專利名稱：用于治療b細胞相關(guān)疾病的包含雙特異性抗cd3、抗cd19抗體構(gòu)建體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的藥物組合物，所述雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體包含特異于人CD3和人CD19的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中相應的可變重鏈區(qū)(VH)和相應的可變輕鏈區(qū)(VL)從N-末端到C-末端按照如下順序排列VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)。此外，本發(fā)明公開了該藥物組合物的制備方法以及特異于人CD3抗原和人CD19抗原的雙特異性單鏈抗體分子的醫(yī)學/藥物用途。
背景技術(shù)：
盡管其醫(yī)學重要性，關(guān)于B細胞介導疾病(如非霍奇金淋巴瘤)的研究僅僅取得了少量臨床可用的數(shù)據(jù)，治療這種疾病的常規(guī)方法仍然進展緩慢和不容樂觀，并且具有復發(fā)的高風險性。例如，盡管用高劑量化學療法作為后期(high grade)非霍奇金淋巴瘤的主要治療方法可以提高整體存活，仍然有大約50％的病人死于這種疾病(Gianni，N Engl.J.Med.336(1997)，1290-7；Urba，J.Natl.Cancer Inst.Monogr.(1990)，29-37；Fisher，Cancer(1994))。此外，仍然不能治愈早期(low-grade)非霍奇金淋巴瘤樣慢性淋巴細胞白血病和套細胞淋巴瘤。這刺激人們尋求替代策略，如免疫療法。針對由CD抗原限定的細胞表面分子的抗體代表了發(fā)展治療試劑的獨特機會。特定CD抗原的表達極大地受限于特定譜系淋巴造血細胞，在過去幾年，針對淋巴特異性抗原的抗體已經(jīng)用于發(fā)展在體外或動物模型體內(nèi)有效的治療(Bohlen，Blood 82(1993)，1803-121；Bohlen，Cancer Res 53(1993)，184310-4；Bohlen，Cancer Res 57(1997)，1704-9；Haagen，Clin ExpImmunol 90(1992)，368-75；Haagen，Cancer Immunol Immunother.39(1994)，391-6；Haagen，Blood 84(1994)，556-63；Haagen，Blood 85(1995)，3208-12；Weiner，Leuk Lymphoma 16(1995)，199-207；Csoka，Leukemia 10(1996)，1765-72)。從這方面來看，CD19已經(jīng)被證實是非常有用的靶標。CD19在從前B細胞到成熟B細胞的整個B細胞譜系中表達，它不會擴散，在所有的淋巴瘤細胞中同樣表達，在干細胞中缺乏(Haagen，Clin ExpImmunol 90(1992)，368-75；Uckun，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，8603-7)。一種有意義的藥征是應用既特異于T細胞上CD19又特異于CD3抗原的雙特異性抗體。然而，迄今可用的雙特異性抗體受限于低T細胞毒性并需要共刺激劑才能呈現(xiàn)出令人滿意的生物活性。CD3復合體表示作為多分子T細胞受體復合體的一部分在T細胞上表達的抗原。它由幾種不同的鏈組成，如γ、δ、ε、ξ或/和η鏈。CD3在T細胞上的成簇(如通過固定的抗CD3抗體)導致類似于嚙合T細胞受體的T細胞活化，但不依賴于它的典型克隆特異性。實際上，大部分抗CD3抗體識別CD3ε鏈。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)例舉了使用抗體分子的T細胞活化事件。例如US 4,361,549推薦一種雜交細胞系，用于生產(chǎn)針對發(fā)現(xiàn)于正常人T細胞和皮膚T淋巴瘤細胞的抗原的單克隆抗體，并且定義此抗體為“OKT3”。在US 5,885,573中，將鼠OKT3(US 4,361,549中所描述的)轉(zhuǎn)移到人抗體框架中，以降低其免疫原性。此外，US 5,885,573公開了在OKT3的Fc受體(“FcR”)-結(jié)合片斷上的特異突變，該突變導致235位為谷氨酸，234位為苯丙氨酸或234位為亮氨酸，即導致CH2區(qū)的特異突變，預期導致人FcR的結(jié)合親和性被改變。在增殖測定或涉及細胞因子釋放的測定中，US 5,885,573所公開的突變OKT3抗體似乎導致與觀察到的用原初鼠OKT3刺激的PBMC相當?shù)募毎隽呀Y(jié)果以及相似量的細胞產(chǎn)生。不過，突變的Glu-235單克隆抗體僅誘導少量TNF-α和GM-CSF，沒有IFN-γ。用來源于三種不同供體的PBMC，濃度高達10μg/ml的Glu-235單克隆抗體(“mab”)沒有誘導T細胞增殖，這提示該單克隆抗體FcR結(jié)合區(qū)的改變削弱了它的促有絲分裂特性。通過Glu-235單克隆抗體的T細胞激活還導致表面標志物Leu23和IL-2受體的低水平表達。US 5,929,212公開了一種重組抗體分子，其中連接區(qū)來源于鼠抗CD3抗體(如OKT3)的重和/或輕鏈可變區(qū)，并且被移植到人構(gòu)架中。WO 98/52975公開了鼠抗CD3抗體OKT3的突變變體。用重組表達系統(tǒng)產(chǎn)生突變的OKT3抗體，并且WO 98/52975認為突變的抗OKT3抗體在長期儲藏的過程中比親本OKT3蛋白質(zhì)穩(wěn)定。US 5,955,358公開了在DNA水平上改組來源于相同或不同抗體的多個互補決定區(qū)(CDR)結(jié)構(gòu)域的方法，即改變它們在抗體可變結(jié)構(gòu)域中的順序，以產(chǎn)生結(jié)合區(qū)的新組合。
在臨床移植中，OKT3被用作治療同種異體移植排斥的有效免疫抑制劑(Thistlethwaite 1984，Transplantation 38，695-701；Woodle 1991，Transplantation 51，1207-1212；Choi 2001，Eur.J.Immunol.31(1)，94-106)。這種治療的主要缺陷是由于T細胞和FcγR承載細胞之間的交叉連接導致的細胞因子釋放所表明的T細胞活化以及人抗鼠抗體(HAMA)應答。一些出版物描述了如OKT3人源化這樣的改變以降低這些副反應US5,929,212；US 5,885,573等。另一方面，OKT3或其它抗CD3抗體可用作刺激T細胞活化與增殖的免疫增強劑(US 6,406,696 Bluestone；US6,143,297 Bluestone；US 6,113,901 Bluestone；Yannelly 1990，J.Immunol.Meth.1，91-100)?？笴D3抗體還被描述為與抗CD28抗體聯(lián)用以誘導T細胞增殖的試劑(US 6,352,694)。OKT3還進一步單獨或作為雙特異性抗體的組分用于將細胞毒T細胞靶向于腫瘤細胞和病毒感染細胞(Nitta 1990，Lancet 335，368-376；Sanna 1995，Bio/Technology 13，1221-1224；WO 99/54440)。
到目前為止，用抗體作為招募T細胞試劑的方法被若干發(fā)現(xiàn)所阻礙。首先，具有T細胞高親和力的天然或改造的抗體常常不會激活它們所結(jié)合的T細胞。其次，T細胞低親和力的天然或改選的抗體在引發(fā)T細胞介導的細胞裂解能力方面也常常是無效的。
包含特異于人CD19和人CD3的、非單鏈形式的、以不依賴主要組織相容性復合體的方式將T細胞的細胞毒性靶標轉(zhuǎn)移到淋巴瘤細胞的雙特異性抗體在動物模型體內(nèi)(Bohlen，Cancer Res 57(1997)，1704-9；Demanet，Int J Cancer Suppl 7(1992)，67-8)和一些臨床前試驗中顯示有效。到目前為止，這些抗體通過雜種雜交瘤技術(shù)、共價連接單克隆抗體(Anderson，Blood80(1992)，2826-34)或雙抗體方法(Kipriyanov，Int.J.Cancer 77(1998)，763-772)構(gòu)建。這些抗體的低生物活性致使必須施用高劑量藥，并且單獨應用這些抗體不能提供有益的治療效果，這些事實阻礙了更廣泛的臨床研究。此外，臨床級別材料的獲得有限?，F(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)例舉了包含特異于人CD3和人CD19抗原的雙特異性單鏈抗體(Loffler，Blood 95(2000)，2098-103；WO 99/54440；Dreier，Int.J.Cancer.100(2002)，690-7)。WO99/54440證明VL(CD19)-VH(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)形式的構(gòu)建體成功的臨床用途，強調(diào)構(gòu)建體可變區(qū)的順序不是決定性的。
然而，特別對于確切的臨床和制藥用途，必須提供可通過重組構(gòu)建體的適度高水平表達和表達后適當?shù)募兓椒ù罅可a(chǎn)的構(gòu)建體。如果僅僅獲得極低量的純蛋白質(zhì)，生產(chǎn)這種構(gòu)建體的治療相應量就變得棘手和/或昂貴。在用于腸胃外施用的蛋白質(zhì)藥物的特殊情況下，即使低濃度，這些藥物也應該具有高活性和高效力，以避免由于過大蛋白質(zhì)濃度或大體積的輸注/注射溶液所引起的有害副反應。高劑量的蛋白質(zhì)藥物或基于核酸的藥物的缺點尤其包括促進過敏和炎癥事件，尤其是在施藥部位。
因此，本發(fā)明的技術(shù)難題是提供產(chǎn)生具有良好耐受性且便利的藥物的手段和方法，所述藥物用于治療和/或減輕B細胞相關(guān)或B細胞介導的紊亂。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及包含雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的藥物組合物，所述的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體包含人CD3和人CD19的特異結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中相應的可變重鏈區(qū)(VH)和相應的可變輕鏈區(qū)(VL)從N-末端到C-末端按如下順序排列，VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、
VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)。
因此，VL″和″VH″指特異抗CD19(CD19)和抗CD3(CD3)抗體的輕鏈和重鏈的可變結(jié)構(gòu)域。
依照本發(fā)明，術(shù)語“藥物組合物”涉及對患者，優(yōu)選人類患者施用的組合物。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包括腸胃外、經(jīng)皮、腔內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)施用或直接注射入組織的組合物。特別設(shè)想該藥物組合物通過輸注或注射施用于患者。適當組合物的施用可以通過不同的途徑實現(xiàn)，例如，通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、局部或皮內(nèi)施用。本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包含可藥用載體。適當藥物載體的實例為本領(lǐng)域眾所周知，包括磷酸緩沖鹽溶液、水、乳濁液(如油/水乳濁液)、多種類型的潤濕劑、無菌溶液等。包含這些載體的組合物可以通過眾所周知的常規(guī)方法制備。這些藥物組合物可以適當?shù)膭┝渴┯糜谑茉囌?。劑量方案由主治醫(yī)師和臨床因素決定。醫(yī)學領(lǐng)域所眾所周知的是，對每一個患者的給藥劑量都依賴于許多因素，包括患者的體型大小、身體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施藥時間及途徑、一般健康狀況和同時施用的其它藥物。優(yōu)選給藥劑量可以在每天每千克體重0.24μg到48mg單位之間，優(yōu)選0.24μg到24mg，更優(yōu)選0.24μg到2.4mg，更優(yōu)選0.24μg到1.2mg，最優(yōu)選0.24μg到240μg。特別首先的劑量于下文詳述。可以通過周期性評估來監(jiān)控進展。劑量將變化，但是靜脈服用DNA的優(yōu)選劑量大約從106到1012拷貝核酸分子，優(yōu)選DNA分子。包含這里所描述的蛋白質(zhì)或核酸化合物的藥物組合物可以局部或全身施用。通常腸胃外(如靜脈內(nèi))投藥；DNA還可以直接施用于靶位點，如通過生物射彈遞送到內(nèi)部或外部靶位點或者通過導管遞送到動脈的一定位點。腸胃外投藥制劑包括無菌水或非水溶液、懸液和乳液。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)、可注射的有機酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、乙醇/水溶液、乳液或懸液，包括鹽溶液和緩沖的介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化鈉、Ringer乳酸鹽或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)載體包括流體和營養(yǎng)補充物、電解質(zhì)補充物(如基于Ringer右旋糖的那些)等。還可以加入防腐劑和其它添加劑，如抗微生物、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。另外，本發(fā)明的藥物組合物可以包含蛋白質(zhì)載體，例如，血清白蛋白或免疫球蛋白，優(yōu)選人源的。除蛋白質(zhì)雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體或編碼同樣的雙特異性單鏈抗體的核酸分子或載體(如本發(fā)明中所描述的)之外，依賴于藥物組合物用途，還可以設(shè)想本發(fā)明藥物組合物包含其它生物活性試劑。這些試劑可以是作用于胃腸系統(tǒng)的藥物、作為細胞抑制劑(cytostatica)起作用的藥物、預防高尿酸血(hyperurikemia)的藥物、抑制免疫反應的藥物(如糖皮質(zhì)激素)、作用于循環(huán)系統(tǒng)的藥物和/或本領(lǐng)域公知的T細胞共刺激分子或細胞因子之類的試劑。
術(shù)語“雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體”涉及包含由上文所描述的可變區(qū)(或它的部分)所組成的、能與人CD3特異相互作用/結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和由上文所描述的可變區(qū)(或它的部分)所組成的、能與人CD19特異相互作用/結(jié)合的另一個結(jié)構(gòu)域。
所述的結(jié)合/相互作用也可以理解成定義“特異識別”。術(shù)語“特異識別”依照本發(fā)明的意思是抗體分子能夠特異作用于和/或結(jié)合本文所定義的每個人類靶分子上的至少兩個氨基酸。該術(shù)語與抗體分子的特異性相關(guān)，即與它區(qū)分本文所定義的人類靶分子特異區(qū)域的能力相關(guān)。抗原作用位點與它的特異抗原的特異性相互作用可以導致信號啟動，例如，由抗原構(gòu)像改變的誘導作用、抗原的寡聚化等所引起。此外，該結(jié)合可以由“鑰匙-鎖原理”的特異性來解釋。因此，抗原作用位點的氨基酸序列中的特異基序與抗原由于它們的一級、二級或三級結(jié)構(gòu)以及該結(jié)構(gòu)的二級修飾的原因而相互結(jié)合。抗原作用位點與其特異抗原的特異性相互作用還可以導致該位點與抗原的簡單結(jié)合。
如本發(fā)明所用的術(shù)語“特異性相互作用”指雙特異性單鏈構(gòu)建體不會或基本上不會與類似結(jié)構(gòu)的(多)肽交叉反應。例如，可以通過在常規(guī)條件下(參見Harlow和Lane，《AntibodiesA Laboratory Manual》，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1988和Using AntibodiesA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)評估一組雙特異性單鏈構(gòu)建體與目的(多)肽和許多(在結(jié)構(gòu)和/功能上)或多或少密切相關(guān)的(多)肽之間的結(jié)合來檢驗所研究的該組雙特異性單鏈構(gòu)建體的交叉反應。只有與目的(多)肽/蛋白質(zhì)相結(jié)合但不會或基本上不會與任何其它(多)肽相結(jié)合的那些抗體被認為具有目的(多)肽/蛋白質(zhì)特異性。
抗原作用位點與特異抗原的特異性相互作用的實例包括配體對其受體的特異性。所述定義尤其包括基于結(jié)合而誘導信號的配體與其特異性受體之間的相互作用。相應配體的實例包括作用于/結(jié)合其特異性受體的細胞因子。所述定義還尤其包括抗原作用位點與抗原(如選擇蛋白家族、整聯(lián)蛋白和生長因子(如EGF)家族的抗原)之間的結(jié)合。所述相互作用的另一個實例是抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點之間的相互作用，該實例也特別包含于所述定義。
術(shù)語“結(jié)合/作用于”還可以涉及構(gòu)象表位，即由人靶標分子或它的部分的兩個區(qū)域所組成的結(jié)構(gòu)表位或不連續(xù)表位。就本發(fā)明而言，構(gòu)象表位定義為當多肽折疊成天然蛋白質(zhì)的時候，在一級序列中分離的兩個或多個不連續(xù)氨基酸序列在分子表面聚集到一起(Sela，(1969)Science 166，1365和Laver，(1990)Cell 61，553-6)。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“不連續(xù)表位”指由在多肽鏈上距離較遠部分的殘基所組裝成的非線性表位。當多肽鏈折疊成三維結(jié)構(gòu)時，這些殘基在分子表面聚集到一起以組成構(gòu)象/結(jié)構(gòu)表位。
依照本發(fā)明，在免疫球蛋白來源抗原的相互作用中使用的術(shù)語“可變區(qū)”包括至少含一個來源于抗體、抗體片斷或其衍生物的互補決定區(qū)(CDR)的(多)肽片斷和衍生物。本發(fā)明設(shè)想的所述至少一個互補決定區(qū)(CDR)優(yōu)選CDR3，更優(yōu)選抗體重鏈的CDR3(CDR-H3)。然而，術(shù)語“可變區(qū)”還具體包含其它抗體來源的互補決定區(qū)。
抗體“特異性結(jié)合”的特征主要在于兩個參數(shù)定性參數(shù)(結(jié)合表位，或者說抗體所結(jié)合的部位)和定量參數(shù)(結(jié)合親和力，或者說抗體結(jié)合的強度)。可通過例如已知的FACS方法、肽-點表位圖譜、質(zhì)譜來方便的測定抗體的結(jié)合表位?？赏ㄟ^例如已知的BIAcore和/或ELISA方法來有利地測定抗體與特定表位的結(jié)合強度。這些技術(shù)的組合可以計算出作為結(jié)合特異性代表性測量的信噪比。在這種信噪比中，信號代表抗體結(jié)合到目的表位的強度，而噪音代表抗體結(jié)合到其它的不同于目的表位的非相關(guān)表位的強度。一般而言，如果在任何情況下抗體與一個表位的結(jié)合比與另一個表位的結(jié)合更加頻繁和/或強烈，那么就可以說這種抗體與前一表位特異性結(jié)合。優(yōu)選地，若目的表位的信噪比比不同于目的表位的其它表位高大約50倍，可以指示評估的抗體與目的表位特異結(jié)合，即是“特異性的結(jié)合體”。
如下文將要詳述的，可變區(qū)的一部分可以至少有一個CDR(互補決定區(qū))，優(yōu)選至少一個CDR3區(qū)。所述的單鏈抗體構(gòu)建體中的兩個結(jié)構(gòu)域/區(qū)域優(yōu)選作為單鏈彼此共價連接。這種連接可直接實現(xiàn)(針對CD3的結(jié)構(gòu)域1-針對CD19的結(jié)構(gòu)域2或針對CD19的結(jié)構(gòu)域1-針對CD3的結(jié)構(gòu)域2)或通過額外的多肽接頭序列實現(xiàn)(結(jié)構(gòu)域1-接頭序列-結(jié)構(gòu)域2)。如果使用接頭，此接頭優(yōu)選其長度和序列足以確保第一和第二個結(jié)構(gòu)域能夠互相獨立地保持它們的結(jié)合特異性。如附帶實施例所證明的，在本發(fā)明的藥物組合物中最優(yōu)選使用的“雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體”為雙特異性單鏈Fv(scFv)。雙特異性單鏈分子在本領(lǐng)域中是公知的，并且在WO 99/54440，Mack，J.Immunol.(1997)，158，3965-3970，Mack，PNAS，(1995)，92，7021-7025，Kufer，Cancer Immunol.Immunother.，(1997)，45，193-197，Lffler，Blood，(2000)，95，6，2098-2103，Brühl，Immunol.，(2001)，166，2420-2426，Kipriyanov，J.Mol.Biol.，(1999)，293，41-56中有所描述。
依照本發(fā)明使用的術(shù)語“單鏈”指雙特異性單鏈構(gòu)建體的所述第一和第二個結(jié)構(gòu)域共價連接，優(yōu)選以單個核酸分子編碼的共線性氨基酸序列的形式共價連接。
如上文所指出的，CD19表示在B譜系(如前B細胞和成熟B細胞)中表達的抗原，它不會擴散(shed)，在所有的淋巴瘤細胞中同樣表達，在干細胞中缺乏(Haagen(1992)上述引文；Uckun(1988)PNAS 85，8603-8607)。CD3表示作為多分子T細胞受體復合體的一部分在T細胞上表達的抗原，并且由至少三種不同鏈CD3ε，CD3δ和CD3γ所組成。CD3在T細胞上的成簇(如通過固定的抗CD3抗體)導致類似于嚙合T細胞受體的T細胞激活，但不依賴于它的典型克隆特異性。實際上，大部分抗CD3抗體識別CD3ε鏈。
現(xiàn)有技術(shù)描述了特異識別CD19或CD3抗原的抗體，如Dubel(1994)，J.Immunol.Methods 175，89-95；Traunecker(1991)EMBO J.10，3655-3699或Kipriyanov，(1998)上述引文。下文進一步列出說明性的實例。此外，可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法產(chǎn)生針對人CD3和/或人CD19的抗體。
此處令人吃驚的發(fā)現(xiàn)針對人CD3和人CD19抗體的，并且包含以VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)的形式存在的可變區(qū)(VH(對應于VH)，VL(對應于VL))或它的一部分(如互補決定區(qū))的雙特異性單鏈構(gòu)建體作為藥物組合物特別有用，因為這些構(gòu)建體比類似形式的構(gòu)建體，如VL(CD3)-VH(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)、VL(CD3)-VH(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)、VL(CD19)-VH(CD19)-VL(CD3)-VH(CD)或VH(CD19)-VL(CD19)-VL(CD3)-VH(CD3)具有優(yōu)勢。后面的四種構(gòu)建體/構(gòu)建體形式特征在于由EC50值所反映出的較低的有益細胞毒活性和/或如附帶實施例所顯示的更低效或較不完全純化。尤其令人吃驚的是，依照本發(fā)明所使用的單鏈構(gòu)建體的抗CD3部分在N-和C-末端位置具有高生物活性，而VH(CD3)-VL(CD3)排列極為優(yōu)選。本發(fā)明的藥物組合物中使用的構(gòu)建體的特征在于有利的生產(chǎn)和純化特性和它們的高生物活性，即所需它們的細胞毒活性。相應的高生物活性由細胞毒性測試中所測定的低到極低的EC50值所反映。就本發(fā)明而言，術(shù)語“EC50”相應于依照本領(lǐng)域已知的方法所測定的和如附帶實施例所闡明的EC50值標準劑量反應曲線由四個參數(shù)定義基線反應(底部)、最大反應(頂部)、劑量反應增長傾率和引起基線和最大之間一半反應的藥物濃度(EC50)。EC50定義為引起基線(底部)和最大反應(頂部)之間一半反應的藥物或分子濃度。尤其可以通過公開于上文的釋放測定來測定細胞裂解的百分率(即細胞毒活性)，例如51Cr釋放測定、LDH釋放測定、鈣熒光素釋放測定等。就本發(fā)明而言，最優(yōu)選使用如附帶實施例所闡明的熒光染料釋放測定。這里所描述的雙特異性單鏈構(gòu)建體的作用于CD19-陽性細胞(例如實驗性的NALM6細胞)的強細胞毒活性涉及的分子包括EC50值＜/-(小于或等于)500pg/ml，優(yōu)選＜/-400pg/ml，基至更優(yōu)選＜/-300pg/ml，甚至更優(yōu)選＜/-250pg/ml，最優(yōu)選＜/-200pg/ml的分子。在此令人吃驚地發(fā)現(xiàn)具有VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)和VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)形式的一些構(gòu)建體顯示出除高細胞毒活性以外的有利特性，這使這些構(gòu)建體非常適合包含在藥物組合物中。相反，如VH(CD19)-VL(CD19)-VL(CD3)-VH(CD3)的其它構(gòu)建體非常難以生產(chǎn)/分離，使后者極不適合包含在藥物組合物中。
在本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選實施方案中，所述CD3特異性結(jié)構(gòu)域的VH和VL區(qū)來源于選自X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特異性抗體。這些CD3特異性抗體在本領(lǐng)域中眾所周知，尤其在Tunnacliffe(1989)，Int.Immunol.1，546-550中進行了描述。在更優(yōu)選的實施方案中，該CD3特異性結(jié)構(gòu)域的所述VH和VL區(qū)來源于OKT-3(如上文所定義和描述的)或TR-66。甚至更優(yōu)選(和如附帶的實施例所說明的)所述VH和VL區(qū)是或來源于Traunecker(1991)，EMBO J.10，3655-3659所描述的特異性針對CD13的抗體/抗體衍生物。依照本發(fā)明，所述VH和VL區(qū)來源于在其它TCR亞基環(huán)境下(如在轉(zhuǎn)入人CD3ε基因的小鼠T細胞中)能夠特異識別人CD3ε的抗體/抗體衍生物。這些轉(zhuǎn)基因小鼠細胞以天然或接近天然構(gòu)象表達人CD3ε。因此，依照本發(fā)明最優(yōu)選來源于CD3ε特異性抗體的VH和VL區(qū)，并且該(親本)抗體應當能夠特異結(jié)合反映天然或接近天然結(jié)構(gòu)的表位或結(jié)合在TCR復合體環(huán)境下的人CD3構(gòu)象表位。Tunnacliffe(1989)把這種抗體歸類為“II型”抗體。在Tunnacliffe(1989)中進一步的分類包括針對CD3的“I型”和“III型”抗體的定義?！癐型”抗體(如UCHT1)識別作為重組蛋白質(zhì)以及細胞表面TCR一部分表達的CD3ε。因此，“I型”抗體對CD3ε高度特異。相反，本文優(yōu)選的“II型”抗體僅僅識別結(jié)合其它TCR亞基的天然TCR復合體中的CD3ε。不受理論限制，本發(fā)明推測就“II型”抗體需要TCR環(huán)境來識別CD3ε。ε結(jié)合的CD3γ和/或δ也涉及“II型”抗體的結(jié)合。所有的這三個亞基都表達可被蛋白質(zhì)酪氨酸激酶在酪氨酸處磷酸化的免疫酪氨酸激活基序(ITAM)。由于此原因，“II型”抗體誘導CD3ε、γ和δ所介導的T細胞信號途徑，與通過CD3ε選擇性誘導T細胞信號途徑的“I型”抗體相比，這產(chǎn)生更強的信號。然而，因為對于治療學應用需要強T細胞信號，本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體使用的VH(CD3)/VL(CD3)區(qū)(或它的部分)，優(yōu)選來源于針對人CD3的抗體和上述引文中Tunnacliffe(1989)歸類的“II型”抗體。
它提供本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體中使用的可變區(qū)(VH和VL)的針對人CD19的抗體/抗體分子/抗體衍生物為本領(lǐng)域中所眾所周知，并且在附帶實施例中闡明。針對人CD19的優(yōu)選抗體是4G7(Meecker(1984)Hybridoma 3，305-20)、B4(Freedman(1987)Blood 70，418-27、B43(Bejcek(1995)Cancer Res.55，2346-51)、BU12(Flavell(1995)Br.J.Cancer 72，1373-9)、CLB-CD19(De Rie(1989)Cell.Immunol.118，368-81)、Leu-12(MacKenzie(1987)，J.Immunol.139，24-8)、SJ25-C1(GenTrak，Plymouth Meeting，Pa)。
在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，所述的VH(CD19)和VL(CD19)區(qū)(或它的部分，如互補決定區(qū))來源于HD37雜交瘤(Pezzutto(1997)，J.Immunol.138，2793-9)提供的抗體。
眾所周知，包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片斷Fv由一條重鏈和一條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH和VL)以非共價形式結(jié)合所形成的二聚體組成。在這種相應于天然抗體中發(fā)現(xiàn)的構(gòu)型中，每個可變結(jié)構(gòu)域的三個互補決定區(qū)相互作用，以在VH-VL二聚體的表面確定抗原結(jié)合位點。六個互補決定區(qū)共同賦予抗體具有抗原結(jié)合特異性。互補決定區(qū)側(cè)翼的框架區(qū)(FR)在像人和小鼠這樣不同物種的天然免疫球蛋白中具有基本保守的三級結(jié)構(gòu)。這些框架區(qū)用于支持互補決定區(qū)處于其正確的方向。恒定結(jié)構(gòu)域不是結(jié)合功能所必需的，但是可以幫助穩(wěn)固VH-VL相互作用。
本發(fā)明還設(shè)想進一步修飾本發(fā)明的藥物組合物中所提供的雙特異性抗體構(gòu)建體。具體而言，設(shè)想去免疫性化如此處所定義的VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)形式的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體。最優(yōu)選地，至少CD3結(jié)合部分。去免疫性需要實施潛在T細胞表位氨基酸的替代。
設(shè)想并優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物包含如上文所定義的VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)形式的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體，其中所述VH區(qū)包含至少一個CDR3區(qū)(VH的CDR-H3或CDR-3)，該CDR3區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.54或77。
此處所用的術(shù)語“CDR區(qū)”表示抗體分子的“互補決定區(qū)”。因此，與術(shù)語“CDR3區(qū)”同義的術(shù)語“CDR-3區(qū)”指抗體分子/抗體構(gòu)建體的“互補決定區(qū)3”。作必要改動后這同樣應用于相應的CDR-2和CDR-1區(qū)。設(shè)想并優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物中所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體不僅包含針對人CD3和人CD19的抗體/抗體分子的可變區(qū)/可變結(jié)構(gòu)域(VH/VL)的CDR-3區(qū)，而且包含CDR-1或CDR-2區(qū)。最優(yōu)選所述分子包含針對CD3的抗體的至少一個VH CDR-3區(qū)和至少一個VL結(jié)構(gòu)域CDR-3區(qū)以及針對CD19的抗體的至少一個VH CDR-3區(qū)和至少一個VL結(jié)構(gòu)域CDR-3區(qū)。最優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物的雙特異性單鏈構(gòu)建體另外還包含位于此處定義的VH和VL結(jié)構(gòu)域的至少一個CDR-1區(qū)和/或至少一個CDR-2區(qū)。因此，此處定義的雙特異性單鏈構(gòu)建體可以包含針對人CD3的抗體/抗體分子(優(yōu)選人CD3ε)的VL CDR-1、CDR-2、CDR-3區(qū)和VH CDR-1、CDR-2、CDR-3區(qū)，此外還包含針對人CD19的抗體/抗體分子的VLCDR-1、CDR-2、CDR-3區(qū)和VH CDR-1、CDR-2、CDR-3區(qū)。
優(yōu)選地，所述VH(CD3)區(qū)包含至少一個CDR2區(qū)，該CDR2區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.53或76。還設(shè)想該VH(CD3)區(qū)包含至少一個CDR1區(qū)，該CDR1區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.52或75。
優(yōu)選地，VL(CD3)區(qū)包含至少一個CDR3區(qū)，該CDR3區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.57或74。VL(CD3)區(qū)可以包含至少一個CDR2區(qū)，該CDR2區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.56或73。VL(CD3)區(qū)還可以包含至少一個CDR1區(qū)，該CDR1區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO.55或72。
如上文所提及的，本發(fā)明藥物組合物所包含的構(gòu)建體包含至少一個針對人CD3的抗體VH區(qū)的CDR-3、至少一個針對人CD3的抗體VL區(qū)的CDR-3、至少一個針對人CD19的抗體VH區(qū)的CDR-3和至少一個針對人CD19的抗體VL區(qū)的CDR-3。然而，在最優(yōu)選的實施方案中，如附帶實施例所闡明的，本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體包含的VH和VL區(qū)不僅包含CDR-3，而且還包含CDR-1和/或CDR-2區(qū)。具體而言，如此處所定義的CDR區(qū)，優(yōu)選CDR-1區(qū)，更優(yōu)選CDR-1區(qū)和CDR-2區(qū)，最優(yōu)選CDR-1區(qū)、CDR-2區(qū)和CDR-3區(qū)，可以用于生成進一步的如此處所定義的雙特異性單鏈構(gòu)建體。最優(yōu)選本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體來源于如此處所公開的親本抗體，并且如上文所公開的，與該親本抗體共享VH區(qū)的CDR-3結(jié)構(gòu)域和VL區(qū)的CDR-3結(jié)構(gòu)域。然而，還設(shè)想本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體包含修飾的CDR區(qū)。例如，尤其設(shè)想CDR2和/或CDR1區(qū)(或CDR間的框架或接頭)是去免疫性的。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明藥物組合物所包含的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體包含的氨基酸序列選自(a)如SEQ ID NO 2、10或14所描述的氨基酸序列；(b)如SEQ ID NO 1、9或13所示的核酸序列所編碼的氨基酸序列；(c)與(b)核酸序列互補鏈嚴格雜交的核酸序列所編碼的氨基酸序列；以及(d)由遺傳密碼導致與(b)核酸序列簡并的核酸序列所編碼的氨基酸序列。
此處所用的術(shù)語“雜交”涉及能夠與此處所定義的編碼雙特異性單鏈構(gòu)建體的多核苷酸或其部分雜交的多核苷酸/核酸序列。因此，該多核苷酸可以分別用作RNA或DNA制品的Northern或Southern Blot分析的探針，或者根據(jù)其各自的大小能夠用作PCR分析中的寡聚核苷酸引物。優(yōu)選地，該雜交多核苷酸在長度上包含至少10個核苷酸，更優(yōu)選至少15個核苷酸，而本發(fā)明中用作探針的雜交多核苷酸在長度上包含至少100個核苷酸，更優(yōu)選至少200個核苷酸，最優(yōu)選至少500個核苷酸。
本領(lǐng)域眾所周知如何用核酸分子實施雜交實驗，即本領(lǐng)域技術(shù)人員知道依照本發(fā)明應該用的雜交條件。這類雜交條件參閱《如MolecularCloning A Laboratory Manual》，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)N.Y.之類的標準教科書。依照本發(fā)明優(yōu)選能夠與本發(fā)明的多核苷酸或它的部分嚴格雜交的多核苷酸。
“嚴格雜交條件”即指于42℃在包含50％甲酰胺、5x SSC(750mMNaCl，75mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5x Denhardt雜交溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的、剪切過的鮭精DNA的溶液中過夜孵育，然后于65℃在0.1x SSC中洗滌濾器。同樣考慮與本發(fā)明多核苷酸在較低嚴格雜交條件下雜交的核酸分子。雜交和信號檢測嚴格性的改變主要通過操縱甲酰胺濃度(低百分率甲酰胺導致低嚴格性)、鹽條件或溫度來實現(xiàn)。例如，低嚴格條件包括于37℃在包含6X SSPE(20X SSPE＝3M NaCl、0.2M NaH2po4、0.02M EDTA，pH 7.4)、0.5％SDS、30％甲酰胺、100μg/ml鮭精封閉DNA的溶液中過夜孵育；然后于50℃用1X SSPE，0.1％SDS洗滌。此外，為了達到更低嚴格性，嚴格雜交后的洗滌可以在更高鹽溶液(例如5X SSC)中完成。值得注意的是，上述條件的改變可以通過包含和/或替代用以抑制雜交實驗背景的封閉試劑來實現(xiàn)。典型的封閉試劑包括Denhardt試劑、BLOTTO、肝素、變性鮭精DNA以及商用的專利制劑。由于兼容性問題，特定封閉試劑的加入可能需要改變上述雜交條件。
如上文所提及的，此處所描述的雙特異性單鏈構(gòu)建體中包含的所述可變區(qū)通過額外連接序列來連接。術(shù)語“肽接頭”依照本發(fā)明定義為一段氨基酸序列，其用于連接本發(fā)明三聚多肽構(gòu)建體單體的第一和第二個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。這種肽接頭的基本技術(shù)特征是它不包含任何聚合活性。特別優(yōu)選的肽接頭的特征在于具有氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，即Gly4Ser，或者其聚合物，即(Gly4Ser)x，其中x是1或更大的整數(shù)。所述肽接頭的特征(包括不能促成二級結(jié)構(gòu))在本領(lǐng)域中是眾所周知的，例如描述于Dall’Acqua等(Biochem.(1998)37，9266-9273)，Cheadle等(MolImmunol(1992)29，21-30)以及Raag和Whitlow(FASEB(1995)9(1)，73-80)。還有特別優(yōu)選肽接頭包含較少的氨基酸殘基。設(shè)想具有少于5個氨基酸的肽接頭包含4、3、2或1個氨基酸，其中優(yōu)選富含Gly的接頭。在所述“肽接頭”環(huán)境中特別優(yōu)選的“單一”氨基酸是甘氨酸。因此，所述的肽接頭可以由單一氨基酸——甘氨酸組成。此外，優(yōu)選不促成任何二級結(jié)構(gòu)的肽接頭。所述結(jié)構(gòu)域之間的連接可以通過如實施例中描述的基因工程實現(xiàn)。制備融合的和有效連接的雙特異性單鏈構(gòu)建體以及在哺乳動物細胞或細菌中表達它們的方法在本領(lǐng)域中眾所周知(如WO 99/54440或Sambrook等，《Molecular CloningA Laboratory Manual》，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
本發(fā)明還提供了包含編碼如上文所描述的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的核酸序列的藥物組合物，所述雙特異性構(gòu)建體為VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)形式。其中，編碼VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)和VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)形式的雙特異性構(gòu)建體的核酸序列尤其利于包含于這類藥物組合物中。相反，編碼如VH(CD19)-VL(CD19)-VL(CD3)-VH(CD3)形式的雙特異性構(gòu)建體的核酸序列非常不適于包含于藥物組合物中，后者非常難以生產(chǎn)/分離。
所述核酸分子可以是天然存在的核酸分子以及重組核酸分子。因此，本發(fā)明的核酸分子可以是天然來源、合成或半合成的。它可以包括DNA、RNA和PNA以及它們的雜交產(chǎn)物。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說非常明顯的是，可以在本發(fā)明核酸分子中加入調(diào)節(jié)序列。例如，可以使用啟動子、轉(zhuǎn)錄增強子和/或誘導本發(fā)明多核苷酸表達的序列。適當?shù)恼T導系統(tǒng)例如Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，5547-5551)以及Gossen等(Trends Bioteeh.12(1994)，58-62)所描述的四環(huán)素調(diào)節(jié)的基因表達，以及如Crook(1989)EMBO J.8，513-519所描述的地塞米松誘導的基因表達系統(tǒng)。
此外，為了其它目的可以設(shè)想核酸分子包含例如硫酯鍵和/或核苷酸類似物。所述修飾可用于抵抗細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶和/或核酸外切酶以穩(wěn)定核酸分子。該核酸分子可以通過包含允許它在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的嵌合基因的適當載體轉(zhuǎn)錄。在這方面，還應當理解本發(fā)明的多核苷酸可以用于“基因?qū)ぐ小被颉盎蛑委煛狈椒āＴ诹硪粋€實施方案中對所述核酸分子進行了標記。用于檢測所述核酸分子的方法為本領(lǐng)域眾所周知，如Southern和Northern印跡、PCR或引物延伸。此實施方案可用于證實基因治療方法中上文所描述的核酸分子已成功引入的篩選方法。
所述核酸分子可以是包含任何上述的單個核酸分子或其組合的重組產(chǎn)生的嵌合核酸分子。優(yōu)選地，核酸分子是載體的一部分。
因此，本發(fā)明還涉及包含含有本發(fā)明所描述核酸分子的載體的藥物組合物。
本發(fā)明的載體可以是例如質(zhì)粒、黏粒、病毒、噬菌體或其它的如基因工程中常規(guī)使用的載體，并且可以包含其它基因，如允許在適當條件下在適當宿主細胞中篩選所述載體的標記基因。
此外，用于產(chǎn)生此處所描述的雙特異性單鏈構(gòu)建體或用于本發(fā)明藥物組合物的載體還可以包含除本發(fā)明的核酸序列之外的允許編碼區(qū)在適當宿主中適當表達的表達控制元件。這種控制元件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，可以包括啟動子、剪切盒、翻譯起始密碼子、翻譯和向載體引入插入物的插入位點。優(yōu)選地，所述核酸分子與允許在真核或原核細胞中表達的表達控制序列有效連接。
確保在真核和原核細胞中表達的控制元件對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是眾所周知的。如上文所述，它們通常包含確保轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)序列以及任選的確保轉(zhuǎn)錄終止并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的多腺苷酸信號序列。額外調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄和翻譯增強子和/或天然連接的或異源的啟動子區(qū)。允許在諸如哺乳動物宿主細胞中表達的可能的調(diào)節(jié)元件包括CMV-HSV胸苷激酶啟動子、SV40、RSV啟動子(勞氏肉瘤病毒)、人延伸因子1α啟動子、糖皮質(zhì)激素誘導的MMTV啟動子(Moloney小鼠腫瘤病毒)、金屬硫蛋白或四環(huán)素誘導的啟動子，或如CMV增強子和SV40增強子之類的增強子?？梢栽O(shè)想用于在白細胞中表達的特異啟動于。所述啟動子是本領(lǐng)域公知的，尤其在Hendon(2002)，Clin.Immunol.103，145-153；Chinnosamy(2000)Blood 96，1309-1316；Zhang(2003)J.Acq.Immun.Def.Synd.245-254；Kaiser(2003)Science 299，495；Hacein-Bay(2002)Int.J.Hemat.76，295-298；Hacein-Bay(2002)New Eng.J.Med.346，1185-1193；Ainti(2002)Science 296，2410-2413中進行了描述或有所提及。對于在原核細胞中的表達，許多啟動子(包括例如tac-lac啟動子或色氨酸啟動子)已有所描述。除負責轉(zhuǎn)錄起始元件之外，這種調(diào)節(jié)元件還可包括在多核苷酸下游的轉(zhuǎn)錄終止信號，如SV40多腺苷酸位點或tk多腺苷酸位點。就本發(fā)明而言，適當?shù)谋磉_載體為本領(lǐng)域公知，例如Okayama-Berg cDNA表達載體pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pX(Pagano(1992)Science 255，1144-1147)、酵母雙雜交載體(如pEG202和dpJG4-5(Gyuris(1995)Cell 75，791-803))，或者原核表達載體(如lambda gt11或pGEX(Amersham-Pharmacia))。除此處所描述的編碼雙特異性單鏈構(gòu)建體的核酸分子之外，載體還可以進一步包含編碼分泌信號的核酸序列。這種序列為本領(lǐng)域技術(shù)人員所眾所周知。此外，依賴于所用表達系統(tǒng)，還可以在本發(fā)明核酸分子編碼序列中加入能夠把本發(fā)明的肽導入細胞區(qū)室的前導序列，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的。前導序列在適當階段與翻譯、起始和終止序列裝配，并優(yōu)選前導序列能夠把翻譯的蛋白質(zhì)分泌物或其中的蛋白質(zhì)導入到周質(zhì)間隙或細胞外基質(zhì)。任選地，異源序列能夠編碼包含C-或N-末端標識肽的融合蛋白，所述標識肽賦予需要的特征，例如穩(wěn)定表達的重組產(chǎn)物或簡化表達重組產(chǎn)物的純化。一旦載體整合入適當?shù)乃拗?，宿主就要維持在適于核酸序列高水平表達的條件下，并且如所期望的，可以隨后收集和純化此處所描述的雙特異性單鏈構(gòu)建體。因此，本發(fā)明還涉及包含此處所定義載體的宿主/宿主細胞。這種宿主可用于獲取本發(fā)明藥物組合物中所包含的雙特異性單鏈構(gòu)建體的方法以及直接用于醫(yī)學/藥物試劑。所述的宿主細胞還可以包括轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染的白細胞，如淋巴細胞，優(yōu)選成熟細胞。這種宿主細胞還可以用于移植治療。
此外，此處所描述的載體和核酸分子可用于基因治療方法?；蛑委熓腔蜣D(zhuǎn)移的最重要的應用之一，它基于通過離體或體內(nèi)技術(shù)把治療基因引入細胞。文獻中描述了體外或體內(nèi)基因治療的適當載體、方法或基因遞送系統(tǒng)，這為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知，例如見Giordano，Nature Medicine2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813；Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodua，Blood 91(1998)，30-36；Verzeletti，Hum.Gene Ther.9(1998)，2243-2251；Verma，Nature 389(1997)，239-242；Anderson，Nature 392(Supp.1998)，25-30；Wang，Gene Therapy 4(1997)，393-400；Wang，Nature Medicine 2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；US 5,580,859；US 5,589,466；US 4,394,448或Schaper，Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，635-640，以及其中所引用的參考文獻。特別地，在血液、淋巴細胞、骨髓及相應干細胞中的基因治療方法中也描述了所述的載體和/或基因投遞系統(tǒng)，例如，Hendon(2002)，Clin.Immunol.103，145-153；Chinnosamy(2000)Blood 96，1309-1316；Zhang(2003)J.Acq.Immun.Def.Synd.245-254；Kaiser(2003)Science 299，495；Hacein-Bay(2002)Int.J.Hemat.76，295-298；Hacein-Bay(2002)New Eng.J.Med.346，1185-1193；Ainti(2002)Science 296，2410-2413?？梢栽O(shè)計包含于本發(fā)明藥物組合物中的核酸分子和載體用于直接導入或通過脂質(zhì)體、病毒載體(如腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒)、電穿孔、彈果(如基因槍)或其它投遞系統(tǒng)導入細胞。此外，桿狀病毒系統(tǒng)可用作本發(fā)明核酸分子在昆蟲細胞中的真核表達系統(tǒng)。優(yōu)選地，導入和基因治療方法應該導致此處所描述的功能雙特異性單鏈構(gòu)建體的表達，其中表達的抗體分子對于治療、減輕和/或預防此處所定義的B細胞相關(guān)惡性腫瘤尤為有用。優(yōu)選地，表達控制序列為處于載體中的真核啟動子系統(tǒng)，所述載體能夠轉(zhuǎn)化要轉(zhuǎn)染的真核宿主細胞，但是也可以使用原核宿主的控制序列。一旦載體整合入適當?shù)乃拗鳎拗骶鸵S持在適于核酸序列高水平表達的條件下，并且如所期望的，可以隨后收集和純化雙特異性單鏈構(gòu)建體，參見例如附帶實施例。
因此，在本發(fā)明還有的實施方案中，提供的藥物組合物包含編碼以VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)形式存在的雙特異性單鏈構(gòu)建體的載體或包含用所述載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。
本發(fā)明藥物組合物還可以包含能夠提供免疫效應細胞額外活化信號的蛋白質(zhì)化合物。這種化合物可以包括(但不限于)CD28 engagers、ICOSengagers、41BB engagers、OX40 engagers、CD27 engagers、CD30 engagers、NKG2D engagers、IL2-R engagers或IL12-R engagers。根據(jù)本發(fā)明，所述的給免疫效應細胞提供活化信號的“蛋白質(zhì)化合物”可能是例如其它初級活化信號，或者共刺激(第二)信號或者任何其它輔助性的(第三)活化信號。例如TCR或TCR樣信號。蛋白質(zhì)化合物的優(yōu)選形式包含額外的雙特異性抗體及其片斷或衍生物，例如，雙特異性scFv。蛋白質(zhì)化合物可以包含(但不限于)4-1 BB、OX 40、CD27、CD70或B7-RP1/B7-H3受體特異的scFv片斷以及T細胞受體或超抗原特異的scFv片斷。超抗原以不依賴于MHC的方式直接結(jié)合T細胞受體可變區(qū)亞家族，因此介導初級T細胞活化信號。蛋白質(zhì)化合物還可以給非T細胞的免疫效應細胞提供活化信號。非T細胞免疫效應細胞的實例尤其包括NK細胞。
在本發(fā)明另一實施方案中，提供了生產(chǎn)本發(fā)明藥物組合物的方法，該方法包含在允許此處所定義的雙特異性單鏈構(gòu)建體表達的條件下培養(yǎng)上文所定義的宿主，并從培養(yǎng)物中回收所生產(chǎn)的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體。相應的方法在附帶實施例中闡明。
在最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及此處所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、核酸序列、載體和/或宿主的用途，用于預防、治療或減輕增生疾病、最小殘留癌、腫瘤性疾病、炎性疾病、免疫紊亂、自身免疫性疾病、傳染病、病毒病、過敏反應、寄生反應、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病或B細胞惡性腫瘤，其中該藥物組合物任選地還包含能夠?qū)γ庖咝毎峁┗罨盘柕牡鞍踪|(zhì)化合物。
因此，本發(fā)明提供了預防、治療或減輕增生性疾病、最小殘留癌癥、腫瘤性疾病、炎性疾病、免疫紊亂、自身免疫性疾病、傳染病、病毒病、過敏反應、寄生反應、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病或B細胞惡性腫瘤的方法，由此該方法包含對需要這種預防、治療或減輕的受試者施用本發(fā)明藥物組合物的步驟。所述的受試者最優(yōu)選人。
用本發(fā)明的藥物組合物治療的腫瘤性疾病可以是最小殘留癌癥，例如，最小殘留淋巴瘤或白血病。
用本發(fā)明的藥物組合物治療的自身免疫性疾病可以是炎癥性的自身免疫性疾病，例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎。
依照本發(fā)明，還設(shè)想此處所描述的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、核酸序列、載體和/或宿主用于制備針對B細胞缺損(depletion)的藥物組合物。
在一個最優(yōu)選的實施方案中，用本發(fā)明藥物組合物治療的B細胞惡性腫瘤為非霍奇金淋巴瘤、B細胞白血病或霍奇金淋巴瘤。因此，本發(fā)明提供了用于治療B細胞惡性腫瘤、B細胞介導的自身免疫性疾病或B細胞缺損的方法和/或延緩由B細胞紊亂引起的病理條件的方法，包含施用本發(fā)明藥物組合物的藥物于受所述惡性腫瘤、疾病和/或病理條件影響的哺乳動物(優(yōu)選人)。
最后，本發(fā)明提供了包含如上文所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、核酸序列、載體和/或宿主的試劑盒。該試劑盒在制備本發(fā)明藥物組合物時尤為有用，并且可能尤其由用于注射或輸注的容器組成。有利的是，本發(fā)明試劑盒還包含任選的緩沖液、儲備液和/或保持劑或用于醫(yī)學或科學目的操作所需的材料。此外，本發(fā)明試劑盒的各部分可以單獨裝入小瓶或瓶或者包裝于組合容器或多容器單元中。本發(fā)明試劑盒尤其可方便地用于實施本發(fā)明的方法，并且可用于多種此處涉及的應用，如作為研究工具或醫(yī)學工具。優(yōu)選按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標準操作制備試劑盒。
這些以及其它實施方案公開于并包含于本發(fā)明說明書及實施例中。按照本發(fā)明所使用的任何抗體、方法、用途和化合物相關(guān)的進一步的文獻可以例如用電子設(shè)備從公共圖書館和數(shù)據(jù)庫中重新獲得。例如，可以用因特網(wǎng)上可獲得的公共數(shù)據(jù)庫″Medline″，例如http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它數(shù)據(jù)庫及地址，如http//www.ncbi.nlm.nih.gov/，http//www.infobiogen.fr/，http//www.fmi.ch/biology/research_tools.html，http//www.tigr.org/，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且還可以用http//www.lycos.com獲得。


圖1A顯示PCR引物結(jié)合位點的抗CD19/抗CD3單鏈雙特異性抗體中VL/VH結(jié)構(gòu)域排列的組成示意圖。A1、A2、B1和B2表示用于構(gòu)建抗CD19/抗CD3單鏈雙特異性抗體的多種可變區(qū)從N-末端到C-末端的位置。
圖1B顯示限制酶識別位點的抗CD19/抗CD3單鏈雙特異性抗體中VL/VH結(jié)構(gòu)域排列的組成示意圖(L＝前導肽)。A1、A2、B1和B2表示用于構(gòu)建抗CD19/抗CD3單鏈雙特異性抗體的多種可變區(qū)從N-末端到C-末端的位置。
圖2雙特異性單鏈抗體在280nm從Zn螯合Fractogel柱(IMAC)洗脫的模式。底線顯示在600ml保留時間處有一個小臺階，在700ml處出現(xiàn)另一個主要臺階，這顯示洗脫緩沖液的理論梯度包含0.5M咪唑。從100-500保留時間在280nm的高吸收是由于未結(jié)合蛋白質(zhì)穿透柱子引起。670.05ml保留時間處洗脫峰的蛋白質(zhì)用于進一步純化。
圖3雙特異性單鏈抗體在280nm從Sephadex S200凝膠過濾柱洗脫模式。81.04ml保留時間的蛋白質(zhì)峰包含抗CD3和CD19的雙特異性抗體，對應分子量為52KD。收集50-110ml保留時間的級分，并且用編號5-35的黑箭頭指示。
圖4雙特異性單鏈抗體蛋白質(zhì)級分的代表性SDS-PAGE分析。泳道M分子量標記物；泳道1細胞培養(yǎng)物上清液；泳道2IMAC穿透液；泳道3IMAC洗脫液；泳道4從凝膠過濾(Sephadex 200)中獲得的抗CD19和CD3的純化抗體。
圖5純化的雙特異性單鏈抗體級分的代表性免疫印跡分析。純化雙特異性蛋白質(zhì)的免疫印跡分析使用針對組氨酸標簽(PentaHis，Qiagen)的抗體和堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白實施。泳道1細胞培養(yǎng)物上清液；泳道2IMAC穿透液；泳道3IMAC洗脫液；泳道4從凝膠過濾(Sephadex 200)中獲得的抗CD19和CD3的純化抗體。
圖6A在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖6B在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖6C在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖6D在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖6E在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖6F在Nalm 6(CD19+)和Jurkat(CD3+)細胞中通過FACS分析測量的抗CD19(VL/VH)x抗CD3(VH/VL)構(gòu)建體的結(jié)合數(shù)據(jù)。左邊的峰為對照，右邊的峰為目的結(jié)合特異的熒光遷移測量。向右側(cè)遷移指示構(gòu)建體分別結(jié)合到CD19或CD3上。從N到C末端(N--＞C)顯示VH和VL結(jié)構(gòu)域的排列。
圖7挑選的結(jié)構(gòu)域重排的抗CD3/抗CD-19構(gòu)建體細胞毒性數(shù)據(jù)。以E∶T比率1∶10使用CB15 T細胞克隆和NALM6細胞。用鈣熒光素標記NALM6靶細胞。細胞裂解后的鈣熒光素釋放由FACS分析測定。
圖8ELISA中145-2C11抗體與純化的重組的鼠CD3ε鏈胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合。ELISA按照實施例5第1段的描述實施。此段描述了結(jié)合包被的145-2C11抗體的抗原制品或不相關(guān)抗原的吸收值。樣品以1∶5、1∶25和1∶125稀釋。
圖9145-2C11抗體關(guān)于鼠CD3ε鏈表面抗原轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞的FACS結(jié)合分析。FACS染色按照實施例5第2段的描述實施。實的柱狀圖代表用同種型對照孵育的細胞。空的柱狀圖表示用145-2C11抗體孵育的細胞。
圖10145-2C11抗體關(guān)于未轉(zhuǎn)染Jurkat細胞的FACS結(jié)合分析。FACS染色按照實施例5第2段的描述實施。實的柱狀圖代表用同種型對照孵育的細胞。加到實柱狀圖上的空的柱狀圖代表用145-2C11抗體孵育的細胞。145-2C11不與Jurkat細胞結(jié)合。
圖11145-2C11抗體關(guān)于CTLL2細胞的FACS結(jié)合分析。FACS染色按照實施例5第2段的描述實施。實的柱狀圖代表用同種型對照孵育的細胞?？盏闹鶢顖D顯示145-2C11抗體結(jié)合CTLL2細胞。
現(xiàn)在通過參考以下實施例對本發(fā)明進行說明，這些實施例僅僅是說明性的，不能被曲解為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1包含不同結(jié)構(gòu)域重排的CD19xCD3和CD3xCD19單鏈雙特異性抗體的構(gòu)建通常，按如下表1所示設(shè)計包含人CD3抗原結(jié)合特異性結(jié)構(gòu)域和人CD19抗原結(jié)合特異性結(jié)構(gòu)域的雙特異性單鏈抗體分子表1包含特異抗CD3和抗CD19的雙特異性單鏈抗體分子的形式

來源于HD37雜交瘤(Pezzutto，J.Immunol.138(1997)，2793-9)的可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)區(qū)結(jié)構(gòu)域依照標準PCR方法(Orlandi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)，3833-7)克隆。用寡聚dT引物和Taq聚合酶合成cDNA。為了通過PCR擴增抗CD19可變結(jié)構(gòu)域，基于Dübel，J.Immunol.Methods 175(1994)，89-95所描述的引物，使用VL結(jié)構(gòu)域兩側(cè)的引物5′L1(SEQ ID NO37)和3′K(SEQ ID NO38)，以及重鏈的5′H1(SEQ ID NO39)和3′G(SEQ ID NO40)?？笴D3 scFv片斷的cDNA由Traunecker(Traunecker，EMBO J.10(1991)3655-9)友情提供。
表1所示的構(gòu)建體1按如下構(gòu)建。為了獲得抗CD19 scFv片斷，相應的VL和VH克隆到分離的質(zhì)粒載體中，作為VL和VH特異PCR的模板，VL和VH特異PCR分別使用寡核苷酸引物對5′VLB5RRV(SEQ ID NO41)/3′VLGS15(SEQ ID NO42)和5′VHGS15(SEQ ID NO43)/3′VHBspE1(SEQ ID NO28)。重疊互補序列被引入PCR產(chǎn)物中，在隨后的融合PCR中它們組合形成15個氨基酸(Gly4Ser1)3接頭的編碼序列。此擴增步驟使用引物對5′VLB5RRV(SEQ ID NO41)/3′VHBspE1(SEQ IDNO28)實施，并且用限制酶EcoRV和BspE1剪切生成的融合產(chǎn)物(或者更確切的說是抗CD19 scFv片斷)，從而克隆到含有抗17-1A/抗CD3雙特異性單鏈抗體的編碼序列(實際上沒有Flag標簽的版本)(Kufer，CancerImmunol.Immunother. 45(1997)193)(EcoR1/Sal1克隆的)的bluescriptKS-載體(Statagene)中。因此抗17-1A特異性被抗CD19 scFv片斷取代，保留連接C-末端抗CD3 scFv片斷的5個氨基酸Gly4Ser接頭。隨后，將編碼抗CD19/抗CD3雙特異性單鏈抗體的具有結(jié)構(gòu)域排列VLCD19-VHCD19-VHCD3-VLCD3的DNA片斷亞克隆入描述的表達載體pEF-DHFR(Mack，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)，7021-5)的EcoR1/Sal1位點。生成的質(zhì)粒DNA通過電穿孔轉(zhuǎn)染入DHFR缺陷的CHO細胞中。按照此前描述(Mack，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(1995)，7021-5)選擇、基因擴增和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。相應于上文表1所示構(gòu)建體1的DNA序列如SEQ ID NO29所示。DNA序列的蛋白質(zhì)翻譯(沒有前導序列，但包含終止密碼子)如SEQ ID NO30所示。
如上文表1所示的其余構(gòu)建體按如下構(gòu)建。相應于SEQ ID NO29、其蛋白質(zhì)翻譯(沒有前導序列，但包含終止密碼子)如SEQ ID NO30所示的DNA序列在設(shè)計如上文表1所示的多種抗CD3/抗CD19單鏈雙特異性抗體中用作PCR模板。
為了在A1和A2位(如圖1A和1B所定義)產(chǎn)生CD19的VH-VL排列，使用了引物組合分別為5′VHCD19BsrGI(SEQ ID NO24)和3′VHCD19GS15(SEQ ID NO25)或5′VLCD19GS15(SEQ ID NO26)和3′VLCD19BspEI(SEQ ID NO27)的PCR。在這些PCR循環(huán)中，重疊互補序列引入PCR產(chǎn)物中，在隨后的融合PCR中形成15個氨基酸接頭的編碼序列。擴增的VL和VH結(jié)構(gòu)域在另一個PCR反應(融合PCR)中融合，其中僅需要5′VHCD19BsrGI(SEQ ID NO24)和3′VLCD19BspEI(SEQ ID NO27)的外部引物以及兩擴增物。
使用其它引物組合的類似操作用于構(gòu)建其它結(jié)構(gòu)域排列。設(shè)計一組適當?shù)囊飦韺嵤┗诙鄠€PCR的克隆步驟，最后導致多種結(jié)構(gòu)域排列。所用的引物聯(lián)合物列于附表中表2用于如表1所示構(gòu)建體2、3、4、5、6、7和8位置A1和A2的構(gòu)建的基于PCR克隆步驟縱覽


為了改變C-末端位置(即圖1A和1B所定義的B1和B2位)的VH-VL結(jié)構(gòu)域排列，設(shè)計包含指定限制酶識別位點的下列引物用于實施基于PCR的克隆步驟。
表3用于如表1所示構(gòu)建體2、3、4、5、6、7和8位置B1和B2的構(gòu)建的基于PCR克隆步驟縱覽

將兩側(cè)為BspEI位點的相應PCR產(chǎn)物克隆到命名為BS-CTI的質(zhì)粒中，該質(zhì)粒用BspEI和XmaI限制酶消化。之前用限制酶剪切位點XbaI和SalI將命名為CTI的多接頭(SEQ ID NO36)插入Bluescript KS載體(GenBank編號X52327)中以提供額外的剪切位點和編碼G4S接頭的序列、6個連續(xù)組胺酸殘基和終止密碼子。在該克隆步驟中，VH結(jié)構(gòu)域的BspEI位點與質(zhì)粒的Xmal位點融合，從而破壞了這兩個位點。通過按照標準方案測序來證實可變區(qū)的正確定位。
上文所需要的所有分子生物學操作按照Sambrook，《MolecularCloning》(A Laboratory Manual，3rd edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001))所描述的標準方案進行。
降表1中編碼單鏈雙特異性抗體的DNA(SEQ ID NO29、1、3、5、7、9、11、13)轉(zhuǎn)染入DHFR缺陷的CHO細胞中，用于如Mack等(Mack，Proc Natl Acad Sci USA 92(1995)，7021-25)所描述的在DHFR缺陷的CHO細胞中真核蛋白質(zhì)表達。通過將甲氨喋呤(MTX)的濃度增加到終濃度為20nM MTX來誘導構(gòu)建體的基因擴增。然后擴增轉(zhuǎn)染細胞，產(chǎn)生1升上清液。
實施例2針對CD3和CD19的單鏈雙特異性抗體的表達和純化蛋白質(zhì)在中國倉鼠卵細胞(CHO)中表達。用磷酸鈣處理細胞(《Molecular Cloning》，Sambrook et.al.1989)后轉(zhuǎn)染表達載體。在收獲前，在轉(zhuǎn)瓶中用CHO改良的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞7天。通過離心除去細胞，包含表達蛋白質(zhì)的上清液儲藏于-20℃。
ktaFPLC系統(tǒng)(Pharmacia)和Unicorn軟件用于層析。所有的化學藥品都是研究級的，購于Sigma(Deisenhofen)或Merck(Darmstadt)。按照制造商提供的方案用裝載ZnCl2的Fractogel柱(Merck)實施固相金屬親和層析(“IMAC”)。用A2緩沖液(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.5，0.4MNaCl)平衡柱子，細胞培養(yǎng)上清液(500ml)以3ml/min的流速加樣于柱子(10ml)上。用緩沖液A2洗滌柱子以除去未結(jié)合的樣品。按如下步驟用緩沖液B2(20mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.5，0.4M NaCl、0.5M咪唑)2步梯度洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)步驟16倍柱體積的20％緩沖液B2；步驟26倍柱體積的100％緩沖液B2。
合并步驟2的洗脫蛋白質(zhì)級分用于進一步純化。
在PBS(Gibco)平衡的Sephadex S200 HiPrep column(Pharmacia)上實施凝膠過濾層析。用標準SDS-PAGE和免疫印跡法檢測洗脫的蛋白質(zhì)樣品(流速1ml/min)(參見圖4和5)。在純化之前，為進行分子量測定而定標柱子(分子量標記物試劑盒，Sigma MW GF-200)。用蛋白質(zhì)測定染料(MicroBCA，Pierce)和IgG(Biorad)作為標準蛋白質(zhì)來測定蛋白質(zhì)濃度。
用IMAC的兩步純化方法(圖2)和凝膠過濾(圖3)分離單鏈雙特異性抗體。通過在PBS中凝膠過濾測定在天然條件下主要產(chǎn)物分子量大約為52KDa。此分子量對應于單鏈雙特異性抗體。所有構(gòu)建體按照這種方法純化。由于特異性蛋白質(zhì)表達并且分泌到上清液中的極低水平，構(gòu)建體#4不能從細胞培養(yǎng)上清液中純化。
在還原條件下用預制4-12％Bis Tris凝膠(Invitrogen)對純化的雙特異性蛋白質(zhì)進行SDS PAGE分析。按照制造商所提供的方案進行樣品制備和應用。用MultiMark蛋白質(zhì)標準品(Invitrogen)測定分子量。凝膠用考馬斯亮藍(Invitrogen protocol)染色。通過SDS-PAGE(圖4；在52KD處的蛋白質(zhì)條帶)測定，所分離蛋白質(zhì)的純度＞95％。
按照制造商所提供的方案，用OptitranBA-S83膜和Invitrogen BlotModule實施免疫印跡。使用針對組氨酸標簽的抗體(Penta His，Qiagen)和堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)，以及BCIP/NBT(Sigma)作為底物。單鏈雙特異性抗體能夠通過免疫印跡特異檢測(圖5)。在相應于純化的雙特異性分子的52KD處檢測到單一條帶。
實施例3CD19xCD3特異性多肽的流式細胞結(jié)合分析為了測試構(gòu)建體關(guān)于CD19和CD3結(jié)合能力的功能，進行流式細胞術(shù)分析(FACS)。為此，使用CD19陽性Nalm 6細胞(人B細胞前體白血病)和CD3陽性Jurkat細胞(人T細胞白血病)。200,000個Nalm 6細胞和200,000個Jurkat細胞各自與50μl CHO細胞培養(yǎng)物純細胞上清液在冰上孵育30min，所述CHO細胞分別表達具有CD19和CD3的VH和VL結(jié)構(gòu)域的不同排列的雙特異性抗體(如實施例2所描述)。細胞用PBS清洗兩遍，并且按如下檢測構(gòu)建體的結(jié)合。按上文所述處理的細胞與未標記的鼠五組氨酸抗體(以1∶20稀釋于具有2％FCS的50μl PBS中；Qiagen；Order No.34660)接觸，該抗體通過構(gòu)建體的C末端組氨酸標簽特異結(jié)合細胞結(jié)合的構(gòu)建體。隨后洗滌步驟除去未結(jié)合的鼠五組氨酸抗體。用綴合藻紅蛋白的Fcγ特異性抗體(Dianova，定購編號115-116-071)(以1∶100稀釋于具有2％FCS的50μl PBS中)檢測結(jié)合的抗組氨酸抗體(圖6A-6F中的粗灰線)。用新鮮培養(yǎng)基代替培養(yǎng)物上清液作為陰性對照(圖6A-6F中的細黑線)。
在FACS-Calibur儀器(Becton Dickinson，Heidelberg)上通過流式細胞術(shù)分析細胞。按《Current Protocols in Immunology》(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，Wiley-Interscience，2002)所描述實施FACS染色和熒光強度測量。如圖6B、6D和6F所示，可以明確檢測幾種結(jié)構(gòu)域排列的結(jié)合能力。在FACS分析中，與使用細胞培養(yǎng)基和1.和2.檢測抗體的陰性對照相比，所有具有特異于CD19和CD3的VH和VL結(jié)構(gòu)域的不同排列的構(gòu)建體結(jié)合CD3。對于如圖6A(#1)、B(#2)、D(#6)、E(#7)、F(#8)所示的構(gòu)建體觀察到導致＞5×101的熒光強度發(fā)生遷移的強結(jié)合能力。觀察到構(gòu)建體#3較弱的結(jié)合CD3(圖6C)。觀察到所有構(gòu)建體都強結(jié)合CD19。
實施例4特異于CD19和CD3的雙特異性抗體的生物活性通過基于熒光染料釋放的細胞毒性測定法來測定具有重排的VH和VL結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體的細胞毒活性。
用10μM鈣熒光素AM(Molecular Probes，Leiden，Netherland，no.C-1430)于37℃在細胞培養(yǎng)基中標記30min的CD19陽性NALM6細胞作為靶細胞(1.5×107)。在細胞培養(yǎng)基中清洗兩遍后，計數(shù)細胞并且將細胞與CD4陽性T細胞克隆CB15細胞(由Dr.Fickenscher，University ofErlangen/Nuernberg，Germany友情提供)混合。每毫升混合有2×106個CB15細胞和2×105個Nalm6細胞(E∶T比率1∶10)，并且向圓底96孔板的每孔加入50μl該懸浮液?？贵w在RPMI/10％FCS中稀釋到所需濃度，并且在細胞懸浮液中加入50μl此溶液。在37℃/5％CO2中孵育2小時進行標準反應。細胞毒性反應后，可以通過熒光讀數(shù)器(Tecan，Crailsheim，Germany)對孵育介質(zhì)中釋放的染料進行定量，并且與對照反應(未加雙特異性抗體)的熒光信號以及完全裂解細胞(在1％皂苷中10min)的熒光信號進行比較。基于這些讀數(shù)，按如下公式計算特異的細胞毒性[熒光(樣品)-熒光(對照)]∶[熒光(完全裂解)-熒光(對照)]×100。
由Prism軟件(GraphPad Software Inc.，San Diego，USA)測定通常具有R2值＞0.97的S形劑量反應曲線。通過分析操作計算的EC50值用于生物活性比較。
如圖7所示，所有構(gòu)建體顯示出抗表達CD19的NALM 6細胞的細胞毒活性。觀察到構(gòu)建體#2，6，8和1具有最強的生物活性。在構(gòu)建體#2，6，8和1中檢測到EC 50值＜500pg/ml的強生物活性。除它們的高生物活性之外，構(gòu)建體#2和#6還尤其適于包含在藥物組合物中。構(gòu)建體#3和#7分別顯示出52ng/ml和31ng/ml的EC50值。
實施例5145-2C11抗體用不同測定法分析針對鼠CD3的單克隆抗體145-2C11，以根據(jù)其特征分為組I或組II抗CD3抗體。Brissinck，1991，J.Immunol.147-4019用145-2C11來構(gòu)建針對BCL-1和鼠CD3的雙特異性抗體，此外de Jonge，1997，Cancer Immunol.Immunother.45-162也使用了此抗體。5.1.ELISA中145-2C11與鼠CD3ε鏈的重組純化胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合用抗鼠CD3ε抗體(145-2C11 BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)(于PBS中5μg/ml的50μl)包被Maxisorp ELISA板(Nunc GmbH，Wiesbaden，F(xiàn)RG)。過夜孵育之后，用溶于PBS的1.5％BSA孵育1小時來封閉非特異性結(jié)合。用200μl PBS清洗3遍后，不同稀釋度的重組C-末端His6-標記的CD3蛋白質(zhì)(通過類似于實施例6所描述的獲取重組體人CD3-ε的操作獲得)和不相關(guān)抗原(BSA)在準備好的板孔中孵育1小時。用結(jié)合多聚組氨酸標簽并綴合辣根過氧化物酶的抗組氨酸抗體(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，F(xiàn)RG；1∶500稀釋于溶于PBS的1.5％BSA)來檢測重組CD3的結(jié)合。根據(jù)制造商說明書，用ABTS(2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸))二銨鹽(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)作為底物。用SPECTRAFluor Plus光度計(Tecan DeutschlandGmbH，Crailsheim)測量吸光度。測量波長為405nm，參考波長為620nm。用Windows下XFLUOR4版本V 4.40作為分析軟件。用1∶5和1∶25稀釋的抗體檢測鼠CD3ε鏈的重組純化胞外結(jié)構(gòu)域與145-2C11抗體的結(jié)合(圖8)。
5.2.FACS中145-2C11與轉(zhuǎn)染鼠CD3ε鏈的人T細胞系的結(jié)合用FACS測定法來檢測145-2C11抗體與鼠CD3ε鏈表面抗原轉(zhuǎn)染的人Jurkat細胞(從ATCC獲取)的結(jié)合。為此，2.5×105個細胞與1∶50稀釋于包含2％FCS的50μl PBS的PE綴合145-2C11抗體(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)孵育。作為對照，另一個細胞樣品與1∶50稀釋于包含2％FCS的50μl PBS的PE綴合倉鼠IgG組1κ同種型對照(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)孵育。另外還在所述條件下測定未轉(zhuǎn)染細胞。用FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)測量樣品。與同種型對照相比，145-2C11抗體的特異性結(jié)合可以在轉(zhuǎn)染的細胞中明顯地檢測到，但是不能在未轉(zhuǎn)染細胞中檢測到(圖9和10)，結(jié)合引起熒光強度遷移。
5.3.FACS中145-2C11與鼠T細胞系的結(jié)合用FACS測定來檢測145-2C11抗體與CTLL2細胞(從ATCC獲取)的結(jié)合。2.5×105個細胞與1∶50稀釋于包含2％FCS的50μl PBS的PE綴合145-2C11抗體(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)孵育。作為對照，另一等分試樣的細胞與1∶50稀釋于包含2％FCS的50μl PBS的PE綴合倉鼠IgG組1κ同種型對照(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)孵育。用FACSscan(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)測量樣品。與同種型對照相比，145-2C11抗體的特異性結(jié)合可以清楚地檢測到(圖11)。
概括地說，這些數(shù)據(jù)明確地顯示鼠抗CD3抗體145-2C11識別純化的重組CD3ε以及在真核細胞中表達的鼠CD3ε。145-2C11結(jié)合到用CD3ε轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞以及在其天然鼠TCR受體復合體中表達CD3ε鏈的鼠T細胞。在其它TCR亞基存在的環(huán)境中，這兩種細胞系都在細胞表面表達CD3ε。依照Tunnacliffe等(Tunnacliffe，1989，Int.Immunol.，1，546-550)所描述的分類法，這兩個標準，即結(jié)合純化的重組CD3ε以及結(jié)合表達TCR復合體中CD3ε的細胞，描述為屬于“組I”的抗CD3抗體的基本特征。相反，“組II”抗體特異結(jié)合依賴于完整T細胞受體復合體的構(gòu)象表位。依照此定義，145-2C11可明確地歸類為屬于“組I”的抗CD3抗體。這證實了Leo，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1987)，1374的觀察，他發(fā)現(xiàn)當用去污劑處理使145-2C11與CD3的其它鏈和T細胞受體復合體解離時，它仍然與CD3ε結(jié)合。
實施例6將CD3活性雙特異性單鏈抗體歸于不同的CD3結(jié)合模式依照《Tunnacliffe，International Immunology 1》(1989)，546的分類法，CD3活性雙特異性單鏈抗體可以歸于不同的CD3結(jié)合模式。為了將CD3活性雙特異性單鏈抗體歸于“組I”CD3結(jié)合模式，可以用純化的重組人CD3ε進行ELISA。重組的人CD3ε可以Tunnacliffe，Immunol.Lett.21(1989)243所描述的C-κ-融合構(gòu)建體獲得，或者以依照如下操作能得到的截短的可溶性CD3ε獲得從人外周血單核細胞分離cDNA。依照標準操作(《Current Protocols inImmunology》(Coligan，Kruisbeek，Margulies，Shevach和Strober，JohnWiley & Sons，Inc.，USA，2002))制備細胞。依照標準操作(Sambrock，《Molecular Cloning；Laboratory Manual》，第2版，Cold Spring Harborlaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989))分離總RNA并通過隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用PCR擴增人CD3ε鏈胞外結(jié)構(gòu)域的編碼序列。設(shè)計PCR中所用的引物(SEQ ID NO80和SEQ ID NO81)以在編碼人CD3ε鏈胞外部分的cDNA起始和末端引入限制性位點。在隨后的克隆操作中利用引入的限制性位點BsrGI和BspEI。按照標準操作，PCR產(chǎn)物通過BsrGI和BspEI克隆到來源于Bluescript KS+克隆載體(StratageneEurope，Amsterdam-Zuiddoost，the Netherlands)命名為BS-Fss-Lsp的質(zhì)粒。(通過經(jīng)由EcoRI和SalI克隆DNA片斷(SEQ ID NO82)到BluescriptKS+生成載體。)通過按照標準操作測序來確定不同克隆的序列。通過克隆到BS-Fss-Lsp，鼠免疫球蛋白重鏈前導肽的編碼序列在框內(nèi)融合到人CD3ε鏈胞外部分編碼序列的5’末端。然后cDNA通過EcoRI和BspEI克隆到另一個命名為BSCTI的質(zhì)粒，以在C末端附加一段編碼具有6個連續(xù)組氨酸殘基的多聚組氨酸標簽序列，其后為終止密碼子(BSCTI在Kufer，Cancer Immunity 1(2001)，10中描述)。在此步cDNA的BspEI位點融合到質(zhì)粒的Xmal位點，因此破壞了這兩個位點。設(shè)計所有的克隆步驟以產(chǎn)生此構(gòu)建體的完整閱讀框。此時質(zhì)粒含有的序列編碼允許分泌表達的鼠免疫球蛋白重鏈的前導肽，其后是人CD3ε鏈的胞外結(jié)構(gòu)域，再其后是6個連續(xù)組氨酸殘基的多聚組氨酸標簽，它允許通過多聚組氨酸標簽(SEQ IDNO78和SEQ ID NO79)進行純化和檢測。然后此序列經(jīng)由EcoRI和SalI克隆進質(zhì)粒pFastBac1TM(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，F(xiàn)RG)。
按照制造商說明，用Bac-to-BacBaculovirus表達系統(tǒng)(InvitrogenGmbH，Karlsruhe，F(xiàn)RG)在High FiveTM細胞中表達人CD3ε鏈胞外結(jié)構(gòu)域。以每批500ml生產(chǎn)10升上清液。然后從培養(yǎng)上清液中純化構(gòu)建體。純化為兩步純化。首先將稀釋的上清液上樣到離子交換柱。用ELISA測定檢測分級洗脫液。為此，用抗人CD3ε抗體(UCHT1 BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG)(于PBS中5μg/ml的50μl)過液包被Maxisorp ELISA板(Nunc GmbH，Wiesbaden，F(xiàn)RG)。用溶于PBS的1.5％BSA孵育1小時來封閉非特異性結(jié)合。所有的之前和之后的洗滌步驟都用200μl PBS洗滌3遍。然后洗脫級分在準備好的板孔中孵育1小時。用辣根過氧化物酶綴合的抗組氨酸抗體(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG；1∶500稀釋于溶于PBS的1.5％BSA)檢測重組蛋白。根據(jù)制造商說明書，用ABTS(2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸))(Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)進行ELISA顯影。用優(yōu)先結(jié)合組氨酸標簽蛋白質(zhì)的鈷螯合柱來進一步純化陽性級分。用所述的ELISA測定來檢測洗脫級分。合并且濃縮陽性級分。
為了將CD3活性雙特異性單鏈抗體歸于“組I”CD3結(jié)合模式，可以用純化的重組人CD3ε(于PBS中10μg/ml的50μl)過液包被MaxisorpELISA板(Nunc GmbH，Wiesbaden，F(xiàn)RG)，然后用溶于PBS的1.5％BSA孵育1小時來封閉非特異性結(jié)合。然后ELISA孔用200μl PBS清洗3遍。然后可以在固定的CD3ε上孵育1小時具有如下形式的純化CD3活性雙特異性單鏈抗體(PBS中10μg/ml的50μl)(i)包含具有dykddddk氨基酸序列的N-末端FLAG-標簽(例如，可按Mack，PNAS 92(1995)7021的描述獲得)，但是(ii)不含多聚組氨酸標簽?？梢允褂貌患与p特異性單鏈抗體的50μl溶于PBS的1.5％BSA作為陰性對照。作為陽性對照，可以在固定的CD3ε上孵育“組I”抗CD3抗體UCHT1(BD biosciences，Heidelberg，F(xiàn)RG；在溶于PBS的1.5％BSA中稀釋到5μg/ml的50μl抗體)。再一次如上文的洗滌步驟后，可以用未綴合的抗FLAG抗體(ANTI-FLAGM2從Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Taufkirchen FRG獲得；在溶于PBS的1.5％BSA中稀釋到5μg/ml的50μl抗體)和隨后用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG、直接檢測與固定的CD3ε結(jié)合的對照抗體Fc-γ片斷特異性抗體(從Dianova，Hamburg，F(xiàn)RG獲得；用具有1.5％BSA的50μlPBS 1∶1000稀釋)來檢測與人CD3ε特異結(jié)合的雙特異單鏈抗體。根據(jù)制造商說明書，用ABTS(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)進行90分鐘的ELISA顯影。與對照抗體UCHT-1相比，Traunecker，EMBO J.10(1991)3655所描述的基于CD3結(jié)合特異性的所有雙特異性單鏈抗體都不顯示出與純化的重組人CD3ε特異性相互作用，因此不屬于“組I”CD3結(jié)合模式?？梢酝ㄟ^對人T細胞和如Tunnacliffe，InternationalImmunology 1(1989)546所述的人CD3ε轉(zhuǎn)基因鼠T細胞的CD3反應性雙特異單鏈抗體流式細胞結(jié)合分析鑒別“組II”和“組III”CD3結(jié)合模式。如果待分析的雙特異性單鏈抗體帶有多聚組氨酸標簽，可以按照本發(fā)明實施例3所述進行流式細胞分析；如果雙特異性單鏈抗體是Flag標記的，除檢測抗體用熒光標記的抗Flag抗體之外，可以按照相同的方案進行分析。
序列表<110>麥克羅梅特股份公司<120>治療B細胞相關(guān)紊亂的藥物組合物<130>H1589 PCT<150>EP 03012136.2<151>2003-05-31<160>82<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1533<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD19 VH/VL x CD3 VH/VL(BsrG I至Sal I)的核苷酸序列<400>1tgtacactcc caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc 60agtgaagatt tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt120gaagcagagg cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga180tactaactac aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag240cacagcctac atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc300aagacgggag actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg360gaccacggtc accgtctcct ccggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg420
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<213>人工序列<220>
<223>CD19 VH/VL x CD3VH/VL(成熟蛋白質(zhì)w/o前導肽)的翻譯<400>2Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr130 135 140
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Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr325 330 335Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys340 345 350Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly355 360 365Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly370 375 380Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser385 390 395 400Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys405 410 415Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser420 425 430Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser435 440 445Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser450 455 460Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys465 470 475 480Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu485 490 495
Glu Leu Lys His His His His His His500 505<210>3<211>1525<212>DNA<213>人工序列<220>
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tcagctgacc cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac 840ctgcagagcc agttcaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagt caggcacctc 900ccccaaaaga tggatttatg acacatccaa agtggcttct ggagtccctt atcgcttcag 960tggcagtggg tctgggacct catactctct cacaatcagc agcatggagg ctgaagatgc1020tgccacttat tactgccaac agtggagtag taacccgctc acgttcggtg ctgggaccaa1080gctggagctg aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc tccggtggtg gtggttctga1140tatcaaactg cagcagtcag gggctgaact ggcaagacct ggggcctcag tgaagatgtc1200ctgcaagact tctggctaca cctttactag gtacacgatg cactgggtaa aacagaggcc1260tggacagggt ctggaatgga ttggatacat taatcctagc cgtggttata ctaattacaa1320tcagaagttc aaggacaagg ccacattgac tacagacaaa tcctccagca cagcctacat1380gcaactgagc agcctgacat ctgaggactc tgcagtctat tactgtgcaa gatattatga1440tgatcattac tgccttgact actggggcca aggcaccact ctcacagtct cctccgggca1500tcatcaccat catcattgag tcgac 1525<210>4<211>502<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD19 VL/VH x CD3 VL/VH(成熟蛋白質(zhì)w/o前導肽)的翻譯<400>4Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15
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<220>
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cccttatcgc ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat 240ggaggctgaa gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt 300cggtgctggg accaagctgg agctgaaagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg 360tggtggtggt tctgatatca aactgcagca gtcaggggct gaactggcaa gacctggggc 420ctcagtgaag atgtcctgca agacttctgg ctacaccttt actaggtaca cgatgcactg 480ggtaaaacag aggcctggac agggtctgga atggattgga tacattaatc ctagccgtgg 540ttatactaat tacaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgactacag acaaatcctc 600cagcacagcc tacatgcaac tgagcagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg 660tgcaagatat tatgatgatc attactgcct tgactactgg ggccaaggca ccactctcac 720agtctcctca tccggaggtg gtggatccca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct 780ggtgaggcct gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag 840ctactggatg aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat 900ttggcctgga gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac 960tgcagacgaa tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc1020tgcggtctat ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat1080ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggtggtggtg gttctggcgg1140cggcggctcc ggtggtggtg gttctgatat ccagctgacc cagtctccag cttctttggc1200tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatctc ctgcaaggcc agccaaagtg ttgattatga1260tggtgatagt tatttgaact ggtaccaaca gattccagga cagccaccca aactcctcat1320ctatgatgca tccaatctag tttctgggat cccacccagg tttagtggca gtgggtctgg1380gacagacttc accctcaaca tccatcctgt ggagaaggtg gatgctgcaa cctatcactg1440tcagcaaagt actgaggatc cgtggacgtt cggtggaggg accaagctcg agatcaaatc1500
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caaaagatgg atttatgaca catccaaagt ggcttctgga gtcccttatc gcttcagtgg 600cagtgggtct gggacctcat actctctcac aatcagcagc atggaggctg aagatgctgc 660cacttattac tgccaacagt ggagtagtaa cccgctcacg ttcggtgctg ggaccaagct 720ggagctgaaa tccggaggtg gtggatccca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct 780ggtgaggcct gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag 840ctactggatg aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat 900ttggcctgga gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac 960tgcagacgaa tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc1020tgcggtctat ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat1080ggactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc ggtggtggtg gttctggcgg1140cggcggctcc ggtggtggtg gttctgatat ccagctgacc cagtctccag cttctttggc1200tgtgtctcta gggcagaggg ccaccatctc ctgcaaggcc agccaaagtg ttgattatga1260tggtgatagt tatttgaact ggtaccaaca gattccagga cagccaccca aactcctcat1320ctatgatgca tccaatctag tttctgggat cccacccagg tttagtggca gtgggtctgg1380gacagacttc accctcaaca tccatcctgt ggagaaggtg gatgctgcaa cctatcactg1440tcagcaaagt actgaggatc cgtggacgtt cggtggaggg accaagctcg agatcaaatc1500cgggcatcat caccatcatc attgagtcga c 1531<210>10<211>504<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>VH/VL x CD19 VH/VL(成熟蛋白質(zhì)w/o前導肽)的翻譯CD3<400>10Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile130 135 140Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser165 170 175Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro180 185 190Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile195 200 205Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp210 215 220Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys225 230 235 240Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu245 250 255Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly260 265 270Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly275 280 285Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr290 295 300Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu305 310 315 320Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp325 330 335
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg340 345 350Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val355 360 365Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly370 375 380Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu385 390 395 400Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr405 410 415Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro420 425 430Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro435 440 445Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile450 455 460His Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser465 470 475 480Thr Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys485 490 495Ser Gly His His His His His His500
<210>11<211>1528<212>DNA<213>人工序列<220>
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catctatgat gcatccaatc tagtttctgg gatcccaccc aggtttagtg gcagtgggtc 960tgggacagac ttcaccctca acatccatcc tgtggagaag gtggatgctg caacctatca1020ctgtcagcaa agtactgagg atccgtggac gttcggtgga gggaccaagc tcgagatcaa1080aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggtggtggt ggttctcagg tgcagctgca1140gcagtctggg gctgagctgg tgaggcctgg gtcctcagtg aagatttcct gcaaggcttc1200tggctatgca ttcagtagct actggatgaa ctgggtgaag cagaggcctg gacagggtct1260tgagtggatt ggacagattt ggcctggaga tggtgatact aactacaatg gaaagttcaa1320gggtaaagcc actctgactg cagacgaatc ctccagcaca gcctacatgc aactcagcag1380cctagcatct gaggactctg cggtctattt ctgtgcaaga cgggagacta cgacggtagg1440ccgttattac tatgctatgg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctccgg1500gcatcatcac catcatcatt gagtcgac 1528<210>12<211>503<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 VL/VH x CD19 VL/VH(成熟蛋白質(zhì)w/o前導肽)的翻譯<400>12Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30
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<223>CD3 VH/VL x CD19 VL/VH(BsrG I至Sal I)核苷酸序列
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tgagtggatt ggacagattt ggcctggaga tggtgatact aactacaatg gaaagttcaa1320gggtaaagcc actctgactg cagacgaatc ctccagcaca gcctacatgc aactcagcag1380cctagcatct gaggactctg cggtctattt ctgtgcaaga cgggagacta cgacggtagg1440ccgttattac tatgctatgg actactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctccgg1500gcatcatcac catcatcatt gagtcgac 1528<210>14<211>503<212>PRT<213>人工序列<220>
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<213>人工序列<220>
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<223>3’VLL2KGS15
<400>32ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttcagctcc agcttggtcc 50<210>33<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’VHL2KGS15<400>33ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gatatcaaac tgcagcagtc agg 53<210>34<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’VHL2KBspEI<400>34aatccggatg aggagactgt gagagtggtg 30<210>35<211>25<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>3’VHCD19BspEI(C-末端)<400>35cctccggagg agacggtgac cgtgg25<210>36<211>73<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CTI多聚接頭<400>36tctagaattc ttcgaatccg gaggtggtgg atccgatatc cccgggcatc atcaccatca 60tcattgagtc gac 73<210>37<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’1<400>37gaagcacgcg tagatatckt gmtsacccaa wctcca36<210>38
<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’K<400>38gaagatggat ccagcggccg cagcatcagc 30<210>39<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’H1<400>39cagccggcca tggcgcaggt scagctgcag sag 33<210>40<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’G<400>40accaggggcc agtggataga caagcttggg tgtcgtttt 39
<210>41<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’VLB5RRV<400>41aggtgtacac tccgatatcc agctgaccca gtctcca 37<210>42<211>51<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’VLGS15<400>42ggagccgccg ccgccagaac caccaccacc tttgatctcg agcttggtcc c 51<210>43<211>53<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5’VHGS15
<400>43ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct caggtsmarc tgcagsagtc wgg 53<210>44<211>750<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD19 VH/VL nuc<400>44caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360accgtctcct ccggtggtgg tggttctggc ggcggcggct ccggtggtgg tggttctgat 420atccagctga cccagtctcc agcttctttg gctgtgtctc tagggcagag ggccaccatc 480tcctgcaagg ccagccaaag tgttgattat gatggtgata gttatttgaa ctggtaccaa 540cagattccag gacagccacc caaactcctc atctatgatg catccaatct agtttctggg 600atcccaccca ggtttagtgg cagtgggtct gggacagact tcaccctcaa catccatcct 660gtggagaagg tggatgctgc aacctatcac tgtcagcaaa gtactgagga tccgtggacg 720ttcggtggag ggaccaagct cgagatcaaa 750
<210>45<211>250<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD19 VH/VL aa<400>45Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr130 135 140Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile145 150 155 160Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu165 170 175Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr180 185 190Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser195 200 205Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Lys Val210 215 220Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr225 230 235 240Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys245 250<210>46<211>729<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>CD3 VH/VL nuc<400>46gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagtc 360gaaggtggaa gtggaggttc tggtggaagt ggaggttcag gtggagtcga cgacattcag 420ctgacccagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 480agagccagtt caagtgtaag ttacatgaac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 540aaaagatgga tttatgacac atccaaagtg gcttctggag tcccttatcg cttcagtggc 600agtgggtctg ggacctcata ctctctcaca atcagcagca tggaggctga agatgctgcc 660acttattact gccaacagtg gagtagtaac ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg 720gagctgaaa 729<210>47<211>243<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 VH/VL aa
<400>47Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr20 25 30Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly115 120 125Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser130 135 140Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys145 150 155 160Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser165 170 175
Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser180 185 190Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser195 200 205Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys210 215 220Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu225 230 235 240Glu Leu Lys<210>48<211>750<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD19 VL/VH nuc<400>48gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300
acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaaggtggtg gtggttctgg cggcggcggc 360tccggtggtg gtggttctca ggtgcagctg cagcagtctg gggctgagct ggtgaggcct 420gggtcctcag tgaagatttc ctgcaaggct tctggctatg cattcagtag ctactggatg 480aactgggtga agcagaggcc tggacagggt cttgagtgga ttggacagat ttggcctgga 540gatggtgata ctaactacaa tggaaagttc aagggtaaag ccactctgac tgcagacgaa 600tcctccagca cagcctacat gcaactcagc agcctagcat ctgaggactc tgcggtctat 660ttctgtgcaa gacgggagac tacgacggta ggccgttatt actatgctat ggactactgg 720ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctcc 750<210>49<211>250<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD19 VL/VH aa<400>49Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp20 25 30Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lle His65 70 75 80Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr85 90 95Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly100 105 110Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val115 120 125Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val130 135 140Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met145 150 155 160Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln165 170 175Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly180 185 190Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln195 200 205Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg210 215 220
Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp225 230 235 240Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser245 250<210>50<211>720<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>CD3 VL/VH nuc<400>50gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60atgacctgca gagccagttc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggagt cccttatcgc 180ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300accaagctgg agctgaaagg tggtggtggt tctggcggcg gcggctccgg tggtggtggt 360tctgatatca aactgcagca gtcaggggct gaactggcaa gacctggggc ctcagtgaag 420atgtcctgca agacttctgg ctacaccttt actaggtaca cgatgcactg ggtaaaacag 480aggcctggac agggtctgga atggattgga tacattaatc ctagccgtgg ttatactaat 540tacaatcaga agttcaagga caaggccaca ttgactacag acaaatcctc cagcacagcc 600tacatgcaac tgagcagcct gacatctgag gactctgcag tctattactg tgcaagatat 660tatgatgatc attactgcct tgactactgg ggccaaggca ccactctcac agtctcctca 720
<210>51<211>240<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 VL/VH aa<400>51Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met20 25 30Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr35 40 45Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr85 90 95Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser115 120 125Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys130 135 140Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln145 150 155 160Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg165 170 175Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr180 185 190Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr195 200 205Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His210 215 220Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser225 230 235 240<210>52<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-H1
<400>52Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His1 5 10<210>53<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-H2<400>53Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys1 5 10 15<210>54<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-H3<400>54Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr1 5 10<210>55
<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-L1<400>55Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn1 5 10<210>56<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-L2<400>56Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser1 5<210>57<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CD3 CDR-L3<400>57Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr1 5<210>58<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-H1<400>58Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn1 5 10<210>59<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-H2<400>59Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys1 5 10 15
Gly<210>60<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-H3<400>60Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr1 5 10 15<210>61<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-L1<400>61Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu Asn1 5 10 15<210>62<211>7
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-L2<400>62Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser1 5<210>63<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 CDR-L3<400>63Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr1 5<210>64<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 VH nuc
<400>64caggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctgggtcctc agtgaagatt 60tcctgcaagg cttctggcta tgcattcagt agctactgga tgaactgggt gaagcagagg 120cctggacagg gtcttgagtg gattggacag atttggcctg gagatggtga tactaactac 180aatggaaagt tcaagggtaa agccactctg actgcagacg aatcctccag cacagcctac 240atgcaactca gcagcctagc atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagacgggag 300actacgacgg taggccgtta ttactatgct atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360accgtctcct cc 372<210>65<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 VH aa<400>65Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr20 25 30Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser115 120<210>66<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 VL nuc<400>66gatatccagc tgacccagtc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg atagttattt gaactggtac 120caacagattc caggacagcc acccaaactc ctcatctatg atgcatccaa tctagtttct 180gggatcccac ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240cctgtggaga aggtggatgc tgcaacctat cactgtcagc aaagtactga ggatccgtgg 300acgttcggtg gagggaccaa gctcgagatc aaa 333
<210>67<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>抗CD19 VL aa<400>67Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp20 25 30Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro35 40 45Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro50 55 60Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His65 70 75 80Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr85 90 95Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110<210>68
<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標準接頭(G4S)3 nuc<400>68ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gttct 45<210>69<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>標準接頭(G4S)3 aa<400>69Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>70<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>標準臂(G4S)1 nuc
<400>70ggaggtggtg gatcc 15<210>71<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>標準接頭(G4S)1 aa<400>71Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>72<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-L1抗CD3<400>72Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn1 5 10<210>73<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>CDR-L2抗CD3<400>73Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser1 5<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-L3抗CD3<400>74Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr1 5<210>75<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H1抗CD3<400>75
Gly Tyr Lys Phe Ser Ser Ser Val Met His1 5 10<210>76<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H2抗CD3<400>76Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Lys1 5 10 15Gly<210>77<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H3抗CD3<400>77Ser Pro Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr1 5 10
<210>78<211>393<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>具有前導肽的CD3-ε胞外結(jié)構(gòu)域-nuc<400>78atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt acactccgat 60ggtaatgaag aaatgggtgg tattacacag acaccatata aagtctccat ctctggaacc 120acagtaatat tgacatgccc tcagtatcct ggatctgaaa tactatggca acacaatgat 180aaaaacatag gcggtgatga ggatgataaa aacataggca gtgatgagga tcacctgtca 240ctgaaggaat tttcagaatt ggagcaaagt ggttattatg tctgctaccc cagaggaagc 300aaaccagaag atgcgaactt ttatctctac ctgagggcaa gagtgtgtga gaactgcatg 360gagatggatt ccgggcatca tcaccatcat cat 393<210>79<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有前導肽的CD3-ε胞外結(jié)構(gòu)域-aa<400>79
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro20 25 30Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln35 40 45Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly50 55 60Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser65 70 75 80Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr85 90 95Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg100 105 110Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Ser Gly His His His115 120 125His His His130<210>80<211>36<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>5’BsrGI引物<400>80aggtgtacac tccgatggta atgaagaaat gggtgg36<210>81<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>3’BspEI引物<400>81cgatccggaa tccatctcca tgcagttctc acacactctt gc 42<210>82<211>146<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>小鼠Ig前導肽和克隆位點<400>82gaattcacca tgggatggag ctgtatcatc ctcttcttgg tagcaacagc tacaggtgta 60cactccgata tcaagcttcc ggacgctccc gactcaagcg cccgtgccac acagccgcaa 120gatctggcgc cgtgtggtca gtcgac 14權(quán)利要求
1.含有雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的藥物組合物，所述雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體包含特異于人CD3和人CD19的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中相應的可變重鏈區(qū)(VH)和相應的可變輕鏈區(qū)(VL)從N-末端到C-末端按照如下順序排列VH(CD19)-VL(CD19)-VH(CD3)-VL(CD3)、VH(CD3)-VL(CD3)-VH(CD19)-VL(CD19)或VH(CD3)-VL(CD3)-VL(CD19)-VH(CD19)。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述CD3特異性結(jié)構(gòu)域的所述VH和VL區(qū)來源于選自O(shè)KT-3、X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、TR-66、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2和F101.01的CD3特異性抗體。
3.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述VH區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.54或77的CDR3區(qū)。
4.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述VH區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.53或76的CDR2區(qū)。
5.權(quán)利要求1或2的藥物組合物，其中所述VH區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.52或75的CDR1區(qū)。
6.權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述VL區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.57或74的CDR3區(qū)。
7.權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述VL區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.56或73的CDR2區(qū)。
8.權(quán)利要求1至5中任一項的藥物組合物，其中所述VL區(qū)包含至少一個含有氨基酸序列SEQ ID NO.55或72的CDR1區(qū)。
9.權(quán)利要求1至8中任一項的藥物組合物，其中所述雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體含有選自如下的氨基酸序列(a)如SEQ ID NO 2、10或14所描述的氨基酸序列；(b)如SEQ ID NO 1、9或13所示核酸序列所編碼的氨基酸序列；(c)在嚴格條件下與(b)核酸序列互補鏈雜交的核酸序列所編碼的氨基酸序列；以及(d)由遺傳密碼導致與(b)核苷酸序列簡并的核酸序列所編碼的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求1至9中任一項的藥物組合物，其中所述可變區(qū)由額外的接頭序列所連接。
11.藥物組合物，其包含編碼權(quán)利要求1至10中任一項所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的核酸序列。
12.藥物組合物，其包含具有權(quán)利要求11所定義核酸序列的載體。
13.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述載體還含有與權(quán)利要求11所定義的核酸序列有效連接的調(diào)節(jié)序列。
14.權(quán)利要求12或13的藥物組合物，其中所述載體是表達載體。
15.藥物組合物，其含有用權(quán)利要求12至14中任一項所定義的載體所轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主。
16.權(quán)利要求1至15中任一項的藥物組合物，其還包含能夠為免疫效應細胞提供活化信號的蛋白質(zhì)化合物。
17.權(quán)利要求1至16中任一項的藥物組合物的生產(chǎn)方法，該方法包括在允許權(quán)利要求1至10中任一項所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體表達的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求15所定義的宿主，并從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體。
18.權(quán)利要求1至10中任一項所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、權(quán)利要求11所定義的核酸序列、權(quán)利要求12至14中任一項所定義的載體和/或權(quán)利要求15所定義的宿主的用途，用于制備預防、治療或減輕增生性疾病、最小殘留癌癥、腫瘤疾病、炎性疾病、免疫紊亂、自身免疫性疾病、傳染病、病毒病、過敏反應、寄生反應、移植物抗宿主疾病、宿主抗移植物疾病或B細胞惡性腫瘤的藥物組合物，其中所述藥物組合物任選地還含有能夠為免疫效應細胞提供活化信號的蛋白質(zhì)化合物。
19.用于預防、治療或減輕增生性疾病、最小殘留癌癥、腫瘤疾病、炎性疾病、免疫紊亂、自身免疫性疾病、傳染病、病毒病、過敏反應、寄生反應、移植物抗宿主疾病或宿主抗移植物疾病或B細胞惡性腫瘤的方法，其包括對需要這種預防、治療或減輕的受試者施用權(quán)利要求1至16中任一項的藥物組合物的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中受試者是人。
21.權(quán)利要求18的用途或權(quán)利要求19或20的方法，其中所述腫瘤疾病選自淋巴瘤、B細胞白血病或霍奇金淋巴瘤。
22.權(quán)利要求1至10中任一項所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、權(quán)利要求11所定義的核酸序列、權(quán)利要求12至14中任一項所定義的載體和/或權(quán)利要求15所定義的宿主在制備用于B細胞缺損的藥物組合物中的用途。
23.權(quán)利要求18的用途或權(quán)利要求19或20的方法，其中所述的B細胞惡性腫瘤為非霍奇金淋巴瘤。
24.權(quán)利要求18的用途或權(quán)利要求19或20的方法，其中所述的自身免疫性疾病為風濕性關(guān)節(jié)炎。
25.試劑盒，其含有權(quán)利要求1至10中任一項所定義的雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體、權(quán)利要求11所定義的核酸序列、權(quán)利要求12至14中任一項所定義的載體和/或權(quán)利要求15所定義的宿主。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體的藥物組合物，所述雙特異性單鏈抗體構(gòu)建體包含人CD3和人CD19特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中相應的可變重鏈區(qū)(V
文檔編號A61P19/02GK1795208SQ200480014513
公開日2006年6月28日 申請日期2004年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月31日
發(fā)明者P·庫弗, R·盧特比澤, B·科赫萊森, S·澤曼, P·博伊爾勒 申請人:麥克羅梅特股份公司