專利名稱：具有降低的細(xì)胞毒性的免疫原性TNFα類似物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性免疫治療領(lǐng)域，特別地涉及靶向下調(diào)自身蛋白質(zhì)和其它弱免疫原性抗原的主動(dòng)免疫治療領(lǐng)域。因此，本發(fā)明提供了腫瘤壞死因子α(TNFα)的新改進(jìn)的免疫原性、去毒的變異體及制備這種變異體必需的工具。本發(fā)明進(jìn)一步涉及免疫治療的方法及這種方法中所用的組合物。
背景技術(shù)：
在過去的20年，主動(dòng)免疫治療(“接種”)用做治愈或減輕疾病的方法已經(jīng)受到日益增加的關(guān)注。值得注意的是，自最近70年報(bào)道了使用抗生育疫苗的第一批試驗(yàn)以來，對(duì)于以某種方式與病理學(xué)(或者其它不期望的)生理學(xué)狀況有關(guān)的自身蛋白質(zhì)，應(yīng)用主動(dòng)免疫治療破壞機(jī)體對(duì)其的耐受性是已知的。
傳統(tǒng)上，通過“免疫原化”相關(guān)的自身蛋白，例如通過化學(xué)偶聯(lián)(“綴合”)大的外源和免疫原性載體蛋白(參看US 4,161,519)或者通過在自身蛋白和外源載體蛋白之間制備融合構(gòu)建體(參看WO 86/07383)，制備了抗自身抗原的疫苗。在這種構(gòu)建體中，免疫原性分子的載體部分負(fù)責(zé)提供T輔助淋巴細(xì)胞的表位(“TH表位”)，該表位使得可以引起自身耐受性的破壞。
最近的研究證明盡管這種策略實(shí)際上可以破壞針對(duì)自身蛋白的耐受性，但是遇到了大量的問題。最重要的事實(shí)是隨著時(shí)間的過去，抗免疫原的載體部分的抗體在誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中占優(yōu)勢(shì)，而抗自身蛋白的反應(yīng)活性常常下降，當(dāng)載體以前已經(jīng)做為免疫原時(shí)，這種效果特別明顯，這種現(xiàn)象稱為載體抑制(參看Kaliyaperuma l等.1995.，Eur.J.Immunol 25，3375-3380)。然而，當(dāng)使用治療接種時(shí)，通常需要每年重復(fù)免疫幾次并維持這種治療許多年，這也引起了這樣的一種狀況抗載體部分的免疫應(yīng)答將以犧牲抗自身分子的免疫應(yīng)答為代價(jià)日益地占優(yōu)勢(shì)。
當(dāng)使用半抗原載體技術(shù)破壞自身耐受性時(shí)，所涉及的進(jìn)一步問題是載體對(duì)這種構(gòu)建體中的自身蛋白質(zhì)部分所施加的負(fù)空間效應(yīng)由于簡(jiǎn)單的表位屏蔽或掩蔽，或者由于免疫原的自身部分中誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，所以可接近的類似于天然自身蛋白中觀察到的構(gòu)象模式的B細(xì)胞表位數(shù)量常常減少。最后，充分詳細(xì)地表征半抗原載體常常是非常困難的。
WO 95/05849提供了上述半抗原載體策略的改進(jìn)。證明其中只置換單一一個(gè)外源TH表位的自身蛋白能夠破壞對(duì)自身蛋白的耐受性。焦點(diǎn)放在自身蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的保持上，以確保在外源TH元件的引入下免疫原中仍將保留最大數(shù)量的自身B細(xì)胞表位。由于誘導(dǎo)的抗體是廣譜的及具有高的親和性，并且免疫應(yīng)答比用常規(guī)載體構(gòu)建體免疫時(shí)觀察到的免疫應(yīng)答具有更早的開始和更高的效價(jià)，這個(gè)策略通常證明是極其成功的。
WO 00/20027提供了上述原則的擴(kuò)充。發(fā)現(xiàn)在自身蛋白編碼序列中引入單TH表位可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)，該細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)與表達(dá)自身蛋白的細(xì)胞特異性反應(yīng)。WO 00/20027的技術(shù)也提供了聯(lián)合治療，其中既誘導(dǎo)抗體也誘導(dǎo)CTLs，在這些實(shí)施方式中仍然需要免疫原保留相當(dāng)大部分的B細(xì)胞表位。
腫瘤壞死因子(TNF，TNFα ，惡液質(zhì)素，TNFSF2)是炎性和免疫功能的有效旁分泌和內(nèi)分泌介質(zhì)。TNFα，特別是其聯(lián)合γ干擾素時(shí)，對(duì)許多細(xì)胞是細(xì)胞毒性的。1975年最初鑒定了TNFα，并且證明其起始腫瘤壞死和消退。后來已經(jīng)詳細(xì)地研究了此抗癌效果，然而盡管仍有利用TNFα的癌癥試驗(yàn)，但是此治療方法做為癌癥治療還沒有成功。后來，發(fā)現(xiàn)TNFα是惡液質(zhì)的原因，并且發(fā)現(xiàn)TNFα通過受體介導(dǎo)的過程發(fā)揮它的功能。已經(jīng)鑒定了兩種不同的TNFα受體(TNFR55和TNFR75)，這些受體介導(dǎo)TNFα的細(xì)胞毒性和炎性作用。在慢性炎性疾病象類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)期間，TNFα誘導(dǎo)和維持炎性過程，并且猜測(cè)它在變態(tài)反應(yīng)和銀屑病中具有至關(guān)重要的作用。用可溶受體封閉TNFα信號(hào)、受體特異性的抑制劑、TNFα產(chǎn)生的下調(diào)或單克隆抗-TNFα抗體是對(duì)抗TNFα上調(diào)和信號(hào)傳導(dǎo)的生物學(xué)作用的有吸引力的治療形式。
從用可溶TNFα受體和單克隆抗-TNFα抗體治療獲得的結(jié)果顯而易見，抗-TNFα治療在幾種疾病，象RA和局限性回腸炎中是成功的?？?TNFα治療被認(rèn)為是安全有效的。
迄今，已經(jīng)批準(zhǔn)了兩種TNFα拮抗劑，Remicade(Infliximab，Centocor/Johnson&Johnson)和Enbrel(Etanercept，Immunex)進(jìn)行臨床應(yīng)用。
Remicade是嵌合的小鼠-人類單克隆IgG1抗體，其定向抗可溶和細(xì)胞相關(guān)的TNFα。Remicade阻斷TNF與其內(nèi)源細(xì)胞表面TNFα受體結(jié)合。美國食品及藥物管理局(FAD)在1998年10月批準(zhǔn)了Remicade在常規(guī)治療方法難以治療的中度到嚴(yán)重或成瘺的局限性回腸炎中使用。這種適應(yīng)癥被延伸到包括在氨甲蝶呤單獨(dú)治療難以治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中與氨甲蝶呤的附加使用和在2002年7月在局限性回腸炎中進(jìn)行的維持治療。
Enbrel是重組蛋白質(zhì)，其由融合至人類IgG1 Fc部分的人類TNFα受體的細(xì)胞外部分組成。Enbrel通過做為誘餌(decoy)TNFα受體抑制TNFα活性。FDA在1998年11月批準(zhǔn)了在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中使用Enbrel。用這些TNFα拮抗劑治療了超過350,000名患者。連續(xù)地進(jìn)行了這些藥劑的臨床效力和安全性信息的評(píng)估，盡管對(duì)于TNFα拮抗劑主要關(guān)注感染和其它免疫相關(guān)的不利事件，但是FDA及專利醫(yī)藥產(chǎn)品委員會(huì)(CPMP)最近進(jìn)行的售后經(jīng)歷安全性評(píng)估陳述到盡管需要標(biāo)記改變，包括嚴(yán)重感染方面的改變，但是抗TNFα治療具有有利的風(fēng)險(xiǎn)-利益平衡。
目前提出的TNFα免疫治療與已經(jīng)確立的抗TNFα治療比較具有微克量接種和更少頻率注射以保持與大量灌輸單克隆抗體相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)高抗TNFα效價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。積極的結(jié)果是更低風(fēng)險(xiǎn)的副作用和較低的治療費(fèi)用。也認(rèn)為天然的多克隆抗體應(yīng)答將比其它抗TNFα治療是更有效的TNFα下調(diào)劑。
TNFα被翻譯成233個(gè)氨基酸前體蛋白質(zhì)，并且做為三聚體類型II跨膜蛋白質(zhì)分泌，其由特異的金屬蛋白酶切割為三聚體可溶蛋白質(zhì)，其中每個(gè)相同的單體亞基由157個(gè)氨基酸組成(在SEQ ID NO10中示出了其氨基酸序列，殘基2-158)。人類TNFα是非糖基化的，而鼠源TNFα具有單一的N-糖基化位點(diǎn)。TNFα單體分子量是17kDa，而三聚體的理論MW是52kDa，但是在SDS-PAGE中交聯(lián)三聚體做為43kDa移動(dòng)。TNFα含有兩個(gè)半胱氨酸，該半胱氨酸通過形成分子內(nèi)二硫鍵來穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。TNFα的N-和C-末端對(duì)于活性都是重要的。尤其是C-末端是敏感的，因?yàn)槿笔?個(gè)、2個(gè)，甚至1個(gè)氨基酸都急劇地降低了可溶性和生物活性。重要的氨基酸是Leu157，其在三聚體中兩個(gè)單體之間形成穩(wěn)定化鹽橋。另一方面，頭8個(gè)氨基酸缺失增加了活性1.5-5倍，而頭9個(gè)氨基酸的缺失將恢復(fù)全長(zhǎng)活性。TNFα是被很好地研究了的蛋白質(zhì)，并且已經(jīng)鑒定了引起三聚體形成和受體結(jié)合的許多分子內(nèi)和分子間相互作用。
因此，在自然界中，人類TNFα(SEQ ID NO10，殘基2-158)做為二聚體和三聚體存在，但是這兩種情況下的分子都非常適合做為本發(fā)明的候選靶。
WO 95/05849和WO 98/46642都披露了適于下調(diào)TNFα(腫瘤壞死因子α)活性的疫苗技術(shù)，TNFα是參與幾種疾病諸如類型I糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸病病理學(xué)的細(xì)胞因子。兩篇公開文獻(xiàn)都教導(dǎo)了當(dāng)該分子遇到免疫系統(tǒng)時(shí)，單體TNFα三級(jí)結(jié)構(gòu)的保持。而且WO03/042244(還沒有公開)披露了大量一般和特異的TNFα變異體。
盡管上述技術(shù)提供了非常有希望的結(jié)果，但是當(dāng)評(píng)估抗擊疾病時(shí)疫苗方法的耐久性時(shí)，存在幾種開始起作用的因素。這些因素之一是免疫原性蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
例如，為了使核酸疫苗起作用，用編碼“免疫原化”(immunogenized)自身蛋白質(zhì)的構(gòu)建體體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞必須能表達(dá)足夠量的免疫原以誘導(dǎo)適宜的免疫應(yīng)答。而且，基于多肽的疫苗要求可以通過工業(yè)發(fā)酵方法產(chǎn)生滿意數(shù)量的免疫原性蛋白質(zhì)。然而，常常觀察到即使已知蛋白質(zhì)氨基酸序列中輕微的改變也可能對(duì)可以回收的蛋白質(zhì)數(shù)量具有明顯的影響。
而且，遺傳修飾的蛋白質(zhì)序列的穩(wěn)定性也可能不是最佳的(在貯藏期方面和體內(nèi)穩(wěn)定性方面)。
而且，當(dāng)在TNFα的情況下期望下調(diào)的自身蛋白質(zhì)是雜聚物或同聚物時(shí)，該蛋白質(zhì)單體單元的變異體將不一定能夠誘導(dǎo)對(duì)聚合體蛋白質(zhì)天然構(gòu)象具有足夠特異性的抗體。
最后，TNFα是有毒物質(zhì)，不幸地是已經(jīng)觀察到最佳折疊的TNFα免疫原性變異體保留了TNFα的天然毒性，因?yàn)檫@些變異體能形成生物學(xué)活性的三聚體(或者折疊成模擬三聚體結(jié)構(gòu)的生物學(xué)活性的單體)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的免疫原性和去毒的人類TNFα類似物及提供用于誘導(dǎo)抗該蛋白質(zhì)的體液免疫的改進(jìn)的方法。而且，本發(fā)明的目的是提供培養(yǎng)可溶TNFα變異體及其它蛋白質(zhì)變異體的改進(jìn)的方法。最后，本發(fā)明的目的也是當(dāng)制備或利用此改進(jìn)的免疫原時(shí)，提供可以使用的其它方法和措施。
發(fā)明概述當(dāng)在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生大規(guī)模數(shù)量的重組蛋白質(zhì)時(shí)，常常希望表達(dá)產(chǎn)物可以做為細(xì)菌內(nèi)部包涵體而獲得。原因是下面幾種例如當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)為不溶包涵體時(shí)，正常地表達(dá)產(chǎn)量相當(dāng)高，并且因?yàn)槿菀缀头奖愕貜募?xì)菌發(fā)酵物中將期望的表達(dá)產(chǎn)物和可溶蛋白質(zhì)分離，所以蛋白質(zhì)的純化也方便。
然而，當(dāng)重組蛋白質(zhì)表達(dá)為不溶的包涵體時(shí)，常常需要使表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行各種蛋白質(zhì)重折疊過程，以獲得其生物學(xué)活性形式，即使這個(gè)步驟引起了從來都不會(huì)折疊成正確生物學(xué)活性形式的總重組蛋白質(zhì)的一定損失，但是這通常是可接受的。
然而，當(dāng)產(chǎn)生非免疫原性自身蛋白質(zhì)諸如TNFα的重組免疫原性變異體時(shí)，需要引入TH表位，因此當(dāng)與天然自身蛋白質(zhì)比較時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)改變。本發(fā)明人經(jīng)歷過即使最微小的改變也使得包涵體表達(dá)后再折疊的常規(guī)方法不可行再折疊后，與天然自身蛋白質(zhì)比較保留了滿意部分的B細(xì)胞表位的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量常常非常低，并且這個(gè)問題隨著目的蛋白質(zhì)的復(fù)雜度而增加。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)從細(xì)菌中以可溶蛋白質(zhì)形式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)構(gòu)建體并實(shí)現(xiàn)其表達(dá)是制備自身蛋白質(zhì)免疫原性變異體的上佳方法，盡管由于必須移除其它可溶蛋白質(zhì)，隨后的純化步驟更復(fù)雜，但是獲得了比上述常規(guī)方法顯著地更高產(chǎn)量的最終純化和正確折疊的產(chǎn)物。并且，非常重要地，從這種類型表達(dá)獲得的純化蛋白質(zhì)顯示了迄今無先例的保留其來源的天然自身蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位的能力。
簡(jiǎn)而言之，根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)最初篩選適于接種目的的自身蛋白質(zhì)免疫原性變異體時(shí)，變異體蛋白質(zhì)的可溶表達(dá)是優(yōu)良的篩選標(biāo)準(zhǔn)。
為了獲得這種免疫原化自身蛋白質(zhì)(和在一級(jí)結(jié)構(gòu)中已經(jīng)引入改變的其它蛋白質(zhì))的可溶蛋白質(zhì)表達(dá)的目的，可以改變幾個(gè)參數(shù)可以產(chǎn)生難于裝配的多聚體蛋白，方法是在單體水平上穩(wěn)定它們的結(jié)構(gòu)及制備TNFα多聚體的單體模擬物，并且可以根據(jù)這里所述的教導(dǎo)穩(wěn)定簡(jiǎn)單的單體蛋白質(zhì)。
另一個(gè)重要的因素是發(fā)酵條件——本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室中的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)表明例如在比正常地用于獲得高水平表達(dá)的溫度低的溫度下發(fā)酵細(xì)菌大大地有利于可溶形式的變異體蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。
本發(fā)明人以前發(fā)現(xiàn)“單體化”或穩(wěn)定形式TNFα的制備可以提供具有高穩(wěn)定性、優(yōu)良免疫原性和期望的生產(chǎn)特性的免疫原性分子。本發(fā)明致力于這些概念的改進(jìn)，其中在變異體中引入了多個(gè)特異性去毒突變以使它們具有更高的患者依從性，而同時(shí)保持免疫原性。
除了去毒突變，本發(fā)明的TNFα變異體還在TNFα單體結(jié)構(gòu)中包括多個(gè)變異，這些變異是充分地非毀壞性的以使得TNFα單體能正確折疊，而同時(shí)引入至少一個(gè)II類MHC結(jié)合氨基酸序列——在WO 03/042244中已經(jīng)詳細(xì)地公開了這些變異。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以在天然TNFα中一個(gè)特定的環(huán)結(jié)構(gòu)中進(jìn)行外源TH表位的插入，而這對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)特征以及對(duì)單體形成功能性TNFα二聚體或三聚體的能力沒有不利的影響。
因此，本發(fā)明的一方面涉及去毒的、免疫原性的人類TNFα類似物，其中該類似物包含至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列并且還具有下面的特征-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在柔性環(huán)3中已經(jīng)插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中引入了至少一個(gè)穩(wěn)定該TNFα單體3D結(jié)構(gòu)的二硫鍵，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中缺失了氨基末端氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9之任一個(gè)，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在內(nèi)含子位置向環(huán)1中插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在人類TNFαN-端中引入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列做為人工莖桿區(qū)(stalk region)的一部分，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中引入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，以通過增加三聚體相互作用界面的疏水性而穩(wěn)定單體結(jié)構(gòu)，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在TNFα氨基酸序列中插入或置換入側(cè)翼具有甘氨酸殘基的至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和/或
-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在D-E環(huán)中插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中在兩個(gè)相同的人類TNFα亞序列(subsequence)之間插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中已經(jīng)加強(qiáng)或用二硫鍵置換了人類TNFα中至少一個(gè)鹽橋，和/或-其是本發(fā)明的人類TNFα單體或hTNFα單體化類似物，其中通過引入模擬鼠TNFα晶體結(jié)構(gòu)的突變?cè)鰪?qiáng)了溶解性和/或?qū)Φ鞍酌附獾姆€(wěn)定性，其中通過引入至少一個(gè)選自Y87S，D143N和A145R的點(diǎn)突變降低或消除毒性，其中氨基酸編號(hào)起始于人類TNFα中N-末端V。
一般地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所有最適的免疫原性類似物均在它們產(chǎn)生階段時(shí)就是可溶蛋白質(zhì)，并且以可溶形式從它們的重組宿主細(xì)胞分離。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼這種免疫原性類似物的核酸片段(諸如DNA片段)，也提供了包含這種DNA片段的載體。
本發(fā)明也提供了用于制備類似物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明類似物或載體的免疫原性組合物。
本發(fā)明也提供了治療方法，其中下調(diào)多聚體蛋白以治療與該特定多聚體蛋白相關(guān)的特定疾病。


圖1是流程圖，表示大腸桿菌(E.coli)生產(chǎn)TNFα蛋白質(zhì)的上游加工。所示工作流程用于評(píng)估本發(fā)明TNFα變異體重組生產(chǎn)中各種發(fā)酵條件的相對(duì)效力。
發(fā)明詳述定義下文將詳細(xì)地定義和解釋本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中所用的大量術(shù)語以闡明本發(fā)明的界限和范圍。
術(shù)語“T淋巴細(xì)胞”和“T細(xì)胞”可互換地使用，指胸腺來源的淋巴細(xì)胞，它們負(fù)責(zé)各種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并在體液免疫應(yīng)答中負(fù)責(zé)輔助細(xì)胞活性。同樣，術(shù)語“B淋巴細(xì)胞”和“B細(xì)胞”可互換地使用，指產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞。
“聚合體蛋白”這里定義為包含至少兩條多肽鏈的蛋白質(zhì)，這兩條多肽鏈沒有通過肽鍵首尾連接在一起(術(shù)語“多聚體蛋白”可以與其互換使用)。因此，聚合體蛋白可以是由幾條多肽組成的聚合體，這些多肽通過二硫鍵和/或非共價(jià)結(jié)合的方法以聚合體形式保持在一起。該術(shù)語中也包括加工的前體蛋白質(zhì)和蛋白原，加工后它們包含至少兩個(gè)自由C-末端和至少兩個(gè)自由N-末端。最后，該術(shù)語中也包含至少兩條多肽之間臨時(shí)存在的復(fù)合物，該復(fù)合物可以形成不穩(wěn)定但是具有生物學(xué)活性的分子實(shí)體，該分子實(shí)體具有明顯的3維結(jié)構(gòu)。
“免疫原性類似物”(或“免疫原化”類似物或變異體)這里指單鏈多肽，其包含完整聚合體蛋白中發(fā)現(xiàn)的序列信息的實(shí)質(zhì)性部分。即，本發(fā)明的類似物蛋白質(zhì)包含一條多肽鏈，而聚合體蛋白包含至少2條多肽鏈。應(yīng)該注意到類似物可以是聚合體單體亞基結(jié)構(gòu)的變異，但是在這種情況下，免疫原性類似物能形成類似于天然聚合體的聚合體蛋白質(zhì)復(fù)合物。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，聚合體蛋白的“單體化”類似物或變異體是單鏈多肽，其包含天然聚合體蛋白中發(fā)現(xiàn)的至少2條多肽鏈，其中這兩條多肽鏈在“單體化”類似物或變異體中通過肽鍵共價(jià)連接，而在天然聚合體蛋白質(zhì)中不通過肽鍵連接。
多聚體蛋白的單體單位的“實(shí)質(zhì)性片段”指單體多肽中至少足以形成結(jié)構(gòu)域的單體多肽的一部分，其中該結(jié)構(gòu)域折疊成與多聚體蛋白中可以發(fā)現(xiàn)的3D構(gòu)象基本相同的3D構(gòu)象。
“TNFα多肽”這里指具有來源于人類和其它哺乳動(dòng)物的TNFα蛋白質(zhì)氨基酸序列的多肽。而且，該術(shù)語的范圍內(nèi)也包含原核生物系統(tǒng)中制備的非糖基化形式TNFα，同樣由于使用了例如，酵母或其它非哺乳動(dòng)物真核生物表達(dá)系統(tǒng)而具有不同糖基化模式的形式也包括在內(nèi)。然而，應(yīng)該注意到使用術(shù)語“TNFα多肽”時(shí)指當(dāng)將所述多肽呈遞給待處理的動(dòng)物時(shí)，該多肽正常是非免疫原性的。換而言之，TNFα多肽是自身蛋白或是這種自身蛋白的異種類似物(xeno-analogue)，其正常將不會(huì)在所述動(dòng)物中引起對(duì)抗TNFα的免疫應(yīng)答。
“TNFα類似物”是其一級(jí)結(jié)構(gòu)中已經(jīng)經(jīng)歷改變和/或與來源于別種分子的元件結(jié)合的TNFα多肽。例如，這種改變可以是TNFα多肽與適合的融合配偶體的融合形式(即，一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變專門地涉及C-和/或N-末端氨基酸殘基的添加)和/或它可以是TNFα多肽氨基酸序列的插入和/或缺失和/或置換形式。該術(shù)語也包含衍生的TNFα分子，參照下述有關(guān)TNFα修飾的討論。
可以理解TNFα類似物也包括含有完整TNFα多聚體蛋白質(zhì)的實(shí)質(zhì)性部分的單體變異體。
當(dāng)這里使用縮寫“TNFα”時(shí)，用于指成熟或野生型TNFα的氨基酸序列(這里也表示為“TNFαm”和“TNFαwt”)。成熟的人類TNFα表示為hTNFα，hTNFαm或hTNFαwt，成熟的鼠類TNFα表示為mTNFα，mTNFαm或mTNFαwt。在DNA構(gòu)建體包含編碼前導(dǎo)序列或其它物質(zhì)的信息的情況下，這將正常地排除于該范圍。
本發(fā)明范圍中的術(shù)語“多肽”指2到10個(gè)氨基酸殘基的短肽，11到100個(gè)氨基酸殘基的寡肽和100個(gè)以上氨基酸殘基的多肽。而且，該術(shù)語也意在包括蛋白質(zhì)，即包含至少一條多肽的功能性生物分子；當(dāng)包含至少兩條多肽時(shí)，它們可以形成共價(jià)連接的復(fù)合物或可以不共價(jià)連接。蛋白質(zhì)中多肽可以被糖基化和/或脂質(zhì)化和/或包含輔基。
術(shù)語“亞序列”意指分別直接地來源于天然TNFα氨基酸序列或核酸序列的任何一段連續(xù)的具有至少3個(gè)氨基酸，或者相應(yīng)地具有至少3個(gè)核苷酸的鏈。
本發(fā)明范圍中的“去毒突變”定義為TNFα氨基酸序列中突變(例如，點(diǎn)突變)，該突變使所得到的分子在相關(guān)動(dòng)物模型中(或在該TNFα氨基酸序列所來源的自身宿主中)具有顯著減少的毒性。然而，可以理解去毒突變不應(yīng)該是顯著地干擾TNFα分子正確折疊的突變，因?yàn)槠谕３諦細(xì)胞表位。
在本發(fā)明范圍中術(shù)語“動(dòng)物”一般指動(dòng)物物種(優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物)，諸如人類(Homo sapiens)，家犬(Canis domesticus)等，而不僅指一個(gè)單一動(dòng)物。然而，該術(shù)語也指這種動(dòng)物物種的群體，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明方法免疫的個(gè)體都具有允許用相同的免疫原進(jìn)行免疫的基本相同的TNFα是重要的。例如，如果在不同人類群體中存在TNFα的遺傳變異體，則可能必須在這些不同的群體中使用不同的免疫原以便能夠破壞每個(gè)群體中對(duì)TNFα的自身耐受性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚本發(fā)明范圍中的動(dòng)物是具有免疫系統(tǒng)的生物。優(yōu)選地動(dòng)物是脊椎動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物。
這里用術(shù)語“下調(diào)”意指(例如，通過干擾TNFα蛋白質(zhì)和該分子的生物學(xué)重要結(jié)合偶配體之間的相互作用)降低活生物體中TNFα的生物學(xué)活性?？梢酝ㄟ^幾種機(jī)理獲得下調(diào)在這些機(jī)理中，通過抗體結(jié)合簡(jiǎn)單地干擾多聚體蛋白中的活性位點(diǎn)是最簡(jiǎn)單的。然而，通過抗體結(jié)合引起清除細(xì)胞(諸如巨噬細(xì)胞和其它吞噬細(xì)胞)將多聚體蛋白移除也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
“向免疫系統(tǒng)呈遞…”的表述意指動(dòng)物的免疫系統(tǒng)以可控方式受到了免疫原性攻擊。從下面的討論將清楚，可以以多種方式完成免疫系統(tǒng)的這種攻擊，其中最重要的方法是用含有多肽的“治療性疫苗(pharmaccine)”(即，通過給藥以治療或改善正在發(fā)展的疾病的疫苗)接種，或核酸治療性疫苗(pharmaccine)接種。獲得的重要結(jié)果是動(dòng)物中免疫活性細(xì)胞以免疫學(xué)有效的方式遇到抗原，而獲得該結(jié)果的確切方式對(duì)于構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的發(fā)明要點(diǎn)并不太重要。
術(shù)語“免疫原性有效量”具有本領(lǐng)域通常的含義，即能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的免疫原的量，其中該免疫應(yīng)答可以顯著地抗擊與免疫原具有共同免疫學(xué)特征的病原體。
當(dāng)這里使用TNFα已經(jīng)被“修飾”的表述時(shí)指構(gòu)成該自身蛋白的骨架的多肽的化學(xué)修飾。例如，這種修飾可以是氨基酸序列中一些氨基酸殘基的衍生化(例如，烷化，?；?，酯化作用等)，但是從下面的討論可以清楚，優(yōu)選的修飾包括氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變(或添加)。
當(dāng)討論“對(duì)TNFα的自身耐受性”時(shí)，應(yīng)理解，因?yàn)門NFα在待接種的群體中是自身蛋白，所以種群中正常個(gè)體不產(chǎn)生抗它的免疫應(yīng)答；然而，這不能排除動(dòng)物群體中偶爾的個(gè)體可能能夠產(chǎn)生抗天然TNFα的抗體，例如做為自身免疫病的一部分。在任何情況下，動(dòng)物物種正常地只對(duì)其自己的TNFα產(chǎn)生自身耐受，但是不能排除所述動(dòng)物也耐受來源于其它物種或來源于具有不同表型的群體的類似物。
“外源T細(xì)胞表位”(或“外源T淋巴細(xì)胞表位”)是能結(jié)合MHC分子和在動(dòng)物物種中刺激T細(xì)胞的肽，因此是可互換使用的術(shù)語。本發(fā)明中優(yōu)選的外源T細(xì)胞表位是“泛主”(promiscuous)(或“通用”或“寬范圍”)表位，即與動(dòng)物物種或群體中特定類別MHC分子的實(shí)質(zhì)性部分結(jié)合的表位。僅僅非常有限數(shù)量的這種泛主T細(xì)胞表位是已知的，并且下面將詳細(xì)地討論它們。應(yīng)該注意為了使本發(fā)明所用的免疫原盡可能在動(dòng)物群體的盡可能大部分個(gè)體中有效，可能必需1)在同一類似物中插入幾個(gè)外源T細(xì)胞表位或2)制備幾種類似物，其中每種類似物插有不同的泛主表位。也應(yīng)該注意外源T細(xì)胞表位的概念也包含隱蔽性T細(xì)胞表位的使用，所述隱蔽性T細(xì)胞表位是來源于自身蛋白并且只在以分離形式，而不是所述自身蛋白的一部分存在時(shí)才顯示免疫原性行為的表位。
“外源T輔助淋巴細(xì)胞表位”(外源的TH表位)是結(jié)合II類MHC分子和可以與II類MHC分子結(jié)合而被呈遞至抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面上的外源T細(xì)胞表位。
“與多聚體蛋白異源的II類MHC結(jié)合氨基酸序列”因此是TNFα中不存在的II類MHC結(jié)合肽。如果這種肽對(duì)含有多聚體蛋白的動(dòng)物物種也是真正外源的，那么這種肽就是外源TH表位。
本發(fā)明范圍中(生物)分子的“功能性部分”意指負(fù)責(zé)分子所發(fā)揮的至少一種生物化學(xué)或生理學(xué)作用的分子部分。本領(lǐng)域公知許多酶和其它效應(yīng)分子具有活性位點(diǎn)，該活性位點(diǎn)負(fù)責(zé)所述分子所發(fā)揮的作用。分子的其它部分可以起到穩(wěn)定或者增加溶解度的目的，因此如果在本發(fā)明一些實(shí)施方式中不涉及這些目的，則可以將其省去。然而，根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選使用該多聚體分子的盡可能多的部分，因?yàn)槭褂眠@里所述的單體時(shí)，實(shí)際上已經(jīng)證明了增加的穩(wěn)定性。
術(shù)語“佐劑”具有疫苗技術(shù)領(lǐng)域通常的含義，即，1)本身不能引起抗疫苗中的免疫原的特異性免疫應(yīng)答，但是2)能增加抗免疫原的免疫應(yīng)答的物質(zhì)或組合物?；蛘撸瑩Q而言之，單獨(dú)用佐劑接種不提供抗免疫原的免疫應(yīng)答，用免疫原接種可以或不可以產(chǎn)生抗免疫原的免疫應(yīng)答，但是用免疫原和佐劑聯(lián)合接種則比單獨(dú)用免疫原接種可以誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗免疫原的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明范圍中分子“靶向”意指一旦分子被引入到動(dòng)物中后，分子偏好地出現(xiàn)在某些組織中或者偏好地與某些細(xì)胞或細(xì)胞類型相關(guān)?？梢杂枚喾N方式實(shí)現(xiàn)該效果，所述方式包括將分子配制在有利于靶向的組合物中或者在分子中引入有利于靶向的基團(tuán)。下面將詳細(xì)地討論這些方面。
“刺激免疫系統(tǒng)”意指物質(zhì)或組合物顯示了一般的，非特異性免疫刺激效果。大量的佐劑和推定的佐劑(諸如一些細(xì)胞因子)都具有刺激免疫系統(tǒng)的能力。使用免疫刺激劑的結(jié)果是免疫系統(tǒng)增加的“警覺性”，這意味著用免疫原進(jìn)行同時(shí)或隨后的免疫將比單獨(dú)使用免疫原誘導(dǎo)顯著更有效的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明去毒的免疫原性TNFα類似物的特征如果本發(fā)明的免疫原性類似物在實(shí)質(zhì)性片段中顯示了在天然生物學(xué)活性TNFα中發(fā)現(xiàn)的實(shí)質(zhì)性部分的B細(xì)胞表位，這是有利的。實(shí)質(zhì)性部分的B細(xì)胞表位在這里意指在抗原性表面相對(duì)于其它蛋白質(zhì)表征TNFα的一部分B細(xì)胞表位。優(yōu)選地，實(shí)質(zhì)性片段顯示在構(gòu)成多聚體蛋白的一部分時(shí)相應(yīng)TNFα單體中發(fā)現(xiàn)的基本上所有B細(xì)胞表位，當(dāng)然在單體TNFα序列中引入微小改變可能是必需的。例如，如上所述，可以通過氨基酸插入、置換、缺失或添加的方法修飾來源于單體單位的氨基酸序列，以便與天然蛋白質(zhì)比較減少TNFα類似物的毒性和/或引入II類MHC結(jié)合氨基酸序列，如果將該序列放置在接頭中是不期望的或是不恰當(dāng)?shù)摹?br> 特別優(yōu)選的實(shí)施方式提供了本發(fā)明免疫原性TNFα類似物，其中每個(gè)實(shí)質(zhì)性部分都基本上包含每個(gè)單體TNFα單位的完整氨基酸序列作為一個(gè)連續(xù)序列或者作為包含插入的序列。也就是類似物中只省去單體TNFα單位序列的無關(guān)緊要的部分，例如在這種序列沒有有助于單體單位的三級(jí)結(jié)構(gòu)或TNFα的四級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下。然而，只要維持多聚體TNFα蛋白的3D結(jié)構(gòu)，這種實(shí)施方式就允許單體的置換或插入。因此，特別有利的是免疫原性TNFα類似物中顯示了TNFα的所有單體單位的氨基酸序列，并且如果類似物以未被打斷的序列形式或者以包含插入物的序列形式包括構(gòu)成TNFα的(所有)單體的完整氨基酸序列，則是尤其有利的。
因此明顯地優(yōu)選在類似物中基本上保持完整天然生物學(xué)活性TNFα的3維結(jié)構(gòu)。
可以用幾種方法證明進(jìn)行這里所述修飾的TNFα保持了實(shí)質(zhì)性部分的B細(xì)胞表位或者甚至是3維結(jié)構(gòu)。一種方法是簡(jiǎn)單地制備抗天然TNFα的多克隆抗血清(例如，在兔中制備的抗血清)，此后(例如，在競(jìng)爭(zhēng)性ELISA中)使用該抗血清做為檢測(cè)產(chǎn)生的此修飾蛋白質(zhì)的檢測(cè)試劑。與天然分子相比和抗血清反應(yīng)的程度相同的修飾形式(類似物)被認(rèn)為與天然分子具有相同的3D結(jié)構(gòu)，而顯示了與這種抗血清的有限(但仍舊是顯著和特異性的)反應(yīng)性的類似物被認(rèn)為維持了實(shí)質(zhì)性部分的原始B細(xì)胞表位。
做為可替代的方案，可以制備與天然TNFα上不同表位反應(yīng)的單克隆抗體選集，并且用作測(cè)試板。這種方法有下面的優(yōu)點(diǎn)允許1)TNFα的表位作圖和2)在制備的類似物中維持的表位的作圖。
當(dāng)然，第三種方法是比較天然TNFα的解析3D結(jié)構(gòu)和所制備的類似物的解析三維結(jié)構(gòu)?？梢越柚赬射線衍射和NMR-光譜學(xué)解析三維結(jié)構(gòu)。關(guān)于三級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步信息可以在一定程度上從圓二色性研究獲得，該圓二色性研究具有只需要純化形式多肽以提供關(guān)于給定分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)的有用信息的優(yōu)點(diǎn)(而X射線衍射需要提供結(jié)晶多肽，NMR需要提供多肽的同位素變異體)。然而，最終必需X射線衍射和/或NMR獲得結(jié)論性數(shù)據(jù)，因?yàn)閳A二色性研究只能通過二級(jí)結(jié)構(gòu)元件的信息提供正確3維結(jié)構(gòu)的間接證據(jù)。
本發(fā)明的免疫原性TNFα類似物可以包含肽接頭，該肽接頭包含或有助于類似物中存在與多聚體蛋白異源的至少一個(gè)II類MHC結(jié)合氨基序列。在不希望改變對(duì)應(yīng)于TNFα中單體單位的氨基酸序列的情況下，這特別有用。做為可替代的方案，肽接頭可以沒有和不參與TNFα蛋白質(zhì)所來源的動(dòng)物物種中II類MHC結(jié)合氨基酸序列的存在；在需要使用非常短的接頭的情況下，或者如本發(fā)明中需要通過例如在活性位點(diǎn)中引入II類MHC結(jié)合元件來去毒可能有毒的類似物的情況下，可以方便地實(shí)施該方案。
優(yōu)選該II類MHC結(jié)合氨基酸序列結(jié)合多聚體蛋白所來源的動(dòng)物物種的大部分II類MHC分子，即，該II類MHC結(jié)合氨基酸序列是通用的或泛主結(jié)合的。
在打算將免疫原用做疫苗組分的物種中該序列充當(dāng)T細(xì)胞表位當(dāng)然是重要的。存在大量天然的“泛主”T細(xì)胞表位，這些T細(xì)胞表位在動(dòng)物物種或動(dòng)物群體的大部分個(gè)體中具有活性，并且優(yōu)選地將它們引入到疫苗中，由此減少在同一疫苗中對(duì)非常大量的不同類似物的需要。因此，所述至少一種II類MHC結(jié)合氨基酸序列優(yōu)選地選自天然的T細(xì)胞表位和人工的MHC-II結(jié)合肽序列。特別優(yōu)選的序列是選自如下的天然T細(xì)胞表位破傷風(fēng)類毒素表位諸如P2(SEQ ID NO2)或P30(SEQ ID NO4)，白喉類毒素表位，流感病毒血凝素表位和惡性瘧原蟲(P.falciparum)CS表位。
過去的許多年已經(jīng)鑒定了大量其它的泛主T細(xì)胞表位。特別地，已經(jīng)鑒定了能結(jié)合大部分由不同HLA-DR等位基因編碼的HLA-DR分子的肽，并且這些均是可能引入到本發(fā)明所用類似物中的T細(xì)胞表位。也參見下面文獻(xiàn)中所述的表位，這里將所有這些文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)WO 98/23635(Frazer IH等，轉(zhuǎn)讓給The University of Queensland)；Southwood S等，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336778-780；Chicz RM等，1993，J.Exp.Med17827-47；Hammer J等，1993，Cell 74197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39230-242。后面的參考文獻(xiàn)也涉及HLA-DQ和-DP配體。這5篇參考文獻(xiàn)中所列出的所有表位適于作為本發(fā)明中所用的候選天然表位，與這些表位具有共同基序的表位也同樣適宜。
做為可替代的方案，表位可以是能結(jié)合大部分II類MHC分子的任何人工T細(xì)胞表位。在該范圍中，WO 95/07707和相應(yīng)的Alexander J等，1994，Immunity 1751-761論文中(這里將這兩篇公開文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn))描述的泛DR表位肽(“PADRE”)是本發(fā)明待要使用的表位的有趣候選者。應(yīng)該注意到這些論文中公開的最有效的PADRE肽在C-和N-末端中帶有D-氨基酸以改進(jìn)給藥時(shí)的穩(wěn)定性。然而，本發(fā)明的主要目的在于摻入相關(guān)表位做為類似物的部分，然后在APCs的溶酶體區(qū)室內(nèi)部將其酶促分解以便允許隨后在MHC-II分子背景中呈遞，因此在本發(fā)明所用的表位中摻入D-氨基酸不是有利的。
一種特別優(yōu)選的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQID NO6和8)或其免疫學(xué)有效亞序列的肽。這個(gè)表位和同樣缺少M(fèi)HC限制的其它表位是優(yōu)選的T細(xì)胞表位，它們應(yīng)該存在于本發(fā)明方法中所用的類似物中。這種超泛主的表位將允許本發(fā)明最簡(jiǎn)單的實(shí)施方式，其中只有單一一種修飾的TNFα被呈遞給接種的動(dòng)物免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括通過引入至少一種外源的免疫優(yōu)勢(shì)TH表位進(jìn)行修飾。TH表位的免疫優(yōu)勢(shì)取決于所述的動(dòng)物物種，這是可以理解的。這里所用的術(shù)語“免疫優(yōu)勢(shì)”簡(jiǎn)單地指表位在接種個(gè)體中引起了顯著的免疫應(yīng)答，但是公知的事實(shí)是在一個(gè)個(gè)體中是免疫優(yōu)勢(shì)的TH表位不一定在相同物種的另一個(gè)個(gè)體中也是免疫優(yōu)勢(shì)的，即使它可能能夠結(jié)合后一個(gè)體中的MHC-II分子。
如上所述，通過引入至少一個(gè)氨基酸插入、添加、缺失或置換可以完成外源T細(xì)胞表位的引入。當(dāng)然，正常的情況是在氨基酸序列中引入一個(gè)以上的改變(例如，完整T細(xì)胞表位的插入或置換)，但是所要達(dá)到的重要目的是當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞(APC)加工類似物時(shí)，該類似物將產(chǎn)生在II類MHC分子背景中被呈遞在APC表面上的這種T細(xì)胞表位。因此，如果單體單位適當(dāng)位置中的氨基酸序列包含也可以在外源TH表位中發(fā)現(xiàn)的多個(gè)氨基酸殘基，那么通過氨基酸插入、添加、缺失和置換方法提供外源表位的剩余氨基酸可以完成外源TH表位的引入。換而言之，不必通過插入或置換引入完整的TH表位。
根據(jù)本發(fā)明，類似物也可以形成更大分子的一部分，其中它偶聯(lián)至少一個(gè)功能性部分，該功能性部分的存在不以顯著程度負(fù)面地干擾類似物的抗體可及性。這種部分(其可以融合類似物)的性質(zhì)可以是將修飾的分子靶向抗原呈遞細(xì)胞(APC)或者B淋巴細(xì)胞，以刺激免疫系統(tǒng)，和優(yōu)化類似物向免疫系統(tǒng)的呈遞。
靶向部分方便地選自B淋巴細(xì)胞特異性表面抗原或APC特異性表面抗原的基本特異性結(jié)合配偶體，諸如B淋巴細(xì)胞或APC上存在受體的半抗原或碳水化合物。免疫刺激部分可以選自細(xì)胞因子、激素和熱激蛋白質(zhì)。優(yōu)化呈遞的部分可以選自脂質(zhì)基團(tuán)，諸如棕櫚?；?、肉豆蔻基、法尼基、牻牛兒-牻牛兒基、GPI錨、N-?；视投セ鶊F(tuán)。
適合的細(xì)胞因子是干擾素γ(IFN-g)、Flt3L、白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素12(IL-12)、白細(xì)胞介素13(IL-13)、白細(xì)胞介素15(IL-15)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或是它們中任何一種的有效部分。
優(yōu)選的熱激蛋白質(zhì)是HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和鈣網(wǎng)蛋白(CRT)，或是它們中任何一種的有效部分。
優(yōu)選地，氨基酸插入、缺失、置換或添加的數(shù)量是至少2個(gè)，諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21和25個(gè)插入、置換、添加或缺失。進(jìn)一步優(yōu)選氨基酸插入、置換、添加或缺失的數(shù)量不超過150個(gè)，諸如最多100個(gè)、最多90個(gè)、最多80和最多70個(gè)。特別優(yōu)選置換、插入、缺失或添加的數(shù)量不超過60個(gè)，特別地該數(shù)量不應(yīng)該超過50個(gè)或者甚至40個(gè)。最優(yōu)選的是不超過30個(gè)的數(shù)量。關(guān)于氨基酸添加，應(yīng)該注意當(dāng)所獲得的構(gòu)建體是融合多肽形式時(shí)，這些氨基酸添加常常相當(dāng)大地高于150個(gè)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括通過引入至少一個(gè)外源免疫優(yōu)勢(shì)的TH表位(＝“外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列”)進(jìn)行修飾?？梢岳斫釺H表位的免疫優(yōu)勢(shì)問題取決于所述的動(dòng)物物種。這里所用的術(shù)語“免疫優(yōu)勢(shì)”簡(jiǎn)單地指表位在接種個(gè)體中引起顯著的免疫應(yīng)答，但是公知的事實(shí)是在一個(gè)個(gè)體中是免疫優(yōu)勢(shì)的TH表位不一定在相同物種的另一個(gè)個(gè)體中也是免疫優(yōu)勢(shì)的，即使它可能能夠結(jié)合后一個(gè)體中的MHC-II分子。
另一個(gè)重要的點(diǎn)是TH表位的MHC限制問題。一般地，天然出現(xiàn)的TH表位是MHC限制的，即，構(gòu)成TH表位的一些肽將只有效地結(jié)合II類MHC分子的亞群。這接著具有下面的效果在大多數(shù)情況下一種特異性TH表位的使用將產(chǎn)生只在一部分群體中有效的疫苗成分，并且取決于該部分群體的大小，在相同分子中包含更多的TH表位可能是必要的，或者可替代的方案是制備多成分的疫苗，其中這些成分是可以通過引入的TH表位的性質(zhì)互相區(qū)分的變異體。
如果所用T細(xì)胞的MHC限制是完全未知的(例如，在接種的動(dòng)物的MHC組分欠明確的情況下)，可以用下面公式確定動(dòng)物群體中被特定疫苗組合物所覆蓋的部分 -其中pi是群體中對(duì)疫苗組合物中存在的第i種外源T細(xì)胞表位產(chǎn)生應(yīng)答的應(yīng)答者的頻率，n是疫苗組合物中外源T細(xì)胞表位的總數(shù)。因此，在群體中分別具有0.8，0.7和0.6應(yīng)答頻率的含有3種外源T細(xì)胞表位的疫苗組合物將產(chǎn)生1-0.2×0.3×0.4＝0.976即，群體中的97.6％將在統(tǒng)計(jì)學(xué)上對(duì)該疫苗產(chǎn)生MHC-II介導(dǎo)的應(yīng)答。
在所用肽的或多或少精確的MHC限制模式已知的情況下，上面的公式不適用。例如，如果某種肽只結(jié)合HLA-DR等位基因DR1，DR3，DR5和DR7所編碼的人類MHC-II分子，那么這種肽與結(jié)合HLA-DR等位基因所編碼的剩余的MHC-II分子的另一種肽一起使用將完成對(duì)所述群體的100％覆蓋。同樣，如果第二種肽只結(jié)合DR3和DR5，這種肽的添加將根本不增加覆蓋率。如果單純地基于疫苗中T細(xì)胞表位的MHC限制來計(jì)算群體應(yīng)答，則可以通過下面公式確定特定疫苗組合物所覆蓋的群體百分?jǐn)?shù) 其中j是群體中編碼如下MHC分子的等位基因單元型的頻率總和，其中所述MHC分子結(jié)合疫苗中任何一種T細(xì)胞表位，并且屬于3種已知HLA基因座中(DP、DR和DQ)的第j種；實(shí)際上，首先確定疫苗中每一種T細(xì)胞表位將由何種MHC分子識(shí)別，此后根據(jù)類型(DP、DR和DQ)列出這些MHC分子，然后，針對(duì)每種類型將列出的各不同等位基因單元型的頻率加和起來，由此得出1、2和3。
可以出現(xiàn)公式I中pi值超過相應(yīng)的理論值ηiηi=1-Πj=13(1-Vj)2---(III)]]>-其中vj是群體中編碼如下MHC分子的等位基因單元型的頻率總和，該MHC分子結(jié)合疫苗中第i種T細(xì)胞表位，并且屬于3種已知HLA基因座(DP、DR和DQ)的中的第j種。這意味著在1-ηi群體中，存在f殘余-i＝(pi-ηi)/(1-ηi)的應(yīng)答者頻率。因此，可以調(diào)整公式II以產(chǎn)生公式IV
-其中術(shù)語1-f殘余-i如果是負(fù)值則設(shè)定為0。應(yīng)該注意公式V要求所有的表位都已經(jīng)對(duì)照相同組的單元型進(jìn)行了單元型作圖。
因此，當(dāng)篩選待引入本發(fā)明類似物中的T細(xì)胞表位時(shí)，包括可獲得的表位的所有知識(shí)是重要的1)群體中應(yīng)答每個(gè)表位的應(yīng)答者的頻率，2)MHC限制數(shù)據(jù)，和3)相關(guān)單元型在群體中的頻率。
應(yīng)該注意本發(fā)明優(yōu)選的類似物包含導(dǎo)致如下多肽的修飾，該多肽包含一段序列，該序列與TNFα相應(yīng)的單體單位或者其至少10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的亞序列具有至少70％序列同一性。優(yōu)選更高的序列同一性，例如至少75％或甚至至少80％或85％。蛋白質(zhì)和核酸的序列同一性可以計(jì)算為(Nref-Ndif)·100/Nref，其中Ndif是兩條序列對(duì)齊時(shí)序列中不相同殘基的總和，其中Nref是序列之一的殘基的總和。因此，DNA序列AGTCAGTC與序列AATCAATC將具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。
最后，為了結(jié)論性地證實(shí)本發(fā)明的TNFα類似物做為免疫原確實(shí)有效，可以進(jìn)行各種檢測(cè)以提供必需的證實(shí)。在此，可以參考WO00/65058中有用的IL5類似物的鑒定討論，這篇公開的文獻(xiàn)可以用于證實(shí)(IL5來源或不是IL5來源的)本發(fā)明技術(shù)的類似物的有用性。
優(yōu)選的TNFα類似物選自1)通過肽接頭首尾連接的2個(gè)或3個(gè)完整的TNFα單體，其中至少一個(gè)肽接頭包含至少一個(gè)II類MHC結(jié)合氨基酸序列，和2)通過惰性肽接頭首尾連接的2個(gè)或3個(gè)完整的TNFα單體，其中至少一個(gè)單體包含至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或其中至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，可選地通過惰性接頭，融合到N-或C-末端單體上。
特別有趣的是具有高度穩(wěn)定性的免疫原性TNFα分子，因?yàn)榘l(fā)明人早先已發(fā)現(xiàn)單體TNFα構(gòu)建體傾向于相對(duì)不穩(wěn)定，參看下面的討論。
先前已經(jīng)產(chǎn)生了通過表位和/或惰性肽接頭連接在一起的3個(gè)TNFα亞基的編碼基因。目的是產(chǎn)生其構(gòu)象盡可能地接近天然TNFα三聚體的變異TNFα分子。設(shè)計(jì)該變異體以有效地激發(fā)抗wtTNFα的中和抗體。發(fā)現(xiàn)最適合的TNFα變異體是在可能破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象的去污劑或其它種類添加劑不存在的情況下可溶和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。
下面的討論關(guān)注TNF的優(yōu)選的修飾，該修飾本身不涉及去毒。
通過表達(dá)利用接頭和TH表位連接在一起做為一條單一多肽鏈的3個(gè)單體，意欲制備比以前的變異TNFα免疫原更穩(wěn)定的TNFα變異體。通過在穩(wěn)定化氫鍵、鹽橋或二硫鍵外引入必需的TH表位，這允許保留TNFα結(jié)構(gòu)。
從TNFα的X射線晶體結(jié)構(gòu)觀察到N末端最初的5個(gè)殘基柔性太大以至于不允許結(jié)構(gòu)確定。而C-末端接近單體界面的中部，并且柔性較低。Arg-6和Leu-157的Cα原子之間距離是10，這是3-4個(gè)氨基酸殘基的距離。因此，看起來可能直接將單體亞基連接在一起，但是因?yàn)镃-末端位于一個(gè)微妙位點(diǎn)，使用柔性接頭，例如甘氨酸接頭進(jìn)行這種連接是有利的。
現(xiàn)在為止，利用“單體化三聚體”方法已經(jīng)設(shè)計(jì)了5個(gè)變異體。對(duì)照TNF_T0(0號(hào)TNFα三聚體，在WO 03/042244中SEQ ID NO22)，由通過2個(gè)單獨(dú)甘氨酸接頭(GlyGlyGly)直接連接在一起的3個(gè)單體。設(shè)計(jì)TNF_T0以使它如同野生型三聚體蛋白質(zhì)一樣穩(wěn)定。當(dāng)然，可以使用蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中已知的其它惰性柔性接頭而不是使用上述甘氨酸接頭，重要的特征是柔性接頭不不利地干擾單體化蛋白質(zhì)折疊成與生理學(xué)活性wtTNFα的3D結(jié)構(gòu)相似的3D結(jié)構(gòu)的能力。
在大腸桿菌(E.coli)中TNF_T0構(gòu)建體表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)，并且它已經(jīng)用于制備示例性構(gòu)建體TNF_T4(參看WO 03/042244)，TNF-T4是其中引入PADRE II類MHC結(jié)合肽(SEQ ID NO6)的變異體。在該構(gòu)建體中，單體單位和外源表位之間的比率是每3個(gè)單體一個(gè)表位，而現(xiàn)有技術(shù)中依賴于免疫原化單體蛋白質(zhì)的變異體為每個(gè)單體一個(gè)表位(WO 03/042244中SEQ ID NO55也如此)。這個(gè)事實(shí)對(duì)三聚體穩(wěn)定性提供了可能的積極影響。這種方法的后代是TNF_C2變異體(參看WO 03/042244)，其是在與TNF_T4中相同的位置中具有PADRE表位的TNFα單體。
平行地，在每個(gè)接頭區(qū)中含有一個(gè)表位的TNF_T1和TNF_T2變異體(參見WO 03/042244)和含有一個(gè)C-末端表位和在第二接頭區(qū)中含有一個(gè)表位的TNF_T3(參見WO 03/042244)已經(jīng)使用了破傷風(fēng)類毒素P2和P30表位(分別是SEQ ID NOs2和4)。蛋白質(zhì)多半從N-末端向C-末端折疊。構(gòu)成TNF_T3的想法是當(dāng)最初兩個(gè)N-末端結(jié)構(gòu)域折疊時(shí)，它們將作為被表位所圍繞的第三結(jié)構(gòu)域(單體)的內(nèi)部侶伴蛋白起作用。
除了上述詳細(xì)描述的多聚體蛋白“單體化”技術(shù)外，WO 03/042244中還公開了TNFα(和可能地許多其它的多聚體蛋白)允許如下單體的產(chǎn)生，該單體1)包含至少一個(gè)穩(wěn)定化突變，和/或2)包含至少一個(gè)非TNFα來源的II類MHC結(jié)合氨基酸序列，其中這些TNFα單體變異體能正確地折疊成三級(jí)結(jié)構(gòu)，隨后該三級(jí)結(jié)構(gòu)允許具有正確四級(jí)結(jié)構(gòu)的二聚體和三聚體TNFα蛋白的形成(如通過它們具有受體結(jié)合活性所證明的)。因此，在這些構(gòu)建體中，可以制備單體TNFα的變異體，這些變異體不一定需要做為單體化三聚體產(chǎn)生，因?yàn)閱误w序列中引入的改變僅有限地破壞單體三級(jí)結(jié)構(gòu)，以致于仍可以形成二或三聚體。根據(jù)構(gòu)成本發(fā)明的觀點(diǎn)，已經(jīng)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)所有這些變異體都可以從細(xì)菌細(xì)胞以可溶蛋白質(zhì)形式表達(dá)。
因此，已經(jīng)證明可以根據(jù)下面的策略制備免疫原性TNFα變異體，這些策略可以聯(lián)合，并且它們可以進(jìn)一步聯(lián)合已經(jīng)討論過的本發(fā)明“單體化方法”(因?yàn)樗羞@些特定修飾本質(zhì)上都是非破壞性的)。
柔性環(huán)策略本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PADRE表位(SEQ ID NO6)插入到環(huán)3中位置Gly108-Ala109是有希望制備具有非常象天然TNFα分子的結(jié)構(gòu)的TNFα變異體的方法。從TNFα晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)推導(dǎo)出直接插入到該位置的TH表位將沒有緊靠發(fā)生相互作用的任何鄰近氨基酸殘基。用TNF34進(jìn)行研究(參見WO 03/042244)——根據(jù)該方法制備的第一個(gè)PADRE構(gòu)建體——已經(jīng)證明當(dāng)在37℃生長(zhǎng)細(xì)菌宿主細(xì)胞時(shí)，在大腸桿菌(E.coli)約5％表達(dá)的蛋白質(zhì)TNF34中是可溶的，并且95％ TNF34表達(dá)為包涵體，但是改變發(fā)酵過程使發(fā)酵溫度為25℃后，來源于該發(fā)酵的可溶蛋白質(zhì)的產(chǎn)率接近100％。因此，生長(zhǎng)條件的優(yōu)化可以增加可溶蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。
已經(jīng)制備了大量的其它構(gòu)建體(TNF35-TNF39，參見WO03/042244)，其中所有這些構(gòu)建體只依賴于柔性環(huán)3中PADRE的引入。本發(fā)明進(jìn)一步考慮可以在環(huán)3的其它部分中或剛好在環(huán)3外部進(jìn)行外源表位的引入。特別地，插入被認(rèn)為是有意義的，并且在人類TNFα中氨基酸95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117和118的任何一個(gè)之后，可以有利地進(jìn)行外源表位諸如PADRE或P2或P30的插入。然而，TNFα相同區(qū)域中的置換也被認(rèn)為是有利的，如涉及相同范圍氨基酸的置換(即，人類TNFα中氨基酸95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117和118中的單一一個(gè)或幾個(gè)連續(xù)氨基酸的置換)。
穩(wěn)定性增強(qiáng)突變?nèi)嵝原h(huán)3中TH表位的引入可以潛在地使TNFα變異體的結(jié)構(gòu)去穩(wěn)定。然而，通過將形成二硫鍵的半胱氨酸引入而穩(wěn)定結(jié)構(gòu)可以抵消這種潛在的去穩(wěn)定作用。至今已經(jīng)在變異體TNF34-A和TNF34-B中在兩個(gè)不同位置引入了胱氨酸對(duì)(參見，WO 03/042244)。而且，可以平行地刪除已知減少受體相互作用強(qiáng)度的柔性N-末端(最初的8個(gè)氨基酸)，因此得到變異體TNF34-C(參見，WO 03/042244)。二硫鍵被引入單體中以與天然出現(xiàn)的二硫鍵(Cys-67 Cys-101)一起穩(wěn)定表位插入位點(diǎn)。認(rèn)為該策略也同樣地穩(wěn)定TNFα單體和單體化的二或三聚體。
其它構(gòu)建體在將是可溶表達(dá)產(chǎn)物的變異體設(shè)計(jì)中使用了幾種不同的策略。TNFX1.1-2(參見，WO 03/042244)是基于TNFα第一環(huán)中PADRE的插入，其中插入位點(diǎn)位于內(nèi)含子位置上。在TNFX2.1(參見，WO 03/042244)中，產(chǎn)生了人工“莖桿”區(qū)，其含有PADRE插入。
TNFα的突變已經(jīng)表明指向三聚體界面中的大的疏水性氨基酸置換穩(wěn)定了三聚體結(jié)構(gòu)。TNFX3.1和TNFX3.2(參見，WO 03/042244)是穩(wěn)定現(xiàn)存TNF34變異體的建議。TNFX4.1(參見，WO 03/042244)利用二甘氨酸接頭以減少PADRE肽對(duì)整體TNF34結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)限制。TNFX5.1(參見，WO 03/042244)利用在TNF家族成員BlyS中發(fā)現(xiàn)的環(huán)結(jié)構(gòu)做為插入點(diǎn)。TNFX6.1-2，TNF7.1-2和TNF8.1(參見，WO 03/042244)是進(jìn)一步的變異體。TNFX9.1和TNFX9.2(參見，WO 03/042244)是TNF34變異體，其在表位前后利用了4-6個(gè)氨基酸的相同重疊TNFα序列。最后，兩種變異體(WO 03/042244中SEQ ID NOs46和47)是PADRE肽位于與TNF34中相同的位置的P2/P30雙變異體。
而且，從TNFα的晶體結(jié)構(gòu)可以觀察到在TNFα單體中殘基Lys-98和Glu-116之間存在一個(gè)穩(wěn)定化鹽橋。鹽橋的定義是Asp或Glu中側(cè)鏈氧與Arg，Lys或His中正電荷原子側(cè)鏈氮之間靜電相互作用，原子間距離小于7.0埃。通過用Arg或His在該位置對(duì)Lys-98進(jìn)行位點(diǎn)定向置換突變并用Asp置換Glu116，可以提高該鹽橋穩(wěn)定性和由此提高三聚體分子穩(wěn)定性。也可以用上述方式以二硫鍵交換這些鹽橋。
已經(jīng)觀察到在溶解性和蛋白酶解方面，鼠類TNFα比人類的TNFα顯著地更穩(wěn)定。TNFα變異體的改進(jìn)包括進(jìn)行位點(diǎn)定向突變以模擬鼠類TNFα晶體結(jié)構(gòu)，以獲得在蛋白酶解方面更穩(wěn)定的TNFα產(chǎn)物。
從人類和鼠類TNFα的X射線結(jié)構(gòu)可以看到三聚體中心(三個(gè)TNFα單體的中間)由于疏水力保持在一起，而三聚體頂部和底部由于天然存在的鹽橋連接在一起。因此，通過篩選具有更強(qiáng)連接的這些鹽橋，將也可以改進(jìn)TNFα三聚體的穩(wěn)定性。
總之，至今已經(jīng)制備了下面特定的TNFα變異體


所使用的編號(hào)是從SEQ ID NO10的N-末端V開始的(即，從SEQ IDNO10中第2位氨基酸開始的)。在一些序列中在N-末端纈氨酸之前是用于翻譯起始的甲硫氨酸。
根據(jù)本發(fā)明去毒所有上述WO 03/042244中公開的TNFα變異體。
本領(lǐng)域已知可以去毒TNFα或至少大幅度地減少毒性的多種點(diǎn)突變。如果必要，這些點(diǎn)突變將被引入到本發(fā)明的變異體中。特別優(yōu)選的突變是對(duì)應(yīng)于成熟TNFα的Ser對(duì)Tyr-87，Asn對(duì)Asp-143和Arg對(duì)Ala-145的置換。而且Loetscher，H.，Stueber，D.，Banner，D.，Mackay，F(xiàn).和Lesslauer，W.1993 JBC 268(35)26350-7中提到的所有有效的突變也是本發(fā)明去毒實(shí)施方式中有意義的實(shí)施方式。這些點(diǎn)突變可以與WO 03/042244中公開任何一種特定構(gòu)建體一起使用。
因此，本發(fā)明最優(yōu)選的蛋白質(zhì)構(gòu)建體是由SEQ ID NOs12，13，14，16，17和18中任何一個(gè)序列及來源于其的只包含保守性氨基酸改變的任何氨基酸序列表示的構(gòu)建體。
無論如何，重要實(shí)施方式是上述所有這些TNFα變異體從細(xì)菌細(xì)胞諸如大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)為可溶蛋白質(zhì)。
當(dāng)目的是從大腸桿菌(E.coli)表達(dá)時(shí)，優(yōu)選的載體是pET28b+，p2Zop2F (WO 03/042244中SEQ ID NO60)是用于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的載體，pHP1(或其商售“孿生”pCI)是用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的載體。
本發(fā)明提供的一般療法本發(fā)明提供了可以以非常有利的方式下調(diào)TNFα的方法。
一般地，提供了下調(diào)自體宿主中TNFα的方法，該方法包括向動(dòng)物免疫系統(tǒng)呈遞免疫原性有效量的至少一種本發(fā)明免疫原性TNFα類似物。優(yōu)選地，自體宿主是哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選地是人類。
可以用大量方法實(shí)施該方法，其中蛋白質(zhì)疫苗給藥是一種選擇，但是核酸接種策略或活疫苗接種策略也具有很大意義。
蛋白質(zhì)/多肽接種和制劑當(dāng)通過向動(dòng)物給藥類似物的方法實(shí)現(xiàn)向動(dòng)物免疫系統(tǒng)呈遞類似物時(shí)，多肽制劑遵循本領(lǐng)域公認(rèn)的原理。
如美國專利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770所示例的，本領(lǐng)域一般熟知含有肽序列做為活性組分的疫苗的制備，這里將所有這些專利文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。典型地，這些疫苗被制備為液體溶液或懸浮液的注射劑；也可以制備適于注射前溶解在或懸浮在液體中的固體形式。制劑也可以被乳化?；钚悦庖咴越M分常常與賦形劑混合，所述賦形劑是藥物學(xué)可接受的，并且可與活性組分相容。例如，適合的賦形劑是水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等及它們的組合。此外，如果希望，疫苗可以含有微量的輔助物質(zhì)諸如濕潤劑或乳化劑，pH緩沖劑或增強(qiáng)疫苗有效性的佐劑；參見下面佐劑的詳細(xì)討論。
常規(guī)地，非胃腸道地通過注射，例如皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi)施用疫苗。適于其它給藥方式的其它制劑包括栓劑和在一些情況下的口服、口腔、舌下、腹膜內(nèi)、陰道內(nèi)、肛門、硬膜外、脊柱和顱內(nèi)制劑。對(duì)于栓劑，常規(guī)的粘合劑和載體可以包括例如聚烷二醇(polya1kalene glycol)或甘油三酯；可以從含有0.5％到10％，優(yōu)選地1-2％活性組分的混合物形成這種栓劑?？诜苿┌Ｊ褂玫馁x形劑，例如藥物學(xué)等級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續(xù)釋放制劑或粉末形式，并且含有10-95％活性組分，優(yōu)選地25-70％活性組分。對(duì)于口服制劑，霍亂毒素是有意義的制劑配偶體(也是可能的綴合偶配體)。
多肽可以制成中性或鹽形式的疫苗。藥物學(xué)可接受的鹽包括與無機(jī)酸諸如，鹽酸或磷酸或者與有機(jī)酸如醋酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的酸加成鹽(與肽的自由氨基形成)。與自由羧基形成的鹽也可以來源于無機(jī)堿諸如，氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵，和有機(jī)堿諸如異丙胺、三甲基胺，2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因(procaine)等。
以與劑量制劑相匹配的方式及治療有效和免疫原性的量給藥疫苗。要施用的量取決于待治療個(gè)體，包括，例如個(gè)體免疫系統(tǒng)引發(fā)免疫應(yīng)答的能力和期望的保護(hù)程度。適合的劑量范圍是每次接種約幾百微克活性組分，優(yōu)選的范圍從約0.1μg到2,000μg(盡管可以考慮1-10mg范圍的更高量)，諸如從約0.5μg到1,000μg的范圍，優(yōu)選地從1μg到500μg的范圍，特別是約10μg到100μg的范圍。用于最初給藥和加強(qiáng)接種的適宜方案也可以變化，但是典型的是在最初給藥后接著是隨后的接種或其它給藥。
施用的方式可以變化很大。任何常規(guī)施用疫苗的方法都可以應(yīng)用。這些方法包括在固體生理學(xué)可接受基質(zhì)上或者在生理學(xué)可接受的分散體中口服施用，非胃腸道地通過注射等方式施用。疫苗的劑量將取決于給藥的途徑，并且將隨著待要接種的個(gè)體的年齡和抗原制劑而變化。
一些疫苗類似物在疫苗中具有足夠免疫原性，但是，對(duì)于一些其它疫苗類似物，如果疫苗進(jìn)一步包含佐劑物質(zhì)，免疫應(yīng)答將得到加強(qiáng)。
已知在疫苗中獲得佐劑效果的各種方法。在″The Theory andPractical Application of Adjuvants″，1995，Dun-can E.S.Stewart-Tull(編輯)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6中和在″VaccinesNew Generation Immunological Adjuvants″，1995，Gregoriadis G等.(編輯)，Plenum Press，New York，ISBN0-306-45283-9中詳述了一般的原理和方法，這里將這兩篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。
尤其優(yōu)選使用可以被證明有利于打破對(duì)自身抗原的自身耐受性的佐劑。適合的佐劑的非限制性例子選自免疫靶向佐劑；免疫調(diào)節(jié)佐劑諸如毒素、細(xì)胞因子和分枝桿菌衍生物；油制劑；聚合物；微團(tuán)形成佐劑；皂苷；免疫刺激性復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM基質(zhì))；顆粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉(r-inulin)；和包囊化佐劑(eneapsulatingcdjnvant)。通常應(yīng)該注意，涉及可用作類似物中第一、第二和第三部分的化合物和試劑的上述公開加以必要的變更也指它們?cè)诒景l(fā)明疫苗的佐劑中的應(yīng)用。
佐劑的施用包括使用試劑諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(明礬)(通常使用緩沖鹽水中0.05到0.1％的溶液)，與0.25％溶液形式的糖合成聚合物(例如，Carbopol)混合，通過70℃到101℃之間的溫度熱處理30秒到2分鐘進(jìn)行疫苗中蛋白質(zhì)的聚集，用交聯(lián)劑的方法也可以進(jìn)行聚集。也可以利用胃蛋白酶處理的抗白蛋白抗體(Fab片段)進(jìn)行再激活而聚集，與細(xì)菌細(xì)胞諸如短小棒狀桿菌(C.parvum)或者革蘭氏陰性細(xì)菌的內(nèi)毒素或脂多糖成分混合，在生理學(xué)可接受的油載體諸如二縮甘露醇單油酸酯(Aracel A)中乳化或用20％全氟化碳溶液(Fluosol-DA)作為嵌段替代物(block substitute)進(jìn)行乳化。還優(yōu)選與油如鯊烯和IFA混合。
根據(jù)本發(fā)明，DDA(溴化二甲基雙十八烷基銨)及DNA和γ-菊粉是感興趣的佐劑候選物，此外，弗氏完全和不完全佐劑及quillaja皂苷諸如QuilA和QS21以及RIBI也是有意義的。另外的可能性是單磷酰脂A(MPL)，上述C3和C3d和胞壁酰二肽(MDP)。
也已知脂質(zhì)體制劑可以賦予佐劑效果，因此根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選脂質(zhì)體佐劑。
并且，根據(jù)本發(fā)明免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)類(ISCOM基質(zhì))佐劑也是優(yōu)選的選擇，尤其是因?yàn)橐呀?jīng)證明這種類型佐劑能上調(diào)APC的II類MHC表達(dá)。ISCOM基質(zhì)由(可選地分級(jí)分離的)來源于皂皮樹(Quillaja saponaria)的皂苷(三萜系化合物)、膽固醇和磷脂組成。當(dāng)與免疫原性蛋白質(zhì)混合時(shí)，所得到的顆粒性制劑就稱為ISCOM顆粒，其中皂苷占60-70％w/w，膽固醇和磷脂占10-15％w/w，和蛋白質(zhì)占10-15％w/w。例如，不僅在涉及佐劑的上述教科書中可以發(fā)現(xiàn)關(guān)于免疫刺激復(fù)合物的組成和應(yīng)用的詳細(xì)情況，而且Morein B等，1995，Clin.Immunother.3461-475以及Barr IG和Mitehell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(這里將這兩篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn))也提供了有關(guān)完整免疫刺激復(fù)合物制備的有用說明。
獲得佐劑效果的另一種高度有意義(因此優(yōu)選的)的可能方案是使用Gosselin等，1992中所述的技術(shù)(這里將這篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn))。簡(jiǎn)而言之，通過綴合抗原和抗單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞上Fcγ受體的抗體(或抗原結(jié)合抗體片段)可以增強(qiáng)相關(guān)抗原諸如本發(fā)明抗原的呈遞。尤其已經(jīng)證明對(duì)于接種目的，抗原和抗FcγRI之間的綴合可以增強(qiáng)免疫原性。
其它的可能性涉及權(quán)利要求中提到的靶向和免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)(尤其是細(xì)胞因子)用做蛋白質(zhì)構(gòu)建體的部分。在這點(diǎn)上，細(xì)胞因子的合成誘導(dǎo)物象聚IC也是可能的。
合適的分枝桿菌衍生物選自胞壁酰二肽、完全弗氏佐劑、RIBI和海藻糖二酯諸如TDM和TDE。
合適的免疫靶向佐劑選自CD40配體和CD40抗體或者其特異性結(jié)合片段(參見上述)，甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合適的聚合物佐劑選自碳水化合物諸如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑性聚合物；膠乳諸如膠乳珠。
調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的另一種感興趣的方法是在“虛擬淋巴結(jié)”(VLN)(ImmunoTherapy，Inc.，360 Lexington Avenue，New York，NY10017-6501開發(fā)的一種專利醫(yī)療裝置)中包含免疫原(可選地以及佐劑和藥物學(xué)可接受的載體和賦形劑)。VLN(細(xì)管狀裝置)模擬了淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)和功能。VLN插入到皮膚下面產(chǎn)生了無菌發(fā)炎位點(diǎn)，同時(shí)細(xì)胞因子和趨化因子高漲。T和B細(xì)胞及APC快速應(yīng)答此危險(xiǎn)信號(hào)，返回發(fā)炎位點(diǎn)并且在VLN多孔基質(zhì)內(nèi)部積累。已經(jīng)證明當(dāng)使用VLN時(shí)，引起對(duì)抗原的免疫應(yīng)答所需的必需抗原劑量減少，并且利用VLN接種賦予的免疫保護(hù)超過了使用Ribi做為佐劑的常規(guī)免疫。在Gelber C等，1998，“利用命名為虛擬淋巴結(jié)的新醫(yī)療裝置激發(fā)對(duì)小量免疫原的強(qiáng)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答”，在″From the Laboratory to the Clinic，書摘，1998年10月12日到15日，Seascape Resort，Aptos，California″中簡(jiǎn)要描述了該技術(shù)。
預(yù)期一年應(yīng)該至少施用一次疫苗，諸如一年至少1，2，3，4，5，6和12次。更具體地，預(yù)期每年1-12次，諸如每年向需要的個(gè)體給藥1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12次。以前已經(jīng)表明使用本發(fā)明優(yōu)選的自身疫苗誘導(dǎo)的記憶免疫不持久，因此需要用類似物定期地攻擊免疫系統(tǒng)。
由于遺傳變異，不同的個(gè)體可能以不同的免疫應(yīng)答強(qiáng)度與相同多肽發(fā)生反應(yīng)。因此，本發(fā)明的疫苗可以包含幾種不同的多肽以增強(qiáng)免疫應(yīng)答，也參見關(guān)于外源T-細(xì)胞表位引入選擇的上述討論。疫苗可以包含兩種或多種多肽，其中所有多肽都是如上述所定義的。
因此，疫苗可以包含3-20種不同的類似物，諸如3-10種類似物。然而，正常地，將試圖保持類似物的數(shù)量達(dá)到最小值諸如1或2種類似物。
核酸接種做為經(jīng)典肽疫苗給藥的一個(gè)非常重要的替代方案，核酸接種技術(shù)(也稱為“核酸免疫”，“遺傳免疫”和“基因免疫”)提供了大量具有吸引力的特征。
首先，與傳統(tǒng)疫苗接種方法相反，核酸接種不需要消耗大規(guī)模產(chǎn)生免疫原性劑的資源(例如，產(chǎn)生蛋白質(zhì)的微生物的工業(yè)規(guī)模發(fā)酵)。而且，不需要純化裝置和免疫原重新折疊的方案。最后，因?yàn)楹怂峤臃N依賴于接種個(gè)體的生物化學(xué)機(jī)器以產(chǎn)生所引入核酸的表達(dá)產(chǎn)物，所以預(yù)期可以出現(xiàn)最適宜的表達(dá)產(chǎn)物翻譯后加工；在自身接種的情況下，這特別重要，因?yàn)槿缟纤?，聚合物的相?dāng)大部分的原始B細(xì)胞表位應(yīng)該被保留在修飾的分子中，并且因?yàn)樵砩螧細(xì)胞表位可以由任何(生物)分子(例如，碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等)的部分組成。因此，免疫原的天然糖基化和脂質(zhì)化模式對(duì)于總的免疫原性可能具有非常重要的作用，并且預(yù)期這可以通過使宿主產(chǎn)生免疫原的方式來確保實(shí)現(xiàn)。
應(yīng)該注意，用目前公開的一些類似物觀察到的增加的表達(dá)水平對(duì)DNA接種效力非常重要，因?yàn)轶w內(nèi)表達(dá)水平是DNA疫苗的免疫原性效力的決定性因子之一。
因此，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式包括通過向動(dòng)物細(xì)胞中引入編碼類似物的核酸，由此使得細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)引入的核酸，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明類似物向免疫系統(tǒng)的呈遞。
在這個(gè)實(shí)施方式中，引入的核酸優(yōu)選地是DNA，該DNA可以是裸DNA，用帶電荷或不帶電荷的脂質(zhì)配制的DNA，配制在脂質(zhì)體中的DNA，包含在病毒載體中的DNA，用有利于轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA，用靶向蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA，用鈣沉淀劑配制的DNA，偶聯(lián)惰性載體分子的DNA，封裝在聚合物囊，例如PLGA(參見WO 98/31398中描述的微囊化技術(shù))或殼多糖或脫乙酰殼多糖中的DNA和用佐劑配制的DNA。在此，注意實(shí)際上涉及在常規(guī)疫苗制劑中應(yīng)用佐劑的所有考慮因素都適用于DNA疫苗制劑。因此，本文中涉及在多肽疫苗中使用佐劑的所有文獻(xiàn)都可以加以必要的修改后將它們應(yīng)用在核酸接種技術(shù)中。
對(duì)于上面詳述的多肽疫苗的給藥途徑和給藥方案，它們也可以應(yīng)用于本發(fā)明的核酸疫苗，并且上述涉及多肽的給藥途徑和給藥方案的所有討論都可以加以必要的修改以應(yīng)用于核酸。應(yīng)該補(bǔ)充的是核酸疫苗可能適于靜脈內(nèi)和動(dòng)脈內(nèi)給藥。而且，本領(lǐng)域公知可以通過使用所謂的基因槍施用核酸疫苗，因此這個(gè)方式和等同的給藥方式也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分。最后，已經(jīng)報(bào)道了核酸給藥中應(yīng)用VLN可以產(chǎn)生好的效果，因此特別地優(yōu)選這種特別的給藥方式。
而且，用做免疫劑的核酸可以含有編碼權(quán)利要求中指出的部分的區(qū)域，例如所述部分是上述的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)形式，諸如討論用做有用佐劑的細(xì)胞因子。這種實(shí)施方式的優(yōu)選形式包括在不同讀框中或至少在不同啟動(dòng)子控制下具有類似物的編碼區(qū)和免疫調(diào)節(jié)劑的編碼區(qū)。由此避免了類似物或表位做為免疫調(diào)節(jié)劑的融合配偶體產(chǎn)生。做為可替代的方案，可以使用兩個(gè)分開的核苷酸片段，但是不太優(yōu)選這種方式，因?yàn)楫?dāng)同一分子中具有兩個(gè)編碼區(qū)時(shí)，具有確保共表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。
因此，本發(fā)明也涉及誘導(dǎo)產(chǎn)生抗TNFα抗體的組合物，該組合物包含-本發(fā)明的核酸片段或載體(參見下面核酸和載體的討論)，和-如上所述藥物學(xué)和免疫學(xué)可接受的賦形劑和/或載體和/或佐劑。
在正常情況下，以載體形式引入核酸，其中核酸的表達(dá)受病毒啟動(dòng)子控制。對(duì)于本發(fā)明的載體和DNA片段的更詳細(xì)的討論參見下文。而且，可以獲得涉及核酸疫苗的制劑和應(yīng)用的詳細(xì)公開文獻(xiàn)，參見Donnelly JJ等，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和DonnellyJJ等，1997，Life Sciences 60163-172。這里將這兩篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。
活疫苗用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明類似物向免疫系統(tǒng)呈遞的第三個(gè)可替代的方案是活疫苗技術(shù)的應(yīng)用。在活疫苗接種中，通過向動(dòng)物給藥非致病性微生物實(shí)現(xiàn)向免疫系統(tǒng)的呈遞，其中已經(jīng)用編碼本發(fā)明類似物的核酸片段或用摻入這種核酸片段的載體轉(zhuǎn)化了所述的非致病性微生物。非致病性微生物可以是任何適合的減毒細(xì)菌株(通過傳代的方法或者通過用重組DNA技術(shù)移除致病性表達(dá)產(chǎn)物的方法減毒)，例如牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG、非致病性鏈球菌屬種(Streptococcusspp.)、大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌屬種(Salmonella spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、志賀氏菌屬種(Shigella)等?？梢栽诶鏢aliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990中發(fā)現(xiàn)關(guān)于本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)活疫苗制備的綜述，這里將這兩篇文獻(xiàn)并入為參考文獻(xiàn)。關(guān)于這種活疫苗中使用的核酸片段和載體的細(xì)節(jié)參見下文討論。
做為細(xì)菌活疫苗的可替代方案，可以將下文討論的本發(fā)明核酸片段摻入到非強(qiáng)毒性病毒疫苗載體諸如痘菌病毒株或任何其它適合的痘病毒中。
正常地，只向動(dòng)物給藥一次非致病性微生物或病毒，但是在一些情況下，在一生中可能必需給藥微生物一次以上以維持保護(hù)性免疫。甚至可以考慮當(dāng)使用活疫苗或病毒疫苗時(shí)，上述用于多肽接種的免疫方案將是有用的。
做為可替代的方案，活疫苗或病毒疫苗接種與先前或隨后的多肽和/或核酸接種聯(lián)合。例如，可以用活疫苗或病毒疫苗實(shí)現(xiàn)初次免疫，接著利用多肽或核酸方法進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
可以用核酸轉(zhuǎn)化微生物或病毒，所述核酸含有編碼上述部分，例如上述的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，諸如討論用做有用佐劑的細(xì)胞因子的區(qū)域。這種實(shí)施方式的優(yōu)選形式包括在不同讀框或至少在不同啟動(dòng)子控制下具有類似物的編碼區(qū)和免疫調(diào)節(jié)劑的編碼區(qū)。由此避免了類似物或表位做為免疫調(diào)節(jié)劑的融合配偶體產(chǎn)生。做為可替代的方案，兩個(gè)分開的核苷酸片段可以用做轉(zhuǎn)化試劑。當(dāng)然，在相同讀框中具有這些佐劑部分可以以表達(dá)產(chǎn)物形式提供本發(fā)明類似物，并且這種實(shí)施方式是本發(fā)明尤其優(yōu)選的。
聯(lián)合治療實(shí)施本發(fā)明的一種尤其優(yōu)選的方式包括使用核酸接種做為第一次(初次)免疫，隨后用上述多肽疫苗或活疫苗進(jìn)行第二次(加強(qiáng))免疫。
本發(fā)明方法在疾病治療中的用途涉及的疾病/病癥是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、脊椎關(guān)節(jié)病、多肌炎、皮肌炎、脈管炎、銀屑病(斑塊狀)、銀屑病關(guān)節(jié)炎、Mb.Crohn、慢性阻塞性肺疾病、骨髓增生異常綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的葡萄膜炎、急性肺功能障礙、(急性和慢性)哮喘、韋格納肉芽腫病、應(yīng)激性腸疾病、顳下頜疾病(下頜關(guān)節(jié)疼痛)、Stomatitisosteoporosis和癌惡病質(zhì)及其它炎性疾病和與TNFα副作用有關(guān)的本領(lǐng)域中通常明了的其它病癥。因此，通過利用本發(fā)明方法下調(diào)多聚體蛋白的活性可以治療或改善與這些疾病中任何一種疾病相關(guān)的癥狀。
本發(fā)明的組合物本發(fā)明也涉及用于實(shí)施本發(fā)明方法的組合物。因此，本發(fā)明也涉及免疫原性組合物，其包含免疫原性有效量的上述類似物，所述組合物進(jìn)一步包含藥物學(xué)和免疫學(xué)可接受的稀釋劑和/或運(yùn)載體和/或載體和/或賦形劑和可選地佐劑。換而言之，本發(fā)明的這部分涉及基本上如上所述的類似物制劑。佐劑、載體和運(yùn)載體的選擇與以上提到用于肽接種的類似物制劑時(shí)已經(jīng)討論的相應(yīng)一致。
通常根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法制備類似物。正常地，用重組基因技術(shù)制備更長(zhǎng)的多肽，該方法包括向適合的載體中引入編碼類似物的核酸序列，用載體轉(zhuǎn)化適合的宿主細(xì)胞，表達(dá)核酸序列(通過在適合的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞)、從宿主細(xì)胞或它們的培養(yǎng)物上清液回收表達(dá)產(chǎn)物和隨后的純化及可選的進(jìn)一步修飾，例如重新折疊或衍生化。不僅可以在標(biāo)題為“本發(fā)明的核酸片段和載體”的下文中而且可以在實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)涉及必需工具的細(xì)節(jié)。在這部分中也描述了類似物重組制備的優(yōu)選的方法，即，低溫發(fā)酵大腸桿菌(E.coli)以獲得可溶的TNFα變異體。
最近肽合成技術(shù)的進(jìn)展已經(jīng)使得能夠通過這些方法產(chǎn)生全長(zhǎng)的多肽和蛋白質(zhì)，因此，用公知的固相或液相肽合成技術(shù)制備長(zhǎng)的構(gòu)建體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的核酸片段和載體從上述討論可以理解不僅可以用重組基因技術(shù)，而且可以用化學(xué)合成或半合成方法制備修飾的多肽；當(dāng)修飾是或者包括與蛋白質(zhì)載體(諸如KLH、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素和BSA)和非蛋白質(zhì)分子諸如碳水化合物聚合物偶聯(lián)時(shí)，以及當(dāng)然當(dāng)修飾包括向聚合物來源的肽鏈添加側(cè)鏈或側(cè)基團(tuán)時(shí)，后兩項(xiàng)技術(shù)是尤其適當(dāng)?shù)摹纳鲜隹梢岳斫?，這些實(shí)施方式不是優(yōu)選的實(shí)施方式。
對(duì)于重組基因技術(shù)目的，當(dāng)然也對(duì)于核酸免疫目的，編碼類似物的核酸片段是重要的化學(xué)產(chǎn)物(它們的互補(bǔ)序列也是)。因此，本發(fā)明的一個(gè)重要部分涉及編碼這里所述類似物，即，如上所詳述的聚合物來源的人工聚合物多肽的核酸片段。本發(fā)明的核酸片段是DNA或RNA片段。
本發(fā)明最優(yōu)選的DNA片段包含如下核酸序列，該核酸序列選自編碼SEQ ID NOs12、13、14、16、17和18中任何一個(gè)序列的核酸序列或與這些序列中任何一個(gè)序列互補(bǔ)的核酸序列。
正常地，本發(fā)明的核酸片段將插入到適合的載體中以形成帶有本發(fā)明核酸片段的克隆或表達(dá)載體；這種新的載體也是本發(fā)明的部分。在下面有關(guān)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和微生物的部分中將討論本發(fā)明這些載體構(gòu)建的細(xì)節(jié)。根據(jù)應(yīng)用的目的和類型，載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微型染色體或病毒，并且只在某些細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的裸DNA也是重要的載體(并且可以在DNA接種中使用)。本發(fā)明優(yōu)選的克隆和表達(dá)載體能夠自主復(fù)制，由此使得能夠獲得用于高水平表達(dá)或便于隨后克隆的高水平復(fù)制目的的高拷貝數(shù)。
本發(fā)明載體的一般輪廓按5′→3′方向包括下面可操作連接的特征驅(qū)動(dòng)本發(fā)明核酸片段表達(dá)的啟動(dòng)子，可選地編碼前導(dǎo)肽的核酸序列(該前導(dǎo)肽使多肽片段能夠向細(xì)胞外相或在可應(yīng)用的情況下向周質(zhì)分泌或者整合到膜中)，本發(fā)明的核酸片段和可選地編碼終止子的核酸序列。當(dāng)在生產(chǎn)株系或細(xì)胞系中操作表達(dá)載體時(shí)，為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞遺傳穩(wěn)定的目的，優(yōu)選地，引入到宿主細(xì)胞中的載體整合到宿主細(xì)胞基因組中。相反，當(dāng)操作用于在動(dòng)物體中實(shí)現(xiàn)體內(nèi)表達(dá)的載體時(shí)(即，當(dāng)在DNA接種中使用載體時(shí))為了安全原因，優(yōu)選地載體不能整合在宿主細(xì)胞基因組中；通常地，使用裸DNA或非整合的病毒載體，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知這種選擇。
本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生本發(fā)明修飾的TNFα多肽。這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分，它們可以是用于本發(fā)明核酸片段和載體擴(kuò)增或用于本發(fā)明修飾的TNFα多肽重組產(chǎn)生的培養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞系。做為可替代的方案，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以是適合的活疫苗株，其中已經(jīng)被插入(單一一個(gè)或多個(gè)拷貝)核酸片段以實(shí)現(xiàn)修飾的TNFα的分泌或整合到細(xì)菌細(xì)胞膜或細(xì)胞壁中。
本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是微生物諸如細(xì)菌(如，埃希氏桿菌屬(Escherichia)(例如大腸桿菌(E.coli))，芽孢桿菌屬(bacillus)(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))，沙門氏菌屬(Salmonella)或分枝桿菌屬(Mycobacterium)(優(yōu)選非致病性的，例如牛分枝桿菌(M.bovis)BCG))，酵母(諸如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)))和原生動(dòng)物。做為可替代的方案，轉(zhuǎn)化細(xì)胞來源于多細(xì)胞生物體諸如真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。最優(yōu)選的是來源于人類的細(xì)胞，參見下文細(xì)胞系和載體的討論。最近的結(jié)果已經(jīng)表明使用商購果繩(Drosophila melanogaster)細(xì)胞系(來自于Invitrogen的Schneider 2(S2)細(xì)胞系和載體系統(tǒng))進(jìn)行本發(fā)明TNFα類似物的重組產(chǎn)生有很大希望，因此特別優(yōu)選這個(gè)表達(dá)系統(tǒng)，因此一般地此類系統(tǒng)也是本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式。
對(duì)于克隆和/或最佳化表達(dá)的目的，優(yōu)選地轉(zhuǎn)化細(xì)胞能復(fù)制本發(fā)明的核酸片段。表達(dá)核酸片段的細(xì)胞是本發(fā)明優(yōu)選使用的實(shí)施方式；它們可以用于小規(guī)模或大規(guī)模地制備類似物，或者在非致病性細(xì)菌的情況下，用做活疫苗中的疫苗組分。
當(dāng)通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法產(chǎn)生本發(fā)明的類似物時(shí)，盡管完全不是必要的，但是表達(dá)產(chǎn)物被向外運(yùn)輸?shù)脚囵B(yǎng)基中或由轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面攜帶是方便的，因?yàn)檫@兩種可選方案都有利于隨后表達(dá)產(chǎn)物的純化。
當(dāng)鑒定了有效的生產(chǎn)者細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選地在其基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，該穩(wěn)定細(xì)胞系帶有本發(fā)明載體并表達(dá)編碼修飾的TNFα的核酸片段。優(yōu)選地，該穩(wěn)定的細(xì)胞系分泌或帶有本發(fā)明TNFα類似物，因此有利于其純化。
一般地，與宿主結(jié)合使用含有復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體，其中該復(fù)制子和控制序列來源于與宿主細(xì)胞相容的物種。載體通常帶有復(fù)制位點(diǎn)及標(biāo)記序列，該標(biāo)記序列能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型篩選標(biāo)記。例如，通常利用來源于大腸桿菌(E.coli)物種的質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)(參見，例如Bolivar等，1977)。pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因此提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的容易方法。pBR質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)?；蚴删w必需也含有，或者被修飾而含有可以被原核微生物用于表達(dá)的啟動(dòng)子。
在原核生物重組DNA構(gòu)建體中最常使用的啟動(dòng)子包括B-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)和色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等，1979；EP-A-0 036 776)。盡管這些是最常用的啟動(dòng)子，但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和使用了其它微生物的啟動(dòng)子，并且已經(jīng)公開了關(guān)于它們的核苷酸序列的細(xì)節(jié)，這使得普通技術(shù)人員能夠?qū)⑺鼈兣c質(zhì)粒載體功能性地連接在一起(Siebwenlist等，1980)。來源于原核生物的一些基因可以從它們自己的啟動(dòng)子序列有效地在大腸桿菌(E.col)中被表達(dá)，而不需要通過人工方法添加另外的啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地原核生物細(xì)胞中TNFα類似物的制備引起可溶蛋白質(zhì)的提供，參見實(shí)施例9，并且尤其優(yōu)選地用于生產(chǎn)的宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.col)細(xì)胞。
本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)證明可以相對(duì)容易和方便地在降低的溫度下在大腸桿菌(E.col)中制備可溶TNFα變異體。大腸桿菌(E.col)發(fā)酵的常規(guī)方法正常地利用約37℃的溫度，但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過在32℃以下溫度發(fā)酵可以獲得增加產(chǎn)量的可溶TNFα變異體，盡管重組蛋白質(zhì)總產(chǎn)量比在約37℃時(shí)發(fā)酵的總產(chǎn)量低，但是最適宜變異體的產(chǎn)量顯著更高，并且不需要不溶的變性蛋白質(zhì)的重折疊。
簡(jiǎn)而言之，本發(fā)明典型的發(fā)酵方法包括下面步驟用轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接種發(fā)酵罐，隨后發(fā)酵以獲得足夠數(shù)量的生物量，接著誘導(dǎo)重組表達(dá)，最后收獲重組蛋白質(zhì)。使用誘導(dǎo)型系統(tǒng)不是必須的，但是這更方便。
因此，本發(fā)明的一個(gè)重要方面涉及細(xì)菌中，尤其是大腸桿菌(E.col)中本發(fā)明TNFα變異的重組產(chǎn)生，其中至少在誘導(dǎo)重組TNFα類似物產(chǎn)生后的階段(即，使用誘導(dǎo)型系統(tǒng)的情況下)實(shí)行小于32℃的溫度。然而，實(shí)施例9證明了當(dāng)在這種低溫下進(jìn)行所有發(fā)酵(誘導(dǎo)前后)時(shí)得到最高產(chǎn)量的可溶性重組TNFα類似物。
優(yōu)選地，在發(fā)酵的兩個(gè)階段(誘導(dǎo)前和后)中任一階段中該降低的溫度是30℃以下，諸如29，28，27，26，25，24，23，22，21或20℃。優(yōu)選地，溫度范圍在20和30℃之間，更優(yōu)選地范圍在22和28℃之間，最優(yōu)選地溫度是約25℃。如實(shí)施例9所示，當(dāng)在該溫度發(fā)酵時(shí)，已經(jīng)獲得了接近100％的可溶TNFα類似物的產(chǎn)率。
應(yīng)該注意本發(fā)明人認(rèn)為用于本發(fā)明可溶TNFα變異體生產(chǎn)的低溫條件可以一般性地應(yīng)用于可溶性免疫原性蛋白質(zhì)變異體的重組生產(chǎn)，盡管用這種發(fā)酵方法獲得的總蛋白質(zhì)產(chǎn)量比例如通過37℃發(fā)酵獲得的總蛋白質(zhì)產(chǎn)量低，但是當(dāng)使用互低溫條件時(shí)，具有有用的3D結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)率顯著更高，并且重要地，可以避免隨后再折疊過程消耗的時(shí)間和資源?；蛘撸?jiǎn)而言之，具有期望構(gòu)象的變異體蛋白質(zhì)的產(chǎn)率更高。
因此，本發(fā)明也表明使用上述低溫發(fā)酵條件的策略是產(chǎn)生有用免疫原性蛋白質(zhì)變異體的一般可應(yīng)用的方法。
除了原核生物，還可以使用真核微生物諸如酵母培養(yǎng)物，并且這里啟動(dòng)子應(yīng)該能驅(qū)動(dòng)表達(dá)。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)或普通的面包酵母是最常用的真核微生物，盡管通?？梢缘玫酱罅科渌闹晗?。為了在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)中表達(dá)，例如通常使用質(zhì)粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。該質(zhì)粒已經(jīng)含有trpI基因，該基因提供了篩選突變酵母株系，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)的篩選標(biāo)記，其中所述突變酵母株系缺少在色氨酸中生長(zhǎng)的能力。此trpI損傷的存在，作為酵母宿主細(xì)胞基因組的一個(gè)特征，為通過在沒有色氨酸的情況下生長(zhǎng)來檢測(cè)轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)有效環(huán)境。
酵母載體中適合的啟動(dòng)子序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。在構(gòu)建適合的表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，與這些基因相關(guān)的終止序列也被連接到表達(dá)載體中位于期望被表達(dá)的序列的3’，以提供mRNA的聚腺苷酸化和終止。
具有通過生長(zhǎng)條件控制轉(zhuǎn)錄的另外優(yōu)點(diǎn)的其它啟動(dòng)子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和前述甘油醛-3-磷酸脫氫酶及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動(dòng)子區(qū)。含有酵母相容的啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和終止序列的任何質(zhì)粒都是合適的。
除了微生物，來源于多細(xì)胞生物體的細(xì)胞的培養(yǎng)物也可以用做宿主。原則上，任何這種細(xì)胞培養(yǎng)物都是可用的，而無論這種細(xì)胞培養(yǎng)物來源于脊椎動(dòng)物或非脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物。然而，脊椎動(dòng)物細(xì)胞最有意義，并且最近幾年脊椎動(dòng)物培養(yǎng)(組織培養(yǎng))增殖已經(jīng)成了常規(guī)方法(Tissue Culture，1973)。這種有用宿主細(xì)胞系的例子是VERO和Hela細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系和W138、BHK、COS-7 293、草地夜蛾(SF)細(xì)胞(可做為完整表達(dá)系統(tǒng)從Protein Sciences，1000Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和從Invitrogen商購獲得)、和MDCK細(xì)胞系。在本發(fā)明中，特別優(yōu)選的細(xì)胞系是可從Invitrogen，PO Box 2312，9704 CH Groningen，The Netherlands商購得到的昆蟲細(xì)胞系S2。
這種細(xì)胞的表達(dá)載體通常包含(如果必要)復(fù)制起點(diǎn)、位于待表達(dá)基因前面的啟動(dòng)子及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、聚腺苷酸化位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用，常常由病毒材料提供表達(dá)載體上的控制功能。例如，常用的啟動(dòng)子來源于多瘤病毒、腺病毒2，并且最常見的是來源于猴病毒40(SV40)或巨細(xì)胞病毒(CMV)。SV40病毒的早晚期啟動(dòng)子特別有用，因?yàn)檫@兩種啟動(dòng)子都容易做為片段從病毒獲得，其也含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)(Fiers等，1978)。只要SV40片段包含從HindIII位點(diǎn)延伸到位于病毒復(fù)制起點(diǎn)的BglI位點(diǎn)的約250bp序列，就可以使用較小或較大的SV40片段。而且，可以并且常常希望使用與期望的基因序列正常連接的啟動(dòng)子或控制序列，只要這種控制序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
通過載體構(gòu)建以包含外源復(fù)制起點(diǎn)，諸如可以來源于SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)的復(fù)制起點(diǎn)，可以提供復(fù)制起點(diǎn)，或者通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)理可以提供復(fù)制起點(diǎn)。如果載體整合到宿主細(xì)胞染色體中，后者常常是滿足需要的。
實(shí)施例1TNFα變異體的制備編碼野生型人類TNFα單體多肽(SEQ ID NO10)的合成DNA序列“SMTNFWT3”(SEQ ID NO9)由Entelechon GmbH作為連接產(chǎn)物而提供。根據(jù)密碼子使用數(shù)據(jù)庫，通過排除大腸桿菌(E.coli)中10％以下頻率的所有密碼子，人類hTNFα的DNA序列被優(yōu)化用于在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)。而且，設(shè)計(jì)該序列以包含用于隨后克隆步驟的5，NcoI限制位點(diǎn)。
SMTNFWT3連接產(chǎn)物被引入到pCR 4 TOPO平端載體中，并且轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH10B細(xì)胞。純化來源于10個(gè)所得到的SMTNFWT3TOPO克隆的質(zhì)粒DNA，并且選擇(當(dāng)通過限制酶(RE)消化分析時(shí))含有期望片段的5個(gè)克隆。
來源于5個(gè)可能正確的SMTNFWT3TOPO克隆的NcoI/EcoRI DNA片段被分離和轉(zhuǎn)移給pET28b(+)載體，并且測(cè)序。4個(gè)克隆中鑒定到插入、缺少或置換，而一個(gè)克隆看起來是正確的。隨后使用該正確的構(gòu)建體SMTNFWT3pET28做為模板以產(chǎn)生所有單個(gè)的TNFα變異體。
實(shí)施例2TNF34的構(gòu)建參見下文，PanDR表位氨基酸序列(SEQ ID NOs6和8)被人工地“逆翻譯”為優(yōu)化用于在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)的DNA序列(SEQID NO7)并且通過SOE PCR被插入到環(huán)3中。
所得到的構(gòu)建體(編碼WO 03/042244中SEQ ID NO19的DNA序列)被放置在pET28b+載體中以產(chǎn)生TNF34-pET28b+。
實(shí)施例3單體化三聚體的構(gòu)建單體化三聚體構(gòu)建體基于3個(gè)TNFα編碼區(qū)，這3個(gè)TNFα編碼區(qū)被三甘氨酸接頭和/或表位編碼區(qū)隔開。
做為3個(gè)單獨(dú)的實(shí)體合成TNFα基因。通過SOE PCR裝配這3個(gè)片段，并且裝配的基因(WO 03/042244中SEQ ID NO21)被克隆到pCR2.1-TOPO中。經(jīng)序列驗(yàn)證后，分離正確的克隆。然后，將hTNFT_0基因(WO 03/042244中的SEQ ID NO21，編碼TNFα-GlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFα，WO 03/042244中的SEQ IDNO22，即通過2個(gè)三甘氨酸接頭隔開的3拷貝SEQ ID NO17)轉(zhuǎn)移給pET28b+以產(chǎn)生hTNFT_0-pET28b+。分離正確的克隆，驗(yàn)證該序列，并且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)株系BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中。
用hTNFT_0-pET28b+做模板以通過SOE PCR產(chǎn)生下面4個(gè)單體化三聚體變異體hTNFT_1，hTNFT_2，hTNFT_3和hTNFT_4(WO 03/042244中SEQ ID NOs49，51，57和59)。用相似的方法可以制備另一種變異體(WO 03/042244中SEQ ID NO53)。
hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3是包含破傷風(fēng)類毒素表位P2和P30(分別是SEQ ID NOs2和4)的變異體，需要2輪SOE PCR裝配它們。hTNFT_4是具有PADRE(SEQ ID NO6)插入的變異體，并且可以通過單輪SOE PCR裝配它。用相似的方法可以制備另一種變異體(WO03/042244中SEQ ID NO55)。
用上述方法構(gòu)建hTNFT_4，并且在TOP 10細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了hTNFT_4-pET28b+的正確克隆，及將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)移給BL21-STAR和HMS174細(xì)胞。
為了產(chǎn)生hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3，用SOE PCR將表位插入到非常小的三聚體片段中，通過RE切割和連接將該三聚體片段插入到hTNFT_0-pET28b+中。
實(shí)施例4穩(wěn)定TNF34突變體為了進(jìn)一步穩(wěn)定上述TNF34-pET28b+變異體，構(gòu)建含有引入的額外二硫鍵的變異體及缺失突變體。構(gòu)建3種不同的突變體TNF34-A-pET28b+含有置換Q67C和A111C，TNF34-B-pET28b+含有A96C和I118C，TNF34-C-pET28b+含有8個(gè)最N-端的氨基酸的缺失，表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如WO 03/042244中SEQ ID NOs20，30和31中所述。
利用SOE PCR制備所有3種構(gòu)建體，并且克隆到BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，隨后進(jìn)行序列驗(yàn)證。
實(shí)施例5柔性環(huán)變異體為了發(fā)現(xiàn)與TNF34-pET28b+變異體比較可能顯示改進(jìn)特征的變異體，制備其中在TNFα分子柔性環(huán)3中來回移動(dòng)PADRE插入物(SEQ IDNO6)的構(gòu)建體。
所有這些TNF35-pET28b+、TNF36-pET28b+、TNF37-pET28b+、TNF38-pET28b+、TNF39-pET28b+，和具有放置在分子C-末端的PADRE的變異體；TNFC2-pET28b+，都用SOE PCR技術(shù)制備并且克隆到BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，接著進(jìn)行序列驗(yàn)證。表達(dá)產(chǎn)物的氨基酸序列如WO 03/042244中SEQ ID NOs23，24，24，26，27和28中所示。
為了也評(píng)估利用昆蟲細(xì)胞做為表達(dá)系統(tǒng)的可能性，TNFWT、TNF34、TNF35、TNF36、TNF37、TNF38、TNF39和TNFC2被轉(zhuǎn)移到p2Zop2f載體中(參見PCT/DKI02/00764中圖1)，并且在S2昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。
實(shí)施例6其它構(gòu)建體已經(jīng)制備了大量其它TNFα變異體，所有這些變異體命名為TNFX，參見上文。通過SOE PCR制備了編碼這些變異體的DNA序列，并且直接克隆到pET28b+中。
正確的TNFX克隆已經(jīng)被轉(zhuǎn)化到BL21-STAR和HMS174中，并且隨后驗(yàn)證序列。
實(shí)施例7外周質(zhì)表達(dá)LTB前導(dǎo)序列已經(jīng)被直接添加到TNF34-pET28b+中WO 03/042244的SEQ ID NO16上游以將表達(dá)導(dǎo)向外周質(zhì)間隙。
實(shí)施例8哺乳動(dòng)物表達(dá)為了檢測(cè)哺乳動(dòng)物中的表達(dá)，WO 03/042244的SEQ ID NO16和編碼TNF34的DNA已經(jīng)被轉(zhuǎn)移給pHP1載體，該載體是商購pCI載體(Promega Corporation)的變異體。pHP1包含卡那霉素抗性基因代替pCI的AmpR基因做為標(biāo)記。
實(shí)施例9大腸桿菌(E.coli)中可溶性蛋白質(zhì)的優(yōu)化生產(chǎn)序言因?yàn)楫?dāng)從大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞表達(dá)時(shí)，TNFα和其變異體的最初表達(dá)只產(chǎn)生非常有限數(shù)量的可溶蛋白質(zhì)，所以任務(wù)是顯著地改進(jìn)TNFα變異體的表達(dá)水平和溶解性以確?？焖俸头奖愕牡鞍踪|(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。
方法最初的實(shí)驗(yàn)是在搖瓶中進(jìn)行的，當(dāng)使用發(fā)酵罐工作時(shí)，利用所獲得的經(jīng)驗(yàn)。同時(shí)運(yùn)轉(zhuǎn)3個(gè)發(fā)酵罐，在發(fā)酵期間取出樣品進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)、TNFα產(chǎn)生和降解水平的分析。
目的該研究的目的是確定免疫原性TNFα變異體在確定成分生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在HMS174大腸桿菌(e.coli)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)表達(dá)的最適宜生長(zhǎng)條件。
材料和方法原始材料用于采用確定成分基本培養(yǎng)基發(fā)酵的起始材料


培養(yǎng)基和緩沖液組成主培養(yǎng)基的制備

項(xiàng)目1-8按照書寫順序溶解在約50％終體積的去離子水中，充分混合直到完全溶解它們。然后將體積調(diào)整到終體積(減去高壓滅菌后添加的體積)，并且轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，通過高壓滅菌進(jìn)行消毒殺菌。
項(xiàng)目9-11被混合并且無菌地轉(zhuǎn)移到冷卻的發(fā)酵罐中(37℃)。將pH調(diào)整到7。
預(yù)培養(yǎng)基的制備

期望體積的貯存液項(xiàng)目1-9被轉(zhuǎn)移到1L測(cè)定燒瓶中。添加RO水達(dá)到955ml。測(cè)定pH，如果必要將pH調(diào)整到7.0。攪拌溶液，并且將它轉(zhuǎn)移到4個(gè)1000ml燒瓶中，每個(gè)燒瓶238ml。高壓滅菌后，不能高壓滅菌的成分項(xiàng)目10-12被無菌地添加到燒瓶中。
微量鹽溶液的制備

在約20％終體積中混合成分。添加酸化(pH＝1)RO水達(dá)到1000ml。攪拌溶液直到所有的鹽都溶解。將溶液轉(zhuǎn)移到1L藍(lán)蓋瓶中，對(duì)它進(jìn)行高壓滅菌。
硫酸亞鐵溶液的制備

氯化鐵(Ferro chloride)溶液的制備

設(shè)備

Infors Labfors發(fā)酵罐系統(tǒng)由6個(gè)2L發(fā)酵罐和主控制單元組成，每個(gè)發(fā)酵罐都有0.5-1.6L的工作體積，主控制單元連接安裝有數(shù)據(jù)獲得和處理軟件(Iris NT 4.1 for Windows)的計(jì)算機(jī)。
方法在以約200rpm/min振蕩的培養(yǎng)箱中，在含有豐富培養(yǎng)基w/60μ/ml卡那霉素的250ml搖瓶中做最初的實(shí)驗(yàn)以評(píng)估表達(dá)的可溶蛋白質(zhì)的百分?jǐn)?shù)。
用Western印跡和考馬斯亮藍(lán)染色SDS PAGE評(píng)估HMS174和BL21Star株系中TNFα蛋白質(zhì)表達(dá)。通過裂解細(xì)胞，在離心步驟(20,000xg，10分鐘)前后從上清液移除樣品評(píng)估總的和可溶的TNFα表達(dá)。通過“目測(cè)”Western印跡估測(cè)可溶TNFα的百分?jǐn)?shù)。
檢測(cè)了不同的溫度組合大多數(shù)情況下，誘導(dǎo)后在37℃產(chǎn)生生物質(zhì)，并且檢測(cè)了25℃(37/25)或37℃(25/37)的表達(dá)溫度。
TNF37(A145R)(SEQ ID NO13)被選作表達(dá)的模式變異體，然后利用37/25℃的組合，在含有確定成分培養(yǎng)基的搖瓶中檢測(cè)它。
建立研究細(xì)胞庫通過用來自含有60μg/ml卡那霉素的酵母培養(yǎng)基(YEM)中250mlON培養(yǎng)物的25ml培養(yǎng)物接種預(yù)先在37℃溫?zé)岬暮?25YEM的1L帶擋板的搖瓶，在37℃以200rpm生長(zhǎng)3.5小時(shí)，在含有60μg/ml卡那霉素的酵母培養(yǎng)基(YEM)中建立TNF37(A145R)的研究細(xì)胞庫(Research Cell Bank，RCB)。通過混合60ml指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物和140ml 86％甘油，并且以1ml等份等分制備相同的甘油冷凍貯存液。在-80℃貯藏這些等份試樣，并且在發(fā)酵前，單個(gè)的等份試樣用于預(yù)培養(yǎng)。
為了測(cè)定RCB的質(zhì)量，用每個(gè)RCB等份試樣接種含有250ml預(yù)培養(yǎng)基w/60μg/ml卡那霉素的3個(gè)預(yù)培養(yǎng)燒瓶，測(cè)定OD600。
接種后直到11小時(shí)培養(yǎng)物都有相同的表現(xiàn)，其中它們達(dá)到了約3.2的OD600。決定在所有下面的實(shí)驗(yàn)中，用在上述條件下已經(jīng)生長(zhǎng)11小時(shí)的50ml預(yù)培養(yǎng)物接種1L發(fā)酵罐。
優(yōu)化發(fā)酵罐條件為了確定最適宜的發(fā)酵條件，從Inforss發(fā)酵罐中生長(zhǎng)培養(yǎng)物取出樣品，并且用分光光度計(jì)分析OD600，利用定量TNF特異性ELISA測(cè)定TNF表達(dá)水平，用Western印跡測(cè)定TNF降解。
在不同的溫度組合，25℃/25℃，25℃/25℃/16℃，37℃/25℃和37℃/37℃測(cè)試發(fā)酵。
檢測(cè)大量樣品的OD600和TNF表達(dá)，并且用Western印跡進(jìn)一步分析幾種代表性樣品的TNF表達(dá)以測(cè)定降解。
圖解說明一般工藝參數(shù)

具體工藝參數(shù)

IPTG濃度是1mM，而且除了37℃/37℃和25℃/25℃方法外，將誘導(dǎo)時(shí)的溫度從37℃降低至25℃?？偟陌l(fā)酵時(shí)間是37℃/37℃方法為14和18小時(shí)之間，并且25℃/25℃和37℃/25℃方法不超過61小時(shí)，包括增值、誘導(dǎo)和蛋白質(zhì)產(chǎn)生?？偟陌l(fā)酵時(shí)間取決于培養(yǎng)物的生長(zhǎng)。如從接種培養(yǎng)物中OD所計(jì)算的，發(fā)酵罐中OD600開始是0.1-0.3之間(預(yù)培養(yǎng)物中2-6)。在OD600＝20±1-2或接種后9到11小時(shí)進(jìn)行37℃/25℃方法的誘導(dǎo)。蛋白質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)行了20-24小時(shí)。在OD600＝10±1-2或接種后22-24小時(shí)進(jìn)行25℃/25℃方法的誘導(dǎo)。蛋白質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)行了24-36小時(shí)。
TNFα變異體表達(dá)通過取出2×1ml樣品并且貯藏在-20℃檢測(cè)TNF表達(dá)水平。然后在冰上融解樣品，并且超聲處理3×30秒，其中兩次之間至少有30秒是放在冰上以防止樣品加熱。以20,000×g離心樣品10分鐘，利用TNFα定量ELISA檢測(cè)上清液的TNFα含量。
該方法的一般概述可以參見圖1的流程圖。
結(jié)果和討論該研究中進(jìn)行的試驗(yàn)表明當(dāng)在25℃下在搖瓶和發(fā)酵罐中表達(dá)TNFα?xí)r，可溶TNF的表達(dá)顯著增加了。
搖瓶試驗(yàn)用5ml ON培養(yǎng)物接種100ml豐富培養(yǎng)基，并且在37℃生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD600時(shí)，用1mM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物。同時(shí)，37℃生長(zhǎng)的培養(yǎng)物或者保持在37℃過夜生長(zhǎng)，或者移動(dòng)到25℃過夜生長(zhǎng)。第二天，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞和分析總的和可溶的TNFα變異體表達(dá)。
結(jié)果表明在誘導(dǎo)點(diǎn)將溫度從37℃轉(zhuǎn)變到25℃對(duì)表達(dá)的可溶TNFα的量具有顯著積極的作用，因此決定在下面的試驗(yàn)中保持這種溫度轉(zhuǎn)變。
選擇的變異體如上所述檢測(cè)所有的變異體，并且由于足夠高水平的表達(dá)，選定TNF34、TNF34A、TNF37、TNFX5.1、TNFX2.1和TNF_T2用于進(jìn)一步研究。
當(dāng)可獲得去毒形式的上述構(gòu)建體時(shí)，檢測(cè)這些變異體的表達(dá)，并且結(jié)果表明與非去毒形式相似的表達(dá)水平。
發(fā)酵罐中表達(dá)為了檢測(cè)確定成分培養(yǎng)基中TNFα變異體表達(dá)，我們?cè)趽u瓶中進(jìn)行了初步的試驗(yàn)，條件與上述條件相同(37℃/25℃)。過夜誘導(dǎo)的培養(yǎng)物顯示了滿意水平的TNFα變異體表達(dá)，因此我們決定檢測(cè)發(fā)酵罐中表達(dá)以優(yōu)化所表達(dá)的TNFα變異體量，并且也試圖最小化在表達(dá)的變異體中仍舊可以觀察到的變異體降解。
細(xì)胞生長(zhǎng)如上所述制備研究細(xì)胞庫，并且我們使用這種預(yù)培養(yǎng)物，用50mlOD600約是3-4的預(yù)培養(yǎng)物接種1L發(fā)酵罐。發(fā)酵罐被預(yù)加熱到選定的溫度(37℃或25℃)以最小化溫度震擾。在37℃發(fā)酵罐的情況下，細(xì)胞繼續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，沒有任何延滯期。當(dāng)37℃預(yù)培養(yǎng)物被接種到25℃發(fā)酵罐中時(shí)，細(xì)胞在以較慢速率開始指數(shù)生長(zhǎng)前有約17小時(shí)的延滯期。預(yù)測(cè)這種情況是細(xì)胞受到溫度震擾的結(jié)果。
當(dāng)我們?cè)谂R誘導(dǎo)前轉(zhuǎn)變37℃培養(yǎng)物到25℃時(shí)觀察到了相同的延滯期。我們?cè)噲D在1個(gè)多小時(shí)逐漸將溫度從37℃轉(zhuǎn)變到25℃(每10分鐘2℃)沒有減少延滯期。
TNFα變異體表達(dá)水平通過TNFα特異性定量ELISA測(cè)定表達(dá)水平觀察到的最高水平是25℃/25℃方法，獲得了約250mg/l的水平。這些試驗(yàn)仍舊是單個(gè)驗(yàn)證，并且誘導(dǎo)后15h和35h之間的時(shí)間還待分析。
37℃/37℃的方法只產(chǎn)生了非常有限量的約15mg/l的可溶TNFα變異體，37℃/25℃方法看似在約100mg/l達(dá)到峰值。
結(jié)論基于從總共超過100次發(fā)酵得到的結(jié)果，(從總共6個(gè)中)選定了生產(chǎn)可溶TNFα變異體蛋白質(zhì)的2個(gè)上游方法。在確定成分的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵(參見下文所述)。選定的發(fā)酵方法基于溫度研究，其中檢測(cè)了4個(gè)不同的溫度組合。所檢測(cè)的TNFα變異體是在大腸桿菌(e.coli)株系HMS174中的TNF37-145。
在誘導(dǎo)前后都采用25℃已經(jīng)獲得了最佳結(jié)果。最佳的收集時(shí)間還有待測(cè)定。
實(shí)施例10選擇測(cè)定法直接受體ELISA和多克隆ELISA及具有KD-4和Wehi細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定法用做首選的測(cè)定法以進(jìn)行篩選和純化。在受體和細(xì)胞毒性測(cè)定法中將產(chǎn)生的抗TNFα變異體的抗體用于抑制wtTNFα結(jié)合以測(cè)定抗體質(zhì)量。
實(shí)施例11純化方法在該實(shí)施例中，詳細(xì)地描述了TNFα變異體之一(TNF37)的重組產(chǎn)生和隨后的純化。然而，根據(jù)本發(fā)明，該純化方法是優(yōu)選的純化方法，并且也可應(yīng)用于(對(duì)每種變異體有些小相關(guān)的調(diào)整)本發(fā)明的其它TNFα變異體。
然而，目前本發(fā)明人正在研究尤其適于TNFα變異體大規(guī)模發(fā)酵的改進(jìn)的純化方案?；旧?，使用了下述相同的單個(gè)步驟，但是順序相反以在SP-瓊脂糖凝膠(Sepharose)和Q-瓊脂糖凝膠層析步驟后用羥磷灰石層析步驟結(jié)束純化。
在5ml LB培養(yǎng)基(60mg卡那霉素/L LB)中重懸浮來源于LB卡那霉素平板(60mg卡那霉素/L含有1.5瓊脂的LB培養(yǎng)基)的大腸桿菌(E.coli)BL21STAR/TN37菌落，并且在37℃過夜生長(zhǎng)(16小時(shí))，同時(shí)在New Braunswick振蕩器中以220RPM振蕩。
2×2ml這種培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到2個(gè)2L帶擋板搖瓶中1L LB(60mg卡那霉素/L)中，使得細(xì)胞在New Braunswick振蕩器中以220RPM生長(zhǎng)到OD436＝0.6-0.8。在示例性溫度37℃和25℃已經(jīng)進(jìn)行了這個(gè)步驟，但是該溫度可以對(duì)每種培養(yǎng)物進(jìn)行優(yōu)化。
向每個(gè)搖瓶添加1ml 1M IPTG，并且允許細(xì)胞生長(zhǎng)16-20小時(shí)。誘導(dǎo)前，將溫度調(diào)整到25℃，如果這不是發(fā)酵溫度的話。
利用Sorvall離心機(jī)中SLA-3000轉(zhuǎn)頭，以5000RPM離心15分鐘，在離心管(500ml)中收集細(xì)胞。
利用0.9％ NaCl將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)500ml預(yù)先稱重的離心管中，并且如前所述通過離心收集細(xì)胞。
棄去上清液，稱重該管以測(cè)定細(xì)胞重量(應(yīng)該是7-11g)。
添加200ml 50mM Na2HPO4，pH＝7.0(如果細(xì)胞被重懸浮，應(yīng)該直接使用它們，否則可以冷凍細(xì)胞)。
細(xì)胞破壞、離心和過濾在效力、穩(wěn)定性和選擇后續(xù)純化步驟中必需的任何緩沖液能力方面，細(xì)胞的機(jī)械破碎比酶促破碎提供了幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。通過在使用前向樣品室添加冰水并且在兩次樣品通過之間讓冰水流過機(jī)械，在操作期間保持APV-100冷卻。離心和過濾用以在蛋白質(zhì)層析分離前，從溶液除去任何顆?；蚓奂铩?yīng)該在同一天完成細(xì)胞破碎和HA層析，因?yàn)檫@可能因?qū)游霾襟E中與蛋白酶活性分離的結(jié)果而最小化明顯的蛋白酶活性。破碎、分離和過濾的方法如下仔細(xì)重懸浮的細(xì)胞材料被轉(zhuǎn)移給細(xì)胞破碎器(APV-1000)。利用700巴反壓力(在該點(diǎn)，溶液應(yīng)該是清澈的)使細(xì)胞懸浮液小心地兩次通過破碎器(每次通過后在冰上冷卻，并且兩次通過之間讓冰水流過APV-1000)。
破碎的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到500ml離心管中，利用SLA-3000轉(zhuǎn)頭，在Sorvall離心機(jī)中以10000RPM離心45分鐘。
將提取物(約225ml)通過0.22μm過濾器。
羥磷灰石(HA)層析羥磷灰石Bio-Gel HTP凝膠(BIO-RAD；目錄#130-0420)是磷酸鈣的晶體形式，已經(jīng)證明了它本身是蛋白質(zhì)諸如單克隆抗體和不能用其它方法分離的其它蛋白質(zhì)分離中獨(dú)特的工具。然而，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，這種物質(zhì)的流動(dòng)特性在某種程度上是關(guān)鍵的，因?yàn)楦哂?ml/min的流速升高了壓力達(dá)到了不可接受的高水平。而且，當(dāng)如制造商所建議，試圖用氫氧化鈉再生時(shí)，這種物質(zhì)已經(jīng)毀壞了幾次。
緩沖液和柱子緩沖液A+B的貯存液1M Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0(用HCl調(diào)整pH到7)。由儲(chǔ)存液稀釋制備緩沖液A+B，緩沖液A50mM Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0緩沖液B0.3M Na2HPO4×2H2O，pH＝7.0。
利用緩沖液A中懸浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其帶有約50-60ml羥磷灰石Bio-Gel HTP凝膠(BIO-RAD；目錄#130-0420)。
層析程序清洗系統(tǒng)20ml，30ml/min流速。
平衡以2ml/min流速的4CV緩沖液A。
以2ml/min流速，通過泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要樣品，約225+5-10ml)加載樣品。
用1.5CV緩沖液A以2ml/min流速洗滌柱子。
洗脫用4CV 0％到100％梯度的緩沖液B，以2ml/min流速洗脫蛋白質(zhì)。
用2CV緩沖液B以2ml/min流速清洗柱子。
用4CV緩沖液A以2ml/min流速再平衡。
選定級(jí)分，收集并且用15×體積20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH8.0，在4℃透析ON。
HA層析后選擇含有TNF37的級(jí)分HA層析洗脫級(jí)分分布圖基本上由“流過的”級(jí)分和可以被分成幾個(gè)峰的一個(gè)洗脫峰組成。必須根據(jù)完整峰的考馬斯染色凝膠選擇含有TNF37的級(jí)分，因?yàn)楹蠺NF37的峰不是直接可被鑒定的。然而，由于隨后的純化步驟，在這個(gè)點(diǎn)選擇級(jí)分不太重要，并且在該方法的以后步驟中可以除去雜質(zhì)。因此，不太謹(jǐn)慎的級(jí)分選擇確保了最大的變異體產(chǎn)量。
最初用“點(diǎn)印跡”檢查“流過的”級(jí)分的任何TNF37。這產(chǎn)生了陽性結(jié)果，該結(jié)果在理論上應(yīng)該表明相當(dāng)大部分的變異體不結(jié)合柱子。然而，當(dāng)對(duì)“流過的”級(jí)分進(jìn)行非常有效的SP-瓊脂糖凝膠陽離子交換層析(參見下一步)，并且用考馬斯染色凝膠分析級(jí)分時(shí)，它們不含有任何可檢測(cè)到的TNF37變異體，表明在“點(diǎn)印跡”中有些假陽性反應(yīng)或者一部分變異體完全不同地結(jié)合SP-瓊脂糖凝膠。
SP-瓊脂糖凝膠陽離子交換層析因?yàn)榕cwtTHFα pI 7.8比較，變異體有相當(dāng)高的計(jì)算的pI 9.4，所以SP-瓊脂糖凝膠是選定的基本陽離子交換步驟。這種pI的增加是通過PADRE表位引入2個(gè)賴氨酸的結(jié)果。這種層析法對(duì)于TNF37變異體是非常有效的和快速的，并且預(yù)期其可以用于大量其它TNFα環(huán)變異體。
在繼續(xù)SP-瓊脂糖凝膠層析前，應(yīng)用的樣品應(yīng)該具有低于8mS/cm的導(dǎo)電率，pH應(yīng)該至少是7.7，因?yàn)榘次覀兊慕?jīng)驗(yàn)與此相偏離已經(jīng)使蛋白質(zhì)的結(jié)合特性不時(shí)地不同。
緩沖液和柱子緩沖液A+B的貯存液1M Tris-HCl，pH＝8.0。
緩沖液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
緩沖液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
利用緩沖液A中懸浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其帶有約60ml SP-瓊脂糖凝膠FF(AmershamBiosciences；目錄#17-0729-01)。
層析程序清洗系統(tǒng)20ml，30m1/min流速。
平衡以4ml/min流速的4CV緩沖液A。
以4ml/min流速，通過泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要樣品，樣品+10ml)加載樣品。
用1.5CV緩沖液A以4ml/min流速?zèng)_洗柱子。
洗脫用4CV 0％到100％梯度的緩沖液B，以4ml/min流速洗脫蛋白質(zhì)。
用2CV緩沖液B以4ml/min流速清洗柱子。
用4CV緩沖液A以4ml/min流速再平衡。
選定級(jí)分，收集并且用15×體積20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH8.0，在4℃透析ON。
SP瓊脂糖凝膠層析后選擇含有TNF37的級(jí)分分布圖基本上由“流過的”級(jí)分和含有蛋白質(zhì)的幾個(gè)峰組成。然而，兩個(gè)峰含有帶有一些雜質(zhì)的變異體。在這一點(diǎn)，不要包含峰α右側(cè)的許多級(jí)分是重要的，因?yàn)榘次覀兊慕?jīng)驗(yàn)這包含了許多雜質(zhì)，而在隨后的層析步驟中不容易除去該雜質(zhì)。
Q-瓊脂糖凝膠陰離子層析Q-瓊脂糖凝膠是選定的基本陰離子交換步驟，用于除去具有高的再現(xiàn)性跟隨在包括HA層析和SP-瓊脂糖的TNF37純化之后的主要雜質(zhì)蛋白質(zhì)。TNF37變異體本身不結(jié)合柱子，但是主要未知雜質(zhì)結(jié)合柱子。然而，可以用避免該雜質(zhì)的方式在SP-瓊脂糖凝膠中早已以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆绞竭x擇級(jí)分。然而，與純化方法中使用Q-瓊脂糖凝膠時(shí)比較，這損失了TNF37變異體的產(chǎn)量，并且因?yàn)樵谠摬襟E中也除去其它少量的雜質(zhì)，所以在總的方法中優(yōu)選地包括該步驟?？傊甉-瓊脂糖凝膠步驟在變異體37的純化中是重要的，并且以高產(chǎn)量提供了甚至更好的終產(chǎn)物。
緩沖液和柱子緩沖液A+B的貯存液1M Tris-HCl，pH＝8.0。
緩沖液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
緩沖液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
利用緩沖液A中懸浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱子，填充柱子使其帶有約50-60ml Q-瓊脂糖凝膠FF(AmershamBiosciences；目錄#17-0510-01)。
層析程序清洗系統(tǒng)20ml，30ml/min流速。
平衡以4ml/min流速的4CV緩沖液A。
以2ml/min流速，通過泵(在BioCad上入口F)(如果在管道里需要樣品，樣品+10ml)加載樣品。
用3CV緩沖液A以4ml/min流速?zèng)_洗柱子。
洗脫用2CV 100％緩沖液B，以4ml/min流速洗脫剩余的蛋白質(zhì)。
用4CV緩沖液A以4ml/min流速再平衡。
選定級(jí)分，收集并且直接應(yīng)用在SP-瓊脂糖凝膠柱子上。
洗脫分布圖基本上由“流過的”級(jí)分和含有蛋白質(zhì)的幾個(gè)峰組成?！傲鬟^的”級(jí)分有時(shí)可以分成幾個(gè)完全分辨的峰，所有這些峰都含有TNF37變異體，因此收集所有的峰。當(dāng)解決了明顯的蛋白酶降解問題時(shí)，就可能解決了TNF37的這種異質(zhì)性。
實(shí)施例12免疫研究材料鹽水(無菌水中0.9％ NaCl，F(xiàn)resenius Kabi Norge AS，Norway)，弗氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)-5881，39H8926)，弗氏不完全佐劑(Sigma，F(xiàn)-5506，60K8937)，Alhydrogel 2％[10mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 96(3176))，Adjuphos[5mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 2(8937))，野生型人類TNF(Invitrogen目錄號(hào)10062-024)，KYM-1D4A.Meager(A.Meager，J.Immunol.Methods 1991，144141-143)提供，WEHI 164克隆13T.Espevik(T.Espevik和J.Nissen-Myer，J.Immunol.Methods 1986，9599-105)提供，四唑鎓鹽(MTS，CeliTiter 96一種水溶液；Promega，G3581)，旋轉(zhuǎn)棒(Rotamix，Heto，Denmark)，
渦漩機(jī)(Vortex)(OLE DICH instrumentmakers ApS，Denmark)。
制劑/佐劑的選擇(20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0中)純化的TNFα變異體蛋白質(zhì)被鹽水(0.9％NaCl)稀釋到0.5mg/ml，分成批次(375μg/小瓶)，并且在用于免疫前在-20℃貯藏。
對(duì)于每種TNFα變異體，用兩種佐劑進(jìn)行免疫1)弗氏完全佐劑(CFA，用于初次免疫)和弗氏不完全佐劑(IFA，用于加強(qiáng)免疫)和2)Alhydrogel或Adjuphos(分別是現(xiàn)有技術(shù)氫氧化鋁和磷酸鋁佐劑)-這兩種佐劑用于初次和加強(qiáng)注射。
初次免疫前，做出選擇Alhydrogel或Adjuphos做為TNF變異體佐劑的決定。選定具有最好吸附TNFα變異體能力的佐劑以在免疫試驗(yàn)中進(jìn)一步使用。在兩個(gè)小瓶中，兩等份TNFα變異體與等體積的Alhydrogel和Adjuphos混合。室溫下在旋轉(zhuǎn)棒上輕輕混合小瓶30分鐘。然后以13000g離心小瓶15分鐘，在梯度(4-12％)SDS凝膠上檢測(cè)上清液中可溶TNFα變異體含量。然后選擇含有最少自由變異體(即，其中更多的變異體已經(jīng)結(jié)合了鋁顆粒)的佐劑/變異體等份為最好的佐劑。
抗原/佐劑emulgate的制備通過下面的方法制備CFA/IFA emulgates融解具有TNFα變異體的小瓶
，轉(zhuǎn)移到10ml無菌小瓶中，并且與等體積的CFA或IFA混合。然后在20℃，在渦漩機(jī)上以3300rpm進(jìn)一步混合小瓶30分鐘。
通過下面的方法制備Alhydrogel/Adjuphos emulgates用鹽水將Alhydrogel/Adjuphos稀釋到1.4mg Al/ml。融解具有TNFα變異體的小瓶
，轉(zhuǎn)移到10ml無菌小瓶中，并且與等體積的Alhydrogel[1.4mg Al/ml]或Adj upho s[1.4mg Al/ml]混合。然后，在20℃，在旋轉(zhuǎn)棒上進(jìn)一步混合小瓶30分鐘。
動(dòng)物模型的選擇用TNFα變異體重復(fù)免疫6至8周齡Balb/Ca雌性小鼠。以不同的時(shí)間間隔收集血液樣品，并且研究分離血清的抗wtTNFα抗體效價(jià)。小鼠定購于Taconic Farms，Inc.Acquires M&B A/S，Denmark。開始試驗(yàn)前，小鼠在Pharmexa的動(dòng)物研究室養(yǎng)一周。
免疫方案和劑量用CFA/IFA和Alhydrogel/Adjuphos中的每種TNFα變異體分別免疫幾組10+10只小鼠。20+20只小鼠用于野生型TNFα免疫。
初次免疫時(shí)，皮下注射佐劑中的50μg蛋白質(zhì)。初次免疫后2，6和10周，所有小鼠都將接受用佐劑中25μg蛋白質(zhì)的另外皮下加強(qiáng)免疫。
緊臨第一次免疫前和每次加強(qiáng)免疫后1周收集血液樣品。
使用的測(cè)定法利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性生物測(cè)定這種測(cè)定法用于測(cè)定本發(fā)明TNFα變異體的毒性。在滴定量的TNFα變異體存在的情況下，培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)，并且通過添加四唑鎓鹽(MTS)檢測(cè)細(xì)胞死亡，該四唑鎓鹽通過活細(xì)胞被生物還原成有色的甲(formazan)產(chǎn)物。比較TNFα變異體與人類野生型TNFα的細(xì)胞毒性。
利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性抑制生物測(cè)定該測(cè)定法用于研究在TNFα免疫的小鼠中產(chǎn)生的抗血清中和野生型TNFα細(xì)胞毒性作用的能力。細(xì)胞與滴定量的抗血清和恒定濃度的野生型人類TNFα一起被培養(yǎng)48小時(shí)，在抗血清不存在的情況下這足以誘導(dǎo)細(xì)胞中50％細(xì)胞死亡。如上所述，用MTS測(cè)定細(xì)胞死亡。比較來源于TNFα變異體免疫的小鼠的血清與獲自用人類野生型TNFα免疫小鼠的血清的中和能力。
體外研究利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性生物測(cè)定利用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性抑制生物測(cè)定。
最好的免疫原性構(gòu)建體的選擇標(biāo)準(zhǔn)TNFα變異體應(yīng)該顯示最小的細(xì)胞毒性。與獲自人類野生型TNFα免疫的小鼠的血清比較，用TNFα變異體免疫小鼠應(yīng)該產(chǎn)生具有更好或同等中和WEHI-或KYM-1D4-細(xì)胞中人類野生型TNFα介導(dǎo)的細(xì)胞毒性能力的抗血清。
序列表<110>Pharmexa A/S<120>具有降低的細(xì)胞毒性的免疫原性人類TNFα類似物及其制備方法<130>15454PCT00<160>18<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破傷風(fēng)類毒素P2表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(45)<400>1cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg45Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>破傷風(fēng)類毒素P2表位<400>2Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>3<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破傷風(fēng)類毒素P30表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(63)<400>3
ttc aac aac ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc48Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15gct tcc cac ctg gaa63Ala Ser His Leu Glu20<210>4<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>破傷風(fēng)類毒素P30表位<400>4Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>5<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>泛DR結(jié)合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<400>5gcc aag ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct 39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>泛DR結(jié)合肽(PADRE)<400>6Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10
<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>泛DR結(jié)合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<400>7gcg aag ttc gtt gca gct tgg acc ctg aag gcc gct gca 39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>8<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>泛DR結(jié)合肽(PADRE)<400>8Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>9<211>477<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人類wt TNF(密碼子優(yōu)化的)<220>
<221>CDS<222>(1)..(477)<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>成熟TNF序列<400>9atg gtg cgc tca agc tcg cgc acg ccg agt gac aaa cca gta get cat48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15
gtt gtg gcc aac cct cag gcg gaa ggc cag ctc caa tgg tta aat cgt 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcg aac gcc ctg ctg gcg aac ggc gtg gaa ctg cgt gat aac cag 144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45ctg gtg gtc ccc agc gag ggg ctg tat ctg atc tat tca cag gtg ttg 192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttt aag ggt cag ggt tgt ccg agc acc cac gtt ctg ctg acg cat acc 240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80att tct cgt att gct gta tct tat caa act aaa gtc aat tta ctt tcg 288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcg atc aaa tcc ccg tgc caa cgt gag acc cct gaa gga gcg gaa gcc 336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aaa cct tgg tac gaa ccg atc tat ctg ggg ggc gtt ttt cag ctc gaa 384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aaa ggt gat cgg ctg agc gcc gaa att aat cgc ccg gac tac ctt gat 432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gca gag tcc ggt cag gtc tac ttc ggc att atc gca ttg taa 477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>10<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人類wt TNF(密碼子優(yōu)化的)<400>10Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>11<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>插入了12個(gè)PADRE氨基酸的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(109)<223>hTNF氨基酸1-109<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>hTNF氨基酸110-157<400>11Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>12<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人類TNF-alpha，殘基110-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(155)..(155)<223>Asp到Arg突變<400>12Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>13<211>169<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MIS_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108<220>
<221>MIS_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人類TNF-alpha，殘基110-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(157)..(157)<223>Ala到Arg突變<400>13Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala ASn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>14<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(87)..(87)<223>Tyr到Ser突變<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>人類TNF-alpha，殘基110-157<400>14Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly A la Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys1 Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135140Ser A la Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>15<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和額外二硫鍵的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>hTNF氨基酸109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突變<400>15
Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>16<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108
<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人類TNF-alpha，殘基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(156)..(156)<223>Asp到Arg突變<400>16Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110
Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Arg Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>17<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突變<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人類TNF-alpha，殘基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(158)..(158)<223>Ala到Arg突變
<400>17Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Arg Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>18<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>帶有PADRE插入和去毒突變的TNF-α<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>人類TNF-alpha，殘基1-108
<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<220>
<221>MUTAGEN<222>(67)..(67)<223>Leu到Cys突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(87)..(87)<223>Lys到Ser突變<220>
<221>MUTAGEN<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>人類TNF-alpha，殘基109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala到Cys突變<400>18Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Ser Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110
Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170
權(quán)利要求
1.人類TNFα蛋白質(zhì)的免疫原性類似物，其中所述類似物包含a)通過肽接頭首尾連接的2個(gè)或3個(gè)完整的TNFα單體，其中至少一個(gè)肽接頭包含至少一個(gè)II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或b)通過惰性肽接頭首尾連接的2個(gè)或3個(gè)完整的TNFα單體，其中至少一個(gè)單體包含至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列或者其中至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，可選地通過惰性接頭，融合到N-或C-末端單體，或c)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中柔性環(huán)3中已經(jīng)插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或d)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中已經(jīng)引入了穩(wěn)定TNFα單體3D結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)二硫鍵，或e)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中缺失了氨基末端氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9中任何一個(gè)氨基酸，或f)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中在內(nèi)含子位置向環(huán)1內(nèi)插入或置換入至少一個(gè)外源I I類MHC結(jié)合氨基酸序列，或g)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中在人類TNFαN-末端中作為人工莖桿區(qū)的一部分引入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或h)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中引入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，以通過增加三聚體相互作用界面的疏水性而穩(wěn)定單體結(jié)構(gòu)，或i)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中在TNFα氨基酸序列中插入或置換入側(cè)翼為甘氨酸殘基的至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或j)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中在D-E環(huán)中插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或k)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中在兩個(gè)相同的人類TNFα亞序列之間插入或置換入至少一個(gè)外源II類MHC結(jié)合氨基酸序列，或1)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中已經(jīng)加強(qiáng)或用二硫橋置換人類TNFα中至少一個(gè)鹽橋，或m)人類TNFα單體或者a或b中所限定的類似物，其中通過引入模擬鼠TNFα晶體結(jié)構(gòu)的突變?cè)鰪?qiáng)了溶解性或?qū)Φ鞍酌附獾姆€(wěn)定性，其中通過引入至少一個(gè)點(diǎn)突變降低或消除了可能的毒性，該點(diǎn)突變選自Y87S，D143N或A145R，氨基酸編號(hào)從人類TNFα中N-末端纈氨酸開始。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫原性類似物，其中II類MHC結(jié)合氨基酸序列可結(jié)合此多聚體蛋白所來源的動(dòng)物物種的大多數(shù)II類MHC分子。
3.如權(quán)利要求2所述的免疫原性類似物，其中至少一種II類MHC結(jié)合氨基酸序列選自天然T細(xì)胞表位和人工MCH-II結(jié)合肽序列。
4.如權(quán)利要求3所述的免疫原性類似物，其中該天然T細(xì)胞表位選自破傷風(fēng)類毒素表位諸如P2或P30、白喉類毒素表位、流感病毒血凝素表位和惡性瘧原蟲(P.falciparum)CS表位。
5.如權(quán)利要求1至4中任一權(quán)利要求所述的免疫原性類似物，其中類似物的氨基酸序列選自SEQ I D NO12、13、14、16、17和18，以及只包含其保守性氨基酸改變的任何氨基酸序列。
6.如前述任一權(quán)利要求所述的免疫原性類似物，其可以由細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)。
7.編碼前述任一權(quán)利要求所述免疫原性類似物的核酸片段，或與其互補(bǔ)的核酸片段。
8.如權(quán)利要求7所述的核酸片段，其是DNA片段。
9.如權(quán)利要求7或8所述的核酸片段，其包含核酸序列，該核酸序列選自編碼SEQ ID NO12、13、14、16、17和18中任何一種序列的核酸序列，或與其互補(bǔ)的核酸序列。
10.一種下調(diào)宿主動(dòng)物中自身TNFα的方法，該方法包括向該動(dòng)物免疫系統(tǒng)呈遞免疫原性有效量的至少一種權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的免疫原性類似物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中自身宿主是哺乳動(dòng)物，諸如人類。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中通過向自身宿主給藥權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的免疫原性類似物實(shí)現(xiàn)呈遞，可選地所述的免疫原性類似物與佐劑混合。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中佐劑選自免疫靶向佐劑；免疫調(diào)節(jié)佐劑諸如毒素、細(xì)胞因子和分枝桿菌衍生物；油制劑；聚合物；微團(tuán)形成性佐劑；皂苷；免疫刺激性復(fù)合物基質(zhì)(ISCOM基質(zhì))；顆粒；DDA；鋁佐劑；DNA佐劑；γ-菊粉；和包囊化佐劑。
14.如權(quán)利要求10至13中任一權(quán)利要求所述的方法，其中通過選自腸胃外途徑，諸如真皮內(nèi)、皮下和肌內(nèi)途徑；腹膜途徑；口服途徑；口腔途徑；舌下途徑；硬膜外途徑；脊柱途徑；肛門途徑；和顱內(nèi)途徑的途徑向動(dòng)物給藥免疫原性有效量的類似物。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中有效量是0.5μg到2,000μg之間。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，該方法包括每年至少一次給藥，諸如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次和至少12次給藥。
17.如權(quán)利要求10所述的方法，其中通過向動(dòng)物細(xì)胞中引入編碼類似物的核酸，并由此獲得所述細(xì)胞對(duì)所引入核酸的體內(nèi)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)類似物向免疫系統(tǒng)的呈遞。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所引入的核酸選自裸DNA，與帶電荷或不帶電荷的脂質(zhì)配制的DNA，脂質(zhì)體中配制的DNA，包含在病毒載體中的DNA，與有利于轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA，與靶向蛋白質(zhì)或多肽配制的DNA，與鈣沉淀試劑配制的DNA，與惰性載體分子偶聯(lián)的DNA，封裝在殼多糖或脫乙酰殼多糖中的DNA和與佐劑，諸如權(quán)利要求13中所定義的佐劑配制的DNA。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中通過動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或通過權(quán)利要求14中所定義的途徑給藥該核酸。
20.如權(quán)利要求17至19中任一權(quán)利要求所述的方法，該方法包括每年至少一次給藥核酸，諸如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次，和至少12次給藥核酸。
21.如權(quán)利要求10所述的方法，其中通過給藥攜帶有編碼和表達(dá)類似物的核酸片段的非致病性微生物或病毒實(shí)現(xiàn)向免疫系統(tǒng)的呈遞。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中該病毒是非強(qiáng)毒痘病毒諸如痘苗病毒。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中該微生物是細(xì)菌。
24.如權(quán)利要求21至23中任一權(quán)利要求所述的方法，其中向動(dòng)物單次給藥該非致病性微生物或病毒。
25.用于誘導(dǎo)抗多聚體蛋白抗體產(chǎn)生的組合物，該組合物包含-如權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的免疫原性類似物，和-藥物學(xué)和免疫學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑和/或佐劑。
26.用于誘導(dǎo)抗多聚體蛋白抗體產(chǎn)生的組合物，該組合物包含-如權(quán)利要求7至9中任一權(quán)利要求所述的核酸片段，和-藥物學(xué)和免疫學(xué)可接受的載體和/或賦形劑和/或佐劑。
27.如權(quán)利要求25或26所述的組合物，其中如權(quán)利要求30或31所述配制類似物。
28.一種制備權(quán)利要求1至7中任一權(quán)利要求所述的類似物的方法，該方法包括在有利于權(quán)利要求7至9中任一權(quán)利要求所述的核酸片段表達(dá)的條件下，培養(yǎng)用該核酸片段轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，隨后從培養(yǎng)物回收做為蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的類似物。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中該宿主細(xì)胞是細(xì)菌宿主細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該類似物是可溶性表達(dá)產(chǎn)物。
31.如權(quán)利要求28或29所述的方法，其中在宿主細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)產(chǎn)物的實(shí)質(zhì)性時(shí)間段期間，在32℃以下的溫度下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中該溫度是約25℃。
33.如權(quán)利要求31或32所述的方法，其中在宿主細(xì)胞培養(yǎng)的完整時(shí)間段期間，溫度基本上保持恒定。
全文摘要
本發(fā)明提供了人類TNFα蛋白質(zhì)的免疫原性類似物，其中所述類似物包含免疫原化的單體TNFα多肽或TNFα二或三聚體，并且其中該類似物進(jìn)一步包含降低或消除毒性的突變，該突變選自從人類TNFα中N－末端纈氨酸開始編號(hào)的Y87S，D143N或A145R。本發(fā)明也提供了編碼該類似物的核酸片段及在該類似物制備中使用的載體和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。也公開了在需要的個(gè)體中下調(diào)TNFα的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1784421SQ200480012635
公開日2006年6月7日 申請(qǐng)日期2004年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月9日
發(fā)明者T·布拉特, S·克呂斯納, F·尼爾森, S·莫里岑, B·沃爾德博格 申請(qǐng)人:法默卡有限公司