑、抗氧化劑和增粘劑，然后使其完全溶解。本發(fā)明的藥物組合物還可以緩釋劑形式給藥。例如，短肽AU6或其鹽可被摻入以緩釋聚合物為載體的藥丸或微囊中，然后將該藥丸或微囊通過(guò)手術(shù)植入待治療的組織。此外，短肽AU6或其鹽還可通過(guò)插入預(yù)先涂有藥物的眼內(nèi)透鏡而得以應(yīng)用。作為緩釋聚合物的例子，可例舉的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羥基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯垸酮、甲基纖維素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，較佳地可例舉的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被用于實(shí)際治療時(shí)，作為活性成分的短肽AU6或其藥學(xué)上可接受的鹽的劑量，可根據(jù)待治療的每個(gè)病人的體重、年齡、性別、癥狀程度而合理地加以確定。例如，當(dāng)局部滴眼時(shí)，通常其濃度約為0.1-10wt。/。，較佳地l-5wty。，每日可2-6次給藥，每次l-5滴。工業(yè)應(yīng)用性含有本發(fā)明肽或其藥學(xué)上可接受鹽作為活性成分的藥物組合物，對(duì)血管新生有顯著的抑制活性。經(jīng)在體動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明多肽不僅可以抑制雞胚尿囊膜的血管新生，而且可以抑制VEGF誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管和缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜新生血管。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括(a)本發(fā)明多肽的分子量小，可透過(guò)眼組織屏障；(b)水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度；(c)安全性高，對(duì)生物組織毒副作用小；(d)可通過(guò)固相合成的方法制備，純度高，產(chǎn)量大，成本低。因此本發(fā)明多肽有望開(kāi)發(fā)成藥物，用于治療新生血管性眼病及相關(guān)的新生血管性疾病，如腫瘤新生血管等。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l多肽的合成采用市售的SYMPHONY多肽合成儀合成序列為SEQIDNO:1的AU6多肽。步驟如下l.根據(jù)軟件計(jì)算配制所需要的保護(hù)氨基酸溶液，和縮合試劑，切割試劑，在儀器相應(yīng)的瓶里加入足量的DMF、DCM2.在反應(yīng)器中加入100^imo1FMOC-Ala-Wang-Resin，3.在收集切割液的管道上放入15mg的離心管。4.編輯程序，一般樹(shù)脂的溶漲時(shí)間是30min，脫保護(hù)時(shí)間是5min、15min兩次、縮合時(shí)間是30分鐘，切割程序是2h。5.開(kāi)機(jī)按照程序合成。6.最后將切割液用乙醚沉淀，離心，吹干，用HPLC純化。制得120mg多肽AU6，為白色粉末(水溶性好)，純度>95%。密封，-20度保存?zhèn)溆谩?shí)施例2AU6對(duì)雞胚尿囊膜血管新生的作用1.材料與方法1.1材料Whatman濾紙購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。1.2模型制作及干預(yù)試驗(yàn)將生后l-2d的雞種蛋隨機(jī)分成3組，依次為對(duì)照組、10pgAU6干預(yù)組、50pgAU6干預(yù)組，每組9-15只。用自來(lái)水洗凈種蛋表面，在0.2。/。的新潔爾滅溶液中浸泡5-10min，鈍端朝上，于條件為溫度37。C，濕度60%-70%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天至少翻轉(zhuǎn)2次，以24h為一天，孵化5天。無(wú)菌條件下，用鑷子在其鈍端(氣室端)打開(kāi)一個(gè)約lcm、2cm2的小孔，依次揭開(kāi)卵殼膜與氣室,露出長(zhǎng)有血管的尿囊膜。以5mm直徑的Whatman濾紙用作樣品載體，每一濾紙吸收含Opg、10pg或50ngKVll的PBS溶液5ul，晾干后放入尿囊膜的中央。用塑料膠帶封好小窗。繼續(xù)在上述同樣條件下孵化2天。1.3計(jì)數(shù)尿囊膜微血管數(shù)打開(kāi)膠帶，觀察尿囊膜上新發(fā)生的微血管,在體視顯微鏡下計(jì)量各組種蛋濾紙周圍5mm內(nèi)的微血管(直徑不大于10微米)數(shù)1.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^士s表示。采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別比較各組雞胚尿囊膜微血管數(shù)。以PO.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果種蛋雞胚尿囊膜上濾紙片周圍5mm范圍內(nèi)，PBS對(duì)照組受精雞胚尿囊膜的血管，從其大血管逐級(jí)分支，形成多條微血管，AU6處理組的微血管數(shù)明顯少于正常組。未發(fā)現(xiàn)AU6對(duì)雞胚的毒性作用(圖1A、1B和1C)。14AU6對(duì)VEGF誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管的作用1.材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料健康雄性C57Bl/6小鼠，56周齡，體重約20g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；硫糖鋁(sucroseoctasulfate-aluminumcomplex),購(gòu)自美國(guó)SIGMA-Aldrich公司；PolyHEMA(poly(2-hydroxyethylmethacylate))，購(gòu)自美國(guó)Aldrich公司；人重組VEGF,65購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。1.2模型制作及干預(yù)試驗(yàn)將12%PolyHEMA乙醇溶液與含有硫糖鋁粉末的生理鹽水溶液等體積混合后，制成體積為0.35mmX0.35mmX0.20mm的空白緩釋顆粒，并在上述顆粒中加入160ngVEGF和不同劑量(0ing、1.0pg、2.(Hxg)的小肽，-20'C貯存?zhèn)溆?。上述操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。將30只C57B1/6小鼠(30只眼)隨機(jī)分為對(duì)照組(VEGF組)、VEGF+1.0pgAU6組、VEGF+2.0pigAU6組，每組10只眼。無(wú)菌條件下，用23G注射針頭在實(shí)驗(yàn)眼角膜基質(zhì)層間行鈍性分離，形成1個(gè)0.5mmX0.5mm小袋。將包含160ngVEGF和不等劑量小肽的顆粒植入各組鼠眼角膜的小袋內(nèi)，并使之距角鞏緣0.60.8mm。術(shù)畢，0.5%金霉素眼膏涂眼以預(yù)防感染和減少刺激。術(shù)后7d攝片觀察角膜新生血管長(zhǎng)入情況，并行組織病理學(xué)檢查。1.3角膜新生血管的定量測(cè)定術(shù)后7d測(cè)量自角鞏緣長(zhǎng)出的角膜新生血管長(zhǎng)度。以連續(xù)彎曲度小、朝向緩釋顆粒生長(zhǎng)的最長(zhǎng)血管為準(zhǔn)，計(jì)算新生血管面積(Area)。公式Area(mm2)二0.5XitXVL(mm)XCNX0.4(mm)，其中VL為最長(zhǎng)新生血管從角鞏緣長(zhǎng)入角膜的長(zhǎng)度，CN為新生血管累及角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)。1.4角膜新生血管的定性觀察各組動(dòng)物于術(shù)后7d以過(guò)量麻醉處死，無(wú)菌條件下取眼球，10%中性甲醛固定，行組織病理學(xué)檢查。標(biāo)本以石蠟包埋，3pm切片，HE染色，光鏡下觀察。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以？士s表示。采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別比較各組小鼠角膜最長(zhǎng)新生血管長(zhǎng)度、鐘點(diǎn)數(shù)和面積。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1角膜新生血管的定量測(cè)定觀察角膜基質(zhì)層內(nèi)移植有C57Bl/6小鼠角15膜血管新生進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)術(shù)后3d，自角鞏緣處長(zhǎng)出新生血管，至術(shù)后7d達(dá)到高峰。術(shù)后7d，AU6干預(yù)組較對(duì)照組在角膜新生血管的最大血管長(zhǎng)度、血管累及鐘點(diǎn)數(shù)和血管面積上均明顯減少(圖2A、2B和2C)。2.2角膜組織病理學(xué)檢查術(shù)后7d，HE染色切片觀察可見(jiàn)對(duì)照組角膜組織水腫，上皮和內(nèi)皮層完整，基質(zhì)板層排列疏松，其間有較多毛細(xì)血管管腔。AU6干預(yù)組角膜組織無(wú)明顯水腫，上皮和內(nèi)皮層完整，基質(zhì)板層排列尚整齊，可見(jiàn)個(gè)別毛細(xì)血管管腔。未發(fā)現(xiàn)AU6對(duì)角膜各層組織的毒性作用。實(shí)施例4AU6對(duì)缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管的作用1.材料與方法1.1材料和主要設(shè)備健康新生C57Bl/6小鼠，雌雄不限，7d齡，體重約4g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；FITC-dextran(分子量為2H0勺購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司。1.2模型制作和干預(yù)實(shí)驗(yàn)將10窩新生鼠隨機(jī)分成5組，依次為給氧組、給氧+PBS組、給氧+AU65pig、給氧+AU610pg組和對(duì)照組，每組10-11只小鼠。生后7d，除對(duì)照組外，將余各組小鼠和其同籠母鼠一起置于密閉的干燥箱中。干燥箱中通入濕潤(rùn)純氧，維持氧箱內(nèi)的氧體積濃度為75%±5%，每3-6h用測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)一次。對(duì)照組正常空氣飼養(yǎng)。于生后12d，無(wú)菌條件下，對(duì)給氧+PBS組、給氧十AU6(5pg、IO貼)組小鼠行玻璃體腔注射分別含有O、5pg、10貼AU6的PBS溶液0.5ul。1.3FITC-dextran視網(wǎng)膜血管造影鋪片于生后17d，對(duì)各組小鼠行左心室灌注50mg/mlFITC-dextran溶液后，立即取眼球，固定于4'C多聚甲醛溶液中5-24h后，分離視網(wǎng)膜并鋪片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管形態(tài)變化。1.4視網(wǎng)膜新生血管的定量測(cè)定各組動(dòng)物于生后17d以過(guò)量麻醉處死，取眼球，10%中性甲醛固定，行組織病理學(xué)檢査。標(biāo)本以石蠟包埋，61^m連續(xù)切片，切片方向?yàn)槭笭钗?，即通過(guò)角膜，并與視神經(jīng)平行，HE染色。每眼隨機(jī)抽取5個(gè)切面(有視神經(jīng)斷面的切面除外)，光鏡下計(jì)數(shù)突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以^is表示。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)法比較給氧組與對(duì)照組，采用采用單因素方差分析(one-wayANOVA)分別AU6處理組與給氧組的突破視網(wǎng)膜內(nèi)界膜的細(xì)胞核數(shù)目。以PO.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.結(jié)果2.1FITC-dextran視網(wǎng)膜血管造影鋪片正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜未見(jiàn)無(wú)灌注區(qū)和新生血管簇，模型處理組視網(wǎng)膜鋪片可見(jiàn)大片區(qū)灌注區(qū)和多處新生血管簇，AU6處理組視網(wǎng)膜鋪片示無(wú)灌注區(qū)縮小，新生血管簇減少(圖3A和3B)。2.2視網(wǎng)膜新生血管的定量測(cè)定正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜切片僅見(jiàn)極少量有突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核，模型處理組視網(wǎng)膜切片顯示突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)明顯多于正常組，AU6處理組視網(wǎng)膜切片可見(jiàn)突破內(nèi)界膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞核數(shù)較模型處理組明顯減少。未發(fā)現(xiàn)AU6對(duì)視網(wǎng)膜各層組織的毒性作用(圖3C)。實(shí)施例6眼藥水的制備利用常規(guī)技術(shù)，混合以下組分，制得1%眼藥水，其配方如下AU6肽10mg羥丙基甲基纖維素0.03g無(wú)菌水加至10ml調(diào)節(jié)滲透壓至3000sm，酸堿度(pH)至6.8-7.1。經(jīng)3位志愿者試用一周，每日2次，每次2滴/眼。結(jié)果表明該眼藥水可抑制眼部的新生新生。討論本發(fā)明多肽AU6具有顯著的抑制血管新生的活性，這表現(xiàn)在AU6可抑制雞胚尿囊膜的血管新生；AU6可抑制VEGF誘導(dǎo)的小鼠角膜的血管新生；AU6可抑制缺氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜血管新生。就序列而言，SEQIDNO:1所示的AU6的氨基酸序列正好與apo(a)KV中一段含6個(gè)氨基酸殘基的片段相同。Kringle結(jié)構(gòu)域是一種由約80個(gè)氨基酸組成的保守結(jié)構(gòu)，包含3對(duì)二硫鍵，形成雙環(huán)狀構(gòu)象，是行使生物學(xué)功能的獨(dú)立折疊單元。Kringle結(jié)構(gòu)域存在于包括生長(zhǎng)因子、蛋白酶和凝血因子等多種不同功能的蛋白質(zhì)。Kringle結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)特異性交互作用及其調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，許多Kringle結(jié)構(gòu)域能夠阻斷血管新生，如angiostatin、plasminogenkringle5等。在包含Kringle結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，載脂蛋白(a)[叩olipoprotein(a)，叩o(a)]是一種分子量為400-800KDa不等的糖蛋白，以二硫鍵與叩oB-100相接構(gòu)成脂蛋白(a)。研究表明，叩o(a)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)LL/2腫瘤因微血管密度減少而消減證實(shí)apo(a)能夠在體內(nèi)抑制血管新生。apo(a)與纖溶酶原高度同源，其中包含幾個(gè)隨機(jī)重復(fù)的與纖溶酶原Kringle4(K4)類似的Kringle區(qū)域(KringleIV，KIV)，依次命名為KIV-I至KIV-IO，后面帶有一個(gè)與纖溶酶原K5同源的KringleV(KV)結(jié)構(gòu)域以及蛋白酶樣區(qū)。本發(fā)明多肽AU6正好與apo(a)KV中一段含6個(gè)氨基酸殘基的片段相同，一個(gè)方面提示了該短肽序列在抑制血管新生方面的重要性，另一方面也提示叩o(a)與纖溶酶原基因可能是由同一個(gè)前體衍化而來(lái)，其中一部分有潛在生物學(xué)活性的保守序列在維持蛋白質(zhì)功能上具有關(guān)鍵作用。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。18序列表<110〉上海市第一人民醫(yī)院<120>預(yù)防和治療血管新生的小分子多肽及其應(yīng)用<130>077548〈160〉3<170〉Patentlnversion3.4<210〉1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220〉<221>misc—feature<222>(1)..(6)<223>血管新生抑制肽AU6<400>1TyrArgGlyLysLysAla15<210>2<211>18<212>DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature<223>AU6多肽的編碼序列<400>2taccggggcaagaaggca<210〉3<211>6<212〉PRT<213>人工序列<220><221>misc—feature〈223〉A(chǔ)U6衍生多肽<220><221>raise—feature<222>(1)..(1)〈223〉Xaa-Y或F<220〉<221>misc—feature〈222〉(2)..(2)〈223〉Xaa:喊K<220〉<221〉tnisc—feature<222〉(3)..(3)<223>Xaa:G或A〈220><221〉misc—feature〈222〉(4)..(4)<223〉Xaa:K或R<220〉<221>misc—feature〈222〉(5)..(5)<223>Xaa:K或R<220><221>misc—feature<222>(6)..(6)<223〉Xaa=A,V,L,或I<柳〉3X膽XaaXaaXaaXaaXaa1520權(quán)利要求1.一種下式I表示的多肽，或其藥學(xué)上可接受的鹽[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7](I)式中，Xaa0是無(wú)，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；Xaa1是選自下組的氨基酸Tyr或Phe；Xaa2是選自下組的氨基酸Arg或Lys；Xaa3是選自下組的氨基酸Gly或Ala；Xaa4是選自下組的氨基酸Lys或Arg；Xaa5是選自下組的氨基酸Lys或Arg；Xaa6是選自下組的氨基酸Ala、Val、Leu、或Ile；Xaa7是無(wú)，或1-3個(gè)氨基酸構(gòu)成肽段；并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，XaaO和Xaa7為無(wú)。3.如權(quán)利要求l所述的多肽，其特征在于，Xaa2為Arg，Xaa4為L(zhǎng)ys和Xaa5為L(zhǎng)ys。4.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽選自下組(a)具有YRGKKA(SEQIDNO:1)所示氨基酸序列的多肽;(b)將SEQIDN0:1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1-2個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。5.—種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求l所述的多肽。6.—種藥物組合物，其特征在于，它含有(a)權(quán)利要求l所述多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽；和(b)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為眼藥水、針劑、眼用凝膠或眼藥膏。8.如權(quán)利要求l所述的多肽或藥學(xué)上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備用于抑制血管新生或防治與血管新生相關(guān)疾病的藥物。9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的與血管新生相關(guān)疾病的選自下組新生血管性眼病、腫瘤、缺血性心臟病、非炎癥性心肌病、冠狀動(dòng)脈硬化、閉塞性動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈栓塞、動(dòng)脈血栓、Berger's病、慢性炎癥、炎癥性腸病、潰瘍、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮癥、銀屑病、不育癥和肉瘤狀病。10.—種抑制哺乳動(dòng)物血管新生的方法，其特征在于，包括步驟給需要的對(duì)象施用本發(fā)明所述的多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽。全文摘要本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療血管新生的小分子多肽。本發(fā)明還涉及所述小分子多肽的制法和應(yīng)用以及含所述多肽的藥物組合物。本發(fā)明多肽具有多種優(yōu)點(diǎn)，例如分子量小，可透過(guò)各種眼組織屏障；水溶性好，能在中性淚液、房水和玻璃體液中保持較高的濃度等。文檔編號(hào)C12N15/11GK101503458SQ20081003354公開(kāi)日2009年8月12日申請(qǐng)日期2008年2月4日優(yōu)先權(quán)日2008年2月4日發(fā)明者迅許,卉趙申請(qǐng)人:上海市第一人民醫(yī)院